CN112126703B - 调控水稻叶片大小的多效QTLs位点qTLS-4的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs，所述QTLs位点定位于水稻4号染色体DNA片段上，命名为qTLS‑4，遗传距离为87.1‑97.4cM，物理距离为28747360‑29507404bp，对水稻剑叶叶片大小具有调控作用。本发明还公开了调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs位点的qTLS‑4分子标记，包括紧密连锁的两对分子标记Indel Fls‑1和Indel Fls‑2。本发明利用分子标记方法来检测水稻品种或品系中是否具有调控水稻剑叶叶片大小的QTLs，从而加快水稻优异品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明属于水稻育种及分子生物学技术领域，具体涉及一个调控水稻叶片大小的多效QTLs位点qTLS-4的分子标记及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa.L)是我国种植面积最大、总产最多、消费量最高的粮食作物，我国的水稻育种主要经历了矮化育种、三系杂交稻培育、二系杂交稻培育、亚种间杂种优势利用、理想株型育种和绿色超级稻培育等6个重要历程[1,2]。在育种过程中，良好的个体株型是水稻高产的必备条件，叶形是株形的重要组成部分，多位育种家提出了水稻高产理想株型模式，无一例外都提及叶片形态的选育。叶片是进行光合作用的主要器官，自水稻抽穗开花期到灌浆结实期，水稻的功能叶(剑叶、倒2叶、倒3叶)是穗部养分的主要供应者，水稻叶片的大小直接影响到水稻的光合作用、蒸腾作用等各项生理活动和最终产量，其中剑叶对水稻产量的贡献率最高[3,4]。叶片大小包括了叶长、叶宽、叶厚、叶周长和叶面积等性状[5]，但基因具有多效型，大部分调控叶长、叶宽的基