CN110628886B - 一种检测dna中的单链断裂的方法 - Google Patents
一种检测dna中的单链断裂的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110628886B CN110628886B CN201910837092.1A CN201910837092A CN110628886B CN 110628886 B CN110628886 B CN 110628886B CN 201910837092 A CN201910837092 A CN 201910837092A CN 110628886 B CN110628886 B CN 110628886B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- tailing
- sequence
- sequences
- diagnostic purposes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 title abstract description 51
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 claims 4
- 235000019527 sweetened beverage Nutrition 0.000 claims 4
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 20
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 12
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 12
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 6
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- WKVZMKDXJFCMMD-UVWUDEKDSA-L (5ar,8ar,9r)-5-[[(2r,4ar,6r,7r,8r,8as)-7,8-dihydroxy-2-methyl-4,4a,6,7,8,8a-hexahydropyrano[3,2-d][1,3]dioxin-6-yl]oxy]-9-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-5a,6,8a,9-tetrahydro-5h-[2]benzofuro[6,5-f][1,3]benzodioxol-8-one;azanide;n,3-bis(2-chloroethyl)-2-ox Chemical compound [NH2-].[NH2-].Cl[Pt+2]Cl.ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl.COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 WKVZMKDXJFCMMD-UVWUDEKDSA-L 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 3
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012946 outsourcing Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 description 2
- 229960003452 romidepsin Drugs 0.000 description 2
- OHRURASPPZQGQM-UHFFFAOYSA-N romidepsin Natural products O1C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(=CC)NC(=O)C2CSSCCC=CC1CC(=O)NC(C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010091666 romidepsin Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 2'-deoxythymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100468275 Caenorhabditis elegans rep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 239000012623 DNA damaging agent Substances 0.000 description 1
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 229940123780 DNA topoisomerase I inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940124087 DNA topoisomerase II inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091060210 Heavy strand Proteins 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 101100238610 Mus musculus Msh3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124160 Myc inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012661 PARP inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229940121906 Poly ADP ribose polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000000365 Topoisomerase I Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000317 Topoisomerase II Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000006846 excision repair Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000019725 replication fork arrest Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测DNA中的单链断裂的方法,包括如下步骤:1)对待测DNA进行片段化,由此产生的片段的3’末端不能被加尾;2)对片段化的待测DNA的3’末端进行第一次加尾;3)对第一次加尾后的样品通过以下步骤捕获和识别全基因组中DNA单链断裂(single strand breaks,SSBs)的位置:首先,使用嵌合5’‑DNA‑RNA‑3’引物对加尾后的片段进行线性扩增;其次,对扩增产物的3’末端进行第二次加尾;最后,目标产物通过包含接头序列的寡核苷酸进行PCR扩增建库并进行二代测序。4)通过测序结果确定SSBs位置。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。旨在提供一种命名为SSiNGLe-ILM(基于Illumina测序平台上核苷酸水平的单链断裂DNA检测)的方法,该方法可在Illumina新一代测序平台上绘制全基因组范围内DNA中的单链断裂(single strand breaks,SSBs),其检测精度可达核苷酸水平。
背景技术
DNA损伤现在被普遍认为是癌症和许多其他与衰老相关疾病的主要原因,与人类健康息息相关。DNA损伤有多种类型,其中单链断裂是最为普遍的一种。这些损伤表现为氧自由基位点的DNA损伤,在切除DNA修复通路以及相关中间产物如拓扑异构酶等过程中起调节作用。SSBs引起的复制叉停滞或者崩塌可进一步恶化成更为严重的双链断裂(doublestrand breaks,DSBs)。另外,作为细胞中的一个主要问题,SSBs可以抑制RNA聚合酶催化的转录进程,甚至在一些情况下可以导致细胞凋亡。目前发现详细的SSBs修复通路,贯穿由发现到开始修复的每个步骤,体现了DNA损伤的重要性。这些细胞通路的缺陷可导致细胞对基因毒性应急反应、胚胎致死以及一系列神经退行性疾病的敏感性增强。
对SSB修复机制的详细步骤的需求与日俱增,然而,与之形成鲜明对比的是定位核苷酸层面上的、全局的、精确无偏的内源性SSBs方法的严重缺失。相比之下,一系列综合性的用于定位DSBs的方法已经较为成熟,例如BLESS、BLISS等等(参考综述)。据了解,目前只有一个方法可以找到对应的内源性SSBs,主要依靠SSB的3’-OH标记,引导DNA聚合酶I进行切口平移反应,用生物素化的核苷酸标记下游DNA。已标记的DNA经过纯化后,直接进行二代测序。然而,这个方法的主要缺点在于反应产物是一段DNA区域,很有可能从原SSB位置中延伸出去几千个碱基,从而无法精确地从核酸层面上鉴定损伤位置。另外一方面,胡教授等人研发了一种检测在全基因组水平定位切除修复过程中切除产生的初级短DNA断裂的方法,该方法能够从核酸层面上精确地找到SSB。但是无法提供由其他机制产生的SSB的信息,因此无法综合反映SSBs。
综上所述,这种非常重要的DNA损伤——SSBs,其核酸水平的全基因组图谱仍未知。在这里,我们研发并验证了一种新方法,即SSiNGLe-ILM,它可以检测核酸水平的SSBs。我们将这种方法应用在常用的Illumina测序平台上。结果表明,断裂的基因组模式——SSB“断裂组”很可能为研究生物***状态提供新的研究维度,并且可作为血液生物标记物的一种新来源。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于核苷酸水平的单链断裂DNA检测方法,该方法可以在二代测序平台上全面地绘制全基因组范围内DNA中的单链断裂(SSB),其检测精度可达核苷酸水平。
本发明的技术方案如下:
一种检测DNA中的单链断裂的方法,包括如下步骤:
1)对待测DNA进行片段化,由此产生的片段的3’末端不能被加尾;
2)对片段化的待测DNA的3’末端进行第一次加尾;
3)对第一次加尾后的样品通过以下步骤捕获和识别全基因组中DNA单链断裂(single strand breaks,SSBs)的位置:
首先,使用嵌合5’-DNA-RNA-3’引物对加尾后的片段进行线性扩增;
其次,对扩增产物的3’末端进行第二次加尾;所述的第一次加尾和第二次加尾所用的碱基不互补;
最后,目标产物通过包含接头序列的寡核苷酸进行PCR扩增建库并进行二代测序;
4)通过测序结果确定SSBs位置。
其中,步骤1)所述的片段化方法包括:采用微球核酸酶(MNase)进行片段化并产生3’磷酸末端。只要在片段化时产生的3’末端不能被加尾,除MNase以外的其他片段化方法也可使用。
优选地,步骤1)所述的片段化后的片段长度范围为150-500碱基对,然而,该范围可进行调整,以适用于其他二代测序平台。
优选地,步骤2)和3)所述的第一次加尾和第二次加尾,可使用不同的碱基,但两次加尾所用的碱基不可互补。例如,如果第一次所加尾为polyA,第二次所加尾则应为polyC、polyG 或其他碱基,而不能使用polyT或polyU。第一次加尾如果使用dATP,其最佳长度范围为50-500 碱基,然而,更大的长度范围也适用。
优选地,所述的5’-DNA-RNA-3’嵌合引物的DNA碱基长度可变,只要其能在所使用的反应条件下退火至第一次所加尾上。作为优选,本发明使用50个DNA碱基。RNA碱基长度可变,只要其能充分防止被末端转移酶(TdT)加尾,并且在对第二次所加尾进行DNA复制时可被聚合酶转化为DNA。
优选地,步骤3)第二次加尾,其长度范围可变。使用dCTP加尾时最佳长度范围为10-100 碱基,然而更大的长度也适用。
第一次加尾和第二次加尾,根据如上所述原则,分别选用polyA/G/C/T中的一种。
