CN112410425A - 用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字pcr试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒及其应用。本发明提供了一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针；用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针；用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针；以及用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针。本发明利用甲基化特异性的PCR检测方法结合微滴数字PCR检测方法，对BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因甲基化位点精确检测，绝对定量、特异性高、准确性高以及灵敏度高，检测方便快捷、结果准确可靠，能够用于肝癌早期的筛查。

Description

用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒及其应用。
背景技术
肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤。
根据最新统计，全球发病率已超过62.6万/年，居于恶性肿瘤的第6位：死亡接近60万/年，位居肿瘤相关死亡的第4位。2018年，全球将会有841,080例新发病例和781,631例死亡病例。中国是众所周知的肝癌大国，全世界每年约50％的新发肝癌和肝癌死亡出现在中国。肝癌正严重威胁我国人民健康和生命。原发性肝癌的临床表现极不典型，其症状一般多不明显，特别是在病程早期。虽然肝癌的治疗技术日新月异，但是肝癌的症状在早期很不明显，甚至患病后较长时间毫无不知感觉。待病情发展到一定程度才会逐步产生一些以肝区疼痛、食欲下降、疲乏无力、日渐消瘦等症状。到晚期则会有黄疸、腹水、呕血、昏迷等表现。肝癌病人的上腹部常可摸到巨大的肿，但此时已到中晚期，甚至已向肺部等处转移，错过了最佳的治疗机会。我国肝癌患者大概15％是早期，这就意味着我国85％的初诊肝癌患者已经处于中晚期阶段。对于肿瘤，手术切除一直是预后最好且最能有效减少复发的治疗手段。然而，因为发现晚，我国仅有25％的初诊肝癌患者可以进行手术切除。我国肝癌患者5年生存率仅约12.5％。研究发现肝癌若在早早期实施根治性的切除手术，五年生存率要超过95％以上。因此肝癌的早期诊断与早期手术是提高肝癌患者5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。但目前临床上未有十分有效的早期检测方法，因此建立高灵敏，经济，简便的分子技术筛查方法尤为重要。
表观遗传学(主要包括DNA甲基化和微RNAs(micro RNAs,miRNAs))异常是肝癌的重要标志，可以有效监测肝癌的发生与发展。其中，DNA的异常甲基化(低甲基化和超甲基化)在体细胞癌变进程中扮演着极其重要的角色，肿瘤特异性DNA甲基化标记是一种很有希望的肿瘤早期预警与临床诊断标记物。
而miRNAs可以通过调控致癌途径中的关键基因，在肝癌发病过程中发挥重要的作用。近年来相关研究又发现，DNA异常甲基化可以改变肿瘤细胞中的miRNAs的表达，进而对肿瘤的发生和发展产生影响。检测组织、血清/血浆等标本中的特异性基因的甲基化状况，是促进肝癌早期诊断、改善预后的有效途径。
BMPR1A属于BMPs受体(BMPR)家族，骨形成蛋白(BMPs)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一员。研究发现其可以调节细胞的分化、增殖、凋亡，对机体的生长和发育起着重要作用。BMPs信号通路中有3个重要的组成部分，分别为BMPs、BMPs受体(BMPR)和Smads蛋白。最近的研究显示骨形成蛋白受体1(BMPR1A)在肺癌、肝癌、胃癌及结肠癌等多种恶性肿瘤中都有表达。而BMPR1A基因对下游基因产物表达有很大影响，所以BMPR1A基因超甲基化有可能影响多个蛋白的表达，从而促使细胞癌变。ARHGAP25基因又称为KAIA0053或HEL-S-308基因，该基因编码Rho蛋白家族的负调节因子，而该蛋白家族涉及肌动蛋白重塑，细胞极性和细胞迁移等过程。该基因的甲基化会对其编码的蛋白产物的功能产生一定的影响，从而影响癌细胞的迁移等过程。KLF3基因又叫碱性KLF因子(bKLF)，是KLF家族的一个成员。KLF家族成员参与调控细胞的多种生理过程，包括分化，发育，细胞增殖，凋亡等过程。而且KLF家族参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。研究表明KLF3可能参与肿瘤的代谢过程，可能是一个抑癌基因，作用有KRAS信号通道，从而抑制肿瘤细胞的生长和转化，并能促进肿瘤细胞的凋亡。ATXN2基因位于12q24，其编码蛋白为Ataxin-2，而Ataxin-2通过与poly(A)结合蛋白的相互作用调节mRNA翻译过程，它还参与应激颗粒和P-体的形成，而P-体在RNA调节中起到了一定的作用。ATXN2基因突变可引起脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)，ATXN2基因的异常在癌症中也起到了重要的作用。
“液体活检”(Liquid Biopsy)技术是一种快速、简便的癌症血液检测方法，是精准医疗重要途径之一，是非介入性的、可重复性地抽取肿瘤样本。应用液体活检技术实现癌症的预防、诊断、预后，从而在抗癌药物的选择、药物功效的评估、耐药的检测等方面拥有广泛的前景。现有的液体活检技术主要包括循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)以及外泌体检测。
循环肿瘤DNA(ctDNA)是指肿瘤细胞脱落或者凋亡后释放进入循环***中的一类DNA，是肿瘤细胞的一种特征性的生物标记物。ctDNA中还会含有其他肿瘤部位释放到血液中的游离DNA，如肿瘤转移部位、克隆性造血体细胞释放的游离DNA等，ctDNA检测结果提供的是患者体内肿瘤的全景数据，所以在肿瘤晚期发生转移时应用ctDNA检测具有可行性高，数据全，效果好等优点，在癌症临床检测中具有广泛的应用潜力。ctDNA基因检测技术可用于无创式肿瘤早期筛查、辅助诊断分型、用药指导、预后判定及动态监测等方面。DNA分子中CpG位点的甲基化是基因表达的重要调节因素，以往研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞呈现出基因组整体甲基化水平降低和抑癌基因启动子CpG岛甲基化水平升高的趋势。研究发现，在肿瘤发生的早期，在同一类型的肿瘤细胞中可检测到稳定和一致的特征性DNA甲基化改变，这种改变常导致相应的抑癌基因失活，因此可作为肿瘤早期诊断的理想标志物。有研究检测了6例正常肝组织和30对肝癌和癌旁组织基因组甲基化的水平，结果发现肝癌组织的DNA甲基化水平明显低于癌旁和正常肝组织，另外，也有相关研究检测了24例肝癌患者的癌组织和癌旁组织的c-myc，发现癌组织的c-myc甲基化程度明显低于癌旁组织，而癌旁组织也出现了不同程度的低甲基化，并发现c-myc的第3外显子的低甲基化可能对肝癌的发生起着重要作用。研究结果显示出CpG甲基化检测在肝癌早期诊断中的巨大价值。
数字PCR(digital PCR，dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法，通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,DDPCR)是定量检测的一个敏感的方法，只需极少量的样本即可检测，该方法不必参照标准品或内源性对照,高灵敏度和所需样本量少，大大满足了临床珍贵样本如穿刺样本、胸腹水、外周血中靶标序列的微量检测的需求。ddPCR技术具有成本低、实用性强、准确、高效、便捷等优点，在临床领域已经显示出良好的应用前景。
目前对癌症的诊断主要依据临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，但许多肝癌患者临床症状出现较晚，且活体取样检测比较困难。甲胎蛋白测定为目前诊断肝细胞癌特异性最高的方法之一，但并非只要出现甲胎蛋白阳性，就可确诊为肝癌。确诊肝癌一定要动态观察甲胎蛋白含量的变化，时间较长。肝癌病人血清中γ-谷氨酰转肽酶，碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的同功酶等可高于正常，但由于缺乏特异性，所以血液酶学检查多作为辅助诊断。放射性核素肝扫描：对肝癌诊断的阳性符合率为85～90％，但对于直径小于3厘米的肿瘤，不易在扫描图上表现出来。分辩率高，可检出直径约1.0厘米左右的早期肝癌，应用增强扫描有助与血管瘤鉴别。对于肝癌的诊断符合率高达90％。但费用昂贵。尚不能普遍应用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒。
本发明提供一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，通过采用微滴式数字PCR绝对定量的技术手段联合检测肝癌高风险人群血液中游离DNA的BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因启动区的甲基化情况来筛查早期肝癌患者，并辅助肝癌的早期诊断。本发明利用甲基化特异性的PCR检测方法结合微滴数字PCR检测方法，同时选取血浆作为标本，给肝癌早期诊断提供了一个操作简便、准确可靠、快速的新途径。
本发明提供了一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针；用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针；用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针；以及用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针。
本发明提供了上述所述的试剂盒在制备肝癌早期筛查用试剂中的应用。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
第一方面，本发明提供一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针；
用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针；
用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针；以及
用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针。
优选的，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物包含引物1和引物2，所述引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物2的序列如SEQ ID NO:2。
优选的，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的第一特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物包含引物3和引物4，所述引物3的序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物4的序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的第二特异性探针的序列如SEQ IDNO:6所示。
优选的，所述用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物包含引物5和引物6，所述引物5的序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物6的序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，所述用于检测KLF3基因甲基化的第三特异性探针的序列如SEQ ID NO:9所示。
优选的，所述用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物包含引物7和引物8，所述引物7的序列如SEQ ID NO:10所示，所述引物8的序列如SEQ ID NO:11所示。
优选的，所述用于检测ATXN2基因甲基化的第四特异性探针的序列如SEQ ID NO:12所示。
优选的，所述试剂盒包含微滴发生油。
优选的，所述试剂盒还包括用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针。
优选的，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物包括引物9和引物10，所述引物9的序列如SEQ ID NO:13所示，所述引物10的序列如SEQ ID NO:14所示。
优选的，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针的序列如SEQID NO:15所示。
优选的，所述试剂盒还包括阳性质控品。
优选的，所述阳性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的甲基化片段。
优选的，所述试剂盒还包括阴性质控品。
优选的，所述阴性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的非甲基化片段。
优选的，所述试剂盒还包括无核酸酶的水。
第二方面，本发明提供所述的基因甲基化数字PCR试剂盒在制备肝癌早期筛查用试剂中的应用。
本发明提供的所述的肝癌早期筛查用的试剂使用方法如下：将样品DNA、阳性质控品以及阴性质控品加入用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针、用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针、用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针、用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针、微滴发生油以及用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针混合后制成微滴，再进行荧光定量PCR反应。
优选的，所述荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性5～10min，1个循环；94～95℃15～30s、58～60℃30～45s，40～50个循环。
本发明的有益效果如下：
本发明所述的试剂盒采用Taqman-MGB探针检测结合微滴式数字PCR检测的手段，对BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因甲基化位点精确检测，绝对定量、特异性高、准确性高以及灵敏度高，检测方便快捷、结果准确可靠，能够用于肝癌早期的筛查。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针；用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针；用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针；以及用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物包含引物1和引物2，所述引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物2的序列如SEQ ID NO:2；优选的，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的第一特异性探针的序列如SEQ IDNO:3所示。
优选的，所述引物1的序列为5’-CAGGAGGGATCGTGGAAGAA-3’；
所述引物2的序列为5’-GACGGATCACTCGGTACCATGT-3’；
所述第一特异性探针的序列为5’-FAM-ACCAATTGTCATATTAC-BHQ-3’。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物包含引物3和引物4，所述引物3的序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物4的序列如SEQ ID NO:5所示；优选的，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的第二特异性探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
优选的，所述引物3的序列为5’-CAGCTCTCAGGCGGAGATG-3’；
所述引物4的序列为5’-CAGGGTGTGCCAGCAACTCT-3’；
所述第二特异性探针的序列为5’-FAM-AGTGGGTTAAATTCC-BHQ-3’。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物包含引物5和引物6，所述引物5的序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物6的序列如SEQ ID NO:8所示；优选的，所述用于检测KLF3基因甲基化的第三特异性探针的序列如SEQID NO:9所示。
优选的，所述引物5的序列为5’-GGACTGTGACCGCAGCTTCT-3’；
所述引物6的序列为5’-CAGGGTGTGCCAGCAACTCT-3’；
所述第三特异性探针的序列为5’-FAM-TTCTGACCATCTTGTC-BHQ-3’。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物包含引物7和引物8，所述引物7的序列如SEQ ID NO:10所示，所述引物8的序列如SEQ ID NO:11所示；优选的，所述用于检测ATXN2基因甲基化的第四特异性探针的序列如SEQ ID NO:12所示。
优选的，所述引物7的序列为5’-GCATGTCCCAAATTACCATACAAC-3’；
所述引物8的序列为5’-CCGTGGAAATGGCAAAGTAGA-3’；
所述第四特异性探针的序列为5’-FAM-AGGAGACAAGTCCTTC-BHQ-3’。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述试剂盒还包括用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针，优选的，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物包括引物9和引物10，所述引物9的序列如SEQ ID NO:13所示，所述引物10的序列如SEQ ID NO:14所示；优选的，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针的序列如SEQ ID NO:15所示。
优选的，所述引物9的序列为5’-AAGATAGTGTTGTGGGTGTAGGT-3’；
所述引物10的序列为5’-CCTACTTAATACACACTCCAAAAC-3’；
所述第五特异性探针的序列为5’-HEX-ACACCAACCTCATAACCTTATCACAC-BHQ-3’。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述试剂盒还包括微滴发生油，所述微滴发生油是用于将甲基化的DNA模板以及包含不同检测基因甲基化的引物和探针及β-actin内参基因甲基化的引物和探针的预混液在微滴发生器中制成微滴。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述试剂盒还包括阳性质控品，优选的，所述阳性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的甲基化片段，优选的，所述甲基化片段为人工合成的片段。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述试剂盒还包括阴性质控品，优选的，所述阴性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的非甲基化片段。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述试剂盒还包括无核酸酶的水，优选的，所述的试剂盒还包含无模板对照品，所述无模板对照品是指不含人类基因组DNA的反应体系。
本发明提供了上述所述的试剂盒在制备肝癌早期筛查用试剂中的应用。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述的肝癌早期筛查用的试剂使用方法如下：将样品DNA、阳性质控品以及阴性质控品加入用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针、用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针、用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针、用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针、微滴发生油以及用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针混合后制成微滴，再进行荧光定量PCR反应。
优选的，所述DNA为甲基化DNA，较优选的，所述甲基化DNA通过将外周血进行离心分离，然后采用DNA抽提试剂提取游离的DNA，接着使用亚硫酸盐进行修饰得到甲基化的DNA。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性5～10min，1个循环；94～95℃15～30s、58～60℃30～45s，40～50个循环。
优选的，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火30s，进行40个循环，最后在98℃延伸10min进行PCR扩增。
本发明是采用伯乐QX200TM微滴数字PCR检测***进行检测分析，其反应包括配置体系、生成微滴、扩增循环和信号读取4个步骤。微滴数字PCR体系为20μl，包含10μl 2×ddPCR Master Mix，10μmol/L正向引物和反向引物各0.8μl、探针0.4μl，DNA模板2μl。生成微滴需要使用专门的微滴生成卡和微滴生成仪，将40μl PCR体系和70μl微滴生成油加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴。
微滴生成是ddPCR的关键步骤，只有微滴数大于10 000时，DNA分子的分布才能符合泊松分布的统计学原理，***才能对阳性和阴性微滴进行计数。
其检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：20±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。
本发明所使用的引物和探针均是由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
本发明所使用的微滴发生器的型号为QX200，所述的微滴发生卡的型号为DG8TM，其生产厂家为伯乐生命医学产品(上海)有限公司；
本发明所使用的进行亚硫酸盐修饰的试剂盒为ZYMO RESEARCH生物公司提供的EZDNA Methylation-DirectTM KIT(D5020)。
实施例1
实施例一提供了一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针，用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针，用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针，用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针，用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针，微滴发生油，阳性质控品、阴性质控品、无模板对照品以及无核酸酶的水；
所述用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物包含引物1和引物2，所述引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物2的序列如SEQ ID NO:2，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的第一特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示；
所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物包含引物3和引物4，所述引物3的序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物4的序列如SEQ ID NO:5所示，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的第二特异性探针的序列如SEQ ID NO:6所示；
所述用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物包含引物5和引物6，所述引物5的序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物6的序列如SEQ ID NO:8所示，所述用于检测KLF3基因甲基化的第三特异性探针的序列如SEQ ID NO:9所示；
所述用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物包含引物7和引物8，所述引物7的序列如SEQ ID NO:10所示，所述引物8的序列如SEQ ID NO:11所示，所述用于检测ATXN2基因甲基化的第四特异性探针的序列如SEQ ID NO:12所示；
所述用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物包括引物9和引物10，所述引物9的序列如SEQ ID NO:13所示，所述引物10的序列如SEQ ID NO:14所示，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针的序列如SEQ ID NO:15所示；
所述阳性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的甲基化片段；
所述阴性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的非甲基化片段；
所述无模板对照为不含有人类基因组DNA的反应体系。
实施例二 试剂盒的使用方法
(1)血浆分离：使用EDTA抗凝管收集人5mL-10mL外周血，对血液样本进行离心，1600g，10min，将收集的血浆样本小心转移至2mL离心管中，4℃条件下对血浆样本进行离心，16 000g，10min，将收集的血浆样本小心转移至新的2mL离心管中，收集完成的血浆样本至于-20℃保存；
(2)游离DNA的提取：采用DNA抽提试剂提取外周血游离DNA，进行DNA质量监控，选取OD260/OD280在1.6-2.0的游离DNA；
(3)DNA修饰：将步骤(2)所得到的游离DNA，使用ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZDNA Methylation-DirectTM KIT(D5020)说明书进行亚硫酸盐修饰，使得DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，得到Bis-cfDNA；
(4)微滴数字PCR反应体系配制：以步骤(3)中的Bis-cfDNA为模板，配制成20μl的微滴数字PCR反应体系，其包含18μl的ddPCR探针法预混液和2μl Bis-cfDNA，其中，用于检测BMPR1A基因甲基化的ddPCR探针法预混液包括500μL的2X ddPCR Supermix for probes，用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物1和引物2，分别为60μl，用于检测BMPR1A基因甲基化的第一特异性探针为20μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物9和引物10，分别为30μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针为15μl和RNase FreedH2O 185μl；
用于检测ARHGAP25基因甲基化的ddPCR探针法预混液包括500μL的2X ddPCRSupermix for probes，用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物3和引物4，分别为60μl，用于检测ARHGAP25基因甲基化的第二特异性探针为20μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物9和引物10，分别为30μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针为15μl和RNase Free dH2O 185μl；
用于检测KLF3基因甲基化的ddPCR探针法预混液包括500μL的2X ddPCR Supermixfor probes，用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物5和引物6，分别为60μl，用于检测KLF3基因甲基化的第三特异性探针为20μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物9和引物10，分别为30μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针为15μl和RNaseFree dH2O185μl；
用于检测ATXN2基因甲基化的ddPCR探针法预混液包括500μL的2X ddPCRSupermix for probes，用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物7和引物8，分别为60μl，用于检测KLF3基因甲基化的第四特异性探针为20μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物9和引物10，分别为30μl，用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针为15μl和RNase Free dH2O185μl；
其中，上述引物和探针的浓度均为10μM；
(5)制备微滴：在DG8TM微滴发生卡上相对应的孔中加入20μl步骤(4)配置的PCR反应液，70μl微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX200微滴发生器内进行反应；然后将处理的微滴缓慢转移到96孔板上，然后将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜，得到微滴反应液；
(6)数字PCR扩增：将步骤(5)所得到的微滴反应液按照95℃变性5min，随后95℃变性15sec，60℃退火30sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min的步骤进行PCR扩增；
(7)信号收集及数据分析：将步骤(6)反应后的PCR板转移至微滴分析仪(Bio-radLaboratories USA)中进行荧光检测，并使用Quanta SoftTM软件进行浓度计算，质控有扩增(在HEX荧光信号区域有微滴分布)的前提下存在甲基化的扩增(在FAM荧光信号区域有微滴分布)，则判断该基因有甲基化。
实施例3
采用实施例一所述的试剂盒按照实施例二所述的使用方法对20份样本进行检测，其中，10份样本为正常的无肝病志愿者的血液样本，10份样本为已确诊为肝癌的志愿者的血液样本。利用实施例一中的试剂盒检测后得到的检测结果与事实相符。说明本发明提供的试剂盒能够应用于肝癌筛查，且检测结果准确可靠。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津脉络生物科技有限公司
<120> 用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggagggat cgtggaagaa 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacggatcac tcggtaccat gt 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accaattgtc atattac 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagctctcag gcggagatg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagggtgtgc cagcaactct 20
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgggttaa attcc 15
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggactgtgac cgcagcttct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagggtgtgc cagcaactct 20
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctgaccat cttgtc 16
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcatgtccca aattaccata caac 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgtggaaat ggcaaagtag a 21
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggagacaag tccttc 16
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagatagtgt tgtgggtgta ggt 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctacttaat acacactcca aaac 24
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acaccaacct cataacctta tcacac 26

Claims (13)

1.一种用于肝癌早期筛查的基因甲基化数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针；
用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针；
用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针；以及
用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针。
2.根据权利要求1所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物包含引物1和引物2，
所述引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物2的序列如SEQ ID NO:2；
优选的，所述用于检测BMPR1A基因甲基化的第一特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物包含引物3和引物4，
所述引物3的序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物4的序列如SEQ ID NO:5所示；
优选的，所述用于检测ARHGAP25基因甲基化的第二特异性探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物包含引物5和引物6，
所述引物5的序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物6的序列如SEQ ID NO:8所示；
优选的，所述用于检测KLF3基因甲基化的第三特异性探针的序列如SEQ ID NO:9所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物包含引物7和引物8，
所述引物7的序列如SEQ ID NO:10所示，所述引物8的序列如SEQ ID NO:11所示；
优选的，所述用于检测ATXN2基因甲基化的第四特异性探针的序列如SEQ ID NO:12所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述试剂盒包含微滴发生油。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针，
优选的，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物包括引物9和引物10，
所述引物9的序列如SEQ ID NO:13所示，所述引物10的序列如SEQ ID NO:14所示；
优选的，所述用于检测β-actin内参基因甲基化的第五特异性探针的序列如SEQ IDNO:15所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性质控品，
优选的，所述阳性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的甲基化片段。
9.根据权利要求1-8任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阴性质控品，
优选的，所述阴性质控品包括BMPR1A基因、ARHGAP25基因、KLF3基因和ATXN2基因的非甲基化片段。
10.根据权利要求1-9任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒，其中，所述试剂盒还包括无核酸酶的水。
11.权利要求1-10任一项所述的基因甲基化数字PCR试剂盒在制备肝癌早期筛查用试剂中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述的肝癌早期筛查用的试剂使用方法如下：将样品DNA、阳性质控品以及阴性质控品加入用于检测BMPR1A基因甲基化的特异性引物和第一特异性探针、用于检测ARHGAP25基因甲基化的特异性引物和第二特异性探针、用于检测KLF3基因甲基化的特异性引物和第三特异性探针、用于检测ATXN2基因甲基化的特异性引物和第四特异性探针、微滴发生油以及用于检测β-actin内参基因甲基化的特异性引物和第五特异性探针混合后制成微滴，再进行荧光定量PCR反应。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性5～10min，1个循环；94～95℃15～30s、58～60℃30～45s，40～50个循环。
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