CN112159476B - 一种用于多发性骨髓瘤的双特异性抗体及其应用 - Google Patents

一种用于多发性骨髓瘤的双特异性抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于多发性骨髓瘤的双特异性抗体及其应用，属基因工程抗体技术领域。本发明以靶向人BCMA的抗体F00和靶向人PD‑1的抗体D00为亲本抗体，依据CrossMab平台利用基因工程技术在两个重链Fc上分别引入‘knob’和‘hole’端，哺乳动物真核表达体系表达DF00。本发明还提供表达和纯化双特异性抗体DF00的方法，通过HEK293细胞分泌表达，亲和层析纯化获得目的蛋白。此双特异性抗体DF00能够特异性同时结合于多发性骨髓瘤（MM）细胞表面的BCMA分子和活化的T细胞表面免疫检查点分子PD‑1，抑制肿瘤中免疫抑制的微环境且将T细胞募集至多发性骨髓瘤细胞周围，重塑T细胞杀伤MM细胞的功能。

Description

一种用于多发性骨髓瘤的双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种新型可以同时靶向人B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)和免疫抑制分子程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1)的双特异性抗体DF00，其可利用双靶向性将表达有PD-1抗原的T细胞募集至高表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞周围，同时抑制免疫抑制的微环境，重塑T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是指应用免疫学原理和方法，通过激活体内的免疫细胞和增强机体抗肿瘤免疫应答，特异性地清除肿瘤微小残留病灶、抑制肿瘤生长，打破免疫耐受的治疗方法。肿瘤免疫治疗就是要克服肿瘤免疫逃逸的机制，从而重新唤醒免疫细胞来清除癌细胞。由于其副作用小、治疗效果明显，正逐渐成为未来肿瘤治疗的发展方向，被称为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。免疫调节策略的有效性取决于基线免疫应答的存在和预先存在的免疫释放，因此效应T细胞在抗肿瘤反应中起中心作用已经达成了普遍共识。
(一)多发性骨髓瘤与肿瘤相关抗原BCMA
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种终末分化浆细胞的恶性肿瘤，患者多见于血清或尿液中的克隆浆细胞和单克隆蛋白的骨髓浸润。多发性骨髓瘤的诊断是在明确的终末器官损害可归因于浆细胞增殖障碍或当发现表明其发展的高可能性存在。从意义不明的单克隆免疫球蛋白增多症(MGUS)的前驱阶段和郁积性多发性骨髓瘤中鉴别需要治疗的症状性多发性骨髓瘤是重要的，因为观察是这些情况的标准。在过去十年中，在疾病生物学和个体化治疗方法的认识方面取得了很大进展。一些新的药物，如蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物，已经加入了传统的治疗手段(皮质类固醇、烷基化剂和蒽环类药物)，并与高剂量治疗和自体造血干细胞移植一起，导致了更深入和持久的临床反应。但大多数MM最终由于耐药性的发展而复发。因此，迫切需要新的治疗策略，特别是在高危复发和难治性多发性骨髓瘤。
BCMA是一种跨膜糖蛋白和非酪氨酸激酶受体，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，几乎仅在浆母细胞和浆细胞中表达。在非恶性淋巴样组织中，在生发中心的滤泡间的区域检测到了BCMA蛋白，但在滤泡外套区未检测到。与其他两个功能相关的TNFR B细胞活化因子受体(BAFF-R)和跨膜活化剂以及钙调节剂和亲环素配体相互作用物(TACI)不同，BCMA在致力于浆细胞分化的晚期记忆B细胞中被独特诱导，并存在于所有浆细胞中。相反，除了相比于相同个体的浆细胞具有显著更低BCMA表达的浆细胞样树突状细胞(pDC)，其他正常组织检测不到的BCMA转录本。使用组织基因表达谱和免疫组化以及流式细胞术分析进行的多项独立研究表明BCMA转录本和蛋白质在浆细胞中强表达，而在正常组织中由于浆细胞的强表达而检测表达微弱。MM细胞中依赖BCMA的生物学作用主要受关键的生长和生存蛋白激酶B(AKT)，MAPK和核因子(NF)-κB信号级联调控。BCMA过表达不仅诱导MM细胞的生存与增殖，同时也会诱导MM细胞上免疫抑制因子(PD-L1，IL10，TGFβ等)的上调，形成免疫抑制的微环境。因此BCMA已成为用于多发性骨髓瘤的新型免疫治疗方式被靶向的理想抗原。
(二)PD-1/PD-L1免疫检查点与骨髓微环境免疫抑制
程序性死亡受体1(PD-1)以及PD-1的配体PD-L1，在T细胞的激活，免疫和耐受方面发挥重要作用。在正常情况下，为了阻止活化的T细胞破坏正常的人体细胞，免疫***能够通过激活PD-1/PD-L1等免疫检查点来控制T细胞的活化进程，防止出现T细胞错误地攻击正常的细胞。然而，癌细胞通过表达表面蛋白PD-L1特异性地识别T细胞表面上的PD-1，窃取这种控制机制，从而激活免疫检查点来抑制T细胞的免疫活性，这就会导致癌细胞逃避免疫识别和茁壮生长。PD-1/PD-L1的相互作用也导致肿瘤特异性T细胞的选择性抑制，因为T细胞在遇到肿瘤抗原被激活后会诱导T细胞表达PD-1，从而形成一个“分子屏障”，使肿瘤逃避免疫应答。
已有大量研究表明，PD-L1在骨髓瘤患者的病理浆细胞(PC)上表达，而在健康供体的正常浆细胞上不表达，而且PD-L1在MM中的PC上的表达高于未定意义的单克隆免疫球蛋白增多症(MGUS)，也有相关报道表明PD-L1的表达与临床MM的进展风险增加之间存在有一定相关性，在持续性MRD和复发的MM患者检测到其CD4和CD8 T细胞PD-1水平明显升高。因此，MM细胞上的PD-L1与PD-1相互作用抑制肿瘤特异性细胞毒性T细胞，避免了T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用，形成免疫抑制的微环境。
(三)双特异性基因工程抗体
单克隆抗体治疗是治疗血液***恶性肿瘤的重要手段，但单克隆抗体的活性较低。然而，双特异性抗体免疫疗法不依赖于传统疗法的细胞毒性机制，可将免疫细胞重定向至肿瘤进行随后的裂解，临床前和积累的临床数据支持这些药物对血液恶性肿瘤的单药疗效，与采用t细胞疗法相比，双特异性抗体(BsAbs)是一种现成的产品，易于扩展，这预示着新双特异性形式的发展将进入一个激动人心的时代。
但同时双特异性抗体相对于单抗在结构上更为复杂，在抗体药物开发上，双特异性抗体面临的挑战更大。与通常意义上的抗体分子不同，双特异性抗体在自然状态下并不存在，双特异IgG抗体产生中的主要挑战就是轻、重链的正确联结。以往最原始的方式是轻、重链随机联结成非对称的异源二聚体IgG抗体，会产生多种不需要的副产品，需要通过重组DNA或细胞融合技术人工制备实现。因此，双抗的分子结构设计是非常重要的关键点，即双抗的技术平台是双抗技术核心。
基于上述理论基础调研，本发明依据CrossMab平台设计了一种同时靶向BCMA与PD-1的双特异性抗体DF00，利用双特异性抗体其中一端F00能够识别并与多发性骨髓瘤细胞表面BCMA结合，抑制多发性骨髓瘤的生长以及免疫抑制因子的表达；同时另一端D00能够识别并结合T细胞表面PD-1抗原，将T细胞募集至多发性骨髓瘤细胞周围，同时重塑T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，避免肿瘤在常规治疗中的免疫逃逸，增强抗肿瘤作用。为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的启发和思路。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种具有肿瘤免疫疗效的能够同时特异性地靶向人BCMA与PD-1的双特异性抗体DF00。
技术方案：一种靶向人BCMA且重新激活T细胞的双特异性抗体，该双特异性抗体包括一端靶向人BCMA的亲本抗体F00(knob端)与另一端靶向人PD-1的亲本抗体D00(hole端)。依据CrossMab平台利用基因工程技术在两个亲本抗体的重链Fc上分别引入‘knob’(T366W,S354C)和‘hole’(T366S,L368A,Y407V和Y349C)端，形成双特异性抗体DF00。
该双特异性抗体抗人BCMA亲本抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述抗人BCMA亲本抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗人BCMA亲本抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述抗人BCMA亲本抗体的轻链的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述抗人PD-1亲本抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述抗人PD-1亲本抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述抗人PD-1亲本抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述抗人PD-1亲本抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
CrossMab是罗氏公司自主研发的双特异性抗体技术，该技术能够利用传统的治疗性抗体生产工艺生产具有正确折叠和组装的双特异性抗体分子，罗氏公司利用该技术开发了同时靶向Ang2和VEGF的双特异性抗体。本发明中设计构建的双特异性抗体主要依据罗氏CrossMab技术平台，该技术平台中Knobs-into-holes(KiH)方法的使用解决了重链异二聚体的正确联结，但其类同的轻链的正确联结数十年来依然是个问题；Crossover技术的出现保证了双特异性异二聚体IgG抗体中轻链的正确联结，它是基于双特异IgG抗体Fab臂功能域的交换而达成目的。
本发明中双特异性抗体的两个亲本单克隆抗体F00与D00，其中一端F00的特征为能够特异性的靶向多发性骨髓瘤表面高表达抗原BCMA，亲和力高；另一端D00则能特异性的靶向T细胞表面的免疫检查点分子PD-1，阻断免疫抑制通路，重塑T细胞杀伤作用。运用“Knob into hole”技术对两个亲本抗体的Fc段进行突变，促使两条亲本重链形成异源二聚体，同时采用“Crossover”对D00的轻链CL与重连CH1进行交换，这样避免双特异性抗体组装过程轻重链之间的异源错配，并且不会改变抗体本身的结构，可以保持抗体与抗原的亲和力；哺乳动物细胞表达***进行蛋白表达，保证双特异性抗体的生物学活性。
一种表达载体，包含所述的同时靶向人BCMA与PD-1的双特异性抗体。
一种宿主细胞，包含所述的同时靶向人BCMA与PD-1的双特异性抗体。
上述同时靶向人BCMA与PD-1的双特异性抗体在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
同时靶向人BCMA与PD-1的双特异性抗体DF00的应用方式：亲本抗体F00发挥靶向作用将双特异性抗体定位到BCMA高表达的多发性骨髓瘤细胞周围，同时通过阻断BCMA信号通路抑制多发性骨髓瘤细胞的生存与生长，而且能够减少肿瘤微环境中免疫抑制因子的表达；亲本抗体D00则发挥另一端靶向作用，通过T细胞上表达的PD-1抗原，既能将活化T细胞募集至多发性骨髓瘤细胞周围，也能通过阻断免疫检查点通路PD-1/PD-L1轴，重塑T细胞对肿瘤细胞的免疫监视功能。
发明进一步说明：
本发明中双特异性抗体DF00由四条链组成，其中一端为靶向BCMA的亲本抗体F00其Fc段经改造为“knob”端的重、轻链；另一端为经“Crossover”转换的靶向PD-1的亲本抗体D00其Fc段经改造为“hole”端的重、轻链。
本发明的目的之一是构建一种新型的能同时靶向BCMA与PD-1的双特异性抗体DF00，具有重新激活T细胞使其成为杀伤肿瘤细胞的核心作用力，专利所述双抗DF00即是在其中F00端可特异性靶向BCMA的基础上，消除免疫抑制的微环境，同时将T细胞募集至肿瘤细胞附近使其发挥杀伤功能；目的之二是形成一套表达该双特异性抗体的工艺流程；目的之三是评估该双特异性抗体对MM的治疗可行性，为当下难以解决MM治疗瓶颈的市场提供一种新的启发和参考方案。
本发明采用分子生物学方法构建了所述双特异性抗体。依托从噬菌体文库筛选得到且经公司优化后的抗BCMA单链抗体2A9的氨基酸序列，经PCR、overlap PCR技术与IgG4压型拼接构建获得knob端抗BCMA全长抗体F00重、轻链，进行克隆重组，再利用实验室保有的hole端抗PD-1全长抗体D00重、轻链序列，构建双特异性抗体DF00重组载体；保菌的同时，提取含有双特异性抗体四条重、轻链序列的质粒，利用瞬转试剂将四种质粒瞬时转染HEK293细胞进行发酵表达；低温离心取上清，将上清过Protein A柱进行分离纯化，SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)和WB(WesternBlotting)鉴定表达产物表达及装配是否正确；ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)实验分析抗体与抗原的亲和能力，FCM(flow cytometry)在细胞水平检测抗体的亲和力，同时进一步揭示双特异性抗体与BCMA+的MM细胞系(NCI-H929、RPMI8226)的结合情况；这两部分的鉴定是作为双特异性抗体DF00得以发挥其靶向及重新激活T细胞杀伤靶细胞功能的基础；LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测法显示由双抗介导引起PBMCs对骨髓瘤细胞的杀伤作用，进一步揭示DF00发挥药效主要通过将T细胞成为杀伤肿瘤细胞的核心作用力，进一步增强杀伤功能。
有益效果：
本发明公开了一种新型双特异性抗体DF00，由分别靶向BCMA与PD-1的IgG4型抗体的两条重轻链组成。本发明DF00可以特异性靶向BCMA，同时通过PD-1端募集活化的T细胞至高表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞周围，使得T细胞成为杀伤肿瘤细胞的核心作用力，进一步增强杀伤功能。
附图说明
图1是基于F00的双特异性抗体DF00重组基因图谱。双特异性抗体DF00的重链基因大小约为1400bp左右，轻链基因大小约为700bp左右。VH和VL分别代表DF00的重链可变区和轻链可变区序列，CH和CL分别代表DF00的重链恒定区和轻链恒定区序列；SP为信号肽序列。图1A和图1B描述F00与DF00基因表达载体的构建示意图。
图2是F00与DF00的表达纯化鉴定图。图2A和图2B为发酵表达的F00与DF00通过ProteinA柱进行分离纯化的非还原性(8％分离胶)与还原性(12％分离胶)SDS-PAGE电泳结果，说明F00与DF00分子量正确，非还原性蛋白分子量约为150kD，还原性蛋白分别大约在50kD与25kD出现条带；图2C和图2D为纯化后F00与DF00的非还原和还原WB结果，说明F00与DF00的装配正确；图2C和图2D中孵育的一抗为羊抗人IgG(H+L)；M为蛋白Marker。
图3是ELISA验证DF00与BCMA及PD-1的结合亲和力。图3A为F00和DF00分别与抗原BCMA的浓度依赖性ELISA结合曲线，半最大效应浓度EC50分别为10.43nM和21.34nM；图3B为D00和DF00分别与抗原PD-1的浓度依赖性ELISA结合曲线，半最大效应浓度EC50分别为14.81nM和30.21nM；双抗DF00相比于两个裸抗F00和D00亲和力略有下调，但总体下降幅度不大。
图4是流式验证DF00细胞水平的结合亲和力。图4A-C分别描述DF00与HEK293、HEK293-BCMA和HEK293-PD-1的流式结合，结合率分别为4.29％、99.3％和99.9％，结果显示双抗DF00在细胞水平也显示出与BCMA、PD-1的较好的结合亲和力。
图5是DF00与不同BCMA表达的人源骨髓瘤细胞株的流式结合情况。图5A描述F00与BCMA+骨髓瘤细胞系NCI-H929，RPMI8226结合，结合率分别为95.8％和42.7％，而与BCMA-的Raji细胞结合率为11.2％，基本不结合；图5B描述DF00与BCMA+骨髓瘤细胞系NCI-H929，RPMI8226结合，结合率分别为86.3％和35.7％，而与BCMA-的Raji细胞基本不结合，结合率仅为4.58％；同时，对于同一种骨髓瘤细胞系，DF00显示出与F00相当的结合率。
图6是DF00介导的浓度依赖性PBMCs对骨髓瘤细胞NCI-H929和RPMI8226的杀伤作用实验结果图。图6A和图6B分别描述DF00介导的浓度依赖性PBMCs对NCI-H929和RPMI8226的杀伤作用，结果显示DF00可以激活PBMCs中T细胞为主的免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用分别为大约60％的NCI-H929和和40％的RPMI8226细胞，且其细胞毒性显著优于F00；结果表明DF00发挥药效主要通过将T细胞成为杀伤肿瘤细胞的核心作用力，募集大量活化T细胞至肿瘤细胞周围，进一步增强杀伤功能。
图7是DF00介导的梯度效靶比对不同BCMA表达的骨髓瘤细胞的细胞毒性实验。图7A描述DF00介导的梯度效靶比对RPMI8226与R-BCMA的细胞毒性作用，图7B为图7A的统计学分析结果；图7C描述DF00介导的梯度效靶比对NCI-H929与NCI-H929-shBCMA的细胞毒性作用，图7D为图7C的统计学分析结果；结果表明DF00能显著增强PBMCs对骨髓瘤细胞的杀伤作用，且在较高的效靶比条件下，其杀伤作用也显著增强，同时这种杀伤作用也依赖于骨髓瘤细胞表面BCMA的表达，BCMA表达越高，其杀伤作用也相应增强。
具体实施方式
实施例1双特异性抗体DF00的构建。
首先以实验室通过噬菌体展示技术筛选得到的并经过公司优化后的靶向BCMA的单链抗体2A9以及靶向PD-1的抗体D00为模板设计引物调取重轻链可变区基因，并且以IgG4恒定区(Fc段经knobs-into-holes突变，Fab段经Crossover改造)基因为模板设计引物调取重轻链恒定区基因，将重轻链的可变区与恒定区分别通过overlap PCR技术连接构建成双特异性抗体DF00重轻链基因；对获得的PCR产物与pCMV3载体分别进行EcoRI和NotI双酶切，回收目的片段和双酶切载体后，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到四组重组质粒pCMV3-F00-H/L-Chain(knob端)、pCMV3-D00-H/L-Chain(hole端)。Cacl2法将酶连产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板，挑取阳性单克隆进行测序比对，选取测序结果正确的保菌进行扩增并保存。
实施例2双特异性抗体DF00的表达纯化与鉴定。
首先将四种重组质粒pCMV3-F00-H/L-Chain(knob端)、pCMV3-D00-H/L-Chain(hole端)按一定的比例通过PEI转染试剂转染至HEK293细胞中，次日换液并对细胞进行传代，逐步扩大细胞发酵培养规模，收集细胞培养液，0.22μm滤膜过滤样品后进行ProteinA柱亲和层析纯化，最终大量获得目的蛋白。分别进行8％非还原以及12％还原SDS-PAGE电泳，Western blotting鉴定其分子量与装配情况，对目的蛋白进行初步验证。结果见图2，F00与DF00成功表达且装配正确。
实施例3通过ELISA分析验证DF00与BCMA及PD-1的结合亲和力。
首先将抗原BCMA和PD-1用50mM NAHCO3缓冲液稀释为1μg/ml,4℃包被于活化的酶标板过夜；经PBS洗涤除去未结合到酶标板的抗原后，5％脱脂牛奶封闭在37℃，2h；再次经PBST洗板后开始孵育一系列倍比稀释的抗体(500nM-0.244nM/250nM-0.122nM)，37℃，2h；随后再次PBST洗板，洗去未与抗原结合的抗体，使用带有HRP标签的山羊抗人IgG(H+L)孵育，37℃，2h；最后PBST洗板后使用TMB显色液显色，待出现明显的颜色梯度时，使用2M稀硫酸终止反应，酶标仪检测OD450-OD630的值作为最终结果。结果见图3，双抗DF00在分子水平与两个亲本抗体亲和力相当。
实施例4流式验证在细胞水平DF00的靶向亲和力。
分别构建了BCMA与PD-1过表达稳转的HEK293-BCMA/PD-1细胞株，该实验中首先将2*105个HEK293、HEK293-BCMA和HEK293-PD-1细胞重悬于250μl PBS中，制备单细胞悬液。随后向各细胞悬液中加入等体积浓度为250nM DF00进行共孵育1h。经PBS洗涤除去未结合的DF00后，利用带有FITC标签的抗人IgG(H+L)抗体与肿瘤细胞孵育，PBS洗涤后流式细胞仪检测肿瘤细胞表面结合有DF00的细胞比例，计算得到DF00与HEK293-BCMA/PD-1细胞的结合率。结果见图4，双抗DF00在细胞水平也显示出与BCMA、PD-1的较好的结合亲和力。
实施例5流式细胞术检测双特异性抗体DF00与不同BCMA表达的人源多发性骨髓瘤细胞株的结合能力。
选取BCMA高表达的人源骨髓瘤细胞系NCI-H929及BCMA中低表达的RPMI-8226作为研究对象，选取BCMA阴性的Raji细胞作对照。该实验中首先将2*105个NCI-H929、RPMI8226和Raji细胞重悬于250μl PBS中，制备单细胞悬液。随后向各细胞悬液中加入等体积浓度为250nM F00与DF00进行共孵育1h。经PBS洗涤除去未结合的F00与DF00后，利用带有FITC标签的抗人IgG(H+L)抗体与肿瘤细胞孵育，PBS洗涤后流式细胞仪检测肿瘤细胞表面结合有F00和DF00的细胞比例，计算得到DF00与NCI-H929、RPMI8226和Raji细胞的结合率。结果见图5，DF00与越高BCMA表达的骨髓瘤细胞具有越高的结合率，且DF00相比F00与骨髓瘤细胞的结合并没有显著降低。
实施例6 LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测法检测由DF00介导的浓度依赖性PBMCs对骨髓瘤细胞NCI-H929和RPMI8226的杀伤作用，PBMCs作为效应细胞，NCI-H929和RPMI8226作为靶细胞。首先提前24h在PBMCs的培养上清中加入1000U/mL的IL-2刺激效应细胞，在效靶比50:1条件下，浓度倍比稀释添加DF00(从1000nM到7.8125nM)，检测在不同浓度DF00条件下，DF00激活PBMCs中T细胞为主的免疫细胞对靶细胞的杀伤作用。其中设置靶细胞自发释放组：靶细胞+培养基；效应细胞自发释放组：效应细胞+培养基；背景空白对照组：无细胞的培养基；体积校正对照组：LDH裂解液+培养基；靶细胞最大释放组：靶细胞+培养基，培养时间结束前1h，向其中加入10％体积的LDH细胞裂解液，反复吹打混匀；每组设置三个平行副孔，37℃在5％CO2培养箱中共孵育一段时间后，400g离心5min，各孔吸取60μl培养上清至一新96孔板，配制LDH工作液，每孔加30μl工作液混匀，室温避光孵育30min，测OD490-OD630.测得的各组吸光度均应减去背景空白对照组吸光度(其中靶细胞最大释放组减去体积校正组吸光度)，计算裂解率＝(实验组-效应细胞自发释放组-靶细胞自发释放组OD值)/(靶细胞最大释放组-靶细胞自发释放组OD值)×100％。结果见图6，DF00介导的对骨髓瘤细胞的杀伤作用呈现浓度依赖性，且介导的细胞毒性显著优于F00。
实施例7 LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测法检测由DF00介导的梯度效靶比对不同BCMA表达的骨髓瘤细胞的杀伤作用，PBMCs作为效应细胞，RPMI8226/R-BCMA、NCI-H929/NCI-H929-shBCMA作为靶细胞。提前24h在PBMCs的培养上清中加入1000U/mL的IL-2刺激效应细胞，在一定浓度500nM DF00，不同效靶比(5:1/50:1/500:1)条件下，检测DF00激活PBMCs中T细胞为主的免疫细胞对靶细胞的杀伤作用。结果见图7，DF00相比于其亲本抗体能显著增强PBMCs对骨髓瘤细胞的杀伤作用，且在较高的效靶比条件下，其杀伤作用也显著增强，同时这种杀伤作用也依赖于骨髓瘤细胞表面BCMA的表达，BCMA表达越高，其杀伤作用也相应增强。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种用于多发性骨髓瘤的双特异性抗体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 463
<212> PRT
<213> DF00 knob端重链氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
20 25 30
Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala
35 40 45
Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
50 55 60
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly
65 70 75 80
Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Val Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 2
<211> 1392
<212> DNA
<213> DF00 knob端重链核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
atggacatga gagtgccagc acagctgctg ggactgctgc tgctgtggct gaggggagca 60
agatgcatgg cagaggtgca gctgcagcag agcggagcag agctggtgaa gcctggagcc 120
tccgtgaagc tgtcttgtac cgccagcggc ttcaacatca aggatacata catgcactgg 180
gtgaagcaga ggccagagca gggactggag tggatcggca gaatcgaccc agccaacggc 240
aataccaagt acgatcccaa gtttcagggc aaggccacca tcacagccga caccagctcc 300
aatacagcct atctgcagct gtctagcctg acctccgagg atacagccgt gtactattgc 360
gcaagatggg tgtactgggg acagggaacc acactgaccg tgtccacagc tagcaccaag 420
ggccccagcg tgttccccct ggccccttgc agcagaagca ccagcgagag cacagccgcc 480
ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcggc 540
gctctgacca gcggcgtgca taccttcccc gccgtgctcc agagcagcgg actgtactcc 600
ctgagcagcg tggtgaccgt gccttccagc agcctgggca ccaagaccta cacctgcaac 660
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagagcaa gtacggccct 720
ccctgccccc cttgccctgc ccccgagttc ctgggcggac ctagcgtgtt cctgttcccc 780
cccaagccca aggacaccct gatgatcagc agaacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 840
gacgtgtccc aggaggaccc cgaggtccag tttaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 900
cataacgcca agaccaagcc cagagaggag cagttcaaca gcacctacag agtggtgtcc 960
gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg aatacaagtg caaggtctcc 1020
aacaagggcc tgcctagcag catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagccacgg 1080
gagccccagg tctacaccct gccaccttgc caagaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1140
ctgtggtgtc tggtgaaagg cttctatccc agcgatatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1200
ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggacagcga cggcagcttc 1260
ttcctgtact ccaagctgac cgtggacaag tccagatggc aggagggcaa cgtcttcagc 1320
tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gagcctgagc 1380
ctgggcaagt ga 1392
<210> 3
<211> 237
<212> PRT
<213> DF00 knob端轻链氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 4
<211> 714
<212> DNA
<213> DF00 knob端轻链核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
atggacatga gagtgccagc acagctgctg ggactgctgc tgctgtggct gaggggagca 60
agatgcgacg tggtcatgac ccagagcccc tcctctatgt atgcctccct gggcgagcgc 120
gtgaccatca cctgtaaggc ctcccaggat atcaactctt acctgagctg gttccagcag 180
aagcccggca agtctcctaa gaccctgatc tatagggcaa ataggctggt ggacggagtg 240
ccatctcggt tttctggcag cggctccggc caggattaca gcctgacaat cagctccctg 300
gagtatgagg acatgggcat ctactattgc ctgcagtacg atgagttccc ttataccttt 360
ggcggcggca caaagctgga gatcaagcgg cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714
<210> 5
<211> 483
<212> PRT
<213> DF00 hole端重链氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Ile
50 55 60
His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr
115 120 125
Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
165 170 175
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
180 185 190
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
210 215 220
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
225 230 235 240
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Ser
245 250 255
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Leu Gly Lys
<210> 6
<211> 1452
<212> DNA
<213> DF00 hole端重链核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 6
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcc 60
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ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtgagagcaa gtacggccct 780
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gacgtgtccc aggaggaccc cgaggtccag tttaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 960
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<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> DF00 hole端轻链氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 7
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230
<210> 8
<211> 699
<212> DNA
<213> DF00 hole端轻链核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 8
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcc 60
agatgtgatg tggtgatgac ccagagcccg ctgagcctgc cggtgaccct gggccagccg 120
gcgagcatta gctgccgcag cagccagagc attgtgcata gcaacggcaa cacctatctg 180
gaatggtatc tgcagaaacc gggccagagc ccgcagctgc tgatttataa agtgagcaac 240
cgctttagcg gcgtgccgga tcgctttagc ggcagcggca gcggcaccga ttttaccctg 300
aaaattagcc gcgtggaagc ggaagatgtg ggcgtgtatt attgctttca gggcagccat 360
gtgccgctga cctttggcca gggcaccaaa ctggaaatta aagctagcac caagggcccc 420
agcgtgttcc ccctggcccc ttgcagcaga agcaccagcg agagcacagc cgccctgggc 480
tgcctggtga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag cggcgctctg 540
accagcggcg tgcatacctt ccccgccgtg ctccagagca gcggactgta ctccctgagc 600
agcgtggtga ccgtgccttc cagcagcctg ggcaccaaga cctacacctg caacgtggac 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagtgtag 699

Claims (5)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体包括抗人 BCMA 与抗人PD-1两个亲本全长抗体的可变区序列；所述抗人BCMA亲本抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，抗人BCMA亲本抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗人PD-1亲本抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述抗人PD-1亲本抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.编码权利要求1所述的双特异性抗体的核酸分子，其特征在于，所述抗人BCMA亲本抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗人BCMA亲本抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗人PD-1亲本抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述抗人PD-1亲本抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求1所述抗体、权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的宿主细胞在制备***药物中的应用；所述的肿瘤为多发性骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
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