优选地,对目的片段进行扩增时,引物需含有(1)和两次所加尾互补的序列以及(2) 相应的二代测序平台所需序列。这里,(1)本发明使用12T和10G,然而,它们的长度和碱基可变,只要能够退火至所加尾即可。(2)的序列同样可变,但应适用于所使用的二代测序平台。这里,本发明所提供的引物序列为Illumina测序平台所适用的序列。
步骤4)通过序列分析确定SSBs位置,包括:
(1)筛选出序列1以(第二次加尾碱基互补和数量对应的碱基)开头,序列2以(第一次加尾碱基互补和数量对应的碱基)开头的双端原始序列;
(2)筛选出的序列比对待测生物体的基因数据库;只保留序列1和序列2都能够特异性比对到合适的结构和间隔的成对序列。
(3)在比对出的序列中,去除PCR产物中由于匹配到和第一次所加尾相似的内源性DNA 序列而产生的读段。这里,本发明去除了序列2中5’端(前15-25bp的T碱基含量分数>40%,优选为前20bp的T碱基含量分数>40%)的成对序列,SSB位点被定义为序列2中引物的对应数量碱基(作为例子,为12个T)后的第一个碱基。然而,如果PCR引物中含有大于12T 或者其他序列,此分析可作相应调整。
本发明还提供一种检测DNA中的单链断裂的方法的用途,用于双链断裂检测。
本技术方案与背景技术相比,具有如下优点:
本发明是基于Illumina平台的核苷酸水平精确度识别基因组中SSBs的方法。它具有以下优点:
a.该方法可以以核苷酸精确度检测各种机制产生的SSBs。
b.通过改变PCR引物序列,该方法可以方便地应用于其他二代测序平台,如IonTorrent 等。
c.该方法可通过虾碱性磷酸酶(SAP)处理将3’-P末端(此处P为-PO4磷酸基团)转化为3’-OH末端来检测具有3’-OH末端及其他末端的断裂,。
d.该方法可用于检测各种环境下产生的SSBs。
e.该方法可用于细胞系或组织。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1.SSiNGLe-ILM方法。带3'-OH SSB(空心圆点)的DNA进行MNase原位片段化,产生3'-P末端(实心圆点),无法使用TdT标记polyA。在加尾后,如图所示进一步处理DNA 并进行Illumina测序。
图2.(A)用指定药物处理48小时后的细胞中分离出细胞DNA,对其进行琼脂糖凝胶电泳分析,然后用MNase消化(右)并以未消化(左)样品作为对照。未消化的材料在凝胶底部的信号代表残留的已降解的RNA。(B)在有、无SAP的情况下,用Nt.BbvCI原位消化经过 H2O2处理的K562细胞核的三个重复实验(“Rep1”-“Rep3”)的结果。通过SSiNGLe-ILM检测出SSB比对Nt.BbvCI位点的每个指定碱基和该位点的顶部和底部链的侧翼序列的比例(Y 轴),X-轴为Nt.BbvCI位点的顶部和底部链的侧翼序列(X轴)。切割位点用红色箭头代表。 (C)用SSiNGLe-ILM方法检测出在HeLa细胞中的SSB或DSB与BLESS方案发现的DSB显著重合。图中展示了两种方法共同识别出的DNA断裂的个数和比值比(基于不同的延伸距离)。 (D)在不同数量的过滤读数(X轴)下检测到的AsiSI和Nt.BbvCI位点(Y轴)的比例。每个实验均重复两次。(E)在不同的加尾和不加尾的样品中,过滤相邻内源polyA后的的唯一比对reads的比例。(F)3种类型样品比对到chrM基因组的负链或H链的每个碱基(X轴) 的SSB的百分比例中值(Y轴)。箭头指示信号的峰值。(G)(F)中箭头所示的主峰区域的放大图。X轴下方的箭头表示之前报道的7S DNA的3'末端位置。在相反的链上仅可观察到背景水平信号。
具体实施方式
本发明在标记之前,使用MNase对大分子量DNA进行片段化并产生3’磷酸末端14,由于此类末端不能作为TdT加尾的底物,因此不会被本发明的后续的方法所检测。该步骤既避免在随后的纯化步骤中机械剪切产生的大分子量DNA断裂,也使得DNA片段长度范围适合下游的二代测序分析。
首先,在片段化之前,细胞通过甲醛进行原位交联。从交联的细胞中提取细胞核,并使用MNase将基因组DNA片段化到150-500碱基对的长度范围。在MNase失活步骤后,将细胞核用蛋白酶K处理并解交联。接下来已片段化的基因组DNA被提取、变性然后用TdT进行polyA加尾。随后,PolyA加尾后的样品进行Illumina测序(图1)通过以下3个步骤捕获和识别全基因组SSBs的位置。首先,使用包括50个2’脱氧胸苷酸和3个胸苷核苷酸的 DNA-RNAoligo-d(T)50-r(T)3嵌合寡核苷酸引物对含有polyA尾的分子进行十个循环的线性扩增,其中,由于RNA不能作为TdT的底物,所以引物3’端最后的三个RNA残基可避免引物在下一步被酶加尾。其次,扩增产物通过TdT进行3’末端polyC加尾。最后,5’末端含有 oligo-d(T)50-r(T)3序列和3’末端含有polyC尾的目标产物通过包含Illumina接头序列的寡核苷酸进行PCR指数扩增并用于Illumina测序。
MNase酶片段化之前细胞核的制备:在室温下使用终浓度1%的甲醛对重悬在2ml培养基(K562,人源红白血病细胞)或PBS(PBMCs,人外周血单核细胞)中的1-6百万个细胞交联10分钟,然后加入甘氨酸(Thermo Fisher Scientific)至终浓度1.375M,室温孵育5分钟后终止交联反应。在4℃以1500g离心收集细胞,然后用冰1X PBS洗涤。制备细胞核时,将交联的细胞在含有5mM PIPES(pH8),3mM KCL,0.5%NP-40(Amresco)的缓冲液中置于冰上裂解10分钟,然后在4℃以1000g离心10分钟。除去上清液后,将细胞核重悬于500μl 冰1×MNase缓冲液(NEB)中,并使用相同离心条件再次沉淀细胞。
(可选)SDS处理:相对较小的MNase(17kDa)可以通过核孔扩散到细胞核中,在使用较大酶(例如限制酶或SAP)处理DNA时需要用SDS进行细胞核透化。去除上清液后,将每100万个细胞核重新悬浮于100μl的冰1×MNase缓冲液中,并将样品以100万个细胞核为单位等分。将每份等分试样与0.3%十二烷基硫酸钠(SDS)温和混匀并在37℃温育1小时。然后,加入triton X-100至浓度为1.8%并在室温下温育5分钟。如果直接用于MNase处理,通过在3500g,27℃下离心10分钟后收集细胞核,然后用1×MNase缓冲液洗涤两次。如果进行限制酶消化操作,则作如下处理。在SSiNGLe-ILM验证实验中由于需要限制酶消化K562 细胞核,因此本发明使用SSiNGLe-ILM方案中的SDS透化步骤处理所有K562和其他细胞系样品(HeLa和N2a)。但是,PBMCs所有样品在SSiNGLe-SMS方法制备中均不使用SDS透化处理。
