CN112159462B

CN112159462B - 柯义巴肽a衍生物及其用途

Info

Publication number: CN112159462B
Application number: CN202011029160.0A
Authority: CN
Inventors: 房丽晶; 粟武; 姚贵阳; 王伟; 武春雷
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: CN109912697B; CN109912697A; CN112159462A

Abstract

本发明公开了一种柯义巴肽A衍生物及其用途，具体公开了一种柯义巴肽A或其衍生物，其具有式I所示结构式：

并公开了柯义巴肽A衍生物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的应用；以及在细胞定位研究中的测试剂的应用。

Description

柯义巴肽A衍生物及其用途

本申请是申请号201711331700.9，申请日为2017年12月13日，发明名称为“柯义巴肽A衍生物及其制备方法和用途”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及柯义巴肽A衍生物及其用途。

背景技术

柯义巴肽A(coibamide A)是一种高度N-甲基化的天然环酯肽。其结构如下所示：

在US20120028905A1中首次公开了从巴拿马海洋蓝藻Leptolyngbya sp.中可以分离纯化得到的天然环脂肽。然而，在该篇现有技术中，由于采用天然产物提取的方法获得柯义巴肽A，其纯化工艺复杂，需要耗费大量的溶剂和较长的时间，并且不能用于放大生产。

研究表明柯义巴肽A是通过一种新的作用机制来抑制癌细胞增殖，对肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病以及中枢神经癌等都具有低纳摩尔的细胞毒性，同时对乳腺、中枢神经以及卵巢癌细胞具有较好的组织选择性。因此，可将柯义巴肽A作为一种具有良好前景的抗癌药物的先导物。然而，由于自然界中存在的柯义巴肽A十分有限，不断有科学家针对柯义巴肽A的合成提出新的方案。

例如，2014年He Wei(Total synthesis of proposed structure of coibamideA，a highly N-and O-methylated cytotoxic marine cyclodepsipeptide.TetrahedronLett.2014，55，610g-12)首次报道了一种柯义巴肽A异构体的全合成方法，该方法采用[(4+1)+3+3]的片段拼接策略，通过多步液相反应，合成了柯义巴肽A的推测结构，但是其核磁数据与McPhail研究组报到的天然产物并不一致。同时，该合成方法涉及到多种缩合试剂，需要对中间体进行柱层析分离纯化，并且由于在多肽缩合过程中存在氨基酸的消旋现象，合成效率很低。

相较于液相合成方法，采用固相多肽合成方法(SPPS)可使柯义巴肽A的合成简便、快速。2015年，Nabika等(Synthesis and biological evaluation of the[D-MeAla¹¹]-epimerof coibamide A.Bio.Med.Chem.Lett.2015，25，302-6.)以TCP树脂为固相载体，通过Fmoc策略合成了包含全部氨基酸单元的环化前体，以TFA/DCM(5∶95，v/v)切除树脂后，通过在溶液中进行大环内酯化反应合成了11位MeAla发生异构化的柯义巴肽A的异构体，并且环化反应的收率极低，仅3.8％，以第一个氨基的取代度计算，合成该柯义巴肽A的异构体的总收率仅1％。

此外，Efficient Synthesis and Stereochemical Revision of coibamideA.J.Am.Chem.Soc.2015，137，13488-91；CN201510648096.7中，也即本课题组以芳基肼树脂为固相载体，以Melle^g-Ala⁸之间为环化位点，以BTC为所有酰胺键的缩合试剂，联用应用Fmoc-和Boc-策略的固相合成方法得到环化前体，氧化切除树脂后，在溶液中进行酰化关环反应，合成了柯义巴肽A的真实结构。虽然该方案以肼树脂为固相载体，实现了柯义巴肽A及其类似物的合成，但是由于肼树脂在氨基酸缩合过程中容易发生酰化反应，导致部分肽链无法从树脂上切割下来，直链肽的收率较低。

在Solid-Phase Total Synthesis of the Proposed Structure of CoibamideA and Its Derivative：Highly Methylated Cyclic Depsipeptides.Eur.J.Org.Chem.2015.7043-52.中，Sable等以2-CTC树脂为固相载体，首先通过酪氨酸上的羟基将双保护的酪氨酸负载在树脂上，选择性脱除酪氨酸氨基上的保护基，进而通过Fmoc-固相合成策略实现肽链的增长，脱除酪氨酸羧基上的保护基后，进行固相环化，进一步延长肽链，切除树脂后，在溶液中对酪氨酸中的羟基进行甲基化反应，得到了柯义巴肽A的异构体。然而，虽然该方案实现了固相环化，但是最终仍然需要在溶液中进行甲基化反应，总体收率较低；并且由于该路线所得到的化合物与其他课题组得到的相同化合物的谱图均不一致，因此该路线的反应过程中存在氨基酸的消旋问题，该技术方案也无法实现柯义巴肽A的合成。

综上可知，现有技术提供的柯义巴肽A的合成方法耗时长、收率低，并且由于反应过程中会发生氨基酸的消旋，也难以确保所合成的分子为所设计的目标分子。因此开发一种高效、快速合成柯义巴肽A或柯义巴肽A异构体或其类似物的方法，以满足研究以及应用的需求是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

通过现有技术可知，虽然现有技术中已知有一些固相或液相合成直链或环化多肽的方法，但是对于包含酯键，以及N甲基化酰胺键的环肽而言，其环合的位点、合成策略以及方法均较大程度地影响着合成效率和最终产品的构型。本发明人发现了在合成过程中由于柯义巴肽A及其衍生物中的多个酰胺键均是N甲基化的酰胺键，且其中环肽结构中包含了酯键，当采用固相合成树脂进行多肽合成时，在环化前体多肽的合成过程中脱除Tyr的Fmoc保护基时容易发生DKP反应，导致多肽链部分脱落，因此无法完成环化前体多肽的合成。同时，在树脂上进行酯化反应时，以常用的DCC/DMAP作为缩合试剂时，反应时间长，效率低，通常需要多次缩合才能得到较好的收率。

为解决上述问题，本发明的发明人在合成柯义巴肽A及其衍生物中只要控制环化的位点，就可以避免肽链部分脱落而导致无法得到环化前体，能够很大程度地提高合成效率，提高产率。

针对酯化效率低的问题，本发明的发明人使用三光气将氨基酸原位转化成高反应活性的酰氯中间体，能够很大程度地提高酯化效率。

本发明一个方面提供了一种侧尾成环的环酯肽的合成方法，所述的环酯肽中包含一个酯键，且形成酯键中提供羧基端一侧的第一位氨基酸的氨基为甲基化氨基酸，所述的合成方法为，

1)以所述成酯键中提供羧基端一侧的第二位氨基酸为起始氨基酸，在固相合成树脂上依次偶联氨基酸得到多肽链，其中，所述第二位氨基酸氨基以Fmoc进行保护，并以其羧基与固相合成树脂进行偶联；

2)裂解树脂，得到环化前体多肽；

3)在液相中，所述环化前体多肽以目标酯肽环的酯键中提供羧基端一侧的第二位氨基酸的羧基和酯键中提供羧基端一侧的第一位氨基酸的氨基进行缩合偶联，得到环酯肽。

本发明另一个方面提供了一种柯义巴肽A或其衍生物的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)以柯义巴肽A第10位氨基酸酪氨酸为起始氨基酸，以固相合成策略在固相合成树脂上依次偶联第10位至第1位氨基酸，并在第5位氨基酸苏氨酸侧链上偶联第11位氨基酸丙氨酸，得到树脂-多肽；

2)裂解树脂，得到游离的环化前体；

3)以第10位氨基酸酪氨酸和第11位氨基酸之间为环化位点进行环化缩合反应，得到柯义巴肽A或其衍生物。

在本发明的技术方案中，步骤1)中树脂-多肽结构如下所示：

其中，R₁＝-CH₃、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH₂OH、-CH₂OCH₃；

R₂＝H、-CH₃；

R₃＝

-CO(CH₂)₃CH₃、H；

R₄＝-CH₃、-CH₂OCH₃、-CH₂OH、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂NHBoc；

A＝O、-NH、-NCH₃；

R₅＝H、-CH₃、-COCH₂CH₂NH₂、-COCH₂CH₂NHCtz。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-D-Val²-OH和L-Me₂-Val¹-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，继续偶联Z-β-Ala-OH；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-D-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-VaI¹-L-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-D-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-D-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-L-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-L-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-D-N-Me-Thr⁵(tBu)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-L-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(tBu)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基；

并且在步骤3)环化完成后还包含了脱除tBu保护基的步骤。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(tBu)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(tBu)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基；

并且在步骤3)环化完成后还包含了脱除tBu保护基的步骤。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-N-Me-Ser⁶(tBu)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-N-Me-Ser³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，继续偶联Boc-β-Ala-OH；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基；

并且在步骤3)环化完成后还包含了脱除Boc的程序。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-D-Val²-OH以及L-Me₂Val¹-OH；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Boc-L-N-Me-Leu⁴-OH；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基；

并且在步骤3)环化之后还包含脱除Boc的步骤。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(tBu)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基；

并且在步骤3)环化之后还包含脱除tBu保护基的步骤。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Boc-L-N-Me-Leu⁴-OH；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基，并与癸酸在PyBOP/DIEA的作用下进行缩合反应。

在本发明的一个技术方案中，步骤1)中依次偶联Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷OH、Fmoc-N-Me-Lys⁶(Boc)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH；脱除第1位Val的Fmoc保护基，甲基化Val¹末端的氨基；在第5位Thr侧链上酯化偶联Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH，脱除Fmoc保护基。

在本发明的技术方案中，Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH的合成方法为Fmoc-L-N-Me-Val¹-OH和(S)-2-羟基-3-甲基-丁酸烯丙酯在缩合剂(三苯基膦和DIAD)的作用下进行酯化反应，再以Pd(PPh₃)₄和DMBA反应脱除烯丙基保护基得到Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH。

在本发明的技术方案中，Fmoc-L-N-Me-Ser^3/6(Me)-OH的合成方法为Boc-L-Ser-OH中加入NaHMDS反应完全后滴加碘甲烷反应至完全，以氯化铵水溶液淬灭，得到的中间体在DCM/TFA(v∶v＝1∶1，60ml)中脱除Boc保护基，以Fmoc-Cl在碱性条件下反应反应，获得Fmoc保护的Fmoc-L-N-Me-Ser^3/6(Me)-OH。

在本发明的技术方案中，步骤1)中的以固相合成方法合成直链肽的方法是在固相合成树脂上依次偶联Fmoc保护的N-甲基化氨基酸或非N-甲基化氨基酸，脱除Fmoc保护基，继续偶联N-甲基化氨基酸或非N-甲基化氨基酸至得到直链肽i；所述的N-甲基化氨基酸或非N-甲基化氨基酸可以为单一氨基酸，或者为多个氨基酸的短肽片段。

在本发明的技术方案中，脱Fmoc保护基方法为以20％的哌啶/DMF溶液进行脱除；优选地，向肽链-树脂中加入20％的哌啶/DMF溶液，悬浮液振摇；抽滤掉溶液，重新加入20％的哌啶DMF溶液，N₂鼓泡混匀；用DMF洗涤，然后用无水THF。

在本发明的技术方案中，将N-甲基化氨基酸以酰胺键偶联到树脂或多肽-树脂上的缩合方法为将N-甲基化氨基酸与缩合剂进行反应，加入碱剂，然后将羧基活化的N-甲基化氨基酸加入到脱保护后的树脂或多肽-树脂中，反应至完全。

在本发明的技术方案中，N-甲基化氨基酸包括α氨基上具有一个或两个甲基的氨基酸，包括但不限于L-N-Me-Leu^4/9-OH、L-N-Me-Ile⁷-OH、L-N-Me-Ser^3/6(Me)-OH、L-N-Me-Thr⁵-OH、L N-Me-Val¹、L-N-Me-Ala^3/6-OH、D-N-Me-Thr⁵(tBu)-OH、、L-N-Me-Ser⁶(tBu)-OH、Me₂Val¹-OH等。

在本发明的技术方案中，将非N-甲基化氨基酸以酰胺键偶联到树脂或多肽-树脂上的缩合方法为将非N-甲基化氨基酸与缩合剂进行反应，加入碱剂，然后将羧基活化的非N-甲基化氨基酸加入到脱保护后的树脂或多肽-树脂中，反应至完全。

在本发明的技术方案中，非N-甲基化氨基酸包括α氨基上不具有甲基的氨基酸，包括但不限于L-Tyr¹⁰(Me)-OH、L-Ala⁸-OH、D-HIV²-OH、L-HIV²-OH、D-Val²-OH、Z-β-Ala-OH、、L-HIV²-OH等。

在本发明的技术方案中，步骤1)中将Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH以酰胺键偶联到树脂或多肽-树脂上的缩合方法为将Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH加入PyAop和OxymaPure进行羧基活化，再加入碱剂，然后将羧基活化的Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH加入到脱保护后的树脂或多肽-树脂中，反应至完全。

在本发明的技术方案中，通过酯化反应将N-甲基化氨基酸11(优选为N-Me-Ala¹¹-OH，更优选为L-N-Me-Ala¹¹-OH或D-N-Me-Ala¹¹-OH)偶联至Thr⁵侧链的方法为将N-甲基化氨基酸11与三光气进行反应，加入碱剂，然后将羧基活化的N-甲基化氨基酸11加入到多肽-树脂中，反应至完全。

在发明中选用了三光气作为固相合成酯化的缩合试剂，反应效率要比普通缩合试剂，如DCC、EDC的反应效率高。

在本发明的技术方案中，将多肽和树脂裂解的条件为TFEA/HOAc/DCM、2％TFA/DCM等。

在本发明的技术方案中，环化缩合的方法为，将多肽与缩合剂以及碱剂进行反应至完全。

在本发明的技术方案中，脱除tBu和或Boc保护基的条件为TFA，优选地，具体步骤为0℃下，将环化产物加入TFA中，在相同温度下搅拌反应30min，减压蒸除三氟乙酸，HPLC纯化，得到目标化合物。

在本发明的技术方案中，用于酰胺键的缩合剂为EDC·HCl、EDIC、三光气(BTC)、DCC、DIC、DMTMM⁺BF4^-、DMTMM⁺Cl^-、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、BOP-Cl、PyBOP、PyAOP、OxymaPure、DPPA、FDP和FDPP中的一种或多种的组合物。

在本发明的技术方案中，碱剂为三甲基吡啶、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、二甲基吡啶(DMAP)、三乙胺(NMM)和2-甲基喹啉中的一种或多种的组合。

在本发明的技术方案中，固相合成树脂选自2-CTC树脂、Wang树脂，Rink树脂等切除树脂后末端为羧基的树脂。

在本发明的技术方案中，采用四氯苯醌/乙醛检测确认缩合反应完全，反应过程中，取待测物以DMF洗涤，加入2％的乙醛溶液和2％的四氯苯醌溶液，室温放置5分钟。树脂如果变绿或者变蓝，这样就说明反应没有完全，反之说明反应完全。

在本发明的技术方案中，所述的氨基酸应当以最广泛的含义理解，其包含了L构型氨基酸也包含了D构型氨基酸。其包含了不进行任何修饰的氨基酸也包含了以保护基进行氨基或羧基或者侧链保护的氨基酸。其包含了天然的氨基酸也包含了人工合成的氨基酸，甚至可以理解为包含了两个活性基团，氨基和羧基的化合物，特别的在本发明的技术方案中HIV即2羟基-3甲基-丁酸这种包含两个活性基团的化合物也可以理解为是一种泛氨基酸。

本发明一个方面提供了一种柯义巴肽A衍生物，其具有式I所示结构式：

其中，R₁＝-CH₃、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH₂OH、-CH₂OCH₃；

R₂＝H、-CH₃；

R₃＝

-CO(CH₂)₃CH₃、H；

A＝O、-NH、-NCH₃

R₅＝H、-CH₃、-COCH₂CH₂NH₂、-COCH₂CH₂NHCtz。

本发明一个具体的技术方案中，所述的柯义巴肽A衍生物具有下表中化合物13-30的结构。

本发明另一个方面提供了本发明所述的柯义巴肽A衍生物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的应用，优选地，其中所述的过度增殖性疾病包括结肠癌、直肠癌、脑瘤、肺癌、表皮鳞癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、结直肠癌、肾细胞癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、***癌、神经胶质瘤及鼻口因癌中的一种或多种；更优选地，所述的过度增殖性疾病为乳腺癌或非小细胞肺癌。

本发明另一个方面提供了本发明所述的柯义巴肽A衍生物在制备研究柯义巴肽A及其衍生物在细胞定位研究中的测试剂的应用。

本发明中的缩写具有如下定义：

BTC：三光气；EDC·HCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；DCC：N，N′-二环己基碳酰亚胺；DIC：N，N′-二异丙基碳二亚胺；DMTMM⁺BF₄ ^-：4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐；DMTMM⁺Cl^-：4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯盐；HATU：O-(7-氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBt：1-羟基苯并***；BOP：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐；BOP-Cl：双(2-氧代-3-恶唑烷基)次磷酰氯；PyBOP：六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷；PyAOP：(3H-1，2，3-***并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鳞六氟磷酸盐；DPPA：叠氮磷酸二苯酯；FDP：pentafluorophenyldiphenylphosphate；FDPP：五氟苯基二苯基磷酸酯；DMAP：4-二甲氨基吡啶；TFA：三氟乙酸；TIS：三异丙基硅烷；Fmoc：9-芴甲氧羰基；Boc：叔丁氧羰基；OxymaPure：2-肟氰乙酸乙酯；DIEA：二异丙基乙胺；DMAP：二甲基吡啶；NMM：三乙胺。

有益效果

本发明以简单廉价的氨基酸为原料，以2-CTC树脂为固相载体，通过选择合适的环化位点及缩合试剂，应用Fmoc-策略的固相合成方法先后完成了主肽链和侧链的合成，切除树脂后进行溶液中的酰化反应进行关环，能够高效、快速、经济地制备该天然产物柯义巴肽A或其异构体或其类似物，其中合成天然产物柯义巴肽A的总收率在30％左右。

附图说明

图1为本发明合成的化合物1(下图)与现有技术4中合成的柯义巴肽A的¹H NMR谱图(上图)比较(400MHz)。

图2为化合物1的HRMS谱图。

图3为化合物8的¹H NMR谱图。

图4为化合物8的¹³C NMR谱图。

图5为化合物9的¹H NMR谱图。

图6为化合物9的¹³C NMR谱图。

图7为化合物12Fmoc-D-N-Me-Ser(Me)-OH的¹H NMR谱图。

图8为化合物12Fmoc-D-N-Me-Ser(Me)-OH的HRMS谱图。

图9为化合物13的¹H NMR谱图。

图10为化合物3的HRMS谱图。

图11为化合物14的¹H NMR谱图。

图12为化合物14的¹³C NMR谱图。

图13为化合物14的HRMS谱图。

图14为化合物15的HRMS谱图。

图15为化合物16的¹H NMR谱图。

图16为化合物16的¹³C NMR谱图。

图17为化合物16的HRMS谱图。

图18为化合物17的¹H NMR谱图。

图19为化合物17的¹³C NMR谱图。

图20为化合物17的HRMS谱图。

图21为化合物18的¹H NMR谱图。

图22为化合物18的¹³C NMR谱图。

图23为化合物18的HRMS谱图。

图24为化合物20的¹H NMR谱图。

图25为化合物20的¹³C NMR谱图。

图26为化合物20的HRMS谱图。

图27为化合物21的¹H NMR谱图。

图28为化合物21的HRMS谱图。

图29为化合物22的¹H NMR谱图。

图30为化合物22的HRMS谱图。

图31为化合物23的¹H NMR谱图。

图32为化合物23的HRMS谱图。

图33为化合物24的HRMS谱图。

图34为化合物25的¹H NMR谱图。

图35为化合物25的HRMS谱图。

图36为化合物26的¹H NMR谱图。

图37为化合物26的HRMS谱图。

图38为化合物27的¹H NMR谱图。

图39为化合物27的HRMS谱图。

图40为化合物28的¹H NMR谱图。

图41为化合物28的HRMS谱图。

图42为化合物29的¹H NMR谱图。

图43为化合物29的HRMS谱图。

图44为化合物30的¹H NMR谱图。

图45为化合物30的HRMS谱图。

图46为柯义巴肽A的制备流程图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1柯义巴肽A的合成

(1)特殊氨基酸的合成：

1)化合物9Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH的合成：

将DIAD(416μL，2.1mmol)缓慢加入Fmoc-L-N-Me-Val¹-OH(6)(707mg，2mmol)，(S)-2-羟基-3-甲基-丁酸烯丙酯(7)(316mg，2mmol)和三苯基膦(525mg，2mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中，室温搅拌过夜，薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压蒸去溶剂得到粗产品，柱层析分离(己烷/乙酸乙酯)得到无色油状产物8(907mg，92％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.73-1.10(m，12H)，2.30-2.20(m，2H)，2.92(s，1.26H)，2.95(s，1.77H)，4.20-4.72(m，6H)，4.85(d，J＝4.2Hz，0.45H)，4.89(d，J＝4.2Hz，0.55H)，5.17-5.25(m，1H)，5.28(dd，J＝2.8，1.4Hz，0.45H)，5.32(dd，J＝2.8，1.4Hz，0.55H)，5.87(ddt，J＝16.2，10.5，5.8Hz，1H)，7.30(t，J＝7.4Hz，2H)，7.37(t，J＝7.3Hz，2H)，7.65-7.58(m，2H)，7.74(d，J＝7.5Hz，2H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ16.9，18.5，18.6，19.5，27.1，29.7，30.1，63.0，63.5，65.3，67.4，76.7，118.5，119.7，124.6，124.8，126.8，127.4，131.3，141.0，143.6，156.7，168.6，170.3.HRMS(ESI-TOF)m/z：calcd.For C₂₉H₃₆NO₆[M+H]⁺ 494.2537found 494.2534.

Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH(9)：将称量好的上述油状产物8(907mg，1.84mmol)和四(三苯基膦)钯(213mg，0.184mmol)溶解到无水四氢呋喃中，向该溶液中缓慢滴加1，3-二甲基巴比妥酸(DMBA，1.61g)的四氢呋喃(1ml)溶液。室温搅拌一小时，减压蒸去溶剂，粗产品经柱层析分离得到无色油状产物9。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.69-1.08(m，12H)，2.12-2.32(m，2H)，2.88(s，1.29H)，2.91(s，1.69H)，4.17(d，J＝10.6Hz，0.45H)，4.21-4.31(m，1H)，4.38-4.58(m，2H)，4.64(d，J＝10.3Hz，0.56H)，4.84(d，J＝4.0Hz，0.45H)，4.89(d，J＝4.0Hz，0.55H)，7.30(t，J＝7.4Hz，2H)，7.38(t，J＝7.4Hz，2H)，7.60(d，J＝7.7Hz，2H)，7.76(d，J＝7.5Hz，2H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ16.9，18.7，19.6，20.7，27.3，29.8，30.4，63.7，67.8，76.6，119.8，124.7，124.9，126.9，127.6，141.2，143.7，157.1，170.5，174.48；HRMS(ESI-TOF)m/z：calcd for C₂₆H₃₂NO₆[M+H]⁺ 454.2224found 454.2211.

2)化合物Fmoc-L-N-Me-Ser^3/6(Me)-OH(12)的合成：

向-78℃溶有Boc-L-Ser-OH(10)(5.12g，25mmol)的四氢呋喃(100ml)溶液中滴加双(三甲基硅基)氨基钠(NaHMDS)(2.0M，37.5ml，75mmol)，滴加完后，-78℃下搅拌30min，然后滴加碘甲烷(11.36g，5.0ml，80mmol)，缓慢升温至室温，搅拌反应20h，饱和氯化铵水溶液淬灭，二氯甲烷萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得粗产物11.

将粗产物11溶解到DCM/TFA(v∶v＝1∶1，60ml)中，0℃下搅拌2h，减压蒸馏除溶剂，用1，4-二氧六环(50ml)稀释，冷却到0℃，缓慢加入10％的碳酸钠溶液至pH为8-9，然后加入4g的Fmoc-Cl，室温搅拌10h，冰浴下加入稀盐酸调pH至3-4，用乙酸乙酯萃取三次，水洗两次，饱和食盐水洗一次，干燥，减压蒸馏得粗产品，经柱层析分离得无色油状化合物12。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ2.96(s，1.5H)，3.05(s，3H)，3.27(s，1.5H)，3.39(s，3H)，3.58(dt，J＝18.3，8.0Hz，1H)，3.86(ddd，J＝14.8，10.5，6.2Hz，2H)，4.23(t，J＝5.8Hz，1H)，4.29(t，J＝7.1Hz，2H)，4.38-4.46(m，2H)，4.47-4.57(m，1H)，4.61(dd，J＝7.7，4.6Hz，0.5H)，4.99(dd，J＝7.8，4.3Hz，1H)，7.28-7.35(m，3H)，7.40(m，3H)，7.56(d，J＝7.4Hz，1H)，7.61(d，J＝7.4Hz，2H)，7.74(d，J＝7.7Hz，1H)，7.77(d，J＝7.5Hz，2H).HRMS(ESI-TOF)m/z：calcd forC₂₀H₂₂NO₅[M+H]⁺ 356.1493found 356.1490.

(2)直链肽3的制备：

称量400毫克2-CTC树脂(0.98mmol/g，0.392mmol)加到25ml的固相合成管中，然后加入3ml二氯甲烷浸泡20分钟，抽除CH₂Cl₂。称量Fmoc-L-Tyr¹⁰(Me)-OH(73.48mg，0.072mmol)和DIEA(200μL)溶解到3ml的无水四氢呋喃中，搅拌一分钟后加入树脂中。N₂鼓泡混匀，缩合反应2h后，树脂用DMF洗四次，无水DMF洗一次。然后加入2ml溶解有乙酸(125μL，1.32mmol)和DIEA(200μL，1.20mmol)的无水DMF溶液，N₂鼓泡混匀2h，然后用DMF洗四次。利用Bienert的方法测定取代度为0.40mmol/g。

使用方法A脱除上述树脂(400mg，0.40mmol/g，0.16mmol)中的Fmoc保护基。同时根据所需的氨基酸的类别选择使用方法B、C或D中的一种进行氨基酸的缩合；依次缩合Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH。重复上述脱保护及缩合步骤，直至完成直链肽3的合成。

其中，方法A：脱Fmoc保护基

向树脂中加入3ml的20％的哌啶DMF溶液，悬浮液振摇10分钟。抽滤掉溶液，重新加入3ml的20％的哌啶DMF溶液，N₂鼓泡混匀10分钟。用3ml分析纯的DMF洗涤6次，然后用3ml无水THF洗一次。

方法B：N-甲基化氨基酸的缩合

将N-甲基化氨基酸(4.0eq)和BTC(1.64eq)溶解到3ml的四氢呋喃中，向混合溶液滴加三甲基吡啶(12eq)，再加完DIEA(20.0eq)后加到脱保护后的树脂中，N₂鼓泡混匀，至四氯苯醌/乙醛检测不再变色。然后用3ml分析纯DMF洗四次。

方法C：非N-甲基化氨基酸的缩合

将非N-甲基化氨基酸(4.0eq)和BTC(1.60eq)溶解到3ml的THF中，向混合溶液中滴加三甲基吡啶(12eq)，搅拌一分钟后，将1ml溶解有HOAt(4.0eq)，DIEA(20eq)的DMF溶液加入，搅拌1分钟。然后加到脱保护后的树脂中，N₂鼓泡混匀，至四氯苯醌/乙醛检测不再变色。然后用3ml分析纯DMF洗四次。

方法D：Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH缩合

将Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH(4eq)、PyAOP(4eq)和OxymaPure(4eq)溶解到3ml的DMF中，再加入DIEA(8eq)，室温搅拌两分钟后加入到脱保护后的树脂中，N₂鼓泡混匀，至四氯苯醌/乙醛检测不再变色。然后用3ml分析纯DMF洗四次。

(3)直链肽4的制备-Val¹脱除Fmoc后上-NHCH₃上的甲基化程序：

使用方法A脱除上述树脂3中的Fmoc保护基。将负载有直链肽3的树脂用CH₂Cl₂(3mL)洗涤两次，然后向树脂中加入NaBH(OAc)₃(10eq)的DCE(3mL)溶液和甲醛(10eq)的DCE溶液(3mL)，N₂鼓泡混匀2h，然后用DCE(3mL)和MeOH(3mL)分别洗两遍，用无水THF(3mL)洗两遍，得到直链肽4。

(4)直链肽5的制备：

使用方法E进行固相酯化反应，再使用方法A脱除树脂上的Fmoc保护基。

用CH₂Cl₂(2x 3ml)洗涤树脂，抽除CH₂Cl₂，加入TFEA/HOAc/DCM(1∶1∶8)混合溶液(10.0mL)，室温下振荡反应24h。将树脂滤除，并用CH₂Cl₂(20mL)洗涤树脂。将有机相浓缩，残留物用制备型HPLC纯化，收集产物，蒸除有机溶剂后，冻干，得到直链肽5(114mg，55％).HRMS(ESI)m/z：calcd for C₆₅H₁₁₃N₁₀O₁₇[M+H]⁺ Exact Mass：1305.8280，found1305.8274.

其中，方法E为树脂上酯化反应：

将N-甲基化氨基酸(12eq)和BTC(4.8eq)溶解到2ml的四氢呋喃中，向混合溶液中滴加三甲基吡啶(36eq)，搅拌一分钟后，加入DIEA(60.0eq)。向脱保护后的树脂中加入2ml的四氢呋喃和DMAP(4eq)，随后加入活化氨基酸的反应混合物，得到的悬浮液N₂鼓泡混匀1h，用3ml分析纯DMF洗四次。

(5)柯义巴肽A的制备：

将EDCI(19.2mg，0.10mmol)，HOAt(13.6mg，0.10mmol)，DIEA(70μL，0.40mmol)溶于CH₂Cl₂(30mL)中，在冰浴下冷却至0℃。将直链肽5(13mg，0.01mmol)溶于CH₂Cl₂(2mL)中，0℃缓慢滴加至EDCl/HOAt/DIEA的反应液中，反应1h后撤去冰浴，将反应混合物继续在室温下搅拌反应48h，减压蒸除溶剂，用制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到产物柯义巴肽A(1)(综合产率：7.2mg，56％)。[α]_D ²³-58.4°(c 0.10，CHCl₃)；IR(neat)：3376，2957，1734，1644，1512，1468，1404，1248，1097，757cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ0.83(d，J＝6.6Hz，3H)，0.88-0.99(m，18H)，1.00(d，J＝4.2Hz，3H)，1.05-1.08(m，9H)，1.11(m，1H)，1.11(d，J＝7.2Hz，3H)，1.28(d，J＝6.6Hz，3H)，1.31(m，1H)，1.36(m，2H)，1.50(m，2H)，1.60(m，1H)，1.68(m，1H)，2.02(m，1H)，2.05(m，1H)，2.21(m，1H)，2.34(br s，9H)，2.75(s，3H)，2.84(m，2H)，2.86(s，3H)，2.89(m，3H)，2.99(m，1H)，3.04(s，3H)，3.12(s，3H)，3.15(s，3H)，3.30(s，3H)，3.35(s，3H)，3.53(m，1H)，3.61(m，1H)，3.65(dd，J＝11.4，4.2Hz，1H)，3.75(m，1H)，3.77(s，3H)，3.83(m，1H)，3.90(m，1H)，4.73(m，1H)，5.00(d，J＝5.5Hz，1H)，5.11(m，1H)，5.32-5.38(m，2H)，5.50(br s，1H)，5.69(m，1H)，6.00(br s，1H)，6.35(br s，1H)，6.63(brs，1H)，6.68(br s，1H)，6.77(d，J＝9.0Hz，2H)，7.09(d，J＝8.4Hz，2H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ11.6，12.9，15.7，17.9，18.0，18.4，18.6，19.5，19.6，21.2，21.4，23.2，23.3，24.2，24.9，25.3，27.6，28.9，29.7，29.9，30.1，30.2，31.3，32.0，36.2，37.9，38.9，39.4，41.3，47.0，49.9，51.0，51.1，52.5，52.9，55.3，58.6，58.8，63.5，64.7，68.6，69.3，73.8，74.8，113.7，128.4，130.4，158.6，167.2，168.7，169.7，170.0，170.5，171.2，171.3，171.5，172.4ppm；HRMS(ESI-TOF)m/z：calcd for C₆₅H₁₁₁N₁₀O₁₆[M+H]⁺ 1287.8174，found1287.8176.

实施例2柯义巴肽A衍生物的合成

化合物13的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将偶联Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH替换为依次偶联Fmoc-D-Val²-OH和L-Me₂-Val¹-OH，并省略将Val¹脱除Fmoc后上-NHCH₃上的甲基化程序。综合产率：54％。

实施例3化合物14的合成

化合物14的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH；将Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH替换为Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH。综合产率：55％。

实施例4化合物15的合成

化合物15的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将得到的直链肽3中Fmoc-L-N-Me-Val¹上的Fmoc保护基以方法A进行脱除后，以方法C继续偶联Z-β-Ala-OH，并省略将Val¹脱除Fmoc后上-NHCH₃上的甲基化程序。综合产率：54％。

实施例5化合物16的合成

化合物16的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-L-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-D-Me-Ser³(Me)-OH，并将(S)-2-羟基-3-甲基-丁酸烯丙酯换成(R)-2-羟基-3-甲基-丁酸烯丙酯。综合产率：50％。

实施例6化合物17的合成

化合物17的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-D-N-Me-Ala³-OH；将Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH替换为Fmoc-D-N-Me-Ala⁶-OH；并将Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH替换为Fmoc-L-N-Me-Ala¹¹-OH。综合产率：52％。

实施例7化合物18的合成

化合物18的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-D-N-Me-Ala¹¹-OH替换为Fmoc-L-N-Me-Ala¹¹OH。综合产率：50％。

实施例8化合物19的合成

化合物19的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-L-N-Me-Thr⁵(tBu)-OH替换为Fmoc-D-N-Me-Thr⁵(tBu)-OH；并将(S)-2-羟基-3-甲基-丁酸烯丙酯换成(R)-2-羟基-3-甲基-丁酸烯丙酯。综合产率：49％。

实施例9化合物20的合成

化合物20的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了省略将Val¹脱除Fmoc后上-NHCH₃上的甲基化程序；将Fmoc-L-N-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH；且将Fmoc-L-N-Me-Ser⁶(Me)-OH替换为Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH。综合产率：48％。

实施例10化合物21的合成

化合物21的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-L-N-Tyr¹⁰(Me)-OH替换为Fmoc-L-N-Tyr¹⁰(tBu)-OH，并且对得到的环化产物进行脱除tBu的程序，具体方法如下：0℃下，将环化产物加入TFA中，在相同温度下搅拌反应30min，减压蒸除三氟乙酸，HPLC纯化，得到目标化合物。综合产率：47％。

实施例11化合物22的合成

化合物22的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-N-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-N-Me-Ser³(tBu)-OH，将Fmoc-N-Me-Ser⁶(Me)-OH替换为Fmoc-N-Me-Ser⁶(tBu)-OH，并且对得到的环化产物进行脱除tBu的程序，具体方法如下：0℃下，将环化产物加入TFA中，在相同温度下搅拌反应30min，减压蒸除三氟乙酸，HPLC纯化，得到目标化合物。综合产率：44％。

实施例12化合物23的合成

化合物23的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-N-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-N-Me-Ser³-OH，将Fmoc-N-Me-Ser⁶(Me)-OH替换为Fmoc-N-Me-Ser⁶(tBu)-OH。综合产率：55％。

实施例13化合物24的合成

化合物24的合成与实施例1中制备柯义巴肽A方法相似，只是在直链肽合成时，根据所需的氨基酸的类别选择使用方法B、C或D中的一种方法，依次缩合Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH以及Boc-β-Ala-OH，并且对得到的环化产物进行脱除Boc的程序，具体方法如下：0℃下，将环化产物加入TFA(1ml)中，在相同温度下搅拌反应30min，减压蒸除三氟乙酸，HPLC纯化，得到目标化合物。综合产率：48％。

实施例14化合物25的合成

化合物25的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相似，只是在合成直链肽时，根据所需的氨基酸的类别选择使用方法B、C或D中的一种，依次缩合Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala³-OH、Fmoc-D-Val²-OH以及Me₂Val¹-OH。综合产率：54％。

实施例15化合物26的合成

化合物26的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相似，只是在合成直链肽时，根据所需的氨基酸的类别选择使用方法B、C或D中的一种，依次缩合Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Boc-L-N-Me-Leu⁴-OH，并且对得到的环化产物进行脱除Boc的程序，具体方法如下：0℃下，将环化产物加入TFA(1ml)中，在相同温度下搅拌反应30min，减压蒸除三氟乙酸，HPLC纯化，得到目标化合物。综合产率：46％。

实施例16化合物27的合成

化合物27的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，只是在合成直链肽时，根据所需的氨基酸的类别选择使用方法B、C或D中的一种，依次缩合Fmoc-L-N-Me-Leu⁹-OH、Fmoc-L-Ala⁸-OH、Fmoc-L-N-Me-Ile⁷-OH、Fmoc-L-N-Me-Ala⁶-OH、Fmoc-L-N-Me-Thr⁵-OH、Fmoc-L-N-Me-Leu⁴-OH、Fmoc-L-N-Me-Ser³(tBu)-OH和Fmoc-L-N-Me-Val¹-D-HIV²-OH。综合产率：52％。

实施例17化合物28的合成

化合物28的制备方法是对化合物27进行脱除tBu的程序，具体方法如下：0℃下，将环化产物加入TFA(1ml)中，在相同温度下搅拌反应30min，减压蒸除三氟乙酸，HPLC纯化，得到目标化合物。综合产率：46％。

实施例18化合物29的合成

化合物29的制备方法是将化合物26与癸酸在PyBOP/DIEA的作用下进行缩合反应，HPLC纯化得到目标化合物。综合产率：50％。

实施例19化合物30的合成

化合物30的制备方法与实施例1中制备柯义巴肽A方法相同，除了将Fmoc-N-Me-Ser³(Me)-OH替换为Fmoc-N-Me-Ala³-OH，将Fmoc-N-Me-Ser⁶(Me)-OH替换为Fmoc-N-Me-Lys⁶(Boc)-OH。综合产率：45％。

实施例3化合物的抗细胞增殖活性：

1)药物及试剂配制：将1L水加入一袋RPMI1640培养基中，补加2g碳酸氢钠，10万单位青霉素和100mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22μm除菌滤膜过滤除菌。95mL培养基加灭活新生牛血清5mL即为完全培养液。胰蛋白酶用D-hanks缓冲液配成0.25％溶液，过滤除菌后4℃保存备用。

2)待测样品溶液配制：准确称取1.0μmol柯义巴肽A(1)或其类似物，将其加到灭菌的0.5mL离心管中，加入100μL DMSO，配成10μM原液，-40℃冷冻保存。临用前融化后取适量以完全培养液稀释成相应的浓度。

3)细胞培养及传代：细胞均贴壁培养于含10mL完全培养液细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌D-hanks液洗两次，加0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30ml后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，继续培养。

4)药物处理：取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台盼蓝(Trypan Blue)染色，于显微镜下计数活细胞数目(死细胞数目不得超过5％)，用完全培养液调整细胞数目至1×105个细胞/毫升。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于CO₂培养箱中培养12小时，取出培养板后于每孔中补加100μL含不同浓度待测样品的完全培养液，使得药物终浓度分别为1000、100.0、10.0、1.0、0.1和0.01nM，每个浓度设4个平行孔，另设4孔细胞加入不含药完全培养液作正常对照孔。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO₂培养箱中继续培养72小时。取出培养板，每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，振荡混匀，继续培养4小时。弃去每孔中培养液，加100μL的DMSO溶解formazan结晶，振荡10min使完全溶解。

5)细胞毒活性测定：半抑制浓度的用酶标仪测定各孔光吸收，测定波长490nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖的抑制率：抑制率(％)＝[1-OD(加药组)/OD(阴性对照组)]×100％。根据药物浓度的对数对应的抑制率用Microcal Origin软件作直线回归，得到直线方程，计算抑制率在50％时对应的药物浓度即为待测样品对肿瘤细胞的半抑制浓度(IC₅₀)，所得数据如表1所示：

表1柯义巴肽A(1)及其类似物13-30的IC₅₀值

从表1可以看出本发明所合成的化合物14,15,23,27具有良好的抗癌细胞增殖活性，尤其是抗乳腺癌细胞及非小细胞癌细胞。

Claims

1.一种柯义巴肽A衍生物，其具有下表所示结构式：

。

2.根据权利要求1所述的柯义巴肽A衍生物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的应用；

其中所述的过度增殖性疾病为结肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌。