CN1121682A - 包被分生组织 - Google Patents

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J·M·迪皮伊
F·莫勒
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Bayer CropScience SA
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Rhone Poulenc Agrochimie SA
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    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor

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Abstract

本发明公开了一种包被分生组织，它包括干的或可干燥的分生组织(1)和与该组织接触的固相载体(3)，该载体部分覆盖分生组织并且使之仍然和一定量的空气(2)接触。该载体能够吸收营养成分并且不妨碍发芽。本发明能用于播种或培养目的。

Description

包被分生组织
本发明涉及一种包括分生组织和固相载体的分生组织。
众所周知，近年来，人们对分生组织越来越感兴趣。分生组织使得人工种子可以按用户的需要进行安置，而这些人工种子具有相同的一般特性和特定的遗传特性(这些性能是被限定的、明确的、成熟的、特异的、和经鉴定的)以便获得高度特异的植物变种。已经提出了许多不同的包被***，但是它们的发芽率不令人满意。
本发明的一个目的是提供一种改进的包被分生组织，它克服了已有的分生组织的缺点。
目前已经发现，这些目的中的全部或部分可以通过本发明的包被分生组织而实现。
本发明涉及一种包被的分生组织，其特征在于，它包括：
—干的或可干燥的分生组织，和
—干的或可干燥的固相载体，
—该固相载体与分生组织接触，并且部分覆盖分生组织，使得分生组织仍然与一定量的空气接触，
—该固相载体能够吸收营养培养基，
—和该固相载体不妨碍发芽。
术语“分生组织”在本发明中指当置于合适的条件下，能够发育成完整的植株或完整植株的一部分的任何植物组织、或者植物细胞群。该术语可以包括任何类型的植物组织，尤其是：体细胞组织、体细胞胚、合子细胞组织、胚原基、不定芽、芽(shoots)、芽原基、类原基体(protocorn—like bodies)、绿斑(green spot)、生殖细胞和生殖细胞系以及幼苗。
本发明涉及大量不同范围的植物，其中包括产粮作物，如水稻、小麦、大麦、玉米、大豆；蔬菜作物如芹菜、欧芹、生菜、花椰菜、胡萝卜、茄子、番茄、洋葱、大蒜、姜、草莓、瓜果、龙须菜；产粮和/或工业作物，如芸苔(欧洲油菜)、甘蔗、甜菜、烟草；药用作物，如颠茄和人参；观赏植物，如菊花、唐菖蒲、百合、兰花、孤挺花、天竺葵花、秋海棠、非洲紫罗兰、一品红；树木或乔木品种或灌木，如针叶树、棕榈树、果树、藤本植物、落叶树木等。
分生组织可以是干的、脱水的或者可以是高达100％湿度的水合形式。
下列材料可以作为分生组织的载体的材料：纤维材料(如羊毛、棉花、玻璃棉、或石棉)、多孔材料、泡状材料(如发泡的合成聚合物，尤其是聚醚和聚氨酯)。更具体地，可以提及的有下列：沙、粘土、蛭石、玻璃珠、棉花、纸、谷糠、木屑、羊毛、乙酸纤维素或其它纤维素衍生物，在这些情况下，为了使这些材料形成某种结构，最经常的是加入至少一种粘合剂和/或增稠剂。能够将形状赋予整体的该载体可以是任何形状，但是优选的是适合工业生产和用户使用的形状。该形状可以是立方体、平行六面体、圆柱体、半圆柱体、或球形，但是也不排除其它形状。这些形状可以使它的一个表面携带或支撑分生组织；并且它具有体积大于分生组织体积的孔穴，该孔穴为分生组织提供了一定量的空气，从而提供了发芽或发育所需的氧气。
载体可以是干的、脱水的或者可以是高达100％湿度的水合形式。
根据本发明，分生组织***于载体中，且载体没有完全覆盖分生组织，因此使得分生组织总是与一定量的空气接触。
更佳地，本发明的包被分生组织还含有围绕着载体的至少一层外表结构，该外表结构部分覆盖分生组织使得分生组织仍然与一定量的空气接触。
本发明中的外表结构是指一层外表薄层，它基本上没有改变载体的形状而且具有非常均一的厚度，通常为1—250微米，更佳为5—100微米。该外表结构基本上由成膜物质构成，该成膜物质本身具有憎水性和/或液态水的不渗透性，并且不妨碍根的向外生长。
可以作为成膜物质的材料有：合成聚合物、天然聚合物、人工合成聚合物、和非聚合的成膜材料。
可以用于本发明的合成聚合物有以下物质：乙烯基树脂尤其是聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚氟乙烯、聚偏氯乙烯、聚氯三氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯基酯共聚物；基于甲醛或丁醛的乙烯基聚合物；聚酯尤其是聚对苯二甲酸乙二醇酯；聚碳酸酯；聚酰胺尤其是聚(11-氨基十一烷酰胺)或尼龙11；聚醚尤其是聚苯氧；氯丁橡胶、聚异戊二烯、聚氨酯、丁基橡胶和聚硅氧烷尤其是有机聚硅氧烷聚合物。
作为天然聚合物的例子，可以提及的有杜仲胶和天然橡胶。
作为人工合成聚合物的例子，可以提及的有不透水的纤维素衍生物，尤其是乙基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素和硝基纤维素。
非聚合物型的成膜物质有脂肪和蜡，尤其是棕榈油和椰子油。
位于分生组织的载体外面的不透水的外表薄层可以用各种已知的方法制备，特别是通过喷射法、涂抹法或浸泡法制备。溶液、乳化液或悬浮液都可以用于制备过程。
除了各种已经描述过的组份之外，本发明的分生组织还可以含有各种其它类型的添加剂或佐剂，尤其是农用化学产品，如杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、肥料、微量元素、营养成分或用于显示位置的添加剂如着色填料或粘合剂。
如上所述的本发明的包被分生组织具有优于已有技术的出色性能，即良好的干燥度和它不仅保证了植物组织的存活，而且在再水化之后，可以以出众的产率得到(转变成)完整的植株，从而符合现代农业的需要。
结合附图1和2，可以更好地理解本发明。这些附图用于阐述本发明而不限制本发明的范围。
图1显示了一个大体为圆柱体形式的包被分生组织的例子。其中，分生组织(此处是体细胞胚1)被放在内部孔穴2中。孔穴2位于固相载体3中并且被外表结构外层4所包围。在载体2和外表结构薄层4之间是涂层5。两个涂层4和5没有覆盖载体的顶部；其中涂层5是纤维素滤膜的圆筒体部分。
图2是本发明的另一种包被分生组织的例子的横截面图。它大体上是球形，具有与图1相同的组成，只是孔穴2并不向外开口。
本发明还涉及一种获得本发明中包被分生组织的方法，指将植物细胞悬浮液培养至胚阶段，再产生分生组织，其特征在于该分生组织附着于干的或可干燥的固相载体，该固相载体能够吸收营养培养基并且允许发芽，其附着方式使得载体部分覆盖分生组织而且分生组织仍然与一定量的空气接触。
在众所周知的第一步骤中，分生组织的制备可以用已知的用于大规模生产的方法，例如F.Molle等人的方法(Synseeds，Ch 15，p.257-287)，通过胚胎发生，然后收获，并在含蔗糖的培养基上成熟。培养基可以是在约4℃凝固的固态培养基，或者是在20—25℃的液态培养基。如果还没有收获胚，那么可以现在进行。
分生组织然后在干燥室中干燥，从而获得低含水量的组织，含水量较佳为低于0.40克水/克干重。
在形成外表薄层或涂层之前或之后，将这样获得的分生组织放置、附着、或***于上述的载体的表面，更佳为中央或载体中的孔穴中，从而使得在分生组织的附近存在一定量的空气。
为了保证相对于外部培养基的封闭，携带分生组织的载体，如果合适，最好先通过粘合剂和/或增稠剂用诸如粘土之类的材料制成的涂层覆盖住。该涂层在干燥后会形成某种外壳，该外壳的功能就是防止用于外表结构的溶液中的聚合物渗透到载体的核心，从而造成载体核心的阻塞并延缓甚至阻碍发芽的进行。然后再用一种成膜聚合物的水溶液涂布，一旦干燥后便形成外表结构。
如果本发明的包被分生组织是处于脱水状态，则它们可以逐渐地再水化以便用于实际应用、用于播种或用于任何类型的作物。
分生组织的干燥度的控制以及发芽质量的控制使得本发明的产品表现出出色的性能，即它们具有出色的干燥度和储存性，同时又维持它们的发芽能力。
结合下列实施例，可以更好地理解本发明。这些实施例用于阐述本发明而不限制本发明。
实施例1：制备体细胞胚
植物材料为无菌的雄性胡萝卜“系”(C4株)。由Tezier公司提供的种子在无菌条件下发芽。摘取下胚轴，将其置于MS(Murashigeand Skoog)H+培养基上以获得愈伤组织。该培养基的组成将在下面的表1中给出，其特征是存在一种植物生长素，2，4-二氯苯氧乙酸。然后将愈伤组织置于液态的MSH+培养基以便获得未分化的细胞悬浮液。
将细胞悬浮液维持在含有100毫升MSH+培养基的250毫升的圆锥烧瓶中。每隔12天，通过筛目大小为50μ的筛布(Scynel；Switzerland)的过滤而继代培养悬浮液。留在过滤器上的组份被称重然后再按每100毫升培养基1克生物材料的比例悬浮于圆锥烧瓶中。该步骤可在含有100毫升MSH+培养基的250毫升的圆锥烧瓶中进行(维持阶段)，或在含有500毫升培养基的1升圆锥烧瓶中(繁殖阶段)进行。悬浮液被放在生长箱中，条件为：25℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗，且光强度为15μEm-2s-1。悬浮液在轨道式摇床(Biobloc scientific agitator 74493)上以100转/分的速度一直摇动。
 大量元素(mM)     MSH+     MSH°   He 0.4M    HE 44mM
 NH4NO3KNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4KClNaNO3NaPO4H2.7h2O     20.618.83.01.51.25     20.618.83.01.51.25 0.510.110.07.00.5 0.510.110.07.00.5
 微量元素(mM)
 KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.7H2OCoCl2.6H2ONaEDTAFeSO4.7H2O      5.0100.0100.030.01.00.10.1100.0100.0      5.0100.0100.030.01.00.10.1100.0100.0      5.0100.0100.030.01.00.10.1100.0100.0      5.0100.0100.030.01.00.10.1100.0100.0
 VITAMINS(mM)
 硫胺素烟酸腺嘌呤     14.840.610.8     14.840.610.8
 蔗糖(M)2，4-D(M)gelrite(g)     0.0610-7      0.06      0.46.0    0.0446.0
    PH      5.8      5.8      5.6      5.6
表1：用于预处理(He 0.4M)和发芽(He 44mM)的培养基(MSH+/MSH°)的组成。(He指Heller培养基)。
为了获得胚，将细胞悬浮液在MSH+培养基上培养12天，然后将其通过筛目大小为100μ的筛布过滤。得到滤液，再通过筛目大小为60μ的筛布。留在滤布上的组份用MSH°培养基漂洗。该培养基的组成在表1中给出，其特征是不存在植物生长素。然后将其溶于45毫升MSH°培养基中，在300g离心5分钟(Jouan C312离心机)。去除上清液，细胞组份再溶于45毫升MSH°培养基中。按同样方式再离心两次。
然后取出1毫升由细胞离心物构成的悬浮液，将其溶于10毫升MSH°培养基中，在900g离心5分钟，从而可以确定在1毫升悬浮液中的组织的数量。细胞材料随后被悬浮在：
—或者MSH°培养基中，含有500毫升培养基的1升圆锥烧瓶，轨道式摇床以100转/分的速度一直摇动，光强度和光周期与上面的条件相同；
—或者含有0.02％活性炭(AC)(Merck)的MSH°培养基中，含有250毫升培养基的500毫升圆锥烧瓶，轨道式摇床以75转/分的速度一直摇动，处于黑暗中。
接种密度为1克生物材料/升。细胞材料被保持在悬浮维持条件下12天，以获得胚。
在MSH°培养基上培养12天后收获胚。胚悬浮液通过筛目为400μ的筛布(Scynel)进行过滤。留在滤布上的组份通过用MSH°培养基的漂洗而与滤布分开，然后转移至直径9厘米的培养皿中(Plastiques Gosselin；France，ref BP 90)。用移液吸管在解剖镜下将大小为500—1500μ的胚取出。
实施例2：涂层和外表结构
a)将单位体积约为0.5立方厘米、由乙酸纤维素滤膜构成的、单位重量小于200毫克的载体浸于涂层混合物中。涂层混合物含有胶凝剂(I型角叉菜胶，0.5％，和50mM CaCl2)、增稠剂(NatrosolHHR250：1.5％)、和粘土填料(Argirec B22：20％)构成。通过将0.5克I型角叉菜胶溶于热水中，再向溶液中加入1.5克NatrosolHHR250和730毫克CaCl2·2H2O，然后加热并加入25克Argirec于溶液中，同时用Waring blendor混合机充分搅拌，可以获得100毫升这种涂层混合物。
然后让纤维素滤膜干燥。
借助移液吸管或镊子，通过涂层的开口部分在每个涂层中引入一个胚。
b)制备在所有情况下都在蒸馏水或培养基中含有5％明胶、10％粘土填料(Argirec B22)，1％增稠剂(Natrosol)的组合物。剧烈搅拌热溶液以形成气泡，气泡因增稠剂的存在而稳定化。以液滴形式，在明胶还没有凝固的温度(30—35℃)下，用吹气法将该组合物置于不粘的载体上。当明胶冷却，便使气泡结构固定。这样获得的半球形结构被翻过来，凸面向下。将胚置于半球的平表面上。最后，湿润接触面，然后将另一个半球粘在第一个半球上。
以聚氯乙烯(3.33％)、聚乙酸乙烯酯(3.33％)和膨润土SDl(3.33％)的四氢呋喃溶液形式，将外部的外表结构的一个或两个薄层涂布于包被胚的一部分上。然后将含有5％各种相同组份的第二种配制物按相同方式施涂。
为了保证操作是在无菌条件下进行，应在将涂料涂布于载体之前、或者在形成两个外表结构之前或之间，将涂料进行高压灭菌。该处理还可保证涂层完全***漏。
实施例3：干燥
可以使胚干燥的预处理过程可以在凝固的培养基上进行。在这种情况下，将每批25个胚置于滤纸上(Whatman 1820025，Maid-stone，England).然后置于直径为6厘米、含有0.4M Heller培养基(组成见表1)(该培养基中已经加入6g/l Phytagel(Sigma))的培养皿(Caric；france)中。培养皿用“Scell′o′frais”保鲜膜封住，接着置于冷柜中，于4℃，黑暗中保存7天。
预处理可以在室温下于液态培养基中进行。可以用0.4M液态的He培养基替换胚胎发生阶段的MSH°培养基。然后悬浮液在100转/分钟的摇动速度、于4℃(四天)或25℃(三天)和黑暗中摇动培养。
接着将经过预处理的胚置于干燥器中，其中相对湿度用过饱和的碳酸钾(Merck)溶液维持在45％。该溶液为每16毫升水加40克盐的混合物。带胚的滤纸被置于空的、直径为6厘米的培养皿中。再将培养皿置于干燥器中。用“Scell′o′frais”保鲜膜封住干燥器，然后将其置于黑暗中，在4℃，处理不同的时间(从15—50天不等)，使得胚的最终水含量小于0.40克/克干重。
实施例4：发芽
胚的发芽是通过将携带胚的滤纸转移至直径6厘米的培养皿中的44mM Heller培养基(组成见表1)上，该操作可以在一完成干燥前的处理之后，或者在各种干燥日期之后进行。培养皿被置于生长箱中，温度为25℃，光周期为16小时光照和8小时黑夜，且光强度为55μEm-2s-1。当幼苗长至高度为约l厘米时，按每培养皿30株幼苗的比例将其转移至Plancton皿(Flow laboratories；USA)中的44mM Heller培养基上。
在下列的所有的例子中，用下列参数进行观察：
在胚被转移后数天，测量置于44mM Heller培养基上的胚的存活率和发芽率，其定义如下：
—存活率：显示长出根或顶端的胚的数目与胚的总数之比。
—发芽率：显示长出含叶绿素的顶端和根的胚的数目与胚的总数之比。
在转移至Plancton皿后约两个月，评估转化率。转化率的定义如下：
—显示长出第一对真叶的胚的数目与胚的总数之比。
4A)“胚＋涂层，不干燥”：
如实施例1那样获得胚(1a于MSH°培养基上，涂层和外表结构如实施例2a)；
4B)“干燥的胚＋涂层”：
如实施例1那样获得胚(于MSH°培养基上)，然后如实施例3那样进行干燥；涂层和外表结构如实施例2；
4C)“干燥的包被胚”：
如实施例1那样获得胚(于MSH°培养基上)，然后如实施例2a)那样进行涂布，包被的胚如实施例3那样进行干燥。
实施例4A)至4C)的有关胚的数据列于表2。其中比较了各例子中的存活率、发芽率、和转化率。此外，如果合适，还与生长在不含活性炭的培养基上的无涂层的、不脱水的(E.N.1)和脱水(E.N.2)的胚比较了根穿过涂层而出现的长根率。
 实施例号  存活率  发牙率  转化率  长根率
   EN1NE24A4B4C     988695100100     98869510085    7770459570     --6595-
这些数据清楚地表明：
1)包被的、未干燥的胚(4A)具有出色的存活率和发芽率；
2)包被的、干燥的胚(4C)具有出色的存活率、发芽率和令人满意的转化率；
3)干燥的然后被包被的胚(4B)不仅具有出色的存活率和发芽率，而且具有出色的转化率以及与转化率相比出色的长根率。这证明了本发明的包被的分生组织的极好的适用性。
实施例5：包被种子的发芽测试
得自Clause公司的苣荬菜种子在无菌条件下发芽。这些种子通过在含35克/升次氯酸钙的溶液中，于真空下放置2小时而灭菌。漂洗种子3次后，将种子置于含有10毫升上述的44mM Heller培养基的试管中，每个试管一粒种子。这些种子已经被包被过或未包被过。
b)当涂层用280微升的Heller培养基浸渍后，将种子置于实施例2a)中所述的涂层中。再进行两次重复，每次处理和每次操作为10粒种子。
在这些条件下，于播种后的17天获得下列数据。
NT：未包被的对照种子
5：包被的种子
实施例号  发芽率％  转化率％  长根率％  植株鲜重的平均值(mg)
    NT5    9273    9273    9273        162102
这些数据清楚地表明，与小植株播种方式比较，包被的种子(5)不仅具有令人满意的发芽率，而且具有令人满意的转化率，并且具有相对于发芽的小植株具有突出的长根率。这表明本发明的包被的植株具有出众的显现能力。

Claims (17)

1.一种包被的分生组织，其特征在于，它包括：
—干的或可干燥的分生组织，和
—干的或可干燥的固相载体，
—该固相载体与分生组织接触，并且部分覆盖分生组织，其覆盖方式使得分生组织仍然与一定量的空气接触，
—该固相载体能够吸收营养培养基，
—和该固相载体不妨碍发芽。
2.如权利要求1所述的包被分生组织，其特征在于，该分生组织是干的。
3.如权利要求1所述的包被分生组织，其特征在于，该分生组织是可干燥的或水合的。
4.如权利要求1—3所述的包被分生组织，其特征在于，该固相载体是干的。
5.如权利要求1—3所述的包被分生组织，其特征在于，该固相载体是可干燥的或水合的。
6.如权利要求1—3所述的包被分生组织，其特征在于，该分生组织被***纤维固相载体中。
7.如权利要求6所述的包被分生组织，其特征在于，该固相纤维载体是纤维素滤膜。
8.如权利要求1—7所述的包被分生组织，其特征在于，该固相载体含有粘合剂。
9.如权利要求1—8所述的包被分生组织，其特征在于，该固相载体含有增稠剂。
10.如权利要求1—9所述的包被分生组织，其特征在于，它还含有围绕着载体的至少一层外表结构，该外表结构部分覆盖分生组织并且使得分生组织仍然与一定量的空气接触。
11.如权利要求10所述的包被分生组织，其特征在于，在固相载体和外表结构层之间有中间层。
12.如权利要求10所述的包被分生组织，其特征在于，该涂层含有粘合剂。
13.如权利要求10所述的包被分生组织，其特征在于，该涂层含有增稠剂。
14.一种获得权利要求1—13所述的包被分生组织的方法，其中植物细胞悬浮液培养至胚阶段，再产生分生组织，其特征在于，该分生组织附着于干的或可干燥的固相载体，该固相载体能够吸收营养培养基并且不妨碍发芽，附着方式使得载体部分覆盖分生组织而且分生组织仍然与一定量的空气接触。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在将分生组织放置在其位置上之前或之后，沉积至少一层部分覆盖载体的外表结构，其方式使分生组织一旦附着于载体，仍然和一定量的空气接触。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在载体被放置在其位置之前或之后干燥分生组织。
17.一种如权利要求1—7中任一权利要求所述的分生组织的用途，其特征在于通过播种或培养而应用。
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