(可选)核内限制性内切酶消化:在3500g,27℃下离心10分钟收集透化后的细胞核,然后使用1×NEB缓冲液2.1(50mM NaCl,10mM Tris-HCl和10mM MgCl2)洗涤两次。去除上清液后,将细胞核重新悬浮于50ul 1×NEB缓冲液2.1中,使用加入或不加入1U SAP酶(NEB)的50U限制性内切酶Nt.BbvCI于37℃孵育2小时进行酶切,然后在70℃处理20 分钟使酶失活。在3500g,27℃下离心10分钟收集细胞核,然后用1×MNase缓冲液洗涤两次。
MNase片段化和DNA纯化:移除上清液后,以100万个细胞核为单位等分样品,将细胞核重悬于加入含100μg/ml BSA的50μl冷的1×MNase缓冲液中,将每个等分样品分别用1200-3000单位的MNase(NEB)和200单位的RNAIf(NEB)在冰上消化30分钟。DNA 纯化后,在1%琼脂糖凝胶上检查消化产物,以确保大部分DNA在150-500bp的范围内,如图2A所示。在MNase消化后,将5.6μl的0.5M EDTA和150μl的核裂解缓冲液(10mM EDTA, 1%SDS,10mMTris-HCl pH 8)加入混合物中。在室温下孵育5分钟后,加入1μl 20μg/ml 蛋白酶K(Roche),然后在55℃温育45分钟、在65℃温育45分钟。加入0.3M KCl和冰异丙醇在-80℃保存30分钟以沉淀DNA,然后在4℃以12,000g离心15分钟后,用冰70%乙醇洗涤并真空干燥。使用2倍体积的VAHTS DNA Clean Beads(Vazyme)对DNA进行纯化后溶于40μl水中,然后使用Qubit 3.0荧光计和“dsDNA HS Assay”试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测量DNA浓度。同时,对于每个样品,本发明对未进行MNase处理的DNA样品进行相同的后续处理,如图2A所示。
使用TdT在DNA断裂处加入polyA尾:将纯化后的100ng片段化DNA在含有2μl 10×TdT 缓冲液、2μl 2.5mM CoCl2和水的19μl体系中95℃变性5分钟,然后在冰上快速快速冷却。将TdT(5单位,NEB)和2μl 1mM(SS5NGLe-SMS分析K562细胞)或10mM(所有其他实验,SSiNGLe-SMS或SSiNGLe-ILM)dATP加入变性DNA中至总体积22μl并在37℃下孵育30分钟。为了阻断游离的3'-OH末端,向上述混合物中加入2μl的1mM(SS5NGLe-SMS 分析K562细胞)或10mM(所有其他实验,SSiNGLe-SMS或SSiNGLe-ILM)ddNTP(ddCTP, ddGTP,ddATP或ddTTP之一)并在37℃下孵育30分钟,然后在70℃温育10分钟以灭活 TdT,反应产物可直接用于SMS或进一步加工用于SSiNGLe-ILM。
线性扩增:加尾样品用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化,溶于16.2μl水后全部用于polyA 加尾分子的线性扩增。具体过程如下所述:溶解的DNA与2μl的10×PCR缓冲液、0.4μl的 10mM dNTP混合液(Invitrogen)、10μM的嵌合DNA-RNA oligo-d(T)50-r(T)3寡核苷酸(50 个2’-脱氧胸苷和3’末端3个胸苷核苷酸)1μl和1U的Taq DNA聚合酶(Tiangen)混合均匀。其扩增条件是,在94℃下起始变性30秒,然后进行10个循环的94℃变性1分钟、55℃退火30秒以及72℃延伸30秒。随后,DNA样品用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化并溶于 15μl水。
polyC加尾:在溶解的DNA样品中加入2μl的10×TdT缓冲液和2μl 2.5mM的氯化钴至终体积19μl,置于95℃变性5分钟并快速放在冰上进行冷却。然后,将5U的TdT(NEB) 和2μl的10mM dCTP(Roche)加入到已变性的DNA中,置于37℃孵育30分钟,此时溶液的总体积是22μl。接着,在加尾混合液中加入2μl的10mM ddCTP(Roche)用于阻断 3'羟基末端的自由延伸,继续置于37℃孵育30分钟。最后将其在70℃条件下孵育10分钟,从而使TdT失活。
建库——PCR条件1:将已加上polyC尾的DNA用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化,溶于15.2μl水后,全部用于随后的建库。20μl的PCR扩增体系包括:1×PCR缓冲液,0.4μl 的10mM dNTP混合液(Invitrogen),浓度为10μM的两条寡核苷酸链Illumina_P5G10 (AATGATACGGCGACCACCGAGAtctACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGG GGGGGGGGHN)和Illumina_P7T12(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAtcgtgatGT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTTTTTTTTVN)各1μl以及1U Taq DNA聚合酶(Tiangen)。PCR条件:(1)94℃下起始变性3分钟;(2)进行一个循环扩增,包括94℃变性30秒、55℃变性1分钟和72℃延伸1分钟;(3)94℃变性30秒,37℃退火1 分钟,按每分钟2℃缓慢升温至72℃后孵育2分钟,(4)94℃孵育30秒后于72℃延伸1分钟,共30个循环。扩增后的DNA用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化后溶于20μl水,随后用Qubit 3.0荧光计和“dsDNAHS Assay”试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测浓度。样品外包到诺禾致源公司(北京)使用双端测序150bp的策略在Illumina平台上测序。
