CN103965299A - 一种环五肽及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机化学合成领域，公开了一种新型结构环五肽及其合成方法与应用。所述新型结构的环五肽为环(N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酰-亮氨酰)，分子式为C35H57N5O5，结构式如下所示。该环五肽以D-亮氨酸、L-亮氨酸、D-苯丙氨酸和D-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐为原料，通过适当的工艺分别制备三肽中间体和二肽中间体，并且关环位点选择在D、L构型相邻的酰胺键位置，有效提高了环合效率。本发明的合成工艺简单，原料成本低，反应条件温和，纯度高，易于产业化，能充分满足医学试验和临床使用的需要。
Description
技术领域
本发明属于有机化学合成领域，具体涉及一种环五肽及其合成方法与应用。
背景技术
环肽类化合物在自然界中广泛存在。植物、动物、低等海洋生物、微生物、细菌和病菌等含有微量的环肽，这些环肽的含量虽然低，但它们的特异结构和药理作用时陆生生物所无法比拟的。天然环肽类化合物具有显著的药理稳定性和强效性，毒理作用相对较小，对防治癌症、艾滋病、心脑血管病、老年病等疑难杂症具有独特效应，已成为开发新药、特效药的主要方向之一。
由于环肽缺少游离的N端和C端，能形成限制性构象。一般地说，与相应的线性肽相比，其在生物体内具有更好的代谢稳定性，抗酶解能力更强。不少研究已经证明，从直链的先导结构肽改为环肽后使得原有的生物活性提高十几倍至几万倍。(FairlieD.P.，Abbenante G.，March D.R.，Curr.Med.Chem.，1995，2，654-686；Bruce J，Aungstand Hirosi Saitoh，Pharmaceutical Research，1996，13(1)，114-119；Dae-Yeon Suh，YongChul Kim，Young-Hwa Kang.J.Nat.Prod.，1997，60，265-269；Bogdanowich-Knipp S.J.，Jois D.S.S.，Siahaan T.J.J.Pept.Res.，1999，53，523-529；DermocCox，ToshiakiAoki，JiroSeki，Yukio Motoyama，keizo YoshidaMed.Res.Rev.，1994，14(2)，195-228.)鉴于环肽的诸多优点，近年来对多肽的研究热点已经转移到环肽的合成和生物评价。
Galaxamide是本课题组从中国南海西沙群岛永兴岛采集的红藻乳状丝节藻(Galaxaura filamentosa)中分离得到的一种新型环五肽(Xu W.J.，Liao X.J.，Xu S.H.，Organic Letters，2008，10(20),4569-4572.)，体外抗肿瘤活性实验表明该化合物对人肝癌细胞株HepG2和Bel-7402，人乳腺癌细胞株MCF-7，人***细胞株Hela等多种肿瘤细胞具有一定的细胞毒性，同时对该化合物诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡机制进行了初步研究，结果显示Galaxamide有望成为新型抗癌药物的先导化合物，但是天然来源分离得到的具有较好活性的天然产物极其少量，不能满足人们需要，因此进一步探索其构效关系、深入研究其药理作用、对Galaxamide进行结构修饰并合成其类似物显得尤为重要。对Galaxamide类似物及其中间体进行体外抗肿瘤活性筛选，并与Galaxamide进行对照，以期开发出新型抗肿瘤药物的先导化合物。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种环五肽。
本发明的另一目的在于提供上述环五肽的合成方法。
本发明的再一目的在于提供上述环五肽在制备抗癌药物中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种环五肽，其化学名称为：环(N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰)；英文缩写表达式为：cyclo-(N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-L-Leu)；分子式为C35H57N5O5；结构式如下所示：
上述环五肽的合成方法，具体包括以下合成步骤：
(1)将L-亮氨酸、D-亮氨酸及D-苯丙氨酸分别与二碳酸二叔丁酯(Boc2O)进行氨基端保护反应，得到叔丁氧羰基-L-亮氨酸(Boc-L-Leu-OH)、叔丁氧羰基-D-亮氨酸(Boc-D-Leu-OH)及叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸(Boc-D-Phe-OH)；
(2)将步骤(1)得到的叔丁氧羰基-D-亮氨酸和叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸分别与碘甲烷进行甲基化反应，得到叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸和叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸；
(3)将步骤(2)得到的叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸和叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸分别与D-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐进行缩合反应，得到叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护二肽D1(Boc-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn)和叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护二肽D2(Boc-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn)；
(4)将步骤(3)得到的二肽D2脱除叔丁氧羰基保护后，与步骤(1)得到的叔丁氧羰基-L-亮氨酸进行缩合反应得到叔丁氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护三肽T(Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn)；
(5)将步骤(3)得到的二肽D1脱除叔丁氧羰基保护，将步骤(4)得到的三肽T脱除苄基保护，然后将两者进行缩合反应得到叔丁氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护线型五肽(Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn)；
(6)将步骤(5)得到的线性五肽分别脱除叔丁氧羰基保护和苄基保护，在混合缩合试剂的作用下进行环合反应即得到目标产物环(N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰)五肽(cyclo-(N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-L-Leu))。
上述环五肽的合成方法中，步骤(1)中所述氨基端保护反应的具体操作步骤为：在氮气保护下，向圆底烧瓶中依次加入四氢呋喃(THF，150mL)、H2O(100mL)和1.0mol/L NaOH溶液(150mL)，冰水浴冷却下一次性加入L-亮氨酸(50mmol)、D-亮氨酸(50mol)或D-苯丙氨酸(50mmol)，搅拌溶解均匀，然后一次性加入Boc2O(60mol，1.2eq)，冰水浴下继续搅拌10min后缓慢升至室温，调节pH为10～10.5，搅拌过夜，减压蒸除溶剂后，用无水***萃取，水相在冰水浴下冷却并用1mol/L盐酸酸化至pH＝2，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥后过滤，最后蒸出溶剂，分别得到叔丁氧羰基-L-亮氨酸、叔丁氧羰基-D-亮氨酸或叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸。
上述环五肽的合成方法中，步骤(2)中所述甲基化反应的具体操作步骤为：将叔丁氧羰基-D-亮氨酸或叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸溶于四氢呋喃(THF，100mL)溶液中，加入碘甲烷(5eq)和氢化钠(3eq)，反应1-2天，冰水浴下向反应体系加入乙酸乙酯(100mL)及水(20mL)，减压蒸除有机溶剂，得到的水溶液用无水***和水洗涤两次，合并水相在冰水浴下用盐酸酸化至pH＝2～3，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，然后分别用水、5％Na2S2O3水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，油泵干燥，分别得到叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸或叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸。
上述环五肽的合成方法中，步骤(3)、(4)、(5)中所述缩合反应是指在缩合试剂3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)和二异丙基乙胺(DIEA)的存在下两种相应的待缩合物进行脱水缩合，其具体操作步骤为：在氮气保护下，将叔丁氧羰基保护的待缩合物溶于四氢呋喃中，冰水浴下依次加入DEPBT(1.5eq)和DIEA(3eq)，反应10～15min后加入苄基保护化合物，待溶解后用DIEA调节pH为7～8，自然升至室温，搅拌过夜，用薄层色谱TLC检测原料消耗完全后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析，即得缩合产物；
上述环五肽的合成方法中，步骤(4)、(5)、(6)中所述脱除叔丁氧羰基保护是指在体积比为1：4的三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(CH2Cl2)的混合液中脱除相应待脱物中的叔丁氧羰基，其具体操作步骤为：将叔丁氧羰基保护的待脱物溶于CH2Cl2中，氮气保护下加入苯甲醚(2eq)，冰浴下搅拌，滴加TFA，反应4～6小时后，减压蒸除溶剂，再加入CH2Cl2，减压蒸除，重复操作三次除去TFA，油泵干燥即得到脱除叔丁氧羰基保护的产物。
上述环五肽的合成方法中，步骤(5)、(6)中所述脱除苄基保护是指用钯的质量百分含量为10％的钯碳氢解还原脱除相应待脱物中的苄基，其具体操作步骤为：将苄基保护的待脱物溶于乙酸乙酯中，氮气保护下加入待脱物质量1/3倍量的10％Pd/C(质量比)，密封条件下通入压力为0.1Mpa的氢气还原，室温下搅拌反应，TLC跟踪，反应4～6小时，停止通入氢气，过滤，回收Pd/C，减压蒸除溶剂，干燥，即得到脱除苄基保护的产物。
上述环五肽的合成方法中，步骤(6)中所述环合反应是指在O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)和二异丙基乙胺(DIEA)的存在下进行环合，其具体操作步骤为：将脱除叔丁氧羰基保护和苄基保护的线性五肽溶于体积比为2：1：2的THF-CH2Cl2-CH3CN混合溶液中，室温下氮气保护，依次加入HATU，DEPBT和TBTU，连续反应4～6天，减压蒸除溶剂，用CH2Cl2溶解后依次用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩，用反相HPLC(Agilent Eclipse ZORBAX SB-C18，5μm，9.4×250nm)分离得到环五肽产物。
上述环五肽采用MTT法研究其体外抗肿瘤活性，其检测原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能把外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。加入二甲基亚砜(DMSO)溶解甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测其吸光度值，可间接反映活细胞数量。其具体操作步骤为：
(1)接种细胞：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔1000～10000个细胞接种到96孔板中，每孔体积100μl(边缘孔用无菌PBS填充)；
(2)培养细胞：在5％CO2，37℃的细胞培养箱中孵育，次日上午加药，每孔加入100μl不同浓度的待测试样品，设3个复孔；
(3)呈色：培养72小时，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL，用PBS配制，pH＝7.4)，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分溶解；
(4)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值，记录结果，计算细胞存活率，同时以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线，并求得半数抑制浓度(IC50)。
上述环五肽化合物采用Annexin V-FITC/PI双染法检测其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡方式，该法能够区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。其具体操作步骤如下：
(1)接种细胞：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔1000000个细胞接种到6孔板中，每孔体积2mL；
(2)培养细胞：在5％CO2，37℃的细胞培养箱中孵育，次日上午加药，每孔加入1mL不同浓度的待测试样品，培养72小时；
(3)收集细胞，包括漂浮在培养基上的细胞，2000转离心5分钟，弃上清，用1mL PBS重悬送样，正常组分细胞分出200μl体积不染色；
(4)离心：1000转/分，5min，弃上清；
(5)重悬：加入200μl Binding Buffer缓冲液混匀；
(6)染色：加入5μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10分钟；
(7)离心：1000转/分，5min，弃上清；
(8)重悬：加入200μl Binding Buffer缓冲液混匀；
(9)染色：加入5μl PI，直接用流式细胞仪测定结果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的环五肽的合成，关环位点选择在D、L构型相邻的酰胺键位置，避免了在含有N-甲基酰胺键处环合，从而有效提高了环合效率，环合收率可达到65.5％；
(2)本发明制备的环五肽具有纯度高的优点，能够充分满足医学试验和临床使用的需要，具有很高的医学价值；
(3)本发明的环五肽采用成本较低的亮氨酸和D-苯丙氨酸为合成原料，合成工艺简单，反应条件温和，易于产业化，具有广阔的市场前景。
(4)活性实验表明，与Galaxamide相比，本发明的环五肽具有更好的抗肿瘤活性，对正常细胞和肿瘤细胞显示出较好的选择性。
附图说明
图1为本发明的环五肽的合成反应方程式；
图2为Galaxamide和本发明的环五肽PX的流式细胞分析图，图中上层的四幅图为Galaxamide的流式细胞分析图，下层的四幅图为本发明的环五肽PX的流式细胞分析图；图中Q1指机械损伤，Q2为坏死细胞，Q3为活细胞，Q4为早期凋亡细胞；图中的百分数为药物的质量浓度；图中的0、3、6、12、24分别表示浓度(单位：μg/mL)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1-10记载的本发明环五肽的合成反应的方程式如图1所示。
实施例1合成叔丁氧羰基-L-亮氨酸(Boc-L-Leu-OH)
在氮气保护下，向圆底烧瓶中依次加入四氢呋喃(THF，150mL)、H2O(100mL)和1.0mol/L NaOH溶液(150mL)，冰水浴冷却下一次性加入L-亮氨酸(50mmol，6.55g)，搅拌溶解均匀，然后一次性加入Boc2O(60mol，13.40g)，冰水浴下继续搅拌10min后缓慢升至室温，调节pH为10～10.5，搅拌过夜，减压蒸除溶剂后，用无水***萃取，水相在冰水浴下冷却并用1mol/L盐酸酸化至pH＝2，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥后过滤，最后蒸出溶剂，得到白色粉末叔丁氧羰基-L-亮氨酸，产率98.7％。
实施例2合成叔丁氧羰基-D-亮氨酸(Boc-D-Leu-OH)
重复实施例1的操作，所不同的是用D-亮氨酸代替L-亮氨酸，从而制得白色粉末叔丁氧羰基-D-亮氨酸，产率99.2％。
实施例3合成叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸(Boc-D-Phe-OH)
重复实施例1的操作，所不同的是用D-苯丙氨酸代替L-亮氨酸，从而制得透明油状物叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸，产率98.5％。
实施例4合成叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸(Boc-N-Me-D-Leu-OH)
将实施例2得到的叔丁氧羰基-D-亮氨酸(20mol，4.62g)溶于四氢呋喃(THF，100mL)溶液中，加入碘甲烷(100mol，6.3mL)和氢化钠(60mol，2.4g)，反应1-2天，冰水浴下向反应体系加入乙酸乙酯(100mL)及水(20mL)，减压蒸除有机溶剂，得到的水溶液用无水***(60mL)和水(100mL)洗涤两次，合并水相在冰水浴下用盐酸酸化至pH＝2～3，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机相，然后分别用水(150mL)、5％Na2S2O3水溶液(100mL×3)和饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，油泵干燥，得到透明油状物叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸，产率89.2％。实施例5合成叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸(Boc-N-Me-D-Phe-OH)
重复实施例4的操作，所不同的是用实施例3得到的叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸代替叔丁氧羰基-D-亮氨酸，从而制得透明油状物叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸，产率87.2％。
实施例6合成Boc-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn
氮气保护下，取实施例4得到的Boc-N-Me-D-Leu-OH1.47g溶于10mL THF中，冰水浴下依次加入2.70g DEPBT和1.6ml DIEA，反应10min后，加入2.60g D-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐，待溶解后用DIEA调节pH＝7～8，自然升至室温，搅拌过夜，TLC跟踪反应至原料点消失后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(洗脱剂V石油醚：V丙酮＝25：1)，即得白色晶体状叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护二肽D1(Boc-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn)2.52g，收率为93.6％。
实施例7合成Boc-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn
氮气保护下，取实施例5得到的Boc-N-Me-D-Phe-OH1.67g溶于10mL THF中，冰水浴下依次加入2.70g DEPBT和1.6ml DIEA，反应10min后，加入2.60g D-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐，待溶解后用DIEA调节pH＝7～8，自然升至室温，搅拌过夜，TLC跟踪反应至原料点消失后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(洗脱剂V石油醚：V丙酮＝25：1)，即得白色晶体状叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护二肽D2(Boc-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn)2.68g，收率为92.5％。
实施例8合成Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn
取实施例7得到的Boc-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn2.41g溶于20mL CH2Cl2中，氮气保护下加入1.05ml苯甲醚，冰浴下搅拌，滴加5ml TFA，反应4小时后，减压蒸除溶剂，再加入20mL CH2Cl2，减压蒸除，重复操作三次除去TFA，油泵干燥即得到脱除叔丁氧羰基保护的N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯(H-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn)，将其溶于5mL THF备用，氮气保护下，将1.67g实施例1得到Boc-L-Leu-OH溶于10mL THF中，冰水浴下依次加入2.24g DEPBT和1.3ml DIEA，反应10min后，加入备用的H-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn THF溶液，用DIEA调节pH＝7～8，自然升至室温，搅拌过夜，用TLC跟踪反应至原料点消失后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(洗脱剂V石油醚：V丙酮＝25：1)，即得透明油状叔丁氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护三肽T(Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-OBn)2.56g，两步收率为85.3％。
实施例9合成Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn
取实施例6得到的保护二肽D12.24g，按实施例8脱除叔丁氧羰基保护，得到N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酸苄酯(H-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn)并将其溶于5mL THF备用；取实施例8得到的保护三肽T2.38g溶于20mL乙酸乙酯中，氮气保护下加入0.8g10％Pd/C，密闭条件下通入压力为0.1MPa的氢气还原，室温下搅拌反应，TLC跟踪，反应4～6小时，停止通入氢气，过滤，减压蒸除溶剂，干燥，得到脱除苄基保护的叔丁氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸(Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-OH)；氮气保护下，将得到的Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-OH溶于10mL THF中，冰水浴下依次加入1.80g DEPBT和1.1ml DIEA，反应10min后，加入备用的H-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn THF溶液，用DIEA调节pH＝7～8，自然升至室温，搅拌过夜，用TLC跟踪反应至原料点消失后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(洗脱剂V石油醚：V丙酮＝25：1)，即得透明油状两端保护线型五肽(Boc-L-Leu-N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-OBn)2.72g，三步收率为81.4％。
实施例10合成cyclo-(N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-L-Leu)
取实施例9得到的两端保护线性五肽0.4277g溶于8mL CH2Cl2中，氮气保护下加入0.1ml苯甲醚，冰浴下搅拌，缓慢滴加2ml TFA，反应4小时后，减压蒸除溶剂，再加入10mL CH2Cl2，减压蒸除，重复操作三次除去TFA，油泵干燥即得到脱除叔丁氧羰基保护的线性五肽；将脱除叔丁氧羰基保护的线性五肽溶于10mL乙酸乙酯中，氮气保护下加入0.14g10％Pd/C，密闭条件下通入压力为0.1MPa的氢气还原，室温下搅拌反应，TLC跟踪，反应4～6小时，停止通入氢气，过滤，减压蒸除溶剂，干燥，即得到脱除苄基保护的线性五肽；将上述脱除苄基保护的线性五肽溶于120mL体积比为2：1：2的THF-CH2Cl2-CH3CN混合溶液中，室温下氮气保护，依次加入0.1426gHATU、0.1122g DEPBT和0.1204g TBTU，连续反应4～6天，减压蒸除溶剂，用CH2Cl2溶解后依次用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩，用反相HPLC(Agilent Eclipse ZORBAX SB-C18，5μm，9.4×250nm)分离得到白色针状环五肽晶体cyclo-(N-Me-D-Phe-D-Leu-N-Me-D-Leu-D-Leu-L-Leu)205.6mg，产率65.5％，纯度达99％以上。所得产物的结构表征数据如下，确认为结构式如下所示的化合物环(N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰)：
1H-NMR(500MHZ，CDCl3)，δ(ppm)：
7.89(s，1H)，7.21(m，5H)，6.70(m，1H)，5.53(m，1H)，5.09(m，1H)，4.82(d，J＝10.0Hz，1H)，4.77(m，1H)，4.31(m，1H)，3.67(dd，J＝5.0Hz，5.0Hz，1H)，3.56(ddd，J＝5.0Hz，5.0Hz，5.0Hz，1H)，3.34(m，1H)，3.13(m，2H)，2.98(m，2H)，2.81(m，1H)，2.68(d，J＝5.0Hz，1H)，2.27(m，1H)，1.85(m，4H)，1.55(m，7H)，0.90(m，18H)，0.70(m，6H)；
13C-NMR(125MHZ，CDCl3)，δ(ppm)：
173.4，172.9，172.1，171.4，168.5，138.8，129.5(2C)，128.8，128.7，127，68.36(2C)，59.37，55.37，47.66，47.3，41.7，36.0(3C)，30.8(2C)，25.4(3C)，23.0(3C)，22.6(3C)，22.03(C)。
实施例11细胞培养
本发明用的肿瘤细胞株包括人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株SW480、脑胶质瘤细胞株U87、人乳腺癌细胞MCF-7及人正常肝细胞L02。培养基(DMEM)中添加胎牛血清(FBS，10％)、链霉素和青霉素双抗(1％)。培养条件：37℃，5％CO2；相对湿度：95％。
(1)实验前处理：所需要的各项高压后的耗材放在超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作灯打开紫外灯照射30min后开始实验操作；
(2)复苏细胞：把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后，拿出来喷点75％酒精放在超净工作台里。然后将细胞悬浮液吸到15mL离心管中，用培养基把冻存管洗一遍，把黏在壁上的细胞都洗下来，加入5mL培养基，2000转离心3分钟。接着弃上清，加入1mL培养基悬浮细胞，吸到装有5mL培养基的7.5cm塑料培养瓶中，前后左右轻轻摇动，使培养瓶中的细胞均匀分布。最后标好细胞种类、日期和培养人等，放在CO2培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，根据其生长状态更换培养基，当细胞生长状态稳定，且呈对数生长期时，可用于实验。
实施例12体外抗肿瘤活性研究
环五肽和Galaxamide采用MTT法研究其体外抗肿瘤活性，具体操作步骤为：
(1)接种细胞：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔1000～10000个细胞接种到96孔板中，每孔体积100μl(边缘孔用无菌PBS填充)；
(2)培养细胞：在5％CO2，37℃的细胞培养箱中孵育，次日上午加药，每孔加入100μl不同浓度的待测试样品，设5个复孔；
(3)呈色：培养72小时，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL，用PBS配制，pH＝7.4)，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分溶解；
(4)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值，记录结果，计算细胞存活率，并求得半数抑制浓度(IC50/μg/mL)。
表1体外抗肿瘤活性实验
| HepG2 | SW480 | U87 | MCF-7 | L02 | |
| Galaxamide | 4.63 | 43.82 | 10.61 | 14.09 | 60.08 |
| PX | 1.46 | 5.1 | 1.85 | 4.18 | 50.68 |
采用MTT法研究了本发明的环五肽及Galaxamide的体外抗肿瘤活性，结果如表1所示。选用了人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株SW480、脑胶质瘤细胞株U87、人乳腺癌细胞MCF-7和一种人正常肝细胞株L02来研究它们的活性，药物作用时间都是72h。从表中可以看出，本发明的环五肽对肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株SW480、脑胶质瘤细胞株U87具有较好的抑制作用，其IC50值分别为1.46μg/mL、5.1μg/mL和1.85μg/mL；本发明的环五肽的抗肿瘤活性比Galaxamide更好，并且两者对正常细胞L02的毒性比肿瘤细胞小很多；本发明的环五肽对正常细胞和肿瘤细胞显示出较好的选择性，在肿瘤的治疗和预防方面展示了良好的应用前景。
实施例13细胞凋亡的测定研究
环五肽化合物对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡方式的研究，其特征在于采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，该法能够区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。其具体操作步骤如下：
(1)接种细胞：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔1000000个细胞接种到6孔板中，每孔体积2mL；
(2)培养细胞：在5％CO2，37℃的细胞培养箱中孵育，次日上午加药，每孔加入1mL不同浓度的待测试样品，培养72小时；
(3)收集细胞，包括漂浮在培养基上的细胞，2000转离心5分钟，弃上清，用1mL PBS重悬送样，正常组分细胞分出200μl体积不染色；
(4)离心：1000转/分，5min，弃上清；
(5)重悬：加入200μl Binding Buffer缓冲液混匀；
(6)染色：加入5μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10分钟；
(7)离心：1000转/分，5min，弃上清；
(8)重悬：加入200μl Binding Buffer缓冲液混匀；
(9)染色：加入5μl PI，直接用流式细胞仪测定结果。
所测结果如图2所示，结果显示，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率也逐渐增加。此外，本发明的环五肽诱导细胞凋亡的能力比Galaxamide更强，相同浓度下，本发明的环五肽的作用更强。结果表明，本发明的环五肽具有更好的诱导细胞凋亡的能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种环五肽，其特征在于：所述环五肽具有以下结构式：
2.权利要求1所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于包括以下合成步骤：
(1)将L-亮氨酸、D-亮氨酸及D-苯丙氨酸分别与二碳酸二叔丁酯进行氨基端保护反应，分别得到叔丁氧羰基-L-亮氨酸、叔丁氧羰基-D-亮氨酸及叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸；
(2)将步骤(1)得到的叔丁氧羰基-D-亮氨酸和叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸分别与碘甲烷进行甲基化反应，分别得到叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸和叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸；
(3)将步骤(2)得到的叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸和叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸分别与D-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐进行缩合反应，得到叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护二肽D1和叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护二肽D2；
(4)将步骤(3)得到的二肽D2脱除叔丁氧羰基保护后，与步骤(1)得到的叔丁氧羰基-L-亮氨酸进行缩合反应得到叔丁氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护三肽T；
(5)将步骤(3)得到的二肽D1脱除叔丁氧羰基保护，将步骤(4)得到的三肽T脱除苄基保护，然后将两者进行缩合反应得到叔丁氧羰基-L-亮氨酰-N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酸苄酯两端保护线型五肽；
(6)将步骤(5)得到的线性五肽分别脱除叔丁氧羰基保护和苄基保护，在混合缩合试剂的作用下进行环合反应即得到目标产物环(N-甲基-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-N-甲基-D-亮氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰)五肽。
3.根据权利要求2所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述氨基端保护反应的具体操作步骤为：在氮气保护下，向圆底烧瓶中依次加入四氢呋喃、H2O和1.0mol/L NaOH溶液，冰水浴冷却下一次性加入L-亮氨酸、D-亮氨酸或D-苯丙氨酸，搅拌溶解均匀，然后一次性加入二碳酸二叔丁酯，冰水浴下继续搅拌10min后升至室温，调节pH为10～10.5，搅拌过夜，减压蒸除溶剂后，用无水***萃取，水相在冰水浴下冷却并用1mol/L盐酸酸化至pH＝2，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥后过滤，最后蒸出溶剂，分别得到叔丁氧羰基-L-亮氨酸、叔丁氧羰基-D-亮氨酸或叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸。
4.根据权利要求2所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于：步骤(2)中所述甲基化反应的具体操作步骤为：将叔丁氧羰基-D-亮氨酸或叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸溶于四氢呋喃溶液中，加入碘甲烷和氢化钠，反应1-2天，冰水浴下向反应体系加入乙酸乙酯及水，减压蒸除有机溶剂，得到的水溶液用无水***和水洗涤两次，合并水相在冰水浴下用盐酸酸化至pH＝2～3，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，然后分别用水、质量分数5％Na2S2O3水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，油泵干燥，分别得到叔丁氧羰基-N-甲基-D-亮氨酸或叔丁氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酸。
5.根据权利要求2所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)、(4)、(5)中所述缩合反应是指在缩合试剂3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮和二异丙基乙胺的存在下两种相应的待缩合物进行脱水缩合，其具体操作步骤为：在氮气保护下，将叔丁氧羰基保护的待缩合物溶于四氢呋喃中，冰水浴下依次加入3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮和二异丙基乙胺，反应10～15min后加入苄基保护化合物，待溶解后用二异丙基乙胺调节pH为7～8，自然升至室温，搅拌过夜，用薄层色谱TLC检测原料消耗完全后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析，即得缩合产物。
6.根据权利要求2所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于：步骤(4)、(5)、(6)中所述脱除叔丁氧羰基保护是指在体积比为1：4的三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中脱除相应待脱物中的叔丁氧羰基，其具体操作步骤为：将叔丁氧羰基保护的待脱物溶于二氯甲烷中，氮气保护下加入苯甲醚，冰浴下搅拌，滴加三氟乙酸，反应4～6小时后，减压蒸除溶剂，再加入二氯甲烷，减压蒸除，重复操作三次除去三氟乙酸，油泵干燥即得到脱除叔丁氧羰基保护的产物。
7.根据权利要求2所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于：步骤(5)、(6)中所述脱除苄基保护是指用钯的质量百分含量为10％的Pd/C氢解还原脱除相应待脱物中的苄基，其具体操作步骤为：将苄基保护的待脱物溶于乙酸乙酯中，氮气保护下加入待脱物质量1/3的10％Pd/C，密封条件下通入压力为0.1Mpa的氢气还原，室温下搅拌反应，TLC跟踪，反应4～6小时，停止通入氢气，过滤，回收Pd/C，减压蒸除溶剂，干燥，即得到脱除苄基保护的产物。
8.根据权利要求2所述的一种环五肽的合成方法，其特征在于：步骤(6)中所述环合反应是指在O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮和二异丙基乙胺的存在下进行环合，其具体操作步骤为：将脱除叔丁氧羰基保护和苄基保护的线性五肽溶于体积比为2：1：2的THF-CH2Cl2-CH3CN混合溶液中，室温下氮气保护，依次加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯，连续反应4～6天，减压蒸除溶剂，用CH2Cl2溶解后依次用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩，用反相HPLC分离得到环五肽产物。
9.权利要求1所述的一种环五肽在制备抗肝癌药物，抗结肠癌药物或抗脑胶质瘤药物中的应用。
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