CN112189022A - 抗cd33抗体、抗cd33/抗cd3双特异性抗体及其用途 - Google Patents

抗cd33抗体、抗cd33/抗cd3双特异性抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明描述了抗CD33抗体及其抗原结合片段以及抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段。本发明还描述了编码所述抗体的核酸、包含所述抗体的组合物、产生所述抗体的方法以及使用所述抗体治疗或预防疾病诸如癌症的方法。

Description

抗CD33抗体、抗CD33/抗CD3双特异性抗体及其用途
技术领域
本发明涉及单克隆抗CD33抗体、双特异性抗CD33抗CD3抗体、编码抗体的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含抗体的组合物。还提供了制备这些抗体的方法，以及使用这些抗体治疗包括癌症的疾病的方法。
背景技术
急性髓性白血病(AML)是以白血病细胞的克隆扩增为特征的遗传异质性疾病。尽管对AML中潜在的疾病生物学的了解越来越多，但在过去几十年中，细胞毒性化学疗法的标准治疗在很大程度上不变，并且总体五年存活率仍然很差，不到30％(Burnett、Wetzler和Lowenberg，2011年；Cancer Genome Atlas Research等，2013年)。因此，迫切需要具有增加的功效和降低的毒性、理想地靶向AML干细胞的新型疗法，因为据信这些细胞在AML的发病机制中至关重要，并且被标准疗法根除不充分被认为是导致复发的高发因素(Hope、Jin和Dick，2004年；Ishikawa等人，2007年)。虽然已证明针对细胞表面分子的治疗性抗体对于治疗恶性疾病诸如淋巴瘤和急性淋巴母细胞白血病以及实体瘤是有效的(Hoelzer，2013年；Jackson和Chester，2015年)，但是目前仅批准了一种基于抗体的疗法用于AML(Godwin、Gale和Walter，2017年)。
CD33是67kD的单通跨膜糖蛋白并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)家族的成员。虽然其确切的生物学功能尚不清楚，但在正常个体中，其主要被认为是髓细胞样分化抗原，在髓细胞样祖细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中表达较低，而在循环的单核细胞和树突状细胞中高度表达。重要的是，已在85％至90％的患有AML的患者的母细胞和白血病干细胞中检测到CD33。有趣的是，CD33的表达仅限于造血细胞(Paul、Taylor、Stansbury和McVicar，2000年；Ulyanova、Blasioli、Woodford-Thomas和Thomas，1999年)，但是在正常造血干细胞上却不存在(Andrews、Torok-Storb和Bernstein，1983年；Griffin、Linch、Sabbath、Larcom和Schlossman，1984；Jilani等人，2002年)。这些发现表明CD33是AML中基于抗体的疗法的合适靶标。
CD33的结构由介导唾液酸结合的氨基末端V-set Ig样结构域(由CD33的外显子2编码)和其细胞外部分中的C2-set Ig样结构域(由外显子3和4编码)组成(Laszlo等人，2016年)。CD33 RNA的另选剪接可导致在细胞表面表达的较短同种型，该较短同种型缺少V-set但保留C2-set Ig样结构域(Laszlo、Estey和Walter，2014年；Laszlo等人，2016年)。该剪接过程的生物相关性在很大程度上是未知的，直至最近的研究显示，单核苷酸多态性(SNP)rs12459419存在于约50％的AML群体中并导致CD33的外显子2的跳越缺失导致了CD33的V结构域的缺失(Lamba等人，2017年)。有趣的是，几种基于CD33抗体的疗法(包括唯一批准的用于AML的抗体Mylotarg)结合并识别CD33的V结构域。上述研究事实上显示，Mylotarg对表达SNP的患者无效，因此仅对约50％的AML群体有效(Lamba等人，2017年)。鉴于Mylotarg的数据，合理的是假设其他V结合CD33抗体也将仅对有限的AML患者池(具体地不具有SNP rs12459419突变的那些患者)有效。
实际上，当研究CD33临床领域时，另外的抗CD33抗体包括Amgen公司的AMG330和AMG673、Amphivena公司的AMV564、Immunogen公司的IMGN779、Boehringer Ingelheim公司的BI836858、Actinium Pharma公司的Actimab和Seattle Genetic公司的SGN33A。Amgen公司的AMG330是CD33×CD3 BiTE，并且据报道其“识别位于CD33的V-set结构域中具有核心序列IPYYDKN的线性表位”(Friedrich等人，2014年)。鉴于AMG673是CD33 BiTE的半衰期延长型式，据信其结合与BiTE相同的表位。Amphivena公司的AMV564是四价双特异性CD33/CD3抗体，并且根据US9803029，该抗体与CD33的V结构域结合。Immunogen公司的IMGN779是缀合至DNA烷基化剂的CD33抗体(My9-6)，并且根据US9359442专利中的图1，125I-标记的My9-6抗体和My9抗体竞争与CD33-阳性U-937细胞的结合。My9抗体与CD33的V结构域结合(Perez-Oliva等人，2011年)。证据一起表明，IMGN779与CD33的V结构域结合。BoehringerIngelheim公司的BI 836858是Fc工程化的抗CD33抗体，其介导NK细胞介导的ADCC并与CD33的V结构域结合(Vasu等人，2016年)。另外，Vasu等人以及Malik等人和Perez-Oliva等人一起示出了用于将利妥珠单抗(HuM195)映射至CD33的V结构域的证据(Malik等人，2015年；Perez-Oliva等人，2011年)。HuM195抗体目前处于临床试验中，其由Actinium pharma公司缀合至锕以制备Actimab。HuM195抗体也已由Seattle Genetics公司缀合至DNA结合剂以制备SGN33A；然而，由于毒性问题，该药物目前被搁置。因此，本领域已知的抗CD33抗体与CD33的V结构域结合。
鉴于这些数据，当涉及AML中基于CD33的抗体疗法时存在严重未满足的医疗需求，并且需要具有结合CD33的C2结构域的抗体用于治疗表达CD33的癌症。
发明内容
在一个总的方面，本发明涉及结合CD33的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合所述CD33的C2结构域。在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合所述CD33的V结构域。
在另一个总的方面，本发明涉及与CD33和CD3结合的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段结合所述CD33的C2结构域。在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段结合所述CD33的V区。
本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合所述CD33的C2结构域。在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；或者
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548。
所述抗体或其抗原结合片段可例如特异性与CD33结合，优选人CD33。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ IDNO:292、291、261、269、280、259、263、264、265、266、272、277、279、284或285有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:332、331、302、310、320、300、304、305、306、307、317、319、324或325有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；或
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段在体外以小于约2nM的EC50诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。所述抗体或其抗原结合片段可例如包含IgG1低岩藻糖主链。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以小于约5×10-9M的解离常数(KD)结合CD33。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合CD33并且以小于约2nM的EC50诱导内化。
在某些实施方案中，将所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段缀合至治疗剂。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的、部分人源化的或完全人源化的。
本文还提供了抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，包含抗CD33抗体或其抗原结合片段以及抗CD3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；或者
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548；
并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
1)分别为SEQ ID NO:342、343、344、465、466和467；或者
2)分别为SEQ ID NO:345、346、347、468、469和470。
在某些实施方案中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:292、291、261、269、280、259、263、264、265、266、272、277、279、284或285有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:332、331、302、310、320、300、304、305、306、307、317、319、324或325有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区；并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:257或258有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:298或299有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
z.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
aa.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
bb.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
cc.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；或
dd.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段在体外在表达CD33的细胞中以小于约1nM的EC50值诱导T细胞依赖性细胞毒性。
在某些实施方案中，抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段是嵌合的、部分人源化的或完全人源化的。
还提供了编码本发明的所述单克隆和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
还提供了包含编码本发明的所述单克隆和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的所述分离的核酸的载体。
还提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发明的所述单克隆和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的所述分离的核酸。
在某些实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的所述分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
还提供了在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的所述药物组合物。在某些实施方案中，所述癌症是血液学癌症。所述血液学癌症可例如选自但不限于白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，所述血液学癌症可以是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS，低风险或高风险)、急性淋巴细胞白血病(ALL，包括所有亚型)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
还提供了制备本发明的所述单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括在制备所述单克隆或双特异性抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆或双特异性抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物回收所述单克隆或双特异性抗体或抗原结合片段。
还提供了制备包含本发明的所述单克隆和/或双特异性抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法。所述方法包括将所述单克隆和/或双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1A至图1B示出了CD33×CD3 T-细胞介导的细胞毒性测定法。将使用抗CD3臂CD3B219的CD33×CD3双特异性抗体与人pan T细胞和CD33+AML细胞系一起温育。在37℃、5％的CO2下温育48小时之后，通过流式细胞术测量总肿瘤细胞的细胞毒性。图1A示出了通过OMNIRat鉴定的抗体候选，并且图1B示出了通过OMNIMouse鉴定的抗体候选。
图2A至图2B示出了使用抗CD3臂CD3B219和CD3B376的CD33×CD3双特异性抗体对新鲜AML患者全血中的母细胞的细胞毒性和T细胞活化进行的体外评估。图2A示出了使用CD33双特异性抗体或CD3×空白对照的AML细胞的总细胞毒性百分比。图2B示出了由CD33双特异性抗体或CD3×空白对照诱导的T细胞活化。未添加Fc阻断剂。
图3A至图3C示出了CD33×CD3 T-细胞介导的细胞毒性测定法。将使用抗CD3臂CD3B219和抗CD3B376的CD33×CD3双特异性抗体与人pan T细胞和对于CD33 SNPrs12459419突变是野生型(KG1，图3A)、杂合型(SH2，图3B)或纯合型(OCIAML3，图3C)的AML细胞系一起温育。在37℃、5％的CO2下温育48小时之后，通过流式细胞术测量总肿瘤细胞的细胞毒性。
图4A至图4B示出了与CD3B219或CD3B376配对的C33B904抗体对外源添加到正常健康人全血(N＝6个供体)的MOLM-13细胞的细胞毒性的体外评估：使用CD33×CD3双特异性抗体和相应空白×CD3对照在48小时后，MOLM-13细胞(图4A)和CD33+CD14+单核细胞(图4B)的细胞毒性百分比。
图5A至图5B示出了使用抗CD3臂CD3B219和CD3B376的CD33×CD3双特异性抗体对来自六个正常食蟹猕猴供体的新鲜全血中的单核细胞的细胞毒性和T细胞活化进行的体外评估。图5A示出了使用CD33双特异性抗体或其CD3×空白对照的CD33+CD14+食蟹猕猴单核细胞的总细胞毒性百分比。图5B示出了由CD33双特异性抗体或其CD3×空白对照诱导的T细胞活化。未添加Fc阻断剂。
图6示出了C3CB189在T细胞人源化NSG小鼠中的MOLM-13人AML异种移植物中的抗肿瘤功效。每周对弥散的MOLM-13肿瘤进行生物发光(BLI)成像两次，并且结果以平均光亮度(p/s/cm2/sr)±SEM(n＝8-10/组)表示。*处理与对照的p≤0.0001，通过双因素方差分析与Bonferroni检验进行计算。
图7示出了用C3CB189处理的动物在T细胞人源化NSG小鼠中的MOLM-13人AML异种移植物中的存活率。使用Kaplan-Meier曲线以图形表示携带MOLM-13的小鼠的存活率，并通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行评估。*处理与对照组的p≤0.0001。
图8示出了C3CB88在T细胞人源化NSG小鼠中的MOLM-13人AML异种移植物中的抗肿瘤功效。每周对弥散的MOLM-13肿瘤进行生物发光(BLI)成像两次，并且结果以平均光亮度(p/s/cm2/sr)±SEM(n＝8-10/组)表示。*处理与对照的p≤0.0001，通过双因素方差分析与Bonferroni检验进行计算。
图9示出了用C3CB88处理的动物在T细胞人源化NSG小鼠的MOLM-13人AML异种移植物中的存活率。使用Kaplan-Meier曲线以图形表示携带MOLM-13的小鼠的存活率，并通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行评估。*处理与对照组的p≤0.05。
图10示出了用于检测MOLM13细胞中的五种抗CD33抗体内化的体外蛋白质A药物缀合细胞活力测定。全部五种抗CD33抗体以剂量依赖性方式示出细胞毒性。
图11A至图11B示出了低岩藻糖IgG1抗CD33 mAb介导ADCC活性。响应于IgG1抗CD33mAb浓度的增加，人NK细胞针对MOLM-13(图11A)和MV4-11(图11B)靶细胞的ADCC。
图12示出了CD33阳性细胞系和CD33阴性细胞系用各种浓度的C3CB189染色4h以表征双特异性抗体的表面结合曲线。
图13示出了在T细胞重定向测定中用指定细胞系测试来自六个健康供体的T细胞，并且通过FACS测定细胞毒性百分比。绘制平均值±SD。
图14A和图14B。C3CB189与C2结构域结合并介导原代样本的细胞毒性，无论其SNP12459419基因型状态如何。图14A)在CD33+KG-1细胞系和CD33-KG1ΔCD33细胞系中使用CD33×CD3或CD123×CD3双特异性抗体进行的T细胞介导的细胞毒性和活化测定。图14B)将单独的T细胞与浓度渐增的C3CB189一起温育48小时，并通过流式细胞术测量T细胞活化。绘制平均值±SD。
图15A至图15C。图15A示出了显示从六个健康供体中读出的细胞毒性的EC20、EC50和EC90的中值。图15B类似于图13，但此处测量了T细胞活化。图15C类似于图15A，但此处示出了从六个健康供体读出的T细胞活化的中值EC20、EC50和EC90的值。
图16A至图16E：在体内C3CB189在两个已建立的鼠AML模型中介导强效的肿瘤活性。图16A示出了对携带已建立的KG-1肿瘤的T细胞人源化NSG小鼠腹膜内注射0.1mg/kg、0.5mg/kg和1mg/kg的C3CB189。每周测量两次肿瘤体积，并且结果表示为每组的平均肿瘤体积±SEM。图16B示出了对携带弥散的MOLM-13Luc细胞的T细胞人源化NSG小鼠腹膜内注射0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg的C3CB189。利用Kaplan Meier生存分析来确定生存率。图16C与图16B相同，但此处每周测量两次生物发光，并且示出第9天、第13天和第16天生物发光的活动物成像的代表性图像(n＝3-5只动物的腹视图和背视图)(由于死亡，对照组在第16天n＝3)。图16D类似于图16B，但此处小鼠以0.005mg/kg和0.05mg/kg施用C3CB189，共三剂。通过流式细胞术分析测量骨髓中的T细胞浸润，并且结果以肿瘤细胞百分比(上图)或CD3+T细胞百分比(下图)表示。图16E与图16D相同，但此处骨髓中的T细胞浸润通过IHC染色测量，并且结果以CD33+肿瘤细胞(上图)或CD8+T细胞(下图)表示。
图17示出了C3CB189在弥散的鼠AML模型中介导抗肿瘤应答。在第0天植入肿瘤细胞，在第5天植入T细胞，并且如X轴下方的柱所示进行给药。将组生物发光绘制为平均值±SEM。*表示在第13天用C3CB189处理与空白×CD3对照之间的显著差异(p≤0.05)(在第13天n＝9-10/组)。
图18A和图18B示出了C3CB189诱导的全血中CD33+细胞系的T细胞依赖性细胞毒性。图18A示出了在T细胞重定向测定中用指定细胞系测试来自十个健康供体(每个供体一个点)的T细胞。绘制平均值±SD。图18B与图18A相同，但此处示出了细胞毒性和T细胞活化EC20、EC50和EC90的值。ND表示无法确定，即，Prism要么提供近似值，要么曲线不明确。值是来自10个健康供体的中值。
图19A和图19B示出了C3CB189介导原代患者样本中AML母细胞的细胞毒性。图19A示出了48小时之后C3CB189介导的新鲜AML患者全血中CD33+母细胞的细胞毒性的体外评估。示出每个患者样本的各个EC50值。图19B与图19A相同，但此处测量了T细胞活化。
图20示出了CD33在食蟹猕猴免疫亚群中表达。将六名正常健康食蟹猕猴供体的全血用CD33的单克隆抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。绘制平均值±SD。
图21示出了C3CB189介导MOLM-13细胞、正常CD33+食蟹猕猴单核细胞和中性粒细胞的细胞毒性以及活化食蟹猕猴T细胞。在外源添加到正常健康食蟹猕猴全血(n＝6)中的AML细胞系MOLM-13细胞中C3CB189介导的细胞毒性的体外评估。示出了使用C3CB189和空白×CD3双特异性抗体的MOLM-13细胞的细胞毒性百分比、T细胞活化以及CD33+单核细胞和中性粒细胞的细胞毒性。绘制平均值±SEM。
图22A至图22D示出了C3CB189介导食蟹猕猴中CD33+白细胞的降低。用单次静脉注射对照(载体)、0.05mg/kg、0.2mg/kg或1mg/kg的C3CB189处理食蟹猕猴。图22A示出了C3CB189浓度随时间曲线的变化。图22B示出了外周血中的T细胞活化(CD8+中的％CD25+)。图22C示出了C3CB189对粒细胞(中性粒细胞)的影响。图22D示出了C3CB189对单核细胞的影响。
图23示出了给食蟹猕猴施用C3CB189后的细胞因子释放。单次静脉注射C3CB189后食蟹猕猴的平均(SD)细胞因子水平。(A)IFNγ、(B)IL-10、(C)IL-2、(D)IL-6、(E)MCP、(F)TNFα。将所有以下LLOQ值视为LLOQ的一半，以用于绘图和平均的计算目的。
图24A至图24C示出了C3CB189与C2结构域结合并介导原代样本的细胞毒性，无论其SNP 12459419基因型状态如何。图24A示出了对于V和C2结合剂mAb的CD33 ECD蛋白质的IgC和IgV结构域中的表位区的HDX作图和后续图解。V表位区以蓝色着色，并且C2表位区以红色着色。图24B示出了在27nM双特异性抗体浓度下进行新鲜AML患者全血中CD33+母细胞的细胞毒性的体外评估。绘制平均值±SD。图24C示出了在0.27nM双特异性抗体浓度下评估C3CB189介导的来自25个正常供体的冷冻纯化单核细胞的细胞毒性。绘制平均值±SD。
图25A至图25C示出了SNP rs12459419的基因分型结果。图25A示出了来自Taqman测定法的细胞系中SNP rs12459419的基因分型结果。图25B与图25A相同，但此处对原代患者样本进行了基因分型。图25C与图25A相同，但此处使用Taqman测定法以及Sanger测序对来自健康供体的冷冻单核细胞进行了基因分型。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更优选地包括人。
还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他***误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。
在两条或更多条核酸或多肽序列(例如，抗CD33抗体和编码其的多核苷酸、抗CD33抗CD3双特异性抗体和编码其的多核苷酸、CD33多肽和编码其的CD33多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当进行比较和比对以获得最大对应时，相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的。
对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法进行(Adv.Appl.Math.第2卷：第482页(1981年))，通过使用Needleman&Wunsch的同源比对算法进行(J.Mol.Biol.第48卷：第443页(1970年))，通过搜索Pearson&Lipman的相似性方法进行(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA第85卷：第2444页(1988年))，通过这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，在威斯康星州遗传学软件包，遗传学计算小组，威斯康辛州，麦迪逊，科学街区575号(575Science Dr.,Madison,WI)计算机化实施，或通过目测(大体参见CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，《实验室指南》，格林尼出版协会和约翰威利父子公司的合资企业(1995年增补版)(Ausubel))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人1990年的J.Mol.Biol.第215卷，第403至第410页和Altschul等人1997年的Nucleic Acids Res.第25卷：第3389-3402页。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字词比对时，该短字词匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻近字词分数阈值(Altschul等人，出处同上)。这些初始邻近字词命中充当用于发起搜索以找到包含它们的较长HSP的种子。然后将字词命中沿每个序列在两个方向上延伸，只要可增加累积的比对分数。
对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和N(错配残基的处罚分数；始终<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff的Proc.Natl.Acad.Sci.USA第89卷：第10915页(1989年))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul的Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA第90卷：第5873页至5787页(1993年))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。
两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是通过第一核酸编码的多肽与通过第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅通过保守置换而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交，如下所述。
抗体
本发明一般涉及分离的抗CD33抗体或其抗原结合片段、编码抗体的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含抗体的组合物。本发明另外涉及分离的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段、编码抗体的核酸和表达载体、含有载体的重组细胞以及包含双特异性抗体的组合物。还提供了制备这些抗体的方法，以及使用这些抗体治疗包括癌症的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于与CD33和/或CD3的高亲和力结合，与CD33和/或CD3的高特异性以及当单独施用或与其他抗癌疗法联合施用时治疗癌症或预防癌症的能力。
在一个总的方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33。在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合CD33的C2结构域。在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合CD33的V结构域。
如本文所用，术语“抗体”广义地使用，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆抗体片段。一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定域。根据具体实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定域之外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每个可变区包含三个域(即，互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCRD3，并且重链可变区另选地被称为HCDR1、HCRD2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CD33特异性地结合的分离的抗体基本上不含不与CD33结合的抗体)。另外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一组基本上均质的抗体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该组的各个抗体是相同的。本发明单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的B细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如像，双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab')。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，这种单链抗体包含通过约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，这种单域抗体包含重链可变区和重链恒定区或者仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段以及/或者包含至少一种人重链多肽和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指被修饰成提高与人抗体的序列同源性的非人抗体，使得抗体的抗原结合特性得以保留，但其在人体内的抗原性下降。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链两者的可变区经常对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区对应于来源于另一个哺乳动物物种(例如，人)的抗体中的序列，以便避免在那个物种中引出免疫反应。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于CD33上，并且第二表位位于CD3上。在一个实施方案中，第一表位位于CD33上，并且第二表位位于PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD3和/或其他肿瘤相关的免疫抑制因子或表面抗原上。
如本文所用，术语“CD33”是指67kD的单通跨膜糖蛋白，其是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)家族的成员。CD33也称为Siglec-3、gp67、或p67。CD33的结构由介导唾液酸结合的氨基末端V-set Ig样结构域(由CD33的外显子2编码)和其细胞外部分中的C2-set IG样结构域(由外显子4编码)组成(Laszlo等人，2016年)。CD33 RNA的另选剪接可导致在细胞表面表达的较短同种型，该较短同种型缺少V-set但保留C2-set Ig样结构域(Laszlo、Estey和Walter，2014年；Laszlo等人，2016年)。该剪接过程的生物相关性在很大程度上是未知的，直至最近的研究显示，单核苷酸多态性(SNP)rs12459419存在于约50％的AML群体中并导致CD33的外显子2的跳越缺失导致了CD33的V结构域的缺失(Lamba等人，2017年)。全长人CD33由Uniprot P20138(SEQ ID NO:1)提供。
如本文所用，“与CD33特异性地结合”的抗体是指以1×10-7M或更小、优选地1×10-8M或更小、更优选地5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与CD33结合、优选地与人CD33结合、优选地与CD33的C2结构域结合的抗体。术语“KD”是指从Kd对Ka的比(即Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)的解离常数。根据本公开，抗体的KD值可以使用本领域中的方法确定。例如，抗体的KD可通过使用表面等离振子共振，诸如通过使用生物传感器***(例如
Figure BDA0002795140310000231
***)，或者通过使用生物层干涉测量技术(诸如Octet RED96***)来确定。
抗体KD的值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
根据一个具体方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548；
p.分别为SEQ ID NO:351、352、353、474、475和476；
q.分别为SEQ ID NO:357、358、359、480、481和482；
r.分别为SEQ ID NO:372、373、374、495、496和497；
s.分别为SEQ ID NO:375、376、377、498、499和500；
t.分别为SEQ ID NO:381、382、383、504、505和506；
u.分别为SEQ ID NO:384、385、386、507、508和509；
v.分别为SEQ ID NO:390、391、392、510、511和512；
w.分别为SEQ ID NO:393、394、395、513、514和515；
x.分别为SEQ ID NO:396、397、398、516、517和518；
y.分别为SEQ ID NO:399、400、401、519、520和521；
z.分别为SEQ ID NO:405、406、407、525、526和527；
aa.分别为SEQ ID NO:414、415、416、534、535和536；
bb.分别为SEQ ID NO:417、418、419、537、538和539；
cc.分别为SEQ ID NO:420、421、422、540、541和542；
dd.分别为SEQ ID NO:429、430、431、549、550和551；
ee.分别为SEQ ID NO:432、433、434、552、553和554；
ff.分别为SEQ ID NO:435、436、437、555、556和557；
gg.分别为SEQ ID NO:438、439、440、558、559和560；
hh.分别为SEQ ID NO:441、442、443、561、562和563；
ii.分别为SEQ ID NO:450、451、452、570、571和572；
jj.分别为SEQ ID NO:453、454、455、573、574和575；
kk.分别为SEQ ID NO:456、457、458、576、577和578；
ll.分别为SEQ ID NO:459、460、461、579、580和581；
mm.分别为SEQ ID NO:378、379、380、582、583和584；
nn.分别为SEQ ID NO:414、415、416、585、586和587；或者
oo.分别为SEQ ID NO:429、430、431、480、481和482；
其中抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33，优选人CD33。
根据另一个具体方面，本发明涉及包含具有与SEQ ID NO:259-296中的一者有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:300-338中的一者有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。根据一个优选的实施方案，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别具有与SEQ ID NO:259-296中的一者有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:300-338中的一者有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。
根据另一个具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区；
z.具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区；
aa.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区；
bb.具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；
cc.具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区；
dd.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区；
ee.具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区；
ff.具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区；
gg.具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区；
hh.具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区；
ii.具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区；
jj.具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区；
kk.具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区；
ll.具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区；
mm.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区；
nn.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区；或
oo.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:259有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:300有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:351、352、353、474、475和476的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:260有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:301有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:261有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:302有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:357、358、359、480、481和482的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:262有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:303有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:263有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:304有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:264有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:305有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:265有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:306有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:266有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:307有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:372、373、374、495、496和497的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:267有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:308有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:375、376、377、498、499和500的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:268有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:309有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:269有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:310有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:381、382、383、504、505和506的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:270有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:311有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:384、385、386、507、508和509的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:271有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:312有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:272有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:307有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:390、391、392、510、511和512的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:273有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:313有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:393、394、395、513、54和515的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:274有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:314有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:396、397、398、516、517和518的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:275有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:315有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:399、400、401、519、520和521的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:276有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:316有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:277有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:317有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:405、406、407、525、526和527的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:278有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:318有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:279有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:319有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:280有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:320有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:320的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:414、415、416、534、535和536的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:281有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:321有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:417、418、419、537、538和539的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:282有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:322有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:420、421、422、540、541和542的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:283有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:323有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:284有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:324有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:285有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:325有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:429、430、431、549、550和551的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:286有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:326有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:432、433、434、552、553和554的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:287有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:327有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:435、436、437、555、556和557的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:288有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:328有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:438、439、440、558、559和560的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:289有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:329有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:441、442、443、561、562和563的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:290有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:330有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:291有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:331有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:292有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:332有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:450、451、452、570、571和572的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:293有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:333有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:453、454、455、573、574和575的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:294有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:334有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:456、457、458、576、577和578的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:295有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:335有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:459、460、461、579、580和581的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:296有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:336有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:378、379、380、582、583和584的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:269有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:337有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:414、415、416、585、586和587的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:281有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:338有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:429、430、431、480、481和482的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID NO:286有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:303有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区。
本文还提供了抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，包含抗CD33抗体或其抗原结合片段以及抗CD3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗CD33抗体或其抗原结合片段是本发明的抗CD33单克隆抗体或其抗原结合片段，并且抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，(1)分别为SEQ ID NO:342、343、344、465、466和467或(2)分别为SEQ ID NO:345、346、347、468、469和470。
术语“CD3”是指CD3蛋白质多亚基复合体。CD3也可称为“分化簇3”。CD3蛋白质多亚基复合体由六(6)条不同的多肽链组成，其包括CD3γ链(SwissProt P09693)(SEQ ID NO:588)、CD3δ链(SwissProt P04234)(SEQ ID NO:589)、两条CD3ε链(SwissProt P07766)(SEQID NO:590)和一条CD3链同源二聚体(SwissProt 20963)(SEQ ID NO:591)，其与T细胞受体α和β链相关联。CD3是同时用于激活细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和T辅助细胞(CD4+初始T细胞)的T细胞共受体。CD3多亚基复合体的CD3γ、CD3δ和CD3ε多肽链与T细胞受体(TCR)和CD3链相关联以在T淋巴细胞中产生激活信号，并且CD3和T细胞受体之间的相互作用构成TCR复合体。除非另有说明，否则术语“CD3”包括由细胞(包括T细胞)天然表达或者能够在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何CD3变体、同种型和物种同源物，优选地“CD3”是人CD3蛋白质多亚基复合体。
经由TCR/CD3复合体将T淋巴细胞重定向至表达CD33的癌症细胞代表了一种有吸引力的另选处理方法。T淋巴细胞的TCR/CD3复合体由在细胞表面共表达的TCRα/β或TCRγ/δ异二聚体与CD3标记的γ、δ、ε、ζ和η的不变亚基组成。人CD3ε以UniProt P07766描述(CD3E_HUMAN)。现有技术中所述的抗CD3ε抗体是SP34(Yang SJ，The Journal ofImmunology，(1986)137；1097-1100)，其与灵长类和人CD3两者反应并且可从Pharmingen公司商购获得。现有技术中所述的其他抗CD3抗体包括UCHT-1(参见WO2000041474)和BC-3(弗雷德哈钦森癌症研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Institute)；用于GvHD的I/II期试验，Anasetti等人，Transplantation，54:844(1992))。SP34与UCHT-1和BC-3的不同之处在于，SP-34识别仅存在于CD3的ε链上的表位(参见Salmeron等人，1991年，J.Immunol.，第147卷，第3047页)，而UCHT-1和BC-3识别由ε链和γ链二者贡献的表位。具有与SP34相同的序列的抗体序列至少在WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837和WO2010037838中有所描述。与SP34VH有96％同一性的抗体序列在US8236308(WO2007042261)中有所描述。
不同形式的双特异性抗体已有所描述，并且最近由Chames和Baty在Curr OpinDrug Disc Dev，2009年，第12卷，第276页中进行了综述。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体是通过受控Fab臂交换得到的双体抗体、交叉体或双特异性抗体，如本发明所述的那些。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括具有互补CH3结构域以强制发生异源二聚体化的IgG样分子；重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白或载体分子融合。
在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、纽扣结构(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)。
在一些实施方案中，重组IgG样双靶向分子包括双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)和CovX体(CovX/Pfizer)。
在一些实施方案中，IgG融合分子包括双重可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)以及TvAb(Roche)。
在一些实施方案中，Fc融合分子包括ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、双亲和性再靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)以及Dual(ScFv).sub.2-Fab(中国国家抗体医药研究中心(National Research Center forAntibodyMedicine--China))。
在一些实施方案中，Fab融合双特异性抗体包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性抗体(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv的、基于双体抗体的结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BiTE)(Micromet)、串联双体抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和性再靶向分子(DART)(MacroGenics)、单链双体抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向纳米抗体(Ablynx)、仅双重靶向重链结构域抗体。
本发明的全长双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位，即CD33上的表位和CD3上的表位。
如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
如本文所用，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“钮扣”技术(参见，例如PCT国际二聚抗体WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532中所述。在其它技术中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述。
除上述方法之外，本发明的双特异性抗体还可在体外无细胞环境中通过下列方式产生：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入不对称突变，并且在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而根据国际专利公布号W02011/131746所述的方法使得二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体(例如，抗CD33抗体)和第二单特异性二价抗体(例如，抗CD3抗体)改造为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最佳可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选为选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
在某些实施方案中，抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548；
p.分别为SEQ ID NO:357、358、359、480、481和482；
q.分别为SEQ ID NO:372、373、374、495、496和497；
r.分别为SEQ ID NO:375、376、377、498、499和500；
s.分别为SEQ ID NO:381、382、383、504、505和506；
t.分别为SEQ ID NO:384、385、386、507、508和509；
u.分别为SEQ ID NO:390、391、392、510、511和512；
v.分别为SEQ ID NO:393、394、395、513、514和515；
w.分别为SEQ ID NO:396、397、398、516、517和518；
x.分别为SEQ ID NO:399、400、401、519、520和521；
y.分别为SEQ ID NO:405、406、407、525、526和527；
z.分别为SEQ ID NO:414、415、416、534、535和536；
aa.分别为SEQ ID NO:417、418、419、537、538和539；
bb.分别为SEQ ID NO:420、421、422、540、541和542；
cc.分别为SEQ ID NO:429、430、431、549、550和551；
dd.分别为SEQ ID NO:432、433、434、552、553和554；
ee.分别为SEQ ID NO:435、436、437、555、556和557；
ff.分别为SEQ ID NO:438、439、440、558、559和560；
gg.分别为SEQ ID NO:441、442、443、561、562和563；
hh.分别为SEQ ID NO:450、451、452、570、571和572；
ii.分别为SEQ ID NO:453、454、455、573、574和575；
jj.分别为SEQ ID NO:456、457、458、576、577和578；
kk.分别为SEQ ID NO:459、460、461、579、580和581；
ll.分别为SEQ ID NO:378、379、380、582、583和584；
mm.分别为SEQ ID NO:414、415、416、585、586和587；或者
nn.分别为SEQ ID NO:429、430、431、480、481和482；
并且抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
1)分别为SEQ ID NO:342、343、344、465、466和467；或者
2)分别为SEQ ID NO:345、346、347、468、469和470。
在某些实施方案中，抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:259-296中的一者有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:300-338中的一者有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区；并且抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:257或258有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:298或299有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
z.具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
aa.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
bb.具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
cc.具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
dd.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
ee.具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
ff.具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
gg.具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
hh.具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
ii.具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
jj.具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
kk.具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
ll.具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
mm.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
nn.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
oo.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
pp.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
qq.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
rr.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ss.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
tt.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
uu.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
vv.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ww.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
xx.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
yy.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
zz.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
aaa.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
bbb.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ccc.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；或
ddd.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
eee.具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
fff.具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ggg.具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
hhh.具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
iii.具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
jjj.具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
kkk.具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
lll.具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
mmm.具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
nnn.具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ooo.具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ppp.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
qqq.具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
rrr.具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
sss.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ttt.具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
uuu.具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
vvv.具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
www.具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
xxx.具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
yyy.具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
zzz.具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
aaaa.具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
bbbb.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
cccc.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；或
dddd.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区。
根据另一个具体方面，本发明涉及诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的分离的抗CD33单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体或其抗原结合片段可例如在体外诱导ADCC。单克隆抗体或其抗原结合片段可以小于约2nM的EC50诱导ADCC。在某些实施方案中，EC50小于约2.0nM、小于约1.9nM、小于约1.8nM、小于约1.7nM、小于约1.6nM、小于约1.5nM、小于约1.4nM、小于约1.3nM、小于约1.2nM，小于约1.1nM、小于约1.0nM、小于约0.9nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM、小于约0.4nM、小于约0.3nM、小于约0.2nM或小于约0.1nM。在某些实施方案中，CD33单克隆抗体或其抗原结合片段包含IgG1低岩藻糖主链。
在本文所述的一些实施方案中，CD33特异性抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后致使靶细胞裂解。
单克隆抗体诱导ADCC的能力可通过改造其寡糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的Fc.γ.RIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用所报告的能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology，64:249-65，2012)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem，277:26733-26740，2002)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs，2(4)，2010；Epub ahead of print；PMID:20562582)，应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem，第278卷，第3466至第3473页，2003年)，引入特异性针对α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng，第88卷，第901页至第908页，2004年)，或共表达β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或有效的α-甘露糖苷酶I抑制剂、几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem，第281卷，第5032页至第5036页，2006年；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng，第93卷，第851页至第861页，2006年；Xhou等人，Biotechnol Bioeng，99:652-65，2008)。
在本文所述的一些实施方案中，也可通过抗体Fc中的某些置换来增强由CD33抗体引发的ADCC。示例性置换为例如在氨基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378或430(根据EU索引对残基进行编号)处的置换，如美国专利6,737,056中有所描述。
根据另一个具体方面，本发明涉及分离的抗CD33单克隆抗体或其抗原结合片段，其能够以小于约5×10-8M的解离常数(KD)结合CD33。在某些实施方案中，解离常数小于约5×10-8M、小于1×10-8M、小于5×10-9M、小于1×10-9M、小于5×10-10M、小于1×10-10M、小于5×10-11M或小于1×10-11M。
根据另一个具体方面，本发明涉及分离的抗CD33单克隆抗体或其抗原结合片段，其能够以小于约2nM的EC50结合CD33并诱导CD33的内化。在某些实施方案中，EC50小于约2.0nM、小于约1.9nM、小于约1.8nM、小于约1.7nM、小于约1.6nM、小于约1.5nM、小于约1.4nM、小于约1.3nM、小于约1.2nM，小于约1.1nM、小于约1.0nM、小于约0.9nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM、小于约0.4nM、小于约0.3nM、小于约0.2nM以及小于约0.1nM。
根据另一个具体方面，本发明涉及分离的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其能够在表达CD33的细胞中诱导T细胞依赖性细胞毒性。双特异性抗体或其抗原结合片段可例如在体外在表达CD33的细胞中以小于约2nM的EC50值诱导T细胞依赖性细胞毒性。在某些实施方案中，EC50小于约2.0nM、小于约1.9nM、小于约1.8nM、小于约1.7nM、小于约1.6nM、小于约1.5nM、小于约1.4nM、小于约1.3nM、小于约1.2nM，小于约1.1nM、小于约1.0nM、小于约0.9nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM、小于约0.4nM、小于约0.3nM、小于约0.2nM以及小于约0.1nM。
根据另一个具体方面，本发明涉及分离的抗CD33单克隆抗体和/或分离的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中抗CD33单克隆抗体或抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
根据另一个具体方面，本发明涉及分离的抗CD33单克隆抗体和/或分离的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中抗CD33单克隆抗体或抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。
在另一个总的方面，本发明涉及编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。在另一个总的方面，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域的技术人员将理解，可以改变(例如置换、缺失、***等)蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可变更编码本发明的单克隆抗体和/或双特异性抗体的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。
在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。根据本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可用于根据本发明的实施方案生成重组表达载体。根据本公开，此类技术是本领域技术人员所熟知的。
在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的单克隆抗体和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的宿主细胞。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体实施方案，通过常规方法诸如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其中将该重组表达载体稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸有效表达。
在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码单克隆抗体或其抗原结合片段的苷酸的细胞，以及从该细胞或细胞培养物(例如，从上清液)回收该抗体或其抗原结合片段。在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码双特异性抗体或其抗原结合片段的苷酸的细胞，以及从该细胞或细胞培养物(例如，从上清液)回收该抗体或其抗原结合片段。可从细胞收获表达的抗体或其抗原结合片段并且根据本领域已知以及如本文所述的常规技术进行纯化。
药物组合物
在另一个总的方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个总的方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药物组合物”意指包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的产品。本发明的抗体和包含其的组合物也可用于制造本文提及的治疗应用的药物。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂中的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据具体实施方案，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
药物活性成分与药学上可接受的载体的制剂为本领域中已知的，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)以及任何后续版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％w/w、70％w/w、75％w/w、80％w/w、85％w/w、90％w/w或至少95％w/w的水。
在一个实施方案中，可将药物组合物配制为可注射的，其可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射。注射可例如皮下、肌内、腹膜内、玻璃体腔内或静脉内递送。
在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，诸如压片和/或包衣片，以及胶囊剂(例如硬明胶胶囊或软明胶胶囊)。药物组合物也可为例如用于重构的小药囊、糖衣丸、粉末、颗粒剂、锭剂或粉末的形式。
剂型可以是速释型，在这种情况下它们可包含水可溶或水可分散的载体，或者它们可被延迟释放、缓释或改变释放，在这种情况下它们可包含在胃肠道中或在皮下调节剂型的溶解速率的水不溶的聚合物。
在其他实施方案中，药物组合物可在鼻内、颊内或舌下递送。
水性制剂中的pH可介于pH 3和pH 10之间。在本发明的一个实施方案中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约3.0至约7.0。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性示例包括：精氨酸、天冬氨酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三嗪和三(羟甲基)氨基甲烷、以及它们的混合物。缓冲剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含防腐剂。缓冲剂的非限制性示例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苄醇、溴代硝基丙二醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己啶、氯苯甘油醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞以及它们的混合物。防腐剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含等渗剂。该实施方案的非限制性示例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(诸如甘油、1,2-丙二醇、丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)以及它们的混合物。等渗剂的另一个示例包括糖。糖的非限制性示例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个示例是糖醇，其中术语“糖醇”被定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性示例包括甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和***糖醇。包含本段中列出的每种等渗剂的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。等渗剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性示例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐、以及它们的混合物。螯合剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性示例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂为羧基-/羟基纤维素及其衍生物(诸如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲基硫基乙醇、聚乙二醇(诸如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、盐(诸如氯化钠)、含硫的物质，诸如硫代甘油或巯基乙酸。稳定剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指任何由水溶性部分(亲水性)和脂溶性和部分(亲脂性)组成的分子或离子。例如，表面活性剂选自：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如例如EDTA和/或苯甲脒盐酸盐(HCl)。蛋白酶抑制剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在另一个总的方面，本发明涉及产生包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。在另一个总的方面，本发明涉及产生包含本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括将双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。
使用方法
在另一个总的方面，本发明涉及在受试者的癌细胞表面上靶向CD33的方法，该方法包括向受试者施用特异性地结合CD33的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、或抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物。
本文还设想了一种治疗性抗CD33抗体免疫缀合物，包含选自放射性核素、硼、钆或铀原子，免疫调节剂诸如细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素诸如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子诸如白介素(IL)、集落刺激因子(CSF)诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(IFN)诸如干扰素-α、-β或-γ和干细胞生长因子诸如命名为“S1因子”、造血因子、***、促血小板生成素、抗体、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、光敏治疗剂，细胞毒性药物诸如抗有丝***剂、烷基化剂、抗代谢物、血管生成抑制剂、凋亡剂、生物碱剂、COX-2抑制剂和抗生素，细胞毒素诸如植物毒素、微生物毒素和动物毒素及其合成变体、血管生成抑制剂、不同抗体以及它们的组合的治疗剂。在一个优选的实施方案中，细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α以及它们的组合，放射性核素选自Auger发射器、β-发射器和α-发射器，诸如P-32、P-33、Sc-47、Fe-59、Cu-64、Cu-67、Se-75、As-77、Sr-89、Y-90、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Ag-111、I-125、I-131、Pr-142、Pr-143、Pm-149、Sm-153、Tb-161、Ho-166、Er-169、Lu-177、Re-186、Re-188、Re-189、Ir-194、Au-198、Au-199、Pb-211、Pb-212和Bi-213、Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m、Ir-192、Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Fm-255、B-10、Gd-157、U-235以及它们的组合。优选地，放射性核素的能量介于20keV和10,000keV之间。
结合CD33的抗体及其抗原结合片段的功能活性可通过本领域已知及如本文所述的方法进行表征。用于表征结合CD33的抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于亲和力和特异性测定，包括Biacore、ELISA和OctetRed分析；通过FACS检测抗体与癌细胞上的CD33结合的结合测定。根据具体的实施方案，用于表征结合CD33的抗体及其抗原结合片段的方法包括以下所述的那些。
在另一个总体方面，本发明涉及治疗对有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用特异性地结合CD33或本发明的药物组合物的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。癌症可以是例如表达CD33的癌症。癌症可例如选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***、头颈癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。癌症可以是例如血液学癌症。血液学癌症可以是例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。。在某些实施方案中，所述血液学癌症可以是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS，低风险或高风险)、急性淋巴细胞白血病(ALL，包括所有亚型)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
根据本发明的实施方案，药物组合物包含治疗有效量的抗CD33抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受治疗者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。
如本文所用，提及到抗CD33抗体或其抗原结合片段，治疗有效量意指在对其有需要的受试者中调节免疫应答的抗CD33抗体或其抗原结合片段的量。
根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状消退；(v)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如欲被治疗的疾病、障碍或病症、施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人或动物、施用的其他药物，以及是否为预防性或治疗性治疗。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受治疗者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。
如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与癌症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受治疗者中可识别的，但能够在受治疗者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。
根据具体实施方案，提供了用于治疗癌症的组合物。对于癌症治疗，组合物可与另一种治疗联合使用，包括但不限于化学疗法、抗CD20mAb、抗TIM-3mAb、抗-CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1疗法、其他免疫肿瘤学药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物缀合物(ADC)、靶向疗法或其他抗癌药物。
如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。
实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
实施方案1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33的C2结构域。
实施方案2是根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；或者
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548；
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33，优选人CD33。
实施方案3是根据实施方案1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:292、291、261、269、280、259、263、264、265、266、272、277、279、284或285有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:332、331、302、310、320、300、304、305、306、307、317、319、324或325有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；或
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区。
实施方案5是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:357、358、359、480、481和482；
b.分别为SEQ ID NO:372、373、374、495、496和497；
c.分别为SEQ ID NO:375、376、377、498、499和500；
d.分别为SEQ ID NO:381、382、383、504、505和506；
e.分别为SEQ ID NO:384、385、386、507、508和509；
f.分别为SEQ ID NO:390、391、392、510、511和512；
g.分别为SEQ ID NO:393、394、395、513、514和515；
h.分别为SEQ ID NO:396、397、398、516、517和518；
i.分别为SEQ ID NO:399、400、401、519、520和521；
j.分别为SEQ ID NO:405、406、407、525、526和527；
k.分别为SEQ ID NO:414、415、416、534、535和536；
l.分别为SEQ ID NO:417、418、419、537、538和539；
m.分别为SEQ ID NO:420、421、422、540、541和542；
n.分别为SEQ ID NO:429、430、431、549、550和551；
o.分别为SEQ ID NO:432、433、434、552、553和554；
p.分别为SEQ ID NO:435、436、437、555、556和557；
q.分别为SEQ ID NO:438、439、440、558、559和560；
r.分别为SEQ ID NO:441、442、443、561、562和563；
s.分别为SEQ ID NO:450、451、452、570、571和572；
t.分别为SEQ ID NO:453、454、455、573、574和575；
u.分别为SEQ ID NO:456、457、458、576、577和578；
v.分别为SEQ ID NO:459、460、461、579、580和581；
w.分别为SEQ ID NO:378、379、380、582、583和584；
x.分别为SEQ ID NO:414、415、416、585、586和587；或者
y.分别为SEQ ID NO:429、430、431、480、481和482；
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33，优选人CD33。
实施方案6是根据实施方案5所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:260、262、267、268、270、271、273、274、275、276、278、281、282、283、286、287、288、289、290、293、294、295或296中的一者有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:301、303、308、309、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、326、327、328、329、330、333、334、335、336、337或338中的一者有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
实施方案7是根据实施方案5或6所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区；或
z.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区。
实施方案8是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段在体外以小于约2nM的EC50诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
实施方案9是根据实施方案8所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含IgG1低岩藻糖主链。
实施方案10是根据实施方案1至7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段以小于约5×10-9M的解离常数(KD)结合CD33。
实施方案11是根据实施方案1至7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合CD33并且以小于约2nM的EC50诱导内化。
实施方案12是根据实施方案1至11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段抑制CD33的活性。
实施方案13是根据实施方案1至12中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
实施方案14是根据实施方案1至13中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。
实施方案15是根据实施方案1至13中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中将所述抗体或其抗原结合片段缀合至治疗剂。
实施方案16是一种分离的核酸，编码根据实施方案1至14中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
实施方案17是一种载体，包含根据实施方案16所述的分离的核酸。
实施方案18是一种宿主细胞，包含根据实施方案17所述的载体。
实施方案19是一种药物组合物，包含根据实施方案1至14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
实施方案20是一种在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用根据实施方案19所述的药物组合物。
实施方案21是根据实施方案20所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
实施方案22是根据实施方案21所述的方法，其中所述血液学癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
实施方案23是根据实施方案22所述的方法，其中所述血液学癌症是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
实施方案24是一种产生根据实施方案1至14中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生所述单克隆抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物回收所述抗体或抗原结合片段。
实施方案25是一种产生包含根据实施方案1至14中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
实施方案26是一种抗CD33/抗CD3双特异性抗体，包含抗CD33抗体或其抗原结合片段以及抗CD3抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；或者
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548；
并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
1)分别为SEQ ID NO:342、343、344、465、466和467；或者
2)分别为SEQ ID NO:345、346、347、468、469和470。
实施方案27是根据实施方案25所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:292、291、261、269、280、259、263、264、265、266、272、277、279、284或285有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:332、331、302、310、320、300、304、305、306、307、317、319、324或325有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区；并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:257或258有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQID NO:298或299有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
实施方案28是根据实施方案25或26所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
z.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
aa.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
bb.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
cc.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；或
dd.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区。
实施方案29是根据实施方案26至28中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段特异性地结合所述CD33的C2结构域。
实施方案30是一种抗CD33/抗CD3双特异性抗体，包含抗CD33抗体或其抗原结合片段以及抗CD3抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:357、358、359、480、481和482；
b.分别为SEQ ID NO:372、373、374、495、496和497；
c.分别为SEQ ID NO:375、376、377、498、499和500；
d.分别为SEQ ID NO:381、382、383、504、505和506；
e.分别为SEQ ID NO:384、385、386、507、508和509；
f.分别为SEQ ID NO:390、391、392、510、511和512；
g.分别为SEQ ID NO:393、394、395、513、514和515；
h.分别为SEQ ID NO:396、397、398、516、517和518；
i.分别为SEQ ID NO:399、400、401、519、520和521；
j.分别为SEQ ID NO:405、406、407、525、526和527；
k.分别为SEQ ID NO:414、415、416、534、535和536；
l.分别为SEQ ID NO:417、418、419、537、538和539；
m.分别为SEQ ID NO:420、421、422、540、541和542；
n.分别为SEQ ID NO:429、430、431、549、550和551；
o.分别为SEQ ID NO:432、433、434、552、553和554；
p.分别为SEQ ID NO:435、436、437、555、556和557；
q.分别为SEQ ID NO:438、439、440、558、559和560；
r.分别为SEQ ID NO:441、442、443、561、562和563；
s.分别为SEQ ID NO:450、451、452、570、571和572；
t.分别为SEQ ID NO:453、454、455、573、574和575；
u.分别为SEQ ID NO:456、457、458、576、577和578；
v.分别为SEQ ID NO:459、460、461、579、580和581；
w.分别为SEQ ID NO:378、379、380、582、583和584；
x.分别为SEQ ID NO:414、415、416、585、586和587；或者
y.分别为SEQ ID NO:429、430、431、480、481和482；
并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
1)分别为SEQ ID NO:342、343、344、465、466和467；或者
2)分别为SEQ ID NO:345、346、347、468、469和470。
实施方案31是根据实施方案29所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:260、262、267、268、270、271、273、274、275、276、278、281、282、283、286、287、288、289、290、293、294、295或296中的一者有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:301、303、308、309、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、326、327、328、329、330、333、334、335、336、337或338中的一者有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区；并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:257或258有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:298或299有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
实施方案32是根据实施方案29或30所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
z.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
aa.具有SEQ ID NO:260的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:301的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
bb.具有SEQ ID NO:262的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
cc.具有SEQ ID NO:267的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:308的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
dd.具有SEQ ID NO:268的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:309的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ee.具有SEQ ID NO:270的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:311的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ff.具有SEQ ID NO:271的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:312的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
gg.具有SEQ ID NO:273的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:313的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
hh.具有SEQ ID NO:274的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:314的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ii.具有SEQ ID NO:275的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:315的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
jj.具有SEQ ID NO:276的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:316的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
kk.具有SEQ ID NO:278的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:318的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ll.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:321的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
mm.具有SEQ ID NO:282的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
nn.具有SEQ ID NO:283的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:323的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
oo.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:326的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
pp.具有SEQ ID NO:287的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:327的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
qq.具有SEQ ID NO:288的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:328的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
rr.具有SEQ ID NO:289的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:329的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ss.具有SEQ ID NO:290的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:330的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
tt.具有SEQ ID NO:293的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:333的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
uu.具有SEQ ID NO:294的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:334的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
vv.具有SEQ ID NO:295的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:335的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
ww.具有SEQ ID NO:296的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:336的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
xx.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:337的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
yy.具有SEQ ID NO:281的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:338的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；或
zz.具有SEQ ID NO:286的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:303的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区。
实施方案33是根据实施方案26至32中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段在体外在表达CD33的细胞中以小于约1nM的EC50值诱导T细胞依赖性细胞毒性。
实施方案34是根据实施方案26至33中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
实施方案35是根据实施方案26至34中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。
实施方案36是一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据实施方案26至35中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段。
实施方案37是一种载体，包含根据实施方案36所述的分离的核酸。
实施方案38是一种宿主细胞，包含根据实施方案37所述的载体。
实施方案39是一种药物组合物，包含根据实施方案26至35中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
实施方案40是一种在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用根据实施方案39所述的药物组合物。
实施方案41是根据实施方案40所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
实施方案42是根据实施方案41所述的方法，其中所述血液学癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
实施方案43是根据实施方案42所述的方法，其中所述血液学癌症是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
实施方案44是一种产生根据实施方案26至35中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物回收所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段。
实施方案45是一种产生包含根据实施方案26至35中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
实施例
试剂
抗原生成
在具有或不具有突变的单体形式的人血清白蛋白(HSA)(具有C58S突变的UniprotP02768)的情况下产生人和食蟹猕猴CD33蛋白，在C-末端融合以用于免疫和测定。合成具有六个组氨酸标签的编码CD33蛋白质抗原的cDNA并使用标准分子生物学技术将其克隆到肌动蛋白启动子下的哺乳动物分泌表达载体中。
将来源于Uniprot P20138(SEQ ID NO:1)的全长人CD33胞外域(ECD)(人CD33ECD)在N末端与信号序列融合，并且具有或不具有HSA，随后在C末端与六个组氨酸标签融合，hCD33 ECD仅具有HSA并且仅具有hCD33 ECD。根据制造商规程使用Expifectamine将人CD33 ECD表达构建体瞬时转染到HEK293衍生细胞Expi293(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Gibco/Thermo Fisher Scientific公司(Gibco/Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA))中。在收获之前，将细胞在37℃下在轨道式摇动器上与8％的CO2温育5天。通过离心移除所表达的细胞，并且使用固定化的金属亲和色谱法(使用Ni Sepharose 6 Fast Flow树脂(英国Little Chalfont的通用电气医疗集团(GE Healthcare；Little Chalfont,UnitedKingdom))，然后在Dubelcco的磷酸盐盐水缓冲液pH 7.2(1×DPBS)中进行Superdex 200制备尺寸排阻色谱法(SEC)(通用电气医疗集团(GE Healthcare))，从培养基中纯化可溶性CD33。将排除任何二硫化物聚集体的SEC洗脱级分合并并无菌过滤以产生用于免疫和CD33测定的最终蛋白质。通过A280测定蛋白质浓度，并且通过SDS-PAGE和分析型SEC(美国加利福尼亚州托伦斯的Phenomenex公司(Phenomenex；Torrance,CA))评估纯化蛋白质的质量。内毒素的测量是使用EndoSafe-PTS色谱柱进行的，一种发色的LAL测定(美国马萨诸塞州威尔明顿Charles River公司(Charles River；Wilmington,MA))。
类似地将人CD33 ECD亚结构域蛋白质、hCD33 V结构域-HSA、hCD33 V结构域-his、hCD33 C2结构域-HSA和hCD33 C2结构域-His构建、表达和纯化为全长人CD33 ECD。
基于Genbank序列XP_005590138.1，还产生了用于免疫和交叉选择性测定的食蟹猕猴CD33构建体食蟹猕猴CD33 ECD-HSA、食蟹猕猴CD33-His。食蟹猕猴CD33蛋白质的表达和纯化与人CD33蛋白质相同。
根据制造商的条件，使用SureLink Chromagenic Biotin Labeling试剂盒(SeraCare KPL公司)将用于筛选的CD33抗原在50mM磷酸钠(pH 7.2)中生物素酰化。简而言之，以生物素与蛋白质的4:1摩尔比将25mM的生物素原液添加到CD33蛋白质中，并且在室温下轻轻旋转温育30分钟，然后切换到4℃再持续2小时。通过将缓冲液交换到1×DPBS中来移除未掺入的生物素。通过使用NanoDrop在A280nm和A354nm下测量来测定蛋白质浓度和生物素掺入。上述抗原中的每一者的序列参见表1。
表1：抗原序列
蛋白质名称 蛋白ID SEQ ID NO
食蟹猕猴CD33 ECD-HSA C33W1 2
人CD33 ECD-HSA C33W2 3
人CD33-V-HSA C33W3 4
人CD33-C2-HSA C33W4 5
人CD33-V-His C33W8 6
人CD33 C2-His C33W9 7
人CD33 ECD-His C33W49 8
食蟹猕猴CD33 ECD-His C33W50 9
人CD33全长 10
食蟹猕猴CD33全长 11
表达CD33同基因细胞系的生成
使用包含全长人CD33或食蟹猕猴CD33和嘌呤霉素的慢病毒(美国马里兰州罗克维尔Genecopoeia公司(Genecopoeia；Rockville,MD))产生表达人和食蟹猕猴CD33的细胞系以用于选择CD33阳性细胞。用慢病毒颗粒转导对CD33呈阴性的HEK293F细胞(ATCC)以过表达人CD33和食蟹猕猴CD33。在转导后，通过处理合并的细胞选择阳性表达CD33和抗性标志物的细胞，使其在DMEM+10％的HI FBS(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的美国生命科技公司)中生长并补充不同浓度的嘌呤霉素(美国生命科技公司)。
除了HEK产生的细胞系之外，还使用了几个商业细胞系进行结合和细胞毒性测定。这些包括MOLM13、KG1、SH2、OCIAML3和MV411，并且可购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)或德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikrooranismen und Zellkulturen)，并且在37℃、5％的CO2下在具有10％的FBS的完全RPMI培养基中培养。
实施例1：免疫活动
OmniRat
人免疫球蛋白转基因大鼠品系(
Figure BDA0002795140310000921
Ligand Pharmaceuticals；SanDiego,CA)用于培养表达人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞。
Figure BDA0002795140310000922
含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VH，全部的人D和JH片段以天然构型连接至大鼠CH基因座)连同完整人IgL基因座(连接至Jκ-Cκ的12个Vκ和连接至Jλ-Cλ的16个Vλ)。(参见例如，Osborn等人，2013年，J Immunol，第190卷，第4期，第1481-1490页)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生具有全人类可变区的高亲和力嵌合的人/鼠IgG单克隆抗体。授予Bruggemann等人的PCT公布WO 2014/093908中描述了
Figure BDA0002795140310000931
的制备和用途以及由此类大鼠携带的基因组修饰。
当用重组人和食蟹猕猴CD33(分别为人CD33 ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA)免疫时，该转基因大鼠产生针对人CD33的嵌合人-大鼠IgG抗体，其中一些也与食蟹猕猴CD33结合。
用人CD33 ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA交替免疫八只OmniRats。在46天免疫方案后，从所有八只OmniRats收获***并用于产生杂交瘤。使用标准技术经由结合ELISA和AlphaLISA筛选八十一个96孔杂交瘤上清液板，其中选择128个杂交瘤上清液用于与人CD33 ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA特异性地结合。128个上清液中的大多数也对过表达人CD33或食蟹猕猴CD33的细胞的结合是阳性的。
仅用rhuCD33免疫六只另外的OmniRats。在31天免疫方案后，从所有六只OmniRats收获***并用于产生杂交瘤。使用标准技术经由结合ELISA筛选三十个96孔杂交瘤上清液板，其中选择94个杂交瘤上清液用于与人CD33 ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA特异性地结合。从阳性克隆制备杂交瘤裂解物并进行到下述v区克隆。
OmniMouse
人免疫球蛋白转基因小鼠品系(
Figure BDA0002795140310000932
Ligand Pharmaceuticals公司)用于培养表达人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞。
Figure BDA0002795140310000933
包含嵌合人/大鼠IgH基因座以及完全人IgL基因座。小鼠表现出小鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生具有全人类可变区的高亲和力嵌合的人/鼠IgG单克隆抗体。
当用重组人和食蟹猕猴CD33(分别为人CD33 ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HAS)免疫时，该转基因小鼠产生针对人CD33的嵌合人-大鼠IgG抗体，其中一些也与食蟹猕猴CD33结合。
用人CD33 ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA交替免疫四只OmniMice。在53天免疫方案后，从所有四只OmniMice收获脾脏和***并用于产生杂交瘤。经由结合ELISA和AlphaLISA筛选四十八个96孔杂交瘤上清液板，其中选择8个杂交瘤上清液用于与人CD33ECD-HSA和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA特异性地结合。从阳性克隆制备杂交瘤裂解物并进行到下述v区克隆。
V区克隆
根据制造商规程使用RNeasy 96试剂盒(德国希尔登Qiagen公司(Qiagen；Hilden,Germany))纯化杂交瘤细胞裂解物中的总RNA，并且使用Drop Sense定量所得RNA并保存于-80℃或使用用于RT-PCR的Invitrogen SuperScript III First-Strand SynthesisSystem(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen公司(Invitrogen；Carlsbad,CA))合成cDNA。使用分别退火至重链、k链和λ链恒定区的基因特异性引物进行第一链cDNA合成。RT-PCR反应混合物由至多3gμ纯化的RNA、基因特异性引物、dNTP混合物、反应缓冲液、25mM的MgCl2、DTT、RNaseOUTTM(40U/μl，Invitrogen公司)和SuperScriptTM III RT(200U/μl，Invitrogen目录号18080-051)组成，并在50℃下温育50分钟并在85℃下温育5分钟。将所得单链cDNA保存在-20℃下，或者对单链DNA进行PCR扩增。使用Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen公司)进行PCR反应。使用优化的PCR条件，通过分别退火至先导序列和重链、k链和λ链恒定区的正向引物和反向引物来扩增v区片段。将所得的PCR片段在凝胶上运行并使用预先设计的引物在GENEWIZ上测序以获得V区序列。收集V区序列的所得.abi文件，并通过Janssen Biologics Discovery创建的Sanger V区序列分析程序进行分析。将回收的V区的AA序列记录在内部数据库中，优化密码子并克隆到携带所需人抗体同种型IgG1 F405L和IgG4 PAA的适当恒定区的基于pUnder的表达载体中。成功克隆了总共76种OMNIRat抗体和8种OMNIMouse抗体，并继续进一步表征。下表汇总了来自OMNIRat活动中鉴定的前42条序列(参见表2)和来自OMNIMouse活动中鉴定的前16条序列(参见表3)，其中将几种OMNIRat抗体克隆到IgG1以及IgG4 PAA中，全部来自OMNIMouse活动的抗体都克隆到IgG1和IgG4 PAA两者中。
表2：在OMNIRat中经由CD33免疫鉴定的抗体序列
Figure BDA0002795140310000951
Figure BDA0002795140310000961
HC：重链；LC：轻链
表3：在OMNIMouse中经由CD33免疫鉴定的抗体序列
Figure BDA0002795140310000962
HC：重链；LC：轻链
Expi293小规模转染和纯化
经由小2ml规模表达和纯化在免疫活动和后续v区克隆(到IgG1 F405L和IgG4PAA)中鉴定的抗体。将Expi293TM细胞(来自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))以1.25×105至2.25×105个活细胞/mL的密度接种到Expi293TM ExpressionMedium中，并在37℃、7％的CO2摇动培养箱(INFORS HT Multitron Pro)中的聚碳酸酯、一次性、无菌、通风、无挡板的锥形摇动烧瓶中培养。对于125mL至2L摇瓶中的常规细胞生长，对于具有19mm摇动直径的摇动器，将摇动速度设定为130rpm。当密度达到具有98％至99％活力的3×610至5×106个活细胞/mL的对数生长期时，对细胞进行继代培养。
在转染当天，测定活细胞密度和活力百分比。以3×106个活细胞/mL的密度转染细胞。为了最佳转染，使用TE缓冲液(10mM的Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中0.1mg/mL浓度的无菌重链和轻链质粒DNA。
根据制造商的转染方案(赛默飞世尔公布号MAN0007814)转染Expi293TM细胞。在24孔深孔板(通用电气医疗集团(GE Healthcare))中进行转染。简而言之，用0.1mL的OptiMEMTM培养基(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以下列比率稀释质粒DNA：0.250μg重链DNA:0.750μg轻链DNA:0.5μg pAdvantage。稀释5μL的ExpiFectamineTM293转染试剂，并且将其与95μL的OptiMEMTM培养基轻轻混合并温育1分钟。将所稀释的ExpiFectamineTM 293试剂添加到所稀释的DNA中，轻轻混合，并将ExpiFectamineTM 293/质粒DNA复合物在室温下温育40分钟。在温育后，将1.8mL的Expi293TM细胞添加到复合物中，在37℃、7％的CO2摇动培养箱中温育过夜。
在转染后第1天，添加10μL的ExpiFectamineTM 293增强剂1和100Lμ的Expifectamine 293TM增强剂2，并且将板放回培养箱中再温育5天。在转染后第6天通过以850×G离心15分钟来收获培养物，然后进行纯化。
将上文制备的1.7ml的澄清表达上清液转移到新的962ml的深孔板。通过将800μl的mAb Select Sure树脂(通用电气医疗集团(GE Healthcare))和DPBS-/-浆液的1:4混合物移到96孔Acroprep Advance 1μM玻璃滤板(颇尔公司(Pall))的每个孔中来制备纯化板。向该板施加200mbar的真空压力以去除过量的PBS，随后用800μl的新鲜PBS洗涤。施加200mbar的真空压力以去除洗涤缓冲液。然后将澄清的上清液转移到PBS洗涤过的树脂，轻轻混合并温育15分钟。在温育后，施加200mbar的真空压力以去除上清液。用PBS将mAbSelect Sure树脂洗涤三次，并用25mM的乙酸钠(pH 5)(美国加利福尼亚州霍利斯特的天惠华公司(TEKNOVA；Hollister,CA))洗涤一次，在洗涤之间施加200mbar的真空压力以去除过量的缓冲液。使用0.1M的乙酸钠(pH 3.5)洗脱与树脂结合的mAb，并温育10分钟以进行有效解离。将滤板置于96深孔板的顶部，并且经由在1000g下离心2分钟将所洗脱的mAb收集在底板中。添加80μl的2.5M的Tris-乙酸盐(pH 7.2)以中和mAb。将mAb在96孔DispoDIALYZER板(美国马萨诸塞州霍利斯顿的哈佛仪器公司(Harvard Apparatus；Holliston,MA))中渗入PBS中过夜，转移至96孔Acroprep Advance 0.2μm Supor滤板(美国纽约州华盛顿港的颇尔公司(Pall；Port Washington,NY))中，置于96深孔板的顶部，并经由台式离心机以1,500g离心15分钟过滤蛋白质溶液。使用DropSense Instrument(Trinean公司)通过在滤液上进行A280测量来确定蛋白质浓度。
实施例2：抗CD33 mAb的特征
经由免疫鉴定、克隆的v区并随后表达和纯化的OMNIRat抗体进一步表征与表达CD33的细胞结合以及与重组抗原结合。评估所纯化的抗体与稳定转染的表达人CD33或食蟹猕猴CD33(上述产生)的HEK293F细胞以及作为阴性对照的亲本HEK293F的结合。使用非酶解离缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific))从组织培养瓶收获细胞。将该瓶用PBS冲洗两次，并将解离缓冲液添加到该瓶中，并将该瓶在37℃下温育10分钟，直到细胞变为非粘连的。将细胞以300g离心5分钟，然后以1.0×106细胞/ml重悬在染色缓冲液(美国新泽西州富兰克林湖的贝迪医疗公司(Becton Dickinson；Franklin Lakes,NJ))中。将50,000个细胞/孔的每种细胞类型置于圆底板(贝迪医疗公司(Becton Dickinson))中的50μl染色缓冲液中。以3种稀释度和零(120nM、12nM以及1.2nM和0nM)添加50μl的2X浓度的测试mAb或同种型对照，并且将所得的溶液在4℃下温育30分钟。将100μl的染色缓冲液添加到每个板的所有孔，将板以300g离心5分钟，去除缓冲液，将200μl的染色缓冲液添加到每个板的所有孔，将板以300g离心5分钟，并去除缓冲液。将50μl的2μg/ml的山羊抗人Fc AF647二抗(美国宾夕法尼亚州西格罗夫的Jackson Immunoresearch公司(Jackson Immunoresearch；WestGrove,PA))添加到板的所有孔中，并将该板在4℃下温育30分钟。将100μl的染色缓冲液添加到板的所有孔，将该板以300g离心5分钟，并去除缓冲液。将200μl的运行缓冲液(运行缓冲液是染色缓冲液、1mM EDTA、0.1％的古洛糖醛酸)添加到板的所有孔中，将该板以300g离心5分钟，并去除缓冲液。将含有Sytox Green活/死染料的30μl运行缓冲液(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))添加到具有细胞的所有孔中，并且在iQue IntelliCyt流式细胞仪上读取板。在前向与侧向散射中对细胞进行门控以消除碎片，然后对单峰进行门控，然后对排除了Sytox染色的活细胞进行门控。通过AF647通道中的平均荧光强度来评估抗体结合。
为了开始评估所纯化的mAb的生物物理结合特性，进行解离速率筛选。测试76种OMNIRat抗CD33 mAb与重组人CD33 ECD-HSA(C33W2)和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA(C33W1)蛋白(Janssen生产)的结合，并且通过IBIS MX96 SPRi阵列平台(美国宾夕法尼亚州牛顿市的Carterra公司(Carterra；Newton,PA))测量解离速率。在IBIS仪器中使用缔合时间为10分钟的CMD50m传感器芯片(Xantec公司，lot CMD50m0415.a)，经由100μg/mL的胺偶联将山羊抗人Fc IgG(Jackson Immunoresearch目录号109-005-098)直接固定在乙酸盐缓冲液(pH4.5)中。达到约9000Rus的平均GAH-Fc固定水平。将传感器芯片转移到连续流微点滴器(CFM)单元以10μg/ml捕集每种抗CD33 mAb 10分钟。通过单循环动力学在不再生的情况下测量对IBIS SPRi的结合。使用PBST(具有0.005％Tween的PBS)作为运行缓冲液，按顺序从低浓度(0.46nM)到高浓度(μ3M)注射每个抗原浓度系列(3μM，3倍稀释系列)以5分钟的缔合时间和15分钟的解离时间结合所捕获的mAb。引用原始结合数据(.trix文件格式)并用SprintX软件(Wasatch，1.9.3.2版本)进行比对，然后导出(.ibmx文件格式)到Scrubber软件(2.0版本)进行1:1结合动力学分析(Wasatch，2.0.0.33版本)以提取koff结果。
下表4汇总了通过与表达人和食蟹猕猴CD33的细胞系以及与重组抗原(其中抗原中的一种抗原的解离速率至少>10e-3)的结合而评估的前32个克隆。在这32个克隆中，除4种之外的所有克隆均显示出可测量的与表达人或食蟹猕猴的细胞的结合。经由表位分箱和完全动力学分析进一步表征所有32个克隆。
表4.来源于OMNIRat的抗CD33抗体的细胞结合和解离速率分析
Figure BDA0002795140310001001
Figure BDA0002795140310001002
Figure BDA0002795140310001011
然后进一步表征这批mAb以用于完全亲和力分析以及表位分箱。通过ProteOn SPR(Bio-Rad)测量抗CD33 mAb与重组人CD33 ECD-HSA(C33W2)和食蟹猕猴CD33 ECD-HSA(C33W1)的结合。经由30μg/mL的胺偶联将山羊抗人Fc IgG(Jackson Immunoresearch，目录号109-005-098)直接固定在乙酸盐缓冲液(pH 5.0)中，在GLC传感器芯片(Bio-Rad，目录号176-5011)上垂直取向的所有6个配体通道上，流速为30μL/min，在含0.005％Tween-20的PBS中。固定密度平均为约5000应答单位(RU)，在不同通道之间具有小于5％的变化。在垂直的配体取向上不同的mAb以0.25μg/ml或0.5μg/ml(160RU至300RU)捕获在抗人Fc IgG表面上，其中第6配体通道作为无配体表面对照。在5倍浓度的3倍稀释系列中，0.3μM浓度的人和食蟹猕猴CD33-HSA蛋白质作为被分析物飞入，从而在水平取向上与捕获的mAb结合。还在第6通道中注入缓冲液样品以监测捕获的mAb的解离和基线稳定性。以100μL/min的流速监测所有浓度的人和食蟹猕猴CD33-HSA的解离阶段，持续15分钟以与C33B782结合，持续60分钟以与C33B912结合(与具有hIgG4的C33B904相同)，然后使用0.85％磷酸的18秒脉冲再生以去除抗原和所结合的mAb。在从以下减去应答数据之后，通过双重参考处理原始结合数据：1)校正Ag和空芯片表面之间的非特异性相互作用的中间点；2)校正由于捕获mAb表面随时间的解离所致的基线漂移的缓冲液通道。将每种mAb在所有抗原浓度下的处理数据全局拟合到1:1简单的朗缪尔结合模型，以提取动力学(kon,koff)和亲和力(KD)常数的估计值。
为了确定这批mAb是否全部结合1个不同的表位或是否存在广泛的表位覆盖率，进行表位分箱实验。使用CMD-200M传感器棱镜芯片，在IBIS SPRi仪器(Carterra公司)上进行CD33 mAb的竞争性抗原表位分箱。使用单独的连续流微点滴器(CFM)，经由胺偶联将每种抗CD33抗体以10μg/ml直接固定在芯片上的乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中。然后将印刷的传感器芯片转移到IBIS仪器，使用经典或“夹置”分箱格式进行分箱分析。通过依次注射50nM的人CD33 ECD-HSA(C33W2)，然后在133nM的溶液中作为竞争性分析物注射单次抗CD33mAb以在抗原和抗体的每个顺序注射循环之后使固定的抗CD33 mAb与表面再生结合来进行分箱。
为了监测再生前后固定化mAb的活性，在实验开始和结束时进行无任何竞争mAb的缓冲液注射以测量抗原单独的结合活性。竞争mAb结合相对于缓冲液(单独的抗原)结合的应答指示溶液中的抗体是阻断还是将抗原夹置结合在固定的mAb。引用原始分箱数据(.trix文件格式)并使用SprintX软件(Wasatch，1.9.3.2版本)归零，然后将其导出(.ibmx文件格式)到分箱软件HtTools.exe(Wasatch，2.0.0.33版本)用于分析。通过移除抗原应答低于20RU的抗体和不自身阻断的抗体来处理数据。竞争mAb应答相对于单独的抗原结合应答进行归一化。归一化应答<0.25的抗体表示阻断剂，归一化应答≥0.25的抗体表示非阻断剂/夹置剂。在组合树状图上使用高度2.5处的切口来预测不同的箱。
下表汇总了32种所选mAb的完全动力学分析和表位分箱。总共有8个抗CD33 mAb对人和食蟹猕猴CD33均具有亚纳摩尔亲和力，并且这些mAb对应于3个不同的表位箱，而较大的一批具有一系列亲和力和7个不同的表位箱。
表5.来源于OMNIRat的mAb的全动力学分析和表位分箱
Figure BDA0002795140310001031
Figure BDA0002795140310001032
Figure BDA0002795140310001041
OmniMouse批次(总计8种mAb)是单独生成的并进一步表征了与细胞的结合。如上所述进行细胞结合并汇总于下表中。在所测试的8种mAb中，6种直接与表达CD33的细胞结合，而2种不与表达CD33的细胞结合。
表6.来源于OMNIMouse的mAb与表达人和食蟹猕猴的细胞系的细胞结合
Figure BDA0002795140310001051
Figure BDA0002795140310001052
使用上述和下表中汇总的方法，经由对重组抗原的完全动力学分析，对细胞上结合CD33的6种mAb进行进一步生物物理表征。在测试的6种mAb中，1种与人CD33结合为皮摩尔亲和力(C33B912)，对食蟹猕猴CD33具有亚摩尔亲和力，而1种对人CD33具有非常强的亲和力，但对食蟹猕猴CD33(C33B911)仅具有纳摩尔亲和力。对于人和食蟹猕猴CD33(C33B913和C33B916)，另外两种克隆是亚纳摩尔亲和力，但亲和力均不在C33B912的范围内。
表7.来源于OMNIMouse的mAb的完全动力学分析
Figure BDA0002795140310001061
对来源于OMNIMouse的6细胞结合mAb以及先前在早期OMNIRat活动中鉴定的几个对照mAb进行表位分箱实验。基于对人CD33的亚纳摩尔亲和力和不同表位箱的数量来选择对照mAb。分箱软件HtTools在每个实验的基础上分配表位箱编号，因此对已经定义的表位箱具有几个对照对于交叉比较至关重要。两种来源于OMNIMouse的人CD33高亲和力克隆(C33B911和C33B912)均与来自上文箱4的克隆(本实验中箱4)分箱，而亚纳摩尔克隆(C33B916)与C33B836(上述实验中箱1)一起分箱成2。
表8：OMNIMouse抗CD33 mAb的表位箱
mAb V区ID 表位箱
C33B915 C33F553 1
C33B916 C33F554 2
C33B836 C33F53 2
C33B914 C33F552 2
C33B913 C33F551 3
C33B806 C33F106 3
C33B911 C33F549 4
C33B912 C33F550 4
C33B778 C33F78 4
C33B830 C33F130 4
C33B782 C33F82 5
C33B792 C33F92 5
C33B799 C33F99 5
C33B760 C33F60 6
C33B777 C33F77 7
CD33由2个IgG结构域、膜远侧V结构域和膜近侧C2结构域构成。SNP rs12459419可导致CD33前mRNA转录物的选择性另选剪接，以产生在细胞上表达的仅C2形式，因此靶向该结构域可提供临床益处。为了确定mAb能够结合两个结构域中哪一个结构域，使用人CD33ECD-HSA、人CD33 V-HSA和人CD33 C2-HSA作为结合抗原，根据上述方案对覆盖4个不同表位箱的具有最高结合能力的6种mAb进行解离速率筛选。如下表所示，先前分组于箱4中的两个克隆均与人CD33 C2结构域结合而非人CD33 V结构域，而箱2和箱3中的克隆结合V结构域而非C2结构域。分组到箱5中的两个克隆不结合任一结构域，因此它们的确切结合位置可跨越两个结构域。本实验包括三(3)种市售的mAb(WM53(德国达姆施塔特的EMD Millipore公司(EMD Millipore；Darmstadt,Germany))、P67.7(美国加利福尼亚州圣地亚哥的Biolegend公司(Biolegend,San Diego,CA))和LSBio克隆906(美国华盛顿州西雅图的LifeSpanBiosciences公司(LifeSpan Biosciences,Seattle,WA)))并全部显示与V结构域结合，但不与C2结构域结合。相对于表9中的C2结构域结合数据查看表5和表8中的表位箱，总共有15种mAb能够潜在地结合人全长蛋白上约25nM至约30pM范围内的C2结构域。
表9.解离速率结构域结合
Figure BDA0002795140310001071
为了支持进一步的体内和体外研究，选择选择选择克隆体(C33B836、C33B782、C33B778、C33B904、C33B806、C33B830、C33B937、C33B792、C33B760和C33B777)进行放大和fab臂交换以产生具有抗CD3抗体的双特异性DuoBody分子。将ExpiCHO-STM细胞(来自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以1.25×105至2.25×105个活细胞/mL接种到ExpiCHOTM Expression Medium中，并在37℃、7％的CO2摇动培养箱(INFORS HT MultitronPro)中的聚碳酸酯、一次性、无菌、通风、无挡板的锥形摇动烧瓶中培养。对于125mL至2L摇瓶中的常规细胞生长，对于具有19mm摇动直径的摇动器，将摇动速度设定为130rpm。当密度达到具有98％至99％活力的4×610至6×106个活细胞/mL的对数生长期时，对细胞进行继代培养。
在转染前两天，将ExpiCHO-STM细胞以1.5×106个活细胞/mL接种到所需的培养物体积。在转染当天，测定活细胞密度和活力百分比。以6×106个活细胞/mL的密度转染细胞。为了最佳转染，使用TE缓冲液(10mM的Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中≥1mg/mL浓度的无菌重链和轻链质粒DNA。
根据制造商的Max Titer转染方案(赛默飞世尔公布号MAN0014337)转染ExpiCHO-STM细胞。下文所示的所有量和体积均为每mL最终转染培养物体积。简而言之，用0.04mL的冷的OptiPROTM培养基(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以下列比率稀释质粒DNA：0.125μg重链DNA:0.375μg轻链DNA:0.5μg pAdvantage。稀释6.4μL的ExpiFectamineTM CHO转染试剂，并且将其与0.04mL的OptiPROTM培养基轻轻混合并温育1分钟。将所稀释的ExpiFectamineTM CHO试剂添加到所稀释的DNA中，轻轻混合，并将ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA复合物在室温下温育5分钟。在温育后，将复合物添加到摇动烧瓶中的ExpiCHO-STM细胞中，并在37℃、7％的CO2摇动培养箱中温育过夜。
对于Max Titer方案，在转染后第1天，添加6μL的ExpiFectamineTM CHO增强剂和160μL的ExpiCHOTM Feed，并且将烧瓶转移到32℃、7％的CO2摇动培养箱。在转染后第5天，再次向烧瓶中添加160μL的ExpiCHOTM Feed，并将其摇动放回32℃培养箱中。在转染后第12天收获培养物，以5000rpm离心15分钟并通过0.2um的Acropak 1500过滤器胶囊(颇尔公司(Pall))澄清。
使用mAbSelect Sure树脂(通用电气医疗集团(GE Healthcare))从所澄清的上清液中纯化表达的抗体。在上样各个培养上清液之前，用1×D-PBS(pH 7.2)平衡MabSelectSuRe Protein A柱。通过用1×D-PBS(pH 7.2)充分洗涤来去除未结合的蛋白质。用0.1M的乙酸钠(pH 3.5)洗脱结合的蛋白质。将峰级分用2.5M的Tris(pH 7.2)中和并合并。将所中和的级分池透析到1×dPBS中用于测定和生物物理表征，或者用于双特异性DuoBody组装。
通过测量OD280nm处的吸光度来确定每个洗脱池的蛋白质浓度，并使用基于氨基酸序列的吸光度消光系数进行计算。
实施例3：使用纯化的亲本mAb的Fab臂交换
CD33×CD3双特异性抗体的形成需要两种亲本mAb，一种是对靶标臂具有特异性的(例如CD33)，一种是对效应臂具有特异性的(例如CD3)。将CD33 mAb与高亲和力(CD3B219)或低亲和力CD3臂(CD3B376)臂重组。这些亲本mAb是IgG4 PAA形式(Labrijn等人，2013年)，其中靶标亲本(CD33)包含K409R突变(IgG4的天然氨基酸)，而杀伤亲本(CD3)包含F405L突变和R409K。单特异性抗CD3抗体表达为IgG4，在其Fc区中具有Fc置换S228P、F234A、L235A、F405L和R409K(CD3臂)(根据EU索引进行编号)。如上所述表达和纯化单特异性抗体。在纯化后，将亲本CD33抗体与所需亲本CD3抗体在75mM的半胱胺-HCl中在还原条件下混合，并在31℃下温育5小时。重组反应基于摩尔比，其中将设定量的CD33抗体(例如，10mg或约74.6纳摩尔)与CD3抗体(例如，约67.8纳摩尔)组合，其中CD33抗体的添加量比CD3抗体高6％。CD33抗体原液的浓度在0.8mg/mL至6mg/mL之间变化，并且重组反应的体积在每个配对中都不同。重组反应随后用PBS透析过夜以去除还原剂。用过量的CD33抗体(比率)进行CD33×CD3双特异性抗体反应，以使重组后剩余的未反应CD3亲本抗体的量最小化。
产生的最终CD33×CD3双特异性抗体以及用于重组反应的亲本mAb(即CD33、CD3或空白)一起列于表10中。
选择的CD33命中也与非杀伤臂(空白)配对以产生用于测试目的阴性对照。对于对照双特异性抗体，生成、纯化B2M1(IgG4 PAA形式的RSV抗体)，并将其分别与CD3臂CD3B219和CD3B376-F405L、R409K组合以生成CD3B288(CD3×空白)和CD3B510(CD3B376×空白)或与CD33臂C33B836、C33B806、C33B782、C33B792、C33B760、C33B830、C33B799、C33B778、C33B777组合以生成C33B941、C33B943、C33B946、C33B945、C33B949、C33B942、C33B944、C33B947、C33B948(CD33×空白)。
表10：CD33×CD3双特异性抗体
Figure BDA0002795140310001101
Figure BDA0002795140310001111
Pep：肽；Nuc：核苷酸；SEQ ID:SEQ ID NO
实施例4：用CD33×CD3双特异性抗体的体外T细胞介导的细胞毒性测定
进行体外T细胞介导的细胞毒性测定以评估CD33命中与CD3臂(CD3B219)配对是否介导杀伤表达AML细胞系OCI-AML5的CD33。简而言之，收获效应细胞(pan T细胞，购自Biological Speciality公司)，对其计数、洗涤并将其重悬于含10％的FBS(Invitrogen公司)细胞培养基的RPMI(Invitrogen公司)中至1×106个细胞/ml。用CFSE(Invitrogen公司)标记靶细胞(MOLM13)并将其重悬于具有10％的FBS的RPMI中至2×105个细胞/mL。效应细胞和CFSE标记的靶细胞在无菌96孔圆底板中以效应细胞:CFSE标记的靶细胞(E:T)＝5:1混合。将10μL的Fc阻断剂(ReoPro Fc片段)以及5μL双特异性抗体等分试样一起添加到含有各种浓度的每个孔中。将培养物在5％的CO2下于37℃温育48小时。在48小时之后，向样本中添加
Figure BDA0002795140310001122
Fixable Near-IR Dead Cell Stain缓冲液(Life Technologies公司)，并且室温下，将培养物在暗处温育20分钟，然后将其洗涤并重悬于100μL至200μL的FAC缓冲液中。使用CANTO II流式细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖的BD生物科学公司(BDBiosciences；Franklin Lakes,NJ))测定药物诱导的细胞毒性，并使用FlowJo软件或Dive软件(BD生物科学公司(BD Biosciences))进行分析。感兴趣的群体是双阳性CFSE+/活/死+细胞。如图1所示，所有CD33×CD3多特异性抗体在48小时后诱导CD33+MOLM-13细胞的T细胞重定向细胞毒性。表11汇总了用CD33×CD3多特异性抗体产生的EC50值。将前4种抗体C3CB10、C3CB12、C3CB7和C3CB88用于进一步表征。
表11：CD33×CD3 T-细胞介导的细胞毒性测定。13种CD33×CD3双特异性抗体的 EC50值的汇总
Figure BDA0002795140310001121
实施例5：体外CD33×CD3介导的AML原代样本中AML母细胞的降低和T细胞活化
为了进一步评估CD33×CD3双特异性抗体的细胞毒性潜力，使用前四种抗体使用AML患者全血进行离体细胞毒性测定(图2)。在该测定中，将各种双特异性抗体(与CD3臂CD3B219和CD3B376配对的CD33抗体)添加到来自AML患者的稀释全血中48小时的时间段而不提供另外的T细胞，因为该测定依赖于患者血液中自体同源T细胞的存在。在48小时后，将样本用CD3 PerCPCy5.5、CD25 PE、CD33 FITC和CD38 APC(所有抗体均购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的Biolegend公司(Biolegend,San Diego,CA))染色。然后将样本在1X LyseRBC Lysis Buffer(eBioscience公司)中至少洗涤3次。然后用
Figure BDA0002795140310001131
FixableNear-IR Dead Cell Stain缓冲液(Life Technologies公司)对样本进行染色。通过首先在双特异性抗体存在下定量AML患者癌细胞级分(定义为CD3-CD38+细胞)中的活CD33+细胞来确定肿瘤细胞毒性的程度。细胞毒性使用以下公式计算为相对于PBS/未处理的对照的百分比：(PBS/未处理的对照中的CD33+％-处理的样本中的CD33+％)/(PBS/未处理的对照中的CD33+％)。将T细胞活化计算为CD3+级分中CD25+事件的百分比。
如图2所示，与任一CD3臂(CD3B376和CD3B219)配对的所有CD33先导抗体促进了48小时后与T细胞活化相关的总细胞毒性的剂量依赖性降低。空白臂对照抗体(空白×CD3B219和空白×CD3B376)未能显示出肿瘤细胞毒性或T细胞活化。该结果还表明CD33×CD3双特异性抗体在自体同源环境中起作用。这些结果代表了4个其他AML供体样本(数据未示出)。表12汇总了用CD33×CD3多特异性抗体产生的EC50值。从EC50值可以看出，与CD3臂(C3CB88、C3CB189)配对的C33B904以及与CD3臂(C3CB7、C3CB97)配对的C33B836是最有效的抗体。因此，这4种抗体是进一步表征的焦点。
表12：CD33×CD3 T-细胞介导的体外细胞毒性测定。8种CD33×CD3双特异性抗体 的EC50值的汇总
双特异性AbID 原代AML细胞杀伤EC<sub>50</sub>(nM)
C3CB11 3.958
C3CB12 2.635
C3CB7 0.3315
C3CB88 0.6722
C3CB103 4.186
C3CB102 4.973
C3CB97 ～0.2316
C3CB189 0.5782
实施例6：CD33×CD3双特异性抗体与CD33的C2结构域结合并诱导表达CD33单核苷 酸多态性(SNP)的细胞系的细胞毒性的证实
用CD33×CD3双特异性抗体的体外T细胞介导的细胞毒性测定
最近的研究显示，单核苷酸多态性(SNP)rs12459419存在于约50％的AML群体中并导致CD33的外显子2的跳越缺失导致了CD33的V结构域的缺失。该研究还显示，与CD33的V结构域结合的Mylotarg在表达SNP的患者中无效，并且因此降低了约50％AML群体的复发风险并改善了存活率(Lamba等人，2017，JCO，CD33 Splicing Polymorphism DeterminesGemtuzumab Ozogamicin Response in De Novo Acute Myeloid Leukemia:Report FromRandomized Phase III Children's Oncology Group Trial AAML0531)。鉴于上述研究中Mylotarg的数据，进行体外T细胞介导的细胞毒性测定以评估CD33命中(V结合C33B836与C2结合C33B904)是否与CD3臂(CD3B219或CD3B376)配对介导了表达SNP rs12459419细胞系的杀伤。简而言之，收获效应细胞(pan T细胞，购自Biological Speciality公司)，对其计数、洗涤并将其重悬于含10％的FBS(Invitrogen公司)细胞培养基的RPMI(Invitrogen公司)中至1×106个细胞/ml。用CFSE(Invitrogen公司)标记靶细胞(KG1、SH2和OCIAML3)并将其重悬于具有10％的FBS的RPMI中至2×105个细胞/mL。选择KG1、SH2和OCIAML3以分别表示对于CD33 SNP rs12459419突变的野生型、杂合型和纯合型。将效应细胞和CFSE标记的靶细胞在无菌96孔圆底板中以效应细胞：CFSE标记的靶细胞比率(E:T)＝5:1混合。将10μl的Fc阻断剂(ReoPro Fc片段)以及5μμL双特异性抗体等分试样一起添加到含有各种浓度的每个孔中。将培养物在5％的CO2下于37℃温育48小时。在48小时之后，向样本中添加
Figure BDA0002795140310001151
Fixable Near-IR Dead Cell Stain缓冲液(Life Technologies公司)，并且室温下，将培养物在暗处温育20分钟，然后将其洗涤并重悬于100μL至200μL的FAC缓冲液中。使用CANTO II流式细胞仪(BD Biosciences)测定药物诱导的细胞毒性，并使用FlowJo软件或Dive软件(BD Biosciences)进行分析。感兴趣的群体是双阳性CFSE+/活/死+细胞。如图3所示，与空白组对照(空白组×CD3B219和空白组×CD3B376)不同，V结合和C2结合CD33×CD3多特异性抗体在48小时后诱导SNP rs12459419突变细胞系KG1的CD33+WT的T细胞重定向细胞毒性。相比之下，与V结合剂C33B836(C3CB97、C3CB7)不同，仅C2结合C33B904配对的双特异性抗体(C3CB189、C3CB88)介导了分别对rs12459419 SNP突变为杂合型或纯合型的SH2和OCIAML3细胞系的细胞毒性。为此，对C33B904配对的双特异性抗体(C3CB189、C3CB88)进行进一步分析和表征。总之，这些数据表明，与V结合竞争抗CD33抗体相比，CD33C2结合双特异性抗体(诸如C33B904配对的双特异性抗体)在更广泛的AML患者中具有显示疗效的潜力。
实施例7：在体外全血MOLM-13细胞毒性测定中，体外CD33×CD3介导的MOLM-13和 单核细胞中加标的降低
为了评估CD33×CD3双特异性抗体在消除MOLM-13细胞和正常人单核细胞中加标时的细胞毒性潜力，利用使用具有外源添加的CD33+ AML细胞系MOLM-13的正常健康人全血的体外细胞毒性测定。类似于上述实验，将各种双特异性抗体(与CD3臂CD3B219和CD3B376配对的CD33抗体)添加到来自6个不同正常人供体的稀释全血中48小时的时间段而不提供另外的T细胞，因为该测定依赖于供体血液中自体同源T细胞的存在。在稀释之前，对每个供体的血液中的T细胞的浓度进行计数。然后将血液用CFSE(Invitrogen)标记的MOLM-13细胞稀释，使得效应细胞：靶细胞比率(E:T)为1:5以模拟AML患者样本中的效应细胞：靶细胞。在48小后，将样本用CD3 PerCPCy5.5、CD25 PE、CD33 FITC和CD14 Pacific Blue(所有抗体购自均Biolegend公司)染色。然后将样本在1X Lyse RBC Lysis Buffer(eBioscience公司)中至少洗涤3次。然后用
Figure BDA0002795140310001161
Fixable Near-IR Dead Cell Stain缓冲液(LifeTechnologies公司)对样本进行染色。通过首先在双特异性抗体存在下定量CD14+单核细胞级分中的活CD33+细胞来确定肿瘤细胞毒性的程度。通过对死CFSE+细胞的百分比进行计数来确定MOLM-13细胞的细胞毒性。单核细胞的细胞毒性使用以下公式计算为相对于PBS/未处理的对照的百分比：(PBS/未处理的对照中的CD33+CD14+％-处理的样本中的CD33+CD14+％)/(PBS/未处理的对照中的CD33+CD14+％)。图4中的数据表明，两种CD33×CD3双特异性抗体(与CD3臂CD3B376和CD3B219配对的相同CD33先导C33B904)在48小时后特异性诱导MOLM-13细胞和CD33+单核细胞的细胞毒性。将空白臂对照用作阴性双特异性抗体对照。空白臂对照显示MOLM-13和CD33+单核细胞几乎没有细胞毒性活性。这些数据显示了6个不同正常供体的平均值。MOLM-13和CD14+单核细胞的细胞毒性的平均EC50值示于表13中。
表13：CD33×CD3 T-细胞介导的体外细胞毒性测定。2种CD33×CD3双特异性抗体 的EC50值的汇总。
双特异性Ab ID MOLM13杀伤EC<sub>50</sub>(nM) CD33<sup>+</sup>CD14<sup>+</sup>杀伤EC<sub>50</sub>(nM)
C3CB189 0.1677 1.156
C3CB88 0.671 0.506
实施例8：CD33×CD3双特异性抗体与食蟹猕猴的物种交叉反应性的证实
在用食蟹猕猴全血进行的体外细胞毒性测定中，体外CD33×CD3介导的单核细胞 的降低
为了证实功能交叉反应性并评估CD33×CD3双特异性抗体在消除正常食蟹猕猴单核细胞时的细胞毒性的潜力，利用使用健康食蟹猕猴全血的体外细胞毒性测定。类似于上述实验，将各种双特异性抗体(与CD3臂CD3B219和CD3B376配对的CD33抗体)添加到来自6个不同正常食蟹猕猴供体的稀释全血中48小时的时间段而不提供另外的T细胞，因为该测定依赖于供体血液中自体同源T细胞的存在。在48小后，将样本用CD3 PerCPCy5.5、CD25 PE、CD33 FITC和CD14 Pacific Blue(除了购自德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎公司(Miltenyi；Bergisch Gladbach,Germany)的CD33抗体之外，所有抗体均购自Biolegend公司)染色。然后将样本在1×Lyse RBC Lysis Buffer(eBioscience公司)中至少洗涤3次，之后用
Figure BDA0002795140310001171
Fixable Near-IR Dead Cell Stain缓冲液(Life Technologies公司)染色。通过首先在双特异性抗体存在下定量CD14+单核细胞级分中的活CD33+细胞来确定单核细胞细胞毒性的程度。细胞毒性使用以下公式计算为相对于PBS/未处理的对照的百分比：(PBS/未处理的对照中的CD33+CD14+％-处理的样本中的CD33+CD14+％)/(PBS/未处理的对照中的CD33+CD14+％)。将T细胞活化计算为CD3+级分中CD25+事件的百分比。图5中的数据表明，CD33×CD3双特异性抗体(与CD3臂CD3B376和CD3B219配对的相同CD33先导C33B904)在48小时后特异性诱导CD33+单核细胞的细胞毒性以及T细胞活化。将空白臂对照用作阴性双特异性抗体对照，并且显示几乎没有细胞毒性或T细胞活性。表14示出了6个不同的食蟹猕猴供体的平均值。
表14：CD33×CD3 T-细胞介导的体外细胞毒性测定。2种CD33×CD3双特异性抗体 的EC50值的汇总。
蛋白质AA ID CD33<sup>+</sup>CD14<sup>+</sup>杀伤EC<sub>50</sub>(nM) T细胞活化EC<sub>50</sub>(nM)
C3CB189 3.60 0.02
C3CB88 0.89 0.02
实施例9：C3CB189和C3CB88在T细胞人源化NSG小鼠的MOLM-13人AML异种移植物中 的功效
在用2千万个T细胞人源化的雌性NOD.Cg-Prkdcsci Il2rgtm1Wjll/SzJ(NSG)小鼠中在已建立荧光素酶转染的弥散的MOLM-13人急性髓性白血病(AML)异种移植物中评估C3CB189和C3CB88的功效。在静脉注射肿瘤植入后的第5天，通过活生物发光成像(BLI)将动物随机分成n＝10/组。以0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg施用C3CB189和C3CB88或以0.5mg/kg施用空白×CD3抗体对照，每3至4天施用一次，持续6周。
在肿瘤植入后的第13天，当每组保留至少八只动物时，计算通过生物发光测定的肿瘤生长抑制(TGI％)。与空白×CD3对照相比，在所有浓度下C3CB189(图6)和C3CB88(图8)均观察到统计意义上显著的肿瘤生长抑制。与用空白×CD3治疗的对照相比，0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg的C3CB189分别引发76％、100％和82％的肿瘤生长抑制，并且0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg的C3CB88分别引发100％、100％和91％的肿瘤生长抑制。
用C3CB189和C3CB88处理导致肿瘤负荷降低和寿命增加(ILS)大于空白×CD3对照组的16天中位生存期。在不同剂量下，用C3CB189处理的动物的中位生存期为19天至27.5天(图7)，而用C3CB88处理的动物的中位生存期为26至28.5天(图9)。与对照组相比，0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg的C3CB189分别导致19％、72％和50％的寿命增加，并且C3CB88分别导致63％、78％和72％的寿命增加。
实施例10：CD33抗体在体外蛋白质A药物缀合物细胞活力测定中的内化的证实
使用预上样的蛋白质A药物缀合物A-MMAF进行体外细胞活力测定，以检测配体结合的靶抗体的内化。用一批抗CD33抗体、C33B782、C33B806、C33B836、C33B904、C33B937和同种型对照抗体CNTO9412在AML细胞系MOLM13中进行该基于细胞的功能测定。在该测定法中，仅测试了靶抗体作为对照，以区分由于抗体内化而引起的细胞毒性和由于测试抗体自身的活性而引起的细胞毒性。图10示出了在37℃、5％的CO2下温育72小时之后MOLM13中蛋白质A-MMAF结合的抗体的细胞毒性。在MOLM13细胞中观察到所有五种CD33抗体的浓度依赖性细胞毒性，这表明在该细胞系中所有五种抗体均内化。同种型对照抗体CNTO9412不显示显著的浓度依赖性细胞毒性，这表明这些CD33抗体在MOLM13细胞中的靶特异性内化。表15示出了五(5)种CD33×CD3双特异性抗体的EC50值。
结果还表明抗体C33B836在MOLM13细胞中具有比其他更好的内化。
表14：CD33内化测定。五种抗CD33抗体的EC50值的汇总。
C33B782 C33B806 C33B836 C33B904 C33B937 CNTO9412
EC<sub>50</sub>(nM) 0.88 0.22 0.04 0.96 1.92
实施例11：证实CD33抗体可介导ADCC活性
为了表征抗CD33 mAb的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，利用健康供体NK效应细胞和MOLM-13和MV4-11 AML靶细胞进行体外ADCC测定。在发起ADCC测定之前，将健康供体NK细胞(美国宾夕法尼亚州科尔马的Biological Specialty公司(BiologicalSpecialty Corporation；Colmar,PA)的供体CC00061和M7015))接种在补充有1×10-6M的氢化可的松(干细胞)、7.5ng/ml的重组人IL-2(美国明尼苏达州明尼阿波里斯市的安迪生物公司(R&D Systems；Minneapolis,MN))、1％的丙酮酸钠(Life Technologies公司)、1％的非必需氨基酸(Life Technologies公司)、1％青霉素链霉素(Life Technologies公司)的MyeloCult H5100生长培养基(美国加利福尼亚州温哥华市Stem Cell Technologies公司(Stem Cell Technologies；Vancouver,CA))中16小时至24小时。在测定当天，将1×106个细胞/ml的MOLM-13和MV4-11细胞在37℃下用10μM钙黄绿素AM标记30分钟。在标记之后，将细胞洗涤三次以去除过量的钙黄绿素AM。随后，在不同浓度的抗CD33抗体的存在下，将1×105钙黄绿素AM标记的MOLM-13或MV4-11靶细胞与健康供体NK细胞(3×105)在37℃下温育1.5小时。通过将Triton X100以0.5％的最终浓度添加到指定的对照样本孔中来产生最大裂解对照样本。用
Figure BDA0002795140310001191
M5多模读板机(美国加利福尼亚州森尼维尔市的Molecular Devices有限公司(Molecular Devices,LLC；Sunnyvale,CA,USA))通过485nm至535nm处的荧光测量钙黄绿素AM的释放。使用以下公式，通过将数据归一化为最大(TritonX100介导的)和最小(单独的效应细胞)裂解来确定细胞裂解百分比：裂解％＝[(实验裂解–自发裂解)/(最大裂解–自发裂解)]*100。
IgG1低岩藻糖抗CD33抗体以浓度依赖性方式诱导ADCC(图11)。与C33B912.CLF相比，C33B48.CLF展示出更有效的针对MOLM-13和MV4-11细胞的ADCC活性，其最大有效浓度值的一半高出12至23倍(EC50，表16)。MOLM-13和MV4-11细胞响应于C33B48.CLF和C33B912.CLF的最大裂解是相似的。
表16：CD33的ADCC测定。2种抗CD33抗体和2种细胞系的EC50值的汇总
EC<sub>50</sub> ADCC C33B48.CLF(nM) EC<sub>50</sub> ADCC C33B912.CLF(nM)
MOLM-13 0.023 0.292
MV4-11 0.113 2.008
实施例12：靶向CD33的C3CB189抗体的结合特性，CD33是白血病母细胞丰富表达的 抗原。
C3CB189是完全人免疫球蛋白G(IgG)4-PAA双特异性抗体，其靶向T细胞上的CD3受体复合物和髓细胞样细胞上的CD33。C3CB189以0.89pM的亲和力(Kd)与人重组(r)CD33结合，并且以363pM的亲和力(Kd)与食蟹猕猴(cyno)rCD33结合。C3CB189还分别以151.32nM和43.83nM的亲和力(Kd)与人和食蟹猕猴rCD3e结合。C3CB189与表达CD33的AML细胞系KG-1、MOLM-13、Kasumi-1和OCI-AML3特异性地结合(图12)。如预期的，用阴性对照CD33×空白抗体观察到类似的结合模式，因为其包含单个抗CD33 Fab臂。阴性对照双特异性抗体空白×CD3以及空白×空白显示出对这些细胞无显著结合。所测试的双特异性抗体均不与CD33阴性细胞系CARNAVAL和KG-1ΔCD33(即，使用CRISPR遗传缺失CD33的KG 1细胞)结合(图12)。另外，与亲本HEK-293T细胞相反，C3CB189与表达食蟹猕猴CD33的HEK 293T细胞结合，这证实食蟹猕猴的交叉反应性(图12)。
实施例13：C3CB189在体外杀伤CD33+AML细胞系并活化T细胞
接下来使用T细胞介导的细胞毒性测定来评估C3CB189在各种细胞系中的体外活性，这些细胞系包括CD33+细胞系，诸如MOLM-13、KG-1、SKNO-1、Kasumi-1和OCI-AML3以及CD33no/low细胞系诸如CARNAVAL和KG1ΔCD33。用来自六个健康供体和片段可结晶区域(Fc)阻断剂的分离的pan人CD3+T细胞建立测定。添加Fc阻断剂以防止Fc介导的C3CB189增长，因为IgG4 Fc区中的PAA突变不会使其完全沉默(Vafa等人，2014年)，并且因为Fcγ受体(FcγR)通常在AML细胞上表达(Ball等人，1989年)。
如图13中所见，在48小时后当与纯化的T细胞组合时C3CB189展示出CD33+AML细胞系的T细胞介导的细胞毒性(图13)。MOLM-13、KG-1、Kasumi-1和OCI-AML3的中值半最大有效浓度(EC50)[以及EC20值]分别是0.1307[0.0283]、0.1677[0.0525]、0.05[0.0366]和0.1826[0.0844]nM(图2B)。对于CD33阴性细胞系CARNAVAL和KG-1ΔCD33或对照双特异性抗体(空白×CD3或CD33×空白；参见图13)未观察到细胞毒性。我们证实，通过用CD123×CD3双特异性抗体进行细胞毒性测定，KG1ΔCD33细胞确实可被T细胞靶向(图14A)。
在细胞毒性测定中还体外评估了在CD33+肿瘤细胞系的存在下由C3CB189诱导的T细胞活化程度，其中CD25表达被测量为活化的指标。如图2C所示，当用CD33+肿瘤细胞系和健康供体pan T细胞温育时C3CB189诱导T细胞活化，而用CD33-CARNAVAL和KG-1ΔCD33细胞观察到极少的T细胞活化或未观察到T细胞活化。MOLM-13、KG-1、Kasumi-1和OCI-AML3的中值EC50[EC20]值分别是0.0283[0.0077]、0.0664[0.0256]、0.0432[0.0267]和0.0500[0.0178]nM(图15C)。C3CB189在不存在靶细胞的情况下不引起T细胞的活化，这证实T细胞活化的特异性(图14B)。CD33×空白对照抗体在任何细胞系中不诱导T细胞活化。在CD33+和CD33-细胞系的存在下，空白×CD3对照抗体在最高浓度533nM和53nM下诱导T细胞活化，但在任何其他剂量下不能介导活化。重要的是，仅在存在CD33+细胞系的情况下而不在存在CD33-细胞系的情况下(图15A)或当T细胞在不存在靶细胞的情况下温育时(图14B)，C3CB189显示出T细胞活化的特异性诱导。
最后，还在上述用Kasumi-1细胞系进行的体外T细胞重定向测定中评估细胞因子应答。C3CB189导致分泌了几种细胞因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-2和IL-8(补充图3)。这些数据与图13和图15A至图15C中所示的细胞毒性和T细胞活化数据一致。细胞因子应答的中值EC50和产生最大可能效应(EC20)值的20％的浓度的汇总报告于表17中。
表17.在用纯化的T细胞和Kasumi-1靶细胞的T细胞重定向测定中C3CB189介导的 细胞因子释放的有效浓度值。EC值以nM为单位。n表示6个供体中可以确定EC值的数量。
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实施例14：C3CB189示出体内有效的抗肿瘤活性
评估了C3CB189在T细胞人源化NSG小鼠中的两种已建立异种移植肿瘤模型中的功能。在已建立的皮下KG-1—荷瘤小鼠中，与空白×CD3处理的对照动物相比，以0.1mg/kg、0.5mg/kg和1mg/kg施用C3CB189进行处理分别引发41％、92％和87％的肿瘤生长抑制(对于0.5mg/kg和1mg/kg，P<0.0001，图16A)。0.5mg/kg和1mg/kg的C3CB189在第55天也分别导致6种和7种完全应答。
在已建立的弥散的荧光素酶表达的MOLM-13模型(MOLM-13-luc)中，在静脉内注射后确认AML细胞归巢到骨髓(BM)后开始C3CB189处理。与空白×CD3对照处理小鼠相比，每隔3天至4天施用0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg的C3CB189显著抑制肿瘤生长，如通过生物发光所评估的(分别为76％、100％和82％)(图17)。0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg的C3CB189分别导致19％、72％和50％的统计意义上显著增加的寿命(P<0.0001，图16B)，这与生物发光所观察到的BM、脊柱和后肢的肿瘤负荷降低相关(图16C)。在研究结束时，在第55天，通过BLI评估，用0.05mg/kg的C3CB189处理的三只动物显示出完全应答。
此外，通过流式细胞术测量(图16D)，用0.05mg/kg和0.005mg/kg较小程度的C3CB189处理的MOLM-13-Luc荷瘤小鼠在第11天在骨髓中显示出肿瘤细胞减少和CD3+T细胞浸润增加，并且通过IHC CD8+T细胞浸润增加(图3E)。这些数据是相关的，因为BM通常是AML中对白血病干细胞(LSC)的抗性位点并且残留的疾病最少。这些数据一起证实C3CB189通过募集T细胞到T细胞人源化小鼠中的肿瘤位点来抑制两种AML肿瘤模型的肿瘤生长。
实施例15：C3CB189介导在健康全血中加标的AML细胞以及来自原代患者样本的 AML母细胞的细胞毒性
据报道，CD33的胞外域(ECD)从细胞中脱落；因此，正常样本和患者样本可包含可溶性CD33(sCD33)。研究显示，在AML患者血浆中检测到大约4ng/mL至30ng/mL的sCD33(Biedermann,B.、Gil,D.、Bowen,D.T.和Crocker,P.R.(2007年)，Leuk Res，第31卷，第211页至第220页)。该值高于在健康人血清中测定的0.6ng/mL至5.8ng/mL的浓度(Biedermann,B.、Gil,D.、Bowen,D.T.和Crocker,P.R.(2007年)，Leuk Res，第31卷，第211页至第220页)。
为了确定正常供体和AML供体中的生理sCD33水平，开发了免疫捕获偶联质谱(MS)测定。正常血清样本和AML血清样本的分析显示相似的平均sCD33水平分别为53.03ng/mL(1.91nM)和52.90ng/mL(1.90nM)(表18)。
表18：对正常样本和AML患者样本中的sCD33水平的评估。使用质谱分析健康人和 AML血清样本(n＝20/每个)的sCD33水平。
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为了在生理上更相关的环境中评估C3CB189的活性，我们使用人外周全血作为效应T细胞的来源，添加各种CD33+肿瘤细胞作为靶标并温育48小时来进行T细胞介导的细胞毒性测定。C3CB189诱导CD33+MOLM-13和Kasumi-1细胞的T细胞介导的细胞毒性，中值EC50[EC20]值分别为0.111[0.054]nM和0.124[0.06]nM(图17)。类似地，C3CB189导致T细胞(如CD25所示)、MOLM-13和Kasumi-1细胞的活化，中值EC50[EC20]值分别为0.037[0.017]nM和0.085[0.039]nM(图18A和图18B)。所测量的C3CB189介导的T细胞活化代表血液中的总T细胞活化，并且其反映了与杀伤外源CD33+肿瘤细胞和可能的内源CD33+外周血白细胞(诸如中性粒细胞和单核细胞，在该测定中未对细胞毒性进行测量)两者相关的活化。另外，这些数据表明尽管全血中存在基线水平的sCD33和其他CD33+白细胞，C3CB189介导了肿瘤细胞杀伤。
接下来使用来自AML供体的全血在离体细胞毒性测定中评估C3CB189在更临床相关的环境中诱导细胞毒性的能力。该***依赖于患者自身血液中自体同源T细胞的存在来杀伤AML细胞。测量T细胞介导的CD33+细胞的细胞毒性和T细胞活化的程度。诱导CD33+母细胞的浓度依赖性细胞毒性(图19A)的C3CB189也与所有6个患者样本中增加的T细胞活化相关(图19B)。C3CB189诱导的最大细胞毒性为大约60％的CD33+母细胞。空白臂对照抗体诱导有限的细胞毒性和T细胞活化。诱导细胞毒性和T细胞活化的C3CB189分别导致EC50值在0.052nM至9.52nM(中值：0.365nM)和0.03nM至5.109nM(中值：0.355nM)的范围内(图19A和图19B)。这些数据表明C3CB189在更生理的体外环境中和在基线sCD33水平的存在下有效杀伤CD33+AML细胞。
实施例16：C3CB189的食蟹猕猴交叉反应性的评估
为了评估食蟹猕猴(cyno)是否是评估C3CB189活性的合适模型，我们首先通过FACS分析研究从6个健康食蟹猕猴获得的白细胞上的CD33表达。结果发现食蟹猕猴外周血中的T细胞和B细胞具有低至零水平的CD33表达(图20)。大约75％至96％的食蟹猕猴中性粒细胞以7,545分子/细胞的平均抗原密度表达CD33(图20)。另一方面，CD33+食蟹猕猴单核细胞的百分比在6个供体中是可变的，范围为0％至84％，其中平均抗原密度为2,146个分子/细胞(图20)。
接下来，为了证实食蟹猕猴交叉反应性并评估C3CB189消除正常食蟹猕猴单核细胞和中性粒细胞的细胞毒性潜力，我们使用健康食蟹猕猴全血以及外源添加的CD33+MOLM-13细胞进行了体外细胞毒性测定。在该***中，还监测了CD33+正常食蟹猕猴单核细胞和正常食蟹猕猴中性粒细胞的耗尽以及T细胞的活化。实际上，在体外温育48小时之后，C3CB189在体外介导了CD33+MOLM-13细胞(EC50：0.013nM至0.452nM)以及CD33+正常食蟹猕猴单核细胞(EC50：0.625nM至5.636nM)和正常食蟹猕猴中性粒细胞(EC50：0.013nM至0.714nM)的杀伤(图21)。空白×CD3对照显示出所有CD33+靶细胞的有限细胞毒性，并且仅在533nM的最高剂量下显示出T细胞活化。这些数据一起显示出C3CB189的功能性食蟹猕猴的交叉反应性，并且建立CD33+食蟹猕猴和中性粒细胞作为在非人灵长类研究中的潜在的药效动力学(PD)标志物。这些数据还显示出C3CB189可介导食蟹猕猴T细胞对人AML细胞系的耗尽。重要的是，这些结果验证食蟹猕猴作为C3CB189的适当功效模型。
实施例17：C3CB189介导食蟹猕猴中CD33+白细胞的降低
为了评估体内C3CB189的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)，将C3CB189作为单一静脉注射剂量施用给食蟹猕猴。PK曲线示于图22A中。C3CB189在0.05mg/kg至1mg/kg剂量范围内表现出具有近似线性PK的典型单克隆抗体(mAb)的PK特性。C3CB189的所估计的平均总清除率是13.03mL/d/kg至21.39mL/d/kg，分布体积是89.14mL/kg至154.91mL/kg，并且终末半衰期为4.20天至5.06天。观察到在1mg/kg剂量组动物中在第10天之后C3CB189的消除明显加速。这最可能与抗药物抗体(ADA)的发展相关，但在该研究中未测试ADA。
与预期的作用机制一致，在单次静脉注射C3CB189后观察到T细胞活化的剂量依赖性增加(CD25+％)，在给药后24小时的第一时间点观察到T细胞毒性淋巴细胞(CD8+/CD4-)上的峰值CD25+％(图22B)。T辅助淋巴细胞(CD4+/CD8-)在C3CB189给药后也表现出类似的活化(CD25+％)曲线(数据未示出)。C3CB189施用还导致在给药后2小时被分析的细胞因子(IFNγ、IL-10、IL-2、IL-6、MCP-1和TNFα)的血浆浓度的剂量依赖性增加(图23)。除IL-10和MCP-1之外，细胞因子在给药后24小时回到低于定量下限(LLOQ)水平。
C3CB189相关剂量导致CD33+粒细胞(中性粒细胞)持续降低。与单核细胞上较低的CD33表达水平一致，还观察到CD33+单核细胞的更瞬时的降低。粒细胞和单核细胞的浓度-时间曲线分别在图22C和图22D中示出。虽然粒细胞和单核细胞从外周血的初始快速消失可与和T细胞活化相关联的瞬时白细胞边缘化相关，但CD33+粒细胞/单核细胞群的减低却更持久。具体地讲，粒细胞群体的降低到第8天一直处于接近最大水平，之后逐渐恢复。单核细胞的回弹较早发生并且更显著。
在以0.01mg/kg至30mg/kg范围内的剂量水平多次静脉施用后，在另外两项食蟹猕猴研究中也研究了C3CB189。C3CB189相关变化通常与单剂量后观察到的变化一致，并且C3CB189在这些剂量水平下耐受性良好(数据未示出)。这些数据一起提供C3CB189介导活性的证据，同时保持对食蟹猕猴的耐受性。
实施例18：不考虑rs12459419 SNP的基因型，C3CB189介导的CD33+细胞系和患者 样本的细胞毒性
SNP rs12459419(C>T；外显子2中的Ala14Val)存在于CD33的调控剪接位点内，其中T等位基因导致预测编码缺乏V set结构域的CD33蛋白质同种型的转录物的表达增加。最近的数据进一步证实，具有SNP rs12459419 CC基因型(约50％的参与者)的受试者在GO治疗之后复发风险显著降低并且无事件存活率(EFS)和无疾病存活率更高，而在具有CT或TT基因型的患者中看不到这种有益效果(Lamba,J.K.、Chauhan,L.、Shin,M.、Loken,M.R.、Pollard,J.A.、Wang,Y.C.、Ries,R.E.、Aplenc,R.、Hirsch,B.A.、Raimondi,S.C.等人，(2017年)J Clin Oncol，第35卷，第2674页至2682页)。鉴于上述研究中的GO数据，我们评估了SNP-rs12459419基因型对C3CB189活性的影响。我们首先经由氢氘交换(HDX)作图确认，C33B904(C3CB189的CD33亲本臂的IgG4型式)与CD33的C2结构域(图24A中的IgC)中的不同区域结合并且在V区(图24A中的IgV)中不具有结合。相比之下，C33B836(C3CB97的CD33亲本臂的IgG4型式)与CD33的V结构域结合并且在CD33的C2区中不具有结合。接下来，我们使用体外T细胞介导的细胞毒性测定来比较由C3CB97(V结合剂)介导的应答与由C3CB189(C2结合剂)介导的应答。基于基因分型数据(图25A)，选择KG-1、SH2和OCI-AML3分别表示对于CD33 SNP rs12459419突变的野生型CC、杂合型CT和纯合型TT。与空白×CD3对照不同，V结合和C2结合CD33×CD3双特异性抗体在48小时诱导CD33+KG-1“CC”细胞系的T细胞重定向细胞毒性(图6B)。相比之下，与V结合剂C3CB97不同，仅C2结合剂C3CB189介导SH2“CT”细胞系和OCI-AML3“TT”细胞系的细胞毒性，而对于V结合剂C3CB97未观察到活性。
然后我们使用AML患者全血进行体外细胞毒性测定以延长并确认我们的上述观察结果。基于基因分型数据，患者样本6095、6116和6152被鉴定为CC基因型，而患者样本6129和USAML0078分别被鉴定为CD33 SNP rs12459419的杂合型CT(图25B)。没有样本被鉴定为CD33 SNP rs12459419的纯合型TT。V结合和C2结合CD33×CD3双特异性抗体的确诱导相当的被鉴定为CC基因型的AML样本的T细胞重定向细胞毒性；相比之下，与V结合C3CB97相比，C2结合C3CB189显示出对于SNP rs12459419突变为杂合型(CT)的AML样本的细胞毒性增强(图24B)。接下来，鉴于SNP rs12459419是种系突变，我们用来自25个不同健康供体的经纯化的单核细胞和匹配的自体同源T细胞进行类似的体外实验。所有25个供体的基因分型数据在图25C中示出。与C3CB189结合CD33的C2结构域的事实一致，C3CB189介导了原代人单核细胞的细胞毒性，无论它们的SNP基因型状态如何(参见图24C)。相比之下，当样本对于SNPrs12459419为CT或TT时，V结合C3CB97介导的细胞毒性有限至无细胞毒性。这三条证据一起表明C3CB189可通过靶向保守的C2表位来证明在更广泛的AML患者群组中的功效。
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。
表19：重链可变区序列
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表20：轻链可变区
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表21：重链CDR1-3序列
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表22：轻链CDR1-3序列
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Claims (38)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33的C2结构域。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；或者
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548。
3.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:292、291、261、269、280、259、263、264、265、266、272、277、279、284或285有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQID NO:332、331、302、310、320、300、304、305、306、307、317、319、324或325有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；或
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段在体外以小于约2nM的EC50诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
6.根据权利要求5所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含IgG1低岩藻糖主链。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以小于约5×10-9M的解离常数(KD)结合CD33。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合CD33并且以小于约2nM的EC50诱导内化。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中将所述抗体或其抗原结合片段缀合至治疗剂。
12.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.一种载体，所述载体包含根据权利要求12所述的分离的核酸。
14.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求13所述的载体。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据权利要求1至10中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
16.一种在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求15所述的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述血液学癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述血液学癌症是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
20.一种产生根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在产生所述单克隆抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
21.一种产生包含根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，所述方法包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
22.一种抗CD33/抗CD3双特异性抗体，所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体包含抗CD33抗体或其抗原结合片段以及抗CD3抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:447、448、449、567、568和569；
b.分别为SEQ ID NO:444、445、446、564、565和566；
c.分别为SEQ ID NO:354、355、356、477、478和479；
d.分别为SEQ ID NO:378、379、380、501、502和503；
e.分别为SEQ ID NO:411、412、413、531、532和533；
f.分别为SEQ ID NO:348、349、350、471、472和473；
g.分别为SEQ ID NO:360、361、362、483、484和485；
h.分别为SEQ ID NO:363、364、365、486、487和488；
i.分别为SEQ ID NO:366、367、368、489、490和491；
j.分别为SEQ ID NO:369、370、371、492、493和494；
k.分别为SEQ ID NO:387、388、389、492、493和494；
l.分别为SEQ ID NO:402、403、404、522、523和524；
m.分别为SEQ ID NO:408、409、410、528、529和530；
n.分别为SEQ ID NO:423、424、425、543、544和545；或者
o.分别为SEQ ID NO:426、427、428、546、547和548；
并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：
1)分别为SEQ ID NO:342、343、344、465、466和467；或者
2)分别为SEQ ID NO:345、346、347、468、469和470。
23.根据权利要求22所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:292、291、261、269、280、259、263、264、265、266、272、277、279、284或285有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:332、331、302、310、320、300、304、305、306、307、317、319、324或325有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区；并且所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:257或258有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者具有与SEQ ID NO:298或299有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
24.根据权利要求22或23所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:257的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:298的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO:292的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:332的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO:291的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:331的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO:261的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:302的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO:269的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:310的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO:280的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:322的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
u.具有SEQ ID NO:259的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:300的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
v.具有SEQ ID NO:263的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:304的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
w.具有SEQ ID NO:264的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:305的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
x.具有SEQ ID NO:265的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:306的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
y.具有SEQ ID NO:266的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
z.具有SEQ ID NO:272的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:307的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
aa.具有SEQ ID NO:277的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:317的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
bb.具有SEQ ID NO:279的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:319的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；
cc.具有SEQ ID NO:284的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:324的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区；或
dd.具有SEQ ID NO:285的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:325的多肽序列的轻链可变区；以及具有SEQ ID NO:258的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:299的多肽序列的轻链可变区。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD33的C2结构域。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段在体外以小于约1nM的EC50值诱导表达CD33的细胞的T细胞依赖性细胞毒性。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。
29.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求22至28中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段。
30.一种载体，所述载体包含根据权利要求29所述的分离的核酸。
31.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求30所述的载体。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据权利要求22至28中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
33.一种在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求32所述的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述血液学癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述血液学癌症是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
37.一种产生根据权利要求22至28中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在产生所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物中回收所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段。
38.一种产生包含根据权利要求22至28中任一项所述的抗CD33/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，所述方法包括将所述抗CD33/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
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