建库——PCR条件2:为了增加样品的丰度,可选择使用以下基于两轮PCR扩增的方法。经polyC加尾的DNA用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化,溶于15.2μl水并全部用于随后的建库。溶解的DNA可使用如下20μl的PCR扩增体系:1×PCR缓冲溶液、0.4μl的10mM dNTP 混合液(Invitrogen)、浓度为10μM的两条寡核苷酸链P5G10 (CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGHN)和P7T12(GTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCTTTTTTTTTTTTTVN)各1μl以及1U的TaqDNA聚合酶(Tiangen)。PCR条件为:(1)94℃下起始变性3分钟;(2)进行一个循环扩增,包括94℃变性30秒、55℃退火1 分钟和72℃延伸1分钟;(3)进行另一个循环扩增,94℃变性30秒,37℃退火1分钟,按每分钟2℃缓慢增温至72℃后孵育2分钟,(4)94℃孵育30秒,60℃退火30秒以及72℃延伸30秒,可进行10-30个循环;(5)72℃孵育7分钟。
样品用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化并溶于15μl水后,部分(25%-100%)可用于进行下一轮PCR扩增。20μl的PCR反应体系包括:1×PCR缓冲溶液、0.4μl的10mM dNTP 混合液(Invitrogen)、浓度为10μM的两条寡核苷酸链Illumina_P5 (AATGATACGGCGACCACCGAGAtctACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)和Illumina_P7(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGC TCTTCCGATCT)各1μl以及1U的Taq DNA聚合酶(Tiangen)。此轮PCR扩增条件如下:(1)94℃下起始变性3分钟;(2)94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸30秒, 10-30个循环;(3)72℃孵育7分钟。扩增后的DNA用两倍体积的VAHTS磁珠进行纯化,溶于20μl水后,用Qubit 3.0荧光计和“dsDNAHS Assay”试剂盒(ThermoFisher Scientific)测浓度。样品外包到诺禾致源公司(北京)使用双端测序150bp的策略在Illumina平台上测序。
Illumina原始数据处理和SSBs匹配方法
(1)筛选出序列1以10个碱基G开头,序列2以12个碱基T开头,且每条序列的每个碱基的Phred质量分值>20的双端原始序列;
(2)筛选出的序列通过软件BWA-MEM(0.7.12版本)在默认设置下分别比对人或小鼠基因组的GRCh37/hg19或GRCm38/mm10数据库;只保留序列1和序列2都能够特异比对到合适的结构和间隔的成对序列。
(3)在比对的序列中,去除其序列2中5’端前20bp的T碱基含量分数>40%的成对序列。 SSB位点被定义为序列2中12个T后的第一个碱基,因此去除了没有被成功加尾的样品。
方法验证:
首先,为了验证该方法是否确实能检测到SSB,在MNase片段化之前,使用仅能剪切CCTCAGC位点上端的特异性限制性内切核酸酶Nt.BbvCI消化交联的细胞核,即单链剪切。如图2B所示,我们观察到比对到CCTCAGC位点的正确剪切所在链的DNA有非常高的DNA 损伤富集(152倍)。其次,用这种酶消化可以检测该方法是否确实具有核苷酸水平的精确度。事实上,大多数(25-35%)Nt.BbvCI诱导的DNA损伤可比对到正确的碱基,且绝大多数 (38-42%)位于预测的剪切位点的1个碱基之内(图2B)。第三,验证是否可以检测到除3'-OH 以外的其它末端损伤。SAP可将3'-磷酸转化为3'-OH末端,我们在使用SAP的情况下用Nt.BbvCI消化细胞核。3'-磷酸末端通常在一些DNA损伤剂作用下产生,如过氧化氢处理,因此我们使用H2O2处理的细胞核进行该实验。由于Nt.BbvCI产生3'-OH末端,因此用SAP 处理并不会影响这些位点的检测。然而,结果正如所预期的一样,我们在多个独立重复中观察到SAP处理后的细胞Nt.BbvCI位点序列的比例减少。这是因为相比于未处理的细胞,SAP 处理后能够检测到更多的断裂位点,而理论上Nt.BbvCl的个数不会增大,因此,Nt.BbvCI 位点序列的比例会相应的降低,如图2B所示。
第二,从理论上讲,SSB和DSB都可以通过这种方法检测,但由于前者比后者多出2-3 个数量级,因此即使使用诸如依托泊苷17这样众所周知的DSB诱导药物处理之后,出现的主要信号仍是SSB。但我们仍然通过两种方法测试了SSiNGLe-ILM检测内源性DSB的能力。首先,我们选择在人类基因组中仅2484个位点的限制性内切酶AsiSI18,检测其引起的外源性DSB。与Nt.BbvCI不同,在交联后的细胞核中我们无法使用实时定量PCR或我们的全基因组方法(数据未显示)在AsiSI酶切位点检测该酶处理后引起的DNA切割。因此,本发明在MNase片段化后用AsiSI消化纯化过的DNA,然后加尾处理,并进行SSiNGLe-ILM测序。结果表明,本发明可以检测到预期靶点两条链上的断裂,其中大部分(51.6%)可比对到正确的碱基,大多数(84.4%)位于预期断裂位点附近的1个碱基内。其次,比较分别使用BLESS 方案和SSiNGLe-ILM方法对HeLa细胞中内源性DSB的检测。在SSiNGLe-ILM数据中我们将DSBs定义为发生在互补链上的两个SSB。在结果中我们发现两个数据集之间存在显著统计学上的重叠,且在卫星重复序列中具有显著的可重复富集(优势比208-343)(图2C)。随着基因组坐标的精确匹配,卫星重复序列富集最高,并且随着两个数据集中断裂位点之间的重叠增加而减少(图2C)。重叠显著较低,但在卫星重复序列之外的区域仍然具有统计学意义(图2C)。
第三,本发明验证了SSiNGLe-ILM检测SSBs和DSBs的灵敏度。上述经AsiSI酶或Nt.BbvCI酶消化的样品的深度测序结果显示,单一对应及过滤后的2.8M序列可检测到人类基因组2484个AsiSI位点的50%(图2D)。另外,要检测到1.4M Nt.BbvCI位点的50%,则此类序列需要增加到5.1M(图2D)。总的来说,要检测到几乎全部的AsiSI或Nt.BbvCI位点,我们估计分别需要大约50M和18M的过滤后序列。
然后,本发明用SSiNGLe-ILM检测经7种抗癌药物分别处理的人源白血病K562细胞中的断裂,并用DMSO处理组作为对照。这7种抗癌药物分别是:依托泊苷(拓扑异构酶II 抑制剂)、SN-38(拓扑异构酶I抑制剂)、罗米地辛(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)、伊马替尼(K562细胞中存在的致癌基因BCR-ABL的抑制剂)、塔拉唑巴(PARP抑制剂)、10074-G5 (c-Myc抑制剂)以及YM-155(DNA嵌入剂)。药物处理时间分别为6、12、24、36和48 小时。经膜联蛋白V染色的荧光激活细胞分选(FACS)评估,所有样品包括DMSO处理组,在药物作用36-48小时后,均导致凋亡细胞显著增加;而琼脂糖凝胶电泳结果显示,大多数 DNA仍然以大分子量的形式存在(图2A)。
重要的是,polyA加尾样品44-86%(中位数72%)的Illumina reads可以唯一地映射到基因组中。此外,其中的38-77%(中位数57%)的reads从邻近的内部polyA序列筛选中存留下来,相比来说,对应的不加尾对照样品筛选后仅剩2-3%(图2E)。而且,加尾样品过滤后的reads在两个不同的生物学重复中相当一致(图2E)。我们在人外周血单核细胞(PBMC)、人Hela细胞的三个生物学重复以及小鼠Neuro2A细胞系中进一步测试了此方法。结果与预期一致,相比于不加polyA尾的对照,在这些细胞类型的加尾样品中,我们观察到显著更高比例的已过虑的reads(不加尾对照样品已过滤的reads比例是2.2-4.2%,而加polyA尾样品是44.8-66.4%,中位数为57%)(图2E)。
甲醛交联在被广泛应用于包括DNA断裂映射在内的很多方法的同时,有报道表示甲醛交联会导致偏差甚至DNA损伤。为了评估交联对于SSiNGLe-ILM断裂检测的潜在影响,本发明做了另外一个生物学重复,分别用依托泊苷、罗米地辛和DMSO处理K562细胞,处理时间为6、12、24、36和48小时,并略去甲醛交联的步骤。过滤之后,在这些样品中本发明获得与交联样品比例相近的reads(图2E)。
最后,我们使用两种方法测试了本发明的方法检测内源SSB的能力。为了检测7SDNA(图 2F&G),读数仅比对到chrM序列。首先,线粒体7S DNA是一种天然存在的小单链DNA分子,具有3'OH末端,其确切位置已经被确定。因此,该分子的3'OH末端可作为鉴定的天然存在的SSB的替代物。由于不同类型的样本中均有大量读数可被比对到线粒体基因组(chrM)(细胞的chrM读数的中位数在1,598-27,606范围内),所以理论上本发明的方法可以检测到7S DNA的3'末端。实际上,如图2F所示,在PBMC,HeLa和K562样品中,我们在线粒体基因组的预期链(负链或H(重)链)上观察到了明显的SSB积累产生的峰值,可比对到这些细胞的7S DNA分子的3'末端的位置。引人注目的是,如图2G所示,在3种类型的样本中,该峰的确切位置恰好与之前报道的位置一致。并且,该信号只在正确的链上存在。比对到7S DNA 的3'末端的线粒体读数的比例是可重复的,如K562细胞的两个生物重复所示(图2G)。然而,该比例在3种样品类型中也有所不同,可能反映了之前被报道过的不同细胞类型中7S DNA 丰度的差异(图2G)。
总的来说,以上数据有力地表明,SSiNGLe-ILM能够在核苷酸水平上可重复地检测出不同细胞种类和不同物种中的内源性SSBs。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种检测DNA中的单链断裂的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgg 60
gggggggg 68
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttttttt tttttt 76
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacacgacg ctcttccgat ctgggggggg gg 32
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcagacgt gtgctcttcc gatctttttt ttttttt 37
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
Claims (9)
1.一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,包括如下步骤:
1)对待测DNA采用微球菌核酸酶—MNase进行片段化并产生3’-磷酸末端和3’-OH末端,该3’-磷酸末端不能被加尾;
2)对片段化的待测DNA的3’-OH末端进行第一次加尾;
3)对第一次加尾后的样品通过以下步骤捕获和识别全基因组中DNA单链断裂—SSBs的位置:
首先,使用5’-DNA-RNA-3’ 嵌合引物对加尾后的片段进行线性扩增;
其次,对扩增产物的3’末端进行第二次加尾;所述的第一次加尾和第二次加尾所用的碱基不互补;
最后, 目标产物通过包含接头序列的寡核苷酸进行PCR扩增建库并进行二代测序;
4)通过测序结果确定SSBs位置。
2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤1)所述的片段化后的产物长度范围为150-500碱基对。
3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:所述的5’-DNA-RNA-3’嵌合引物,能在所使用的反应条件下退火结合至第一次加尾上。
4.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤3)第二次加尾,使用dCTP加尾时长度范围为10-100碱基。
5.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:所述的接头序列为包括Illumina在内的二代测序***所用的接头序列。
6.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤4)通过序列分析确定SSBs位置,包括:
(1)筛选出符合以下要求的双端原始序列:序列1以第二次加尾碱基互补和数量对应的碱基开头,序列2以第一次加尾碱基互补和数量对应的碱基开头;
(2)筛选出的序列比对待测生物体的基因数据库;只保留序列1和序列2都能够特异性比对到合适的结构和间隔的成对序列;
(3)在比对出的序列中,去除其序列2中5’端前15-25bp的T碱基含量>40%的成对序列,SSB位点被定义为序列2中引物的对应数量碱基后的第一个碱基。
7.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤(3)中,去除其序列2中5’端前20bp的T碱基含量>40%的成对序列。
8.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:SSB位点被定义为序列2中12个T后的第一个碱基。
9.根据权利要求1至8任一项所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法在双链断裂检测的非诊断目的用途。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910837092.1A CN110628886B (zh) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | 一种检测dna中的单链断裂的方法 |
US17/014,322 US11898200B2 (en) | 2019-09-05 | 2020-09-08 | Method for detecting single strand breaks in DNA |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910837092.1A CN110628886B (zh) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | 一种检测dna中的单链断裂的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110628886A CN110628886A (zh) | 2019-12-31 |
CN110628886B true CN110628886B (zh) | 2022-09-30 |
Family
ID=68970247
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910837092.1A Active CN110628886B (zh) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | 一种检测dna中的单链断裂的方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11898200B2 (zh) |
CN (1) | CN110628886B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116287124A (zh) * | 2023-05-24 | 2023-06-23 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 单链接头预连接方法、高通量测序文库的建库方法及试剂盒 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105143525A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-09 | 纽亘技术公司 | 用于生成成链rna或dna文库的方法、组合物和试剂盒 |
CN105754995A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-07-13 | 清华大学 | 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用 |
CN108300765A (zh) * | 2012-03-13 | 2018-07-20 | 斯威夫特生物科学公司 | 用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚物加尾的方法和组合物 |
CN108753939A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-06 | 华侨大学 | 一种检测全基因组的单链dna损伤的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9957515B2 (en) * | 2013-03-15 | 2018-05-01 | Cibus Us Llc | Methods and compositions for targeted gene modification |
-
2019
- 2019-09-05 CN CN201910837092.1A patent/CN110628886B/zh active Active
-
2020
- 2020-09-08 US US17/014,322 patent/US11898200B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108300765A (zh) * | 2012-03-13 | 2018-07-20 | 斯威夫特生物科学公司 | 用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚物加尾的方法和组合物 |
CN105143525A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-09 | 纽亘技术公司 | 用于生成成链rna或dna文库的方法、组合物和试剂盒 |
