CN112159382B - 一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法 - Google Patents

一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法，该方法有效制备荔枝生理落果中具有活性的低聚原花青素，且设备简单、操作简便、绿色安全；所选用的有机溶剂对低聚原花青素有很好的溶解性，三相分离过程能选择性地富集和纯化荔枝生理落果中的低聚原花青素，纯化过程无需经过层析柱分离工序；采用三相分离制备荔枝生理落果提取物，相较于普通大孔树脂纯化，可大大缩短生产所需时间，简化生产步骤；通过有机溶剂和硫酸铵组成的三相体系所制备的低聚原花青素平均聚合度在3以下，其抗氧化活性可接近并达到经大孔树脂纯化后的程度；所用的提取试剂可回收循环使用，降低生产成本，节能环保。

Description

一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法
技术领域
本发明涉及于生物活性多酚物质分离纯化技术领域，更具体地，涉及一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法。
背景技术
荔枝是一种位于东南亚热带到热带的作物，荔枝自开花结果到成熟过程中，因品种、气象条件等因素，会有3～4次的落果高峰，这些荔枝生理落果不可食用，应用范围较窄，常作为农业废弃物丢弃。研究发现荔枝果实在成熟过程中果皮的原花青素含量逐渐减少，这主要是由于在这个过程中原花青素合成的减少或向其他化合物转化所导致的。而荔枝生理落果果皮中富含低聚原花青素，已被鉴定出具有儿茶素、表儿茶素、原花青素A1、原花青素A2和原花青素B2等低聚原花青素，且A型原花青素含量高于B型。这些低聚原花青素具有独特的化学性质，是提供荔枝药理活性的主要物质之一，已证实具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗癌、抗病毒、免疫调节、抗糖尿病等保健作用。因此荔枝生理落果可作为原花青素，尤其是A型原花青素的一个良好来源，极具开发利用成为保健品乃至药品的潜力。聚合度在4以下的原花青素称为低聚原花青素，而聚合度≥5的原花青素为高聚物，对于生物体来讲分子量较低更易于被机体消化吸收，也有研究表明聚合度小于4的原花青素易于进入血液循环被吸收利用，相较于高聚物有着较高的生物利用度。
目前，植物原料中原花青素的制备主要为溶剂提取与大孔树脂纯化相结合的方法。栾连军等人于2015年9月9日申请的专利名称“一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法”(授权号CN 103664855 B)，黄辛等人于2016年9月24日申请的专利名称“一种从荔枝提取物中制备含低聚体原花青素的方法”(授权号CN 106478580 B)，谢冬养于2018年2月23日申请的专利名称“荔枝皮原花青素的提取工艺”(申请号201711040011.2)。虽然通过大孔树脂纯化能够有效除去提取液中的杂质，但是大孔树脂使用前需要活化、装柱后需沉降平衡、使用后仍需清洗，整个过程耗时相对较长，同时洗脱过程中需要大量的溶剂，其处理量相对较低，存在耗时长、效率低、操作步骤繁琐、树脂易被污染且难以清洗等缺点。因此一种绿色、高效、快速的制备低聚原花青素的方法显得尤为重要。
三相分离技术是基于盐析、等电点沉淀和共溶剂沉淀等技术，使体系分成水相、蛋白质层和有机相三相，目前主要应用于水相中的多糖及中间层的蛋白质或酶的分离、浓缩和纯化。近年来，有机相中生物化学物质的分离纯化逐渐得到发展，三相分离方法简单易行，绿色快速，有机相和硫酸铵可回收重复利用，减少提取溶剂的消耗量。有研究者对穿心莲提取物进行三相分离纯化发现，有机相中多酚化合物含量高于水相，且具有良好的抗氧化活性。经检索，目前还未见利用有机溶剂和硫酸铵组成的三相体系从荔枝生理落果中分离制备活性低聚原花青素的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法，能有效制备具有活性的低聚原花青素提取物，相较于大孔树脂制备能极大地缩短生产所需时间，简化加工步骤，其活性可接近并达到经大孔树脂纯化后的程度，具有操作简单、处理量大、工艺流程短、绿色快速、成本低廉等优点，适合用于大规模工业化生产。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明要求保护一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法，包括以下步骤：
S1.用乙醇溶液提取荔枝原料，收集上清液；
S2.去除S1中的上清液中的乙醇，用蒸馏水稀释，得多酚粗提液；
S3.将多酚粗提液、硫酸铵和有机溶剂混合，充分混匀后离心，形成三相体系；
S4.收集三相体系中的有机相，完全去除溶剂，加入无水乙醇充分溶解混匀，离心去除沉淀取上清，完全去除上清液中的乙醇，得到低聚原花青素固体。
步骤S3中，利用硫酸铵不溶于无水乙醇，无水乙醇中仅仅溶解有低聚原花青素，从而去除硫酸铵，也起到了回收硫酸铵的目的。
本发明经三相分离制备多酚的回收率在80％以上，经高效液相色谱-质谱鉴定发现三相分离后的产品中含有大量的低聚原花青素，原花青素平均聚合度≤3，聚合度在5以下的原花青素有13种以上，且A型原花青素含量多于B型。虽然三相分离制备的多酚纯度仅为大孔树脂纯化后的86.36％，但是三相分离制备所得成品的抗氧化能力可接近并达到大孔树脂纯化后的程度。更重要的是本发明的三相分离步骤仅需约2h，可大大节省大孔树脂纯化所需的时间(活化+装柱+上样洗脱约3～4天)，而且大孔树脂一次能够纯化的样品量有限，效率较低，操作步骤繁琐，树脂易被污染而效果减弱。
优选地，步骤S2中，利用旋转蒸发去除乙醇，同时达到回收乙醇的目的。
更优选地，旋转蒸发温度为30～50℃。
进一步优选地，旋转蒸发温度为40℃。
优选地，将步骤S2中的水相和步骤S4中的离心的沉淀混合后采用进行蒸发结晶，以回收硫酸铵。
优选地，步骤S4中，利用旋转蒸发去除有机溶剂，以达到回收有机溶剂的目的。
更优选地，旋转蒸发温度为30～50℃。
进一步优选地，旋转蒸发温度为40℃。
优选地，步骤S4中，利用旋转蒸发去除乙醇，以达到回收乙醇的目的。
更优选地，旋转蒸发温度为30～50℃。
进一步优选地，旋转蒸发温度为40℃。
同时本发明中使用的所有试剂均可回收重复利用，减少了有机溶剂的消耗量，有利于避免对生态环境造成不利的影响，并且极大地降低了生产成本，简化加工步骤，更有利于实现大规模工业化生产。
优选地，步骤S1中，取干燥后的荔枝生理落果去核打粉作为荔枝原料，以70％乙醇进行提取，离心收集上清液。
更优选地，提取时，料液比为1︰5～10，提取温度40～60℃，提取时间1～3h，提取次数为1～3次。
进一步优选地，提取时，料液比为1︰5，提取温度40℃，提取时间3h，提取次数为3次。
优选地，步骤S1中，离心收集上清液，3500～10000r/min离心10～30min。
更优选地，步骤S1中，离心收集上清液，3500r/min离心15min。
优选地，步骤S3中，硫酸铵加入量为多酚粗提液体积的10％～60％(w/v)，有机溶剂加入量为多酚粗提液体积的0.5～1.5倍。
更优选地，硫酸铵加入量为多酚粗提液的20％～50％(w/v)，有机溶剂加入量为多酚粗提液体积的1～1.5倍。
进一步更优选地，硫酸铵加入量为多酚粗提液的50％(w/v)，有机溶剂加入量为多酚粗提液体积的1.5倍。
优选地，步骤S3中，所述有机溶剂为叔丁醇、正丁醇、正丙醇中的任一种。
更优选地，所述有机溶剂为叔丁醇。
优选地，步骤S3中，磁力搅拌充分混匀，磁力搅拌0.5～1h。
更优选地，磁力搅拌0.5h。
优选地，步骤S4中，离心收集上清液，3500～10000r/min离心15～30min。
更优选地，10000r/min离心30min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法，有效制备荔枝生理落果中具有活性的低聚原花青素，且设备简单、操作简便、绿色安全；所选用的荔枝落果富含低聚原花青素，相较于荔枝熟果果皮中的原花青素平均聚合度更低；所选用的有机溶剂对低聚原花青素有很好的溶解性，三相分离过程能选择性地富集和纯化荔枝生理落果中的低聚原花青素，纯化过程无需经过层析柱分离工序；采用三相分离制备荔枝生理落果提取物，相较于普通大孔树脂纯化，可大大缩短生产所需时间，简化生产步骤；通过有机溶剂和硫酸铵组成的三相体系所制备的低聚原花青素的抗氧化活性可接近并达到经大孔树脂纯化后的程度；所用的提取试剂可回收循环使用，降低生产成本，节能环保。
附图说明
图1为对照例1大孔树脂洗脱曲线。
图2为0.1mg/mL浓度下各方法纯化前后及抗坏血酸DPPH自由基清除能力对比。
图3为各方法及荔枝落果、熟果果皮乙醇粗提物平均聚合度对比
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、多酚含量的测定
用福林酚法测定样品中多酚含量，取0.2mL的样品液加入到10mL的容量瓶中，其中包含0.3mL的水。加入0.5mL的福林酚试剂和2.5mL的20％Na2CO3溶液，摇匀。室温下反应40分钟后，在725nm处测定吸光度。样品多酚含量以没食子酸当量(GAE)表示。多酚回收率为成品中多酚含量占多酚粗提液中多酚含量的百分比。
2、原花青素平均聚合度的测定
样品用适量甲醇溶解，取1mL稀释后的样品液于10mL避光试管中，加入5mL含4％盐酸和0.5％香草醛的甲醇溶液，30℃反应30min，在500nm处测定吸光度，以甲醇代替样品溶液作为空白对照计算样品原花青素质量浓度。
取1mL用乙酸稀释的样品液于10mL避光试管中，加入5mL含4％盐酸和0.5％香草醛的乙酸溶液混匀后，于20℃反应5min，在500nm处测定吸光度，以乙酸代替样品溶液作为空白对照计算样品原花青素摩尔浓度。根据公式计算计算原花青素的平均聚合度：
公式：mDP＝m/(Mn)
其中：m为质量含量(μg/mL)，n为分子含量(μmol/mL)，M为儿茶素的相对分子质量为290
3、DPPH自由基清除能力测定
取0.1mL样品(0.1mg/mL)加到3.9mL DPPH溶液中，以等量的甲醇和DPPH作为对照，摇匀后置于黑暗中静置30分钟，测量517nm处的吸光度。清除DPPH自由基的能力按下式计算:DPPH％抑制率＝[(A1-A2)/A1]×100，其中A1＝对照反应的吸光度；A2＝样品存在时的吸光度。
4、高效液相色谱-质谱联用鉴定原花青素
使用安捷伦Zorbax SB-C18柱，紫外分光光度检测器。联用Agilent 6540UHD Q-TOF进行ESI负离子分析。流速0.5mL/min，检测波长280nm，流动相为0.4％(v/v)甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱。
实施例1一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法
一、实验方法
取5g干燥后的荔枝生理落果去核粉碎，按1︰5的料液比与70％乙醇混合，40℃提取3h，3500r/min离心15min收集上清液，滤渣与70％乙醇混合，重复提取多2次，合并提取液。提取液置于旋蒸瓶中，于40℃回收乙醇。剩余的提取液用蒸馏水稀释至100mL得到多酚粗提液，加入硫酸铵固体量为多酚粗提液中的50％(w/v)，按多酚粗提液︰叔丁醇＝1︰1.5(v/v)的比例加入叔丁醇，磁力搅拌0.5h后，3500r/min离心15min使其分层。取上层有机相于旋转蒸发仪中40℃蒸干，加入无水乙醇充分搅拌，溶液于10000r/min 4℃下离心30min，收集上清液，干燥后测定产品的多酚含量、原花青素含量及平均聚合度、DPPH自由基清除能力。
二、实验结果
产品经福林酚法测定多酚纯度为48.09％，多酚的回收率为85.74％，原花青素平均聚合度为2.58；经高效液相色谱-质谱测定，表儿茶素含量在3％以上，A型原花青素含量在10％以上，B型原花青素含量在2.5％以上，并鉴定出聚合度在5以下的原花青素有14种，A型原花青素5种，B型原花青素3种；经抗氧化能力测定，产品在0.1mg/mL水平下的DPPH自由基清除能力为91.09％。除去乙醇提取所需的时间，三相分离纯化仅包括搅拌分层、旋蒸和离心三步，耗时仅需2h。
实施例2一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法
一、实验方法
取5g干燥后的荔枝生理落果去核粉碎，按1︰5的料液比与70％乙醇混合，40℃提取3h，3500r/min离心15min收集上清液，滤渣与70％乙醇混合，重复提取多2次，合并提取液。提取液置于旋蒸瓶中，于40℃回收乙醇。剩余的提取液用蒸馏水稀释至100mL得到多酚粗提液，加入硫酸铵固体量为多酚粗提液中的20％(w/v)，按多酚粗提液︰叔丁醇＝1︰1(v/v)的比例加入叔丁醇，磁力搅拌1h后，3500r/min离心15min使其分层。取上层有机相于旋转蒸发仪中40℃蒸干，加入无水乙醇充分搅拌，溶液于3500r/min 4℃下离心15min，收集上清液，干燥后测定产品的多酚含量、原花青素含量及平均聚合度、DPPH自由基清除能力。
二、实验结果
产品经福林酚法测定多酚纯度为43.40％，多酚的回收率为83.94％，原花青素平均聚合度为2.83；经高效液相色谱-质谱测定，表儿茶素含量在3％以上，A型原花青素含量在10％以上，B型原花青素含量在2.5％以上，并鉴定出聚合度在5以下的原花青素有13种，A型原花青素4种，B型原花青素3种；经抗氧化能力测定，产品在0.1mg/mL水平下的DPPH自由基清除能力为82.81％。除去乙醇提取所需的时间，三相分离纯化仅包括搅拌分层、旋蒸和离心三步，耗时仅需2h。
实施例3一种从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法
一、实验方法
取5g干燥后的荔枝生理落果去核粉碎，按1︰5的料液比与70％乙醇混合，40℃提取3h，3500r/min离心15min收集上清液，滤渣与70％乙醇混合，重复提取多2次，合并提取液。提取液置于旋蒸瓶中，于40℃回收乙醇。剩余的提取液用蒸馏水稀释至100mL得到多酚粗提液，加入硫酸铵固体使多酚粗提液中硫酸铵浓度为50％(w/v)，按多酚粗提液︰叔丁醇＝1︰1.5(v/v)的比例加入叔丁醇，磁力搅拌0.5h后，3500r/min离心15min使其分层。取上层有机相于旋转蒸发仪中40℃蒸干，加入无水乙醇充分搅拌，溶液于3500r/min 4℃下离心30min，收集上清液，干燥后测定产品的多酚含量、原花青素含量及平均聚合度、DPPH自由基清除能力。
二、实验结果
产品经福林酚法测定多酚纯度为45.18％，多酚的回收率为87.32％，原花青素平均聚合度为2.60；经高效液相色谱-质谱测定，表儿茶素含量在3％以上，A型原花青素含量在10％以上，B型原花青素含量在2.5％以上，并鉴定出聚合度在5以下的原花青素有14种，A型原花青素5种，B型原花青素3种；经抗氧化能力测定，产品在0.1mg/mL水平下的DPPH自由基清除能力为82.95％。除去乙醇提取所需的时间，三相分离纯化仅包括搅拌分层、旋蒸和离心三步，耗时仅需2h。
对照例1利用AB-8大孔树脂从荔枝生理落果中高效制备活性低聚原花青素的方法
一、实验方法
用AB-8大孔树脂纯化70％乙醇提取液作为与三相分离比较的参考方法。取5g干燥后的荔枝生理落果去核粉碎，按1︰5的料液比与70％乙醇混合，40℃提取3h，3500r/min离心15min收集上清液，滤渣与70％乙醇混合，重复提取多2次，合并提取液并用蒸馏水稀释至100mL。树脂使用前用95％乙醇、5％NaOH溶液和5％HCl溶液分别浸泡24h、12h和12h将其活化，湿法装入玻璃层析柱(2.5cm×60cm)中，静置过夜使树脂柱平衡，上样洗脱，洗脱曲线如图1，收集洗脱液干燥后测定多酚回收率、原花青素平均聚合度、纯度及DPPH自由基清除能力。
二、实验结果
结果表明，经AB-8大孔树脂纯化后，多酚的纯度为55.21％，多酚的回收率为24.62％，原花青素平均聚合度为3.98，DPPH自由基清除能力约为90％。由于树脂对多酚物质吸附量有限，若提取液用量过多或浓度过高均会导致样品中多酚物质大量损失，极大地限制了一次纯化过程能够处理的样品量。
除去乙醇提取所需的时间，大孔树脂纯化一个流程需经活化、装柱平衡、上样洗脱和清洗树脂等步骤，树脂活化与装柱平衡(预处理)需3天时间，上样洗脱纯化耗时约3h，同时由于提取液中含有大量色素，使用后的树脂颜色明显变深，需重新用酸溶液、碱溶液及不同浓度的乙醇清洗，耗时约3h。整个纯化流程约耗时3～4天时间，远高于三相分离纯化所需时间。
可见大孔树脂相较于三相分离纯化效率较低、操作步骤繁琐且耗时较长。
对照例2荔枝生理落果乙醇粗提物多酚纯度及其抗氧化活性
一、实验方法
取5g干燥后的荔枝生理落果去核粉碎，按1︰5的料液比与70％乙醇混合，40℃提取3h，3500r/min离心15min收集上清液，滤渣与70％乙醇混合，重复提取多2次，合并提取液后旋蒸冻干，得到荔枝生理落果乙醇粗提物，测定产品的多酚含量、DPPH自由基清除能力。
二、实验结果
结果表明，荔枝生理落果乙醇粗提物多酚纯度为25.47％，在0.1mg/mL水平下DPPH自由基清除能力为77.92％。以抗坏血酸为阳性对照，实施例与对照例成品的DPPH自由基清除能力对比如图2。
通过对比可发现，经大孔树脂纯化和三相分离纯化后样品的DPPH自由基清除能力均有明显的上升，并且三相分离制备所得成品可接近并达到大孔树脂纯化后的程度，说明通过三相分离快速制备同样能够有效地富集生物活性物质。
对照例3荔枝生理落果及荔枝熟果皮乙醇粗提物原花青素聚合度
一、实验方法
分别取5g干燥后的荔枝生理落果去核及荔枝熟果皮粉碎，分别按1︰5的料液比与70％乙醇混合，40℃提取3h，3500r/min离心15min收集上清液，滤渣与70％乙醇混合，重复提取多2次，合并提取液后旋蒸冻干，得到荔枝生理落果及荔枝熟果皮乙醇粗提物，测定样品中原花青素平均聚合度。
二、实验结果
结果表明，荔枝生理落果乙醇粗提物原花青素平均聚合度为4.05，荔枝熟果皮乙醇粗提物原花青素平均聚合度为6.96。实施例与对照例成品的原花青素平均聚合度对比如图3。
经对比发现，荔枝生理落果中所含原花青素的平均聚合度显著低于荔枝熟果皮中的原花青素，说明荔枝生理落果中富含低聚原花青素，是低聚原花青素的良好来源；经三相分离纯化后，成品原花青素平均聚合度相较于乙醇粗提物和对照例1中AB-8纯化后成品更低，说明三相分离能够有效地保留和富集粗提物中的活性低聚原花青素。

Claims (9)

1.一种从荔枝生理落果中制备活性低聚原花青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.用乙醇溶液提取荔枝原料，收集上清液；
S2.去除S1中的上清液中的乙醇，用蒸馏水稀释，得多酚粗提液；
S3.将多酚粗提液、硫酸铵和有机溶剂混合，充分混匀后离心，形成三相体系；
S4.收集三相体系中的有机相，完全去除溶剂，加入无水乙醇充分溶解混匀，离心去除沉淀取上清，完全去除上清液中的乙醇，得到低聚原花青素固体；
步骤S3中，所述有机溶剂为叔丁醇、正丁醇、正丙醇中的任一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，利用旋转蒸发去除乙醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤S2中的水相和步骤S3中的离心的沉淀混合后进行蒸发结晶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，利用旋转蒸发去除有机溶剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，利用旋转蒸发去除乙醇。
6.根据权利要求1到5任一所述的方法，其特征在于，步骤S1中，取干燥后的荔枝生理落果去核打粉作为荔枝原料，以70％乙醇进行提取。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中，提取时，料液比为1︰5～10，提取温度40～60℃，提取时间1～3h，提取次数为1～3次。
8.根据权利要求1到5任一所述的方法，其特征在于，步骤S3中，硫酸铵加入量为多酚粗提液体积的10％～60％w/v，有机溶剂加入量为多酚粗提液体积的0.5～1.5倍。
9.根据权利要求1到5任一所述的方法，其特征在于，步骤S3中，磁力搅拌充分混匀，磁力搅拌0.5～1h。
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