CN112144176A - 一种通过酶促降解pcl/plla聚合物生产多孔三维材料的方法 - Google Patents

一种通过酶促降解pcl/plla聚合物生产多孔三维材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程载体材料技术领域，特别是公开了一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法：将PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N‑二甲基酰胺的混合溶剂中，得到PCL/PLLA溶液；将该溶液进行静电纺丝，得到PCL/PLLA纤维膜；将该纤维膜置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，得到力学性能无明显下降的多孔三维PCL/PLLA纤维膜，该多孔三维PCL/PLLA纤维膜有望作为制备多孔组织工程支架或水/空气处理的优质原材料。本发明通过调节酯酶的浓度及降解时间，可以达到控制PCL/PLLA纤维膜表面微孔的大小及数量的目的，为制备孔隙率较高的多孔材料提供了一种新的思路。

Description

一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法
技术领域
本发明涉及生物工程载体材料技术领域，特别涉及一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法。
背景技术
据《中国心血管病报告》披露，中国目前心血管病患人数约为2.9亿。心血管病治疗中，基于生物学和工程技术的方法来制造心脏支架及血管支架等来替代受损部位，已经成为生物工程的重要研究领域。理想的支架通常应该具有如下特征：(1)三维的高孔隙率结构，可以便于营养物质和代谢物质的传输及细胞附生；(2)生物相容、可降解，降解速率可调控且能够匹配细胞和组织在体内的再生速度；(3)一定的力学性能和其他化学性能等。左旋聚乳酸(PLLA)、聚己内酯(PCL)均具有良好的降解性能和生物相容性，但是物理性能分别存在脆性高和强度低的缺陷，因此通常采用共混的方式进行改性，使二者性能互补，继而获得具有许多独特性能的静电纺丝纤维，以拓宽潜在的应用价值。静电纺丝技术可以将PCL与PLLA的共混物制备成尺寸介于数十纳米至数微米的具有超高特异性及比表面积的超细纤维，使其表现出更好的生物相容性、可降解性、机械耐受性以及诱导再生性。但是，其孔隙结构少，不具备制备理想支架的潜质。
发明内容
为解决以上现有技术的不足，本发明提出了一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，最终得到的三维PCL/PLLA纤维膜孔隙率高且力学性能好，有望成为制备多孔组织工程支架的良好原材料或应用于环境保护中的水/空气处理领域。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，包括如下操作步骤：
步骤1，将PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的混合溶剂中，得到PCL/PLLA溶液；
步骤2，将PCL/PLLA溶液放入高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，得到微米级或纳米级的PCL/PLLA纤维膜；
步骤3，将PCL/PLLA纤维膜置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，得到多孔、三维PCL/PLLA纤维膜。
酯酶对PCL/PLLA纤维膜具有较高的降解效率。在实践中，我们意外的发现，酯酶降解的早期，PCL/PLLA纤维膜的韧性及强度并未明显减弱，即力学性能没有发生明显下降。随着降解时间的延长，PCL/PLLA纤维膜表面的片段被去除，纤维膜表面微孔数量增加，当所有的分子链都受到酯酶分子攻击时，就会发生彻底的降解。通过多次创造性试验及多种测试表征证实，酯酶促进PCL/PLLA聚合物降解的机理是：吸附于PCL/PLLA纤维膜表面的酯酶分子攻击其附近的聚合物链，PCL的晶区和PLLA的非晶分子链在局部相对快速降解，继而在PCL/PLLA纤维膜上留下空腔。结晶区的高模量有助于半晶聚合物保持较高强度，非晶区的高分子迁移率有助于半晶聚合物保持较高韧性。酯酶降解的早期，PCL的非晶区和PLLA的晶区所受影响比较小，由于PCL的非晶区是PCL/PLLA纤维膜韧性的主要贡献者，PLLA的晶区是PCL/PLLA纤维膜强度的主要贡献者，因此酯酶降解PCL/PLLA纤维膜的初期，可以得到力学性能佳的多孔三维PCL/PLLA纤维膜。本发明的这一发现为制备孔隙率较高的多孔材料提供了一种新的思路。
优选的，步骤3中，酯酶的浓度为0.01-0.5mg/ml，降解温度为35-38℃。在实践中，我们惊喜的发现：在相同的降解时间内，PCL/PLLA纤维膜表面微孔的大小随着酯酶浓度的提高而增大；在相同的酯酶浓度下，PCL/PLLA纤维膜表面微孔的数量随着降解时间的延长而增多。为了保证酯酶具有良好的活性，优选的降解温度为35-38℃。
进一步优选的，步骤3中，酯酶的浓度为0.1mg/ml，为了达到最佳的降解效果，降解温度最优选的为37℃，PBS缓冲液的pH为7.4。
优选的，步骤1中，PCL与PLLA的质量比为(1-10)：1；混合溶剂中，二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为(1-5)：1，PCL/PLLA溶液的质量百分数为5％-15％；步骤2中，静电纺丝的技术参数为：纺丝电压10-25kv，针距20-30cm，转筒的转速1000-3000r/min，推进泵移动速度0.1-100μm/s。
进一步优选的，步骤1中，PCL与PLLA的质量比为7：3；混合溶剂中，二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为3：1，PCL/PLLA溶液的质量百分数为10％；为了获得形态较好的纤维，步骤2中，最为优选的纺丝电压为20kv，针距为20cm。
更为优选的，步骤3中，先将PCL/PLLA纤维膜用酒精冲洗干净并烘干，再进行降解，避免其表面附着的杂质影响降解速率及降解效果。
与现有技术相比，本发明以简单、易操作的方法获得了表面多孔的三维PCL/PLLA纤维膜，该操作方法对设备的要求低，且通过酯酶浓度及降解时间的控制，可以达到有效调节PCL/PLLA纤维膜表面微孔大小及数量的目的，为制备孔隙率较高的多孔材料提供了一种新的思路。
附图说明
图1为酶促降解前后PCL/PLLA纤维膜的SEM图，其中：(a)为降解之前，(b)为酶促降解8天，(c)为酶促降解16天；
图2为无酶参与的水降解前后PCL/PLLA纤维膜的SEM图，其中：(a)为降解之前，(b)为水降解8天，(c)为水降解16天；
图3为降解后PCL/PLLA纤维膜的失重率曲线图，其中：WD为水降解后PCL/PLLA纤维膜的失重率曲线，ED为酯酶降解后PCL/PLLA纤维膜的失重率曲线；
图4为酯酶降解不同时间的PCL/PLLA纤维膜的WAXD图及降解过程中总结晶度和PCL结晶度的变化；
图5为酯酶降解不同时间的PCL/PLLA纤维膜的工程应力与应变的曲线；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，所用的原材料均商购获得：PCL具体型号为Perstorp Capa6500；PLLA具体型号为NatureWorks 4032D，酯酶BS3购买自J&K Scientific(提取自嗜热芽孢杆菌)，配制PBS缓冲液的磷酸氢二钠购买自Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd。为了便于观察，以下实施例中均先将步骤2得到的PCL/PLLA纤维膜切成边长1cm的正方形，再进行步骤3的操作。
实施例1
一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，包括如下操作步骤：
步骤1，将质量比7：3的PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的混合溶剂(二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为3：1)中，得到质量百分数10％的PCL/PLLA溶液；
步骤2，将PCL/PLLA溶液放入高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝的技术参数为：纺丝电压20kv，针距20cm，转筒的转速为3000r/min，推进泵移动速度50μm/s，得到PCL/PLLA纤维膜；
步骤3，将PCL/PLLA纤维膜用酒精冲洗后置于预设温度40℃的真空烘箱中彻底干燥，然后再置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，降解时间为8天，酯酶的浓度为0.1mg/ml，降解温度为37℃，PBS缓冲液的pH为7.4，最终得到多孔、三维PCL/PLLA纤维膜。
实施例2
一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，包括如下操作步骤：
步骤1，将质量比10：1的PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的混合溶剂(二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为4：1)中，得到质量百分数5％的PCL/PLLA溶液；
步骤2，将PCL/PLLA溶液放入高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝的技术参数为：纺丝电压10kv，针距30cm,转筒的转速为2000r/min，推进泵移动速度为0.1μm/s，得到PCL/PLLA纤维膜；
步骤3，将PCL/PLLA纤维膜用酒精冲洗后置于预设温度40℃的真空烘箱中彻底干燥，然后再置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，酯酶的浓度为0.5mg/ml，降解温度为35℃，PBS缓冲液的pH为7.4，最终得到多孔、三维PCL/PLLA纤维膜。
实施例3
一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，包括如下操作步骤：
步骤1，将质量比1：1的PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的混合溶剂(二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为5：1)中，得到质量百分数15％的PCL/PLLA溶液；
步骤2，将PCL/PLLA溶液放入高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝的技术参数为：纺丝电压15kv，针距25cm，转筒的转速为1000r/min,推进泵移动速度为100μm/s，得到PCL/PLLA纤维膜；
步骤3，将PCL/PLLA纤维膜用酒精冲洗后置于预设温度40℃的真空烘箱中彻底干燥，然后再置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，酯酶的浓度为0.01mg/ml，降解温度为37.2℃，PBS缓冲液的pH为7.4，最终得到多孔、三维PCL/PLLA纤维膜。
实施例4
一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，包括如下操作步骤：
步骤1，将质量比10：1的PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的混合溶剂(二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为1：1)中，得到质量百分数12％的PCL/PLLA溶液；
步骤2，将PCL/PLLA溶液放入高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝的技术参数为：纺丝电压25kv，针距28cm，转筒的转速为3000r/min,推进泵移动速度为60μm/s，得到PCL/PLLA纤维膜；
步骤3，将PCL/PLLA纤维膜用酒精冲洗后置于预设温度40℃的真空烘箱中彻底干燥，然后再置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，酯酶的浓度为0.3mg/ml，降解温度为38℃，PBS缓冲液的pH为7.4，最终得到多孔、三维PCL/PLLA纤维膜。
实施例5
将实施例1中的降解时间缩短至4天。
实施例6
将实施例1中的降解时间延长至12天。
实施例7
将实施例1中的降解时间延长至16天。
实施例8
PBS缓冲溶液中不添加酯酶，其余技术参数均与实施例1相同。
实施例9
将降解时间缩短至4天，其余技术参数与实施例8相同。
实施例10
将降解时间延长至12天，其余技术参数与实施例8相同。
实施例11
将降解时间延长至16天，其余技术参数与实施例8相同。
如说明书附图1所示：图1(a)为降解之前的PCL/PLLA纤维膜的SEM图，表面光滑；图1(b)为酶促降解8天得到的多孔PCL/PLLA纤维膜的SEM图(实施例1)，表面出现大量介孔；图1(c)为酶促降解16天得到的多孔PCL/PLLA纤维膜的SEM图(实施例7)，表面介孔的数量较降解8天的更多，且在纤维表面呈扩散趋势，部分多孔甚至互相渗透。由图1可知：在同一酯酶浓度下，随着降解时间的延长，纤维表面介孔的数量逐渐增大，而纤维的形态并未发生变化。实施例1所得的材料，无论是多孔结构的数量分布，还是多孔结构的孔径分布，都比较均匀，实施例2-4所得的多孔、三维PCL/PLLA纤维膜与实施例1类似，只是多孔结构的分布及孔径大小的均匀度不如实施例1。
为了进一步探究酯酶对PCL/PLLA纤维膜降解的促进作用，本发明采集实施例5、1、6、7样品降解前后的质量(取样后用纯水冲洗并置于40℃的真空烘箱中进行干燥)及实施例9、8、10、11样品降解前后的质量，具体如上表1所示：很明显，酶解样品的失重比水解样品快得多。例如，16天水解样品的失重量为0.18mg，而酶解样品的失重量为2.00mg。为了比较酶解与水解样品的质量变化趋势，根据下列公式
Figure BDA0002661488460000061
计算失重率(weight loss，简称WLR)。其中，W1和W2分别表示降解前后的样品质量。酶解(ED)与水解(WD)的失重率随降解时间的变化如说明书附图3所示。从图3可以更直观地看出，酯酶溶液中PCL/PLLA纤维膜的降解比水解降解更有效。在前16天，在酯酶的作用下，WLR增加到20％左右，水解的WLR在16天内不超过2％，而酯酶降解仅4天失重率即达到5％。由此可见，酯酶的存在显著加速了PCL/PLLA纤维膜的降解。
表1不同降解天数的样品的质量的变化(单位：mg)
Figure BDA0002661488460000071
如说明书附图2所示：图2(a)为降解之前的PCL/PLLA纤维膜的SEM图，表面光滑、厚度均匀；图2(b)为水降解8天得到的PCL/PLLA纤维膜的SEM图(实施例8)，图2(c)为水降解16天得到的PCL/PLLA纤维膜的SEM图(实施例11)。将实施例1的SEM图(图1(b))与实施例8的SEM图(图2(b))进行对比，将实施例7的SEM(图1(c))与实施例11的SEM(图2(c))进行对比，可知：相同的降解条件下，随着时间的延长，水解纤维膜中超细纤维与原基体纤维分离，纤维表面变得坚固，而且纤维之间出现粘结。但是，纤维表面没有出现任何的多孔结构；而酯酶酶解的纤维膜中，纤维表面介孔的数量逐渐增多，并在纤维表面呈现扩散状态，而纤维的形态并未发生变化。很明显，PCL/PLLA纤维膜确实是在酯酶的作用下降解继而呈现出多孔结构。而且，结合失重率与SEM图，我们推测酯酶促PCL/PLLA的降解机理与水降解PCL/PLLA应该显著不同。
为了找出PCL/PLLA纤维膜结构变化的原因，我们采用WAXD对酯酶降解不同时间的PCL/PLLA纤维膜进行测试。具体结果如说明书附图4所示：图4(a)显示了不同酶解天数下PCL/PLLA纤维膜的WAXD曲线，其中2θ位于21.2°和23.6°的两个尖锐峰分别是来自于PCL(110)和(200)晶面的衍射，而其余两个位于21.7°和22.2°的衍射峰则分别代表了PLLA(200)和(203)晶面。我们惊奇的发现，随着降解时间的增加，PCL晶体的衍射强度逐渐减小，而PLLA晶体的衍射强度在降解后先显著增加后减小。特别是对于PLLA(203)的晶面，在未降解时的WAXD曲线上没有，只有酶解4天后才出来。为了进一步定性的对比二者之间的降解速度，我们通过积分拟合了各峰位面积，根据公式(1)、(2)计算了纤维内部所有晶体的相对含量以及PCL的晶体含量。
Figure BDA0002661488460000081
Figure BDA0002661488460000082
其中，A(PCL)、A(PLLA)和A(amor)分别是代表PCL、PLLA和非晶区的衍射峰区域。虽然每个组分的单位体积的衍射强度可能不同，但结晶度随降解时间的演变趋势可以定性地判断，如图4(b)所示：PCL和PLLA的总结晶度呈先上升后下降的趋势，而实际变化范围从45％到48％而已。由于酶降解过程中不能忽略溶胀引起的自由体积的变化，因此总结晶度的变化实际上是非常微弱的。结合说明书附图3的失重率曲线，酯酶降解16天后质量损失高达20％，由此推断通过酯酶降解的纤维内部晶区和无定型区降解速度应该基本一致。然而，PCL的结晶度呈现线性下降的趋势，在16天内从40％下降到33％，可见PCL在酯酶条件下有着更快的降解速度。
为了进一步确认上述推断，我们根据公式(3)计算了在降解过程中PCL与PLLA相对含量的变化趋势，其中A(PCL)和A(PLLA)分别是PCL和PLLA衍射峰的面积。
Figure BDA0002661488460000083
为了比较，将PLLA的结晶度绘制为双Y轴。首先，PLLA结晶度的非线性增长引起了更多关注。可以看出，在最初的4天内，结晶度从5％迅速增加到10％，这归因于总体结晶度的轻微增加。在接下来的几天中，PLLA晶体的生长非常微弱，仅约1％。由于PLLA晶体的非线性生长，PCL和PLLA的相对含量呈非线性下降趋势。回顾WAXD给出的PCL结晶度下降的趋势，可以证实：在酯酶的作用下，PCL晶体区域的降解更为明显；PLLA结晶度的增加可能是由于浸泡过程中的溶胀作用所致，其中PLLA分子链的构象调整可以稍微增加结晶度；而且，PLLA链在非晶区的降解也会增加结晶度；相比之下，溶胀对结晶度的影响则微不足道。由于使用酯酶使总质量显著下降，因此PCL晶体区域和PLLA非晶区域的降解速度都比其他区域快。
酯酶促进PCL/PLLA纤维膜的降解，使其表面呈现出明显的多孔结构，我们进一步探究了该多孔结构的力学性能的变化趋势。如说明书附图5所示：酯酶降解8天后，纤维表面的多孔形貌是明显的(如说明书附图1(b)所示)，但是膜强度仅从3.2MPa下降到2.4MPa，杨氏模量和断裂伸长率都没有很大变化；随着降解时间的延长，纤维的韧性进一步减弱，当降解16天时，断裂伸长率下降50％以上。
综合上述测试表征，我们得出酯酶促使PCL/PLLA纤维膜降解的机理为：吸附于PCL/PLLA纤维膜表面的酯酶分子攻击其附近的聚合物链，PCL的晶区和PLLA的非晶分子链在局部相对快速降解，继而在PCL/PLLA纤维膜上留下空腔。结晶区的高模量有助于半晶聚合物保持较高强度，非晶区的高分子迁移率有助于半晶聚合物保持较高韧性。酯酶降解的早期，PCL的非晶区和PLLA的晶区所受影响比较小，由于PCL的非晶区是PCL/PLLA纤维膜韧性的主要贡献者，PLLA的晶区是PCL/PLLA纤维膜强度的主要贡献者，因此酯酶降解PCL/PLLA纤维膜的初期，通过酯酶浓度及降解时间的控制，可以达到有效调节PCL/PLLA纤维膜表面微孔大小及数量的目的，最终有望得到力学性能佳的多孔三维PCL/PLLA纤维膜。本发明的这一发现为制备孔隙率较高的多孔材料提供了一种新的思路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明未具体叙述的部件或连接方式均采用现有技术。本发明所叙述的前侧面、后侧面、左侧面、右侧面均为了方便描述其结构，并不用于限制本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，其特征在于：包括如下操作步骤：
步骤1，将PCL与PLLA溶解于二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的混合溶剂中，得到PCL/PLLA溶液；
步骤2，将所述PCL/PLLA溶液放入高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，得到PCL/PLLA纤维膜；
步骤3，将所述PCL/PLLA纤维膜置于添加有酯酶的PBS缓冲液中进行降解，得到多孔、三维PCL/PLLA纤维膜。
2.根据权利要求1所述的通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，其特征在于：步骤3中，酯酶的浓度为0.01-0.5mg/ml，降解温度为35-38℃。
3.根据权利要求2所述的通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，其特征在于：步骤3中，酯酶的浓度为0.1mg/ml，降解温度为37℃，PBS缓冲液的pH为7.4。
4.根据权利要求1所述的通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，其特征在于：步骤1中，PCL与PLLA的质量比为(1-10)：1；所述混合溶剂中，二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为(1-5)：1，所述PCL/PLLA溶液的质量百分数为5％-15％；步骤2中，所述静电纺丝的技术参数为：纺丝电压10-25kv，针距20-30cm，转筒的转速1000-3000r/min，推进泵移动速度0.1-100μm/s。
5.根据权利要求4所述的通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，其特征在于：步骤1中，PCL与PLLA的质量比为7：3；所述混合溶剂中，二氯甲烷和N,N-二甲基酰胺的体积比为3：1，所述PCL/PLLA溶液的质量百分数为10％；步骤2中，所述静电纺丝的技术参数为：纺丝电压20kv，针距20cm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的通过酶促降解PCL/PLLA聚合物生产多孔三维材料的方法，其特征在于：步骤3中，先将所述PCL/PLLA纤维膜用酒精冲洗并烘干，再进行降解。
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