CN110243917A - 一种快速检测小分子化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速检测小分子化合物的方法，包括以下步骤：明确待测样品内的目标化合物，选取与待测样品相兼容的基质，以及与目标化合物结构一致且含有稳定同位素标记的标准品，将基质和标准品配制为乙腈水溶液后与待测样品混合，得进样混合液，采用具有MRM功能的MALDI‑MS质谱仪对待测样品依次进行一级扫描和二级扫描，得到二级图谱，在二级图谱的基础上进行数据处理和分析，即可对目标化合物进行定性定量分析。本发明无需开发应用不受限且适合小分子的基质，也避开了衍生化的繁琐步骤，快速、准确、成本低、普适性高。

Description

一种快速检测小分子化合物的方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种采用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱仪快速检测小分子化合物的方法。
背景技术
小分子化合物的检测有多种分析手段，如：①光学手段(基于紫外可见光吸收、荧光、化学发光等进行检测)，具有检测成本低、速度快、通量高等优点。但无法检测无光吸收或即使通过反应也无法获得光信号的代谢产物，并且当化合物所处环境体系较复杂时，无法做到排除同类物质的干扰进行特异识别，除此之外光学分析手段灵敏度较低，对低含量化合物较难检测；②色谱技术(如高效液相色谱、气相色谱等)，具有准确、灵敏度高等优点。但其分析时间长，每个样品均需要耗费大量的时间从前处理、进样、检测、数据分析直至结果呈现，其通量极低，当面对上百甚至上千个样品时，各个样品的耗时严重制约检测速度；③核磁共振技术，具有准确的特点，但对样品纯度要求高，分析复杂样品体系时解谱困难，并且检测限高、通量低，也不适合快速检测；④质谱技术，其灵敏度高，检测限低，特别适合微量、痕量化合物的检测，并且准确度高，可以通过精确分子量对化合物进行定性，进而定量检测。但质谱仪类型众多，例如高分辨质谱仪、三重四级杆质谱、基质辅助激光解析电离质谱仪等，很多质谱仪需要与液相、气相色谱联用，联用后，则受制于色谱技术的低通量，使联用型质谱仪也不适合小分子化合物的快速检测，并且联用型质谱仪的成本较高。
基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS)是一种离线型质谱仪，其工作原理为：用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。MALDI-MS在使用自动点靶设备点样时，一块样品靶最多可点至1536个样品，每个样品点的检测时间只有几秒，具有高灵敏、高通量、分子结构完整等特点，广泛应用与蛋白质、多肽、核算等生物大分子的研究中。但由于传统的有机小分子基质在分析小分子化合物时，低子量区(m/z<1000)会产生干扰及抑制效应，使MALDI-MS在分析小分子时结果欠佳，使其对小分子的分析一直未得到广泛推广。为了解决这一问题，许多手段被提出，例如：(1)开发适合小分子使用的新型基质，以排除基质干扰和离子抑制效应，目前已有大量的有机及无机基质被开发出来，如纳米材料等。但这些基质的应用非常受限，一般只能对一种或一类化合物产生较好效果，普适性差，不能在一次检测中实现非同类化合物的同时检测；
(2)另外一种较常见的方法为对小分子化合物进行衍生化，来避免基质背景信号的干扰。但这种方法更为受限，首先要找到特异性的衍生化试剂，费用高；其次衍生化步骤繁琐，反应速度慢，时间成本高；再次，应用范围小，普适性差。例如公开号为CN107449650A的中国发明专利公开了一种基于MALDI-MS和稳定同位素标记的N聚糖快速定量分析方法。主要步骤为：①在微波辅助下PNGaseF使N聚糖以糖胺形式释放②d0/d5-苯甲酰氯分别与糖胺发生亲核反应，之后纯化③将d0-苯甲酰氯和d5-苯甲酰氯衍生的聚糖以摩尔比1:1的比例进行混合④对混合后的d0/d5-苯甲酰氯衍生的N聚糖进行甲胺化反应⑤MALDI-MS检测⑥数据分析。该专利即对小分子化合物进行衍生化，以定量检测小分子寡糖-N聚糖，衍生化步骤繁琐，应用范围小，普适性差。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中所述的缺陷，从而提供一种快速检测小分子化合物的方法，该方法可定性定量的检测出小分子化合物，无需开发应用不受限且适合小分子的基质，也避开了衍生化的繁琐步骤，快速、准确、成本低、普适性高。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种快速检测小分子化合物的方法，包括以下步骤：
(1)明确待测样品内的目标化合物，选取基质与标准品；
所述基质与所述待测样品相兼容即可；所述标准品化学结构与所述目标化合物结构一致，且含有稳定同位素标记；
(2)将所述基质配置为基质乙腈水溶液；将所述标准品配置为标准品乙腈水溶液，得内标溶液；将所述基质乙腈水溶液和所述内标溶液按比例与所述待测样品进行混合，得进样混合液；
(3)采用MALDI-MS质谱仪对所述进样混合液内的目标化合物进行检测；其中所述MALDI-MS质谱仪具有MRM功能，所述MRM功能用于对选定的所述目标化合物进行质谱信号的采集，并获得二级碎片信息；
(4)对所述二级碎片信息进行数据处理，获取所述待测样品内目标化合物的浓度。
优选地：步骤(1)中所述稳定同位素标记为13C标记、15N标记、氘标记或氚标记。
优选地：步骤(1)中所述基质为有机基质和/或无机基质，所述有机基质包括CHCA、DHB、SA、9-AA、1,5-DAN，所述无机基质包括石墨烯、纳米材料、介孔材料。当然使用本发明的方法检测小分子化合物并不仅限于所述基质，所述基质与所述待测样品极性相同、相兼容即可。
优选地：所述基质为1,5-DAN，步骤(2)中所述基质乙腈水溶液和所述内标溶液均为50％的乙腈水溶液。
进一步地：步骤(2)中所述基质乙腈水溶液以及所述内标溶液的浓度均为10mg/mL，所述基质乙腈水溶液、所述内标溶液与所述待测样品的体积比为10：1：1。
优选地：步骤(3)中所述二级碎片数据的采集方法为：
a、先设定一级参数，根据所述目标化合物选定具有特征性的母离子；
b、再设定二级参数，将所述具有特征性的母离子进行碰撞诱导，得到二级谱图以及各子离子峰的质谱信号。
优选地：步骤(4)中所述数据处理为通过所述二级碎片信息调出具有特征子离子的目标化合物的碎片峰以及被稳定同位素标记的目标化合物的碎片峰，并根据公式计算目标化合物的相对定量信息。
进一步地：所述公式为：
其中，C内标为内标溶液的浓度；
X为二级谱图中特征子离子双峰中非标化合物特征离子峰的intensity值；
Y为二级谱图中特征子离子双峰中内标化合物特征离子峰的intensity值；
e为根据化合物结构式计算得到的非标化合物特征子离子峰与其天然存在的同位素峰的相对丰度，为一常数；
f为内标溶液中可能产生的与非标化合物特征离子峰分子量相同的子离子与内标化合物特征离子峰的相对丰度，为一常数，由实验测得，也可为0。
优选地：步骤(3)中所述进样混合液通过自动液体处理设备或手动点到所述MALDI-MS质谱仪的样品靶上，得样品点，所述样品点的个数为多个，步骤(4)中所述数据处理为对每一个所述样品点的二级碎片信息进行处理，获取平均值。
检测限(LOD,limit of detection)又称为检出限，指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差，是方法(方法检测限MDL)和仪器(仪器检测限IDL)灵敏度体现的重要指标之一。
小分子化合物，即OCO小分子。凡分子量小于500的分子称之为小分子，小分子一般为简单的单体物质。从化学的角度上说，小分子就是分子量比较小的天然化合物，通常是指分子量小于1000道尔顿的生物功能分子；从生物角度上说，小分子就是具有生物活性的小肽、寡肽、寡糖、寡核苷酸、维生素、矿物质、小分子团水、植物次生代谢产物及其降解产物如苷元、黄胴元、甙元、生物碱等；从营养角度上说，小分子是营养元素的“第二代”，人们可以姑且简称之为“二代营养素”。
CHCA(α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid)为α-氰基-4-羟基肉桂酸的缩写，别称为α-氰基-4-羟基桂皮酸，化学式为C10H7NO3。
DHB(2,5-Dihydroxybenzoic acid)是2,5-二羟基苯甲酸的缩写，又称5-羟基水杨酸；氢醌羧酸；龙胆酸；分子式为C7H5O4，白色针状结晶，溶于水、乙醇和***，难溶于氯仿、苯和二硫化碳。
SA(3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-enoic acid)是芥子酸的缩写，别称4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸。化学式：C11H12O5，为黄褐色粉末，有刺激性，通常对水是不危害的。与酸类、食用化学品分开存放。溶于热乙醇，微溶于水和***。
9-AA(9-aminoacridine)是9-氨基吖啶的缩写，又称氨基吖啶或3-氨基邻苯二甲酸酐，分子式为C13H10N2，黄色晶体或粉末。
1,5-DAN(1,5-Naphthalenediamine)是1,5-二氨基萘的缩写，又名1,5-萘二胺，分子式是C10H10N2，分子量为158.1998，白色或浅紫色、紫色粉末。
质荷比(M/Z)：是质谱分析中的一个重要参数，以m/z表示。
本发明的有益效果为：
(1)本发明采用MRM技术结合稳定同位素技术实现对多个小分子化合物的同时定性与定量，无需为了排除基质干扰和离子抑制效应而开发应用不受限且适合小分子的基质，也避开了衍生化的繁琐步骤；
本发明首先明确待测样品内的目标化合物，该目标化合物可以为单个的小分子化合物，也可为多个小分子化合物，其目的是为了对MRM设置指定所需采集的信号，MRM基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术，本发明使用二级图谱对小分子化合物进行定性分析，完全避开了基质对待测小分子的干扰，无需对待测样品进行衍生化处理，所得谱图干净，特异性强；可同时检测多种不同类型的小分子，避免了由于基质选择不当造成的无响应或响应值低等问题，灵敏度高；使用二级特征碎片与同位素的比例关系进行定量分析，避免了由于基质的不均匀共结晶对点-点定量比较时的干扰，定量准确；不需要经过衍生化等复杂处理，简单混合后即可上机检测，几秒内即可完成，本发明相较于传统一级图谱鉴定来说避免了不同的代谢小分子其荷质比(或分子量)的不唯一性的假阳性结果，采用精确分子量+同位素pattern的二级图谱鉴定方法的检测结果可信度更高，且快速、准确、成本低、普适性高；
(2)本发明采用13C等稳定同位素进行标记，根据小分子化合物的自身性质来说，C、H、N等元素更理想和稳定；
(3)本发明基于MRM技术和稳定同位素标记的方法完全避开了基质对待测小分子的干扰，降低了传统小分子化合物检测时对基质选择的标准，本发明可根据待测样品目标化合物的性质，选取极性相同、具有兼容性的基质即可，所用的基质既可以使有机基质也可以是无机基质或者二者的结合；对于大多数的小分子化合物来说，可选择1,5-DAN作为基质，在进样以前先将固体基质配置为10mg/mL的50％的乙腈水溶液，同样的，将标准品配置为10mg/mL的50％的乙腈水溶液，形成内标溶液，将基质乙腈水溶液、内标溶液与待测样品简单混合得到进样混合液即可进行检测，例如按照10：1：1的体积比进行混合，本发明无需对待测样品进行衍生化处理，极大的降低了小分子化合物的检测时间；
(4)本发明二级碎片数据的采集条件设置为一级离子扫描范围：
50-1000Da；二级离子扫描范围：30-1000Da，其中二级离子选择窗口的依据为根据一级检测结果，将具有特征性的母离子进行碰撞诱导，去除其他子离子的干扰，若为多个目标化合物时，设定多个二级离子选择窗口；
(5)本发明还根据上述检测方法提出了目标化合物的定量计算公式，该公式根据步骤(4)所采集到的二级碎片信息可快速的得出相应目标化合物的浓度，当然，为了进一步增加本发明的准确性，该浓度值最好为多个样点值的平均值，该平均值的可由进样时设置多个样品点来实现。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例所提供的检测流程示意图；
图2为实施例1中MRM采集的二级碎片信息。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用到的主要仪器：
基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱仪ABSciex MALDI TOF/TOF5800，由ABSCIEX中国公司提供；
材料：
1,5-二氨基萘，由湖北信康医药化工有限公司提供；
乙腈，由济南汇丰达化工有限公司提供；
标准品，由sigma公司提供；
水，为去离子水，由实验室自行制备。
实施例1
如图1所示，一种快速检测柠檬酸-2,4-C2的方法，包括以下步骤：
(1)选定柠檬酸-2,4-C2为目标化合物；
(2)将作为基质的1,5-二氨基萘配制成浓度为10mg/mL的50％乙腈水溶液，得基质乙腈水溶液；
(3)将购自sigma公司的柠檬酸-2,4-13C2配制浓度为10mg/mL的50％乙腈水溶液，得内标溶液；
(4)将所述基质乙腈水溶液、内标溶液和待测样品以10:1:1的体积比混合，并进行反复吹打或涡旋振荡以混匀，得进样混合液；
(5)将每1ul的所述进样混合液手动点到所述MALDI-MS的一个样品靶上，形成样品点并晾干；
(6)将干燥后的样品靶放入质谱样品仓中，进靶，使用TOF/TOF Service软件，校正质量轴，校准通过后，再对样品点进行MRM质谱数据采集。采集方法为：a、先设定一级参数，根据所述目标化合物选定具有特征性的母离子；其中检测模式，Reflector negative；激光强度，4000；离子扫描范围：50-1000Da；b、再设定二级参数，将所述具有特征性的母离子进行碰撞诱导，去除其他子离子的干扰，只对选定的所述特征子离子进行质谱信号的采集。二级离子选择窗口为Precursor Mass(Da)，191.0197；Precursor Mass Window(Da)，3；激光强度为4800；离子扫描范围为30-1000Da；设定好采集条件后进行检测，得二级碎片信息，如图2所示；
(7)将质谱检测结果使用软件中的“Launch Peaks to Mascot”功能，导出数据为txt格式。读取txt数据中柠檬酸特征碎片离子峰m/z 111和m/z113的intensity值，按照下列公式计算待测样品中柠檬酸的含量。
其中，C内标为内标溶液的浓度，此处为柠檬酸-2,4-13C2的浓度；
X为二级谱图中特征子离子双峰中非标化合物特征子离子峰的intensity值；此处为12C-峰的intensity值，即m/z 111的intensity值；
Y为二级谱图中特征子离子双峰中内标化合物特征子离子峰的intensity值；此处为13C-峰的intensity值，即m/z 113的intensity值；
e为根据化合物结构式计算得到的非标化合物特征子离子峰与其天然存在的同位素峰的相对丰度，为一常数，此处为0.6；
f为内标溶液中可能产生的与非标化合物特征离子峰分子量相同的子离子与内标化合物特征离子峰的相对丰度，为一常数，由实验测得，也可为0。
将所采集到的各数据代入上述公式，即得待测样品中柠檬酸的浓度。
实施例2
如图1所示，一种快速检测苹果酸-2-C、葡萄糖-1-C、谷氨酸-5-C、葡萄糖-6-磷酸-1-C的方法，包括以下步骤：
(1)选定苹果酸-2-C、葡萄糖-1-C、谷氨酸-5-C、葡萄糖-6-磷酸-1-C为目标化合物；
(2)将作为基质的1,5-二氨基萘配制成浓度为10mg/mL的50％乙腈水溶液，得基质乙腈水溶液；
(3)将购自sigma公司的苹果酸-2-13C、葡萄糖-1-13C、谷氨酸-5-13C、葡萄糖-6-磷酸-1-13C配制成浓度均为10mg/mL的50％乙腈水溶液，得混合稳定的内标溶液；
(4)将所述基质乙腈水溶液、内标溶液和待测样品以10:1:1的体积比混合，并进行反复吹打或涡旋振荡以混匀，得进样混合液；
(5)将每1ul的所述进样混合液手动点到所述MALDI-MS的一个样品靶上，形成样品点并晾干，所述样品点为多个；
(6)将干燥后的样品靶放入质谱样品仓中，进靶，使用TOF/TOF Service软件，校正质量轴，校准通过后，再对样品点进行MRM质谱数据采集。采集方法为：a、先设定一级参数，根据所述目标化合物选定具有特征性的母离子；其中检测模式，Reflector negative；激光强度，4000；离子扫描范围：50-1000Da；b、再设定二级参数，将所述具有特征性的母离子进行碰撞诱导，去除其他子离子的干扰，只对选定的所述特征子离子进行质谱信号的采集。二级离子选择窗口为Precursor Mass 1(Da)，133.0142；Precursor Mass Window 1(Da)，2；Precursor Mass 2(Da)，179.1489；Precursor Mass Window 2(Da)，2；Precursor Mass 3(Da)，146.0458；Precursor Mass Window 3(Da)，2；Precursor Mass 4(Da)，259.1288；Precursor Mass Window 4(Da)；激光强度为4800；离子扫描范围为30-1000Da；
(7)将质谱检测结果使用软件中的“Launch Peaks to Mascot”功能，导出数据为txt格式。分别读取txt数据中苹果酸的特征碎片峰m/z 115和m/z116的intensity值，葡萄糖特征碎片峰m/z161和m/z162的intensity值，谷氨酸特征碎片峰m/z128和m/z129的intensity值，葡萄糖-6-磷酸特征碎片峰m/z128和m/z129的intensity值，分别按照下列公式计算待测样品中各化合物的含量。
其中，C内标为内标溶液的浓度，此处为柠檬酸-2,4-13C2的浓度；
X为二级谱图中特征子离子双峰中非标化合物特征子离子峰的intensity值；
Y为二级谱图中特征子离子双峰中内标化合物特征子离子峰的intensity值；
e为根据化合物结构式计算得到的非标化合物特征子离子峰与其天然存在的同位素峰的相对丰度，为一常数；
f为内标溶液中可能产生的与非标化合物特征离子峰分子量相同的子离子与内标化合物特征离子峰的相对丰度，为一常数，由实验测得，也可为0。
将所采集到的各数据代入上述公式，即得待测样品中苹果酸、葡萄糖、谷氨酸和葡萄糖-6-磷酸的浓度最好给出检测的谱图。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种快速检测小分子化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)明确待测样品内的目标化合物，选取基质与标准品；
所述基质与所述待测样品相兼容即可；所述标准品化学结构与所述目标化合物结构一致，且含有稳定同位素标记；
(2)将所述基质配置为基质乙腈水溶液；将所述标准品配置为标准品乙腈水溶液，得内标溶液；将所述基质乙腈水溶液和所述内标溶液按比例与所述待测样品进行混合，得进样混合液；
(3)采用MALDI-MS质谱仪对所述进样混合液内的目标化合物进行检测；其中所述MALDI-MS质谱仪具有MRM功能，所述MRM功能用于对选定的所述目标化合物进行质谱信号的采集，并获得二级碎片信息；
(4)对所述二级碎片信息进行数据处理，获取所述待测样品内目标化合物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述稳定同位素标记为13C标记、15N标记、氘标记或氚标记。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述基质为有机基质和/或无机基质，所述有机基质包括CHCA、DHB、SA、9-AA、1,5-DAN，所述无机基质包括石墨烯、纳米材料、介孔材料。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质为1,5-DAN，步骤(2)中所述基质乙腈水溶液和所述内标溶液均为50％的乙腈水溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述基质乙腈水溶液以及所述内标溶液的浓度均为10mg/mL，所述基质乙腈水溶液、所述内标溶液与所述待测样品的体积比为10：1：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述二级碎片数据的采集方法为：
a、先设定一级参数，根据所述目标化合物选定具有特征性的母离子；
b、再设定二级参数，将所述具有特征性的母离子进行碰撞诱导，得到二级谱图以及各子离子峰的质谱信号。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述数据处理为通过所述二级碎片信息调出具有同一特征子离子的目标化合物的碎片峰以及被稳定同位素标记的目标化合物的碎片峰，并根据公式计算目标化合物的相对定量信息。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述公式为：
其中，C内标为内标溶液的浓度；
X为二级谱图中特征子离子双峰中非标化合物特征子离子峰的intensity值；
Y为二级谱图中特征子离子双峰中内标化合物特征子离子峰的intensity值；
e为根据化合物结构式计算得到的非标化合物特征离子峰与其天然存在的同位素峰的相对丰度，为一常数；
f为内标溶液中可能产生的与非标化合物特征离子峰分子量相同的子离子与内标化合物特征离子峰的相对丰度，为一常数，由实验测得，也可为0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述进样混合液通过自动液体处理设备或手动点到所述MALDI-MS质谱仪的样品靶上，得样品点，所述样品点的个数为多个，步骤(4)中所述数据处理为对每一个所述样品点的二级碎片信息进行处理，获取平均值。
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