CN105754995A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-07-13 | 清华大学 | 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用 |
CN108753939A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-06 | 华侨大学 | 一种检测全基因组的单链dna损伤的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Huifen Cao等.Novel approach reveals genomic landscapes of single-strand DNA breaks with nucleotide resolution in human cells.《Nature Communication》.2019,第10卷第1-14页. * |
Misha Liu等.Sensitive electrochemical detection of DNA damage based on in situ double strand growth via hybridization chain reaction.《Anal Bioanal Chem》.2017,第409卷第6821-6829页. * |
Stefan Czene,Mats Harms-Ringdahl.Detection of single-strand breaks and formamidopyrimidine-DNA glycosylase-sensitive sites in DNA of cultured human fibroblasts.《Mutation Research》.1995,第336卷第235-242页. * |
鲍岳等.利用正向重复片段的GUS报告基因检测DNA 双链断裂引起的基因重组研究.《科技风》.2018,第16卷第15-18页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210071233A1 (en) | 2021-03-11 |
US11898200B2 (en) | 2024-02-13 |
CN110628886A (zh) | 2019-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11098357B2 (en) | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read | |
US9745614B2 (en) | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors | |
US9890375B2 (en) | Isolated oligonucleotide and use thereof in nucleic acid sequencing | |
JP6766236B2 (ja) | 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法 | |
US10351848B2 (en) | Method for constructing nucleic acid single-stranded cyclic library and reagents thereof | |
Shin et al. | Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing | |
US20100035249A1 (en) | Rna sequencing and analysis using solid support | |
US20170349893A1 (en) | Method and reagent for constructing nucleic acid double-linker single-strand cyclical library | |
EP2722401B1 (en) | Addition of an adaptor by invasive cleavage | |
US20190185932A1 (en) | Method for preparing libraries for massively parallel sequencing based on molecular barcoding and use of libraries prepared by the method | |
US11555185B2 (en) | Target enrichment | |
CN116472356A (zh) | 用于分离双链断裂的方法 | |
US20140357528A1 (en) | Adapters for Ligation to RNA in an RNA Library with Reduced Bias | |
CN115109842A (zh) | 用于准确的平行定量核酸的高灵敏度方法 | |
US20150099670A1 (en) | Method of preparing post-bisulfite conversion DNA library | |
CN110628886B (zh) | 一种检测dna中的单链断裂的方法 | |
CN108753939B (zh) | 一种检测全基因组的单链dna损伤的方法 | |
WO2018081666A1 (en) | Methods of single dna/rna molecule counting | |
KR20240032631A (ko) | 변이체 핵산의 정확한 병렬 정량을 위한 고감도 방법 | |
KR20240032630A (ko) | 핵산의 정확한 병렬 검출 및 정량화 방법 | |
CN114616342A (zh) | 制备用于crispr的个性化的靶标不相关的向导rna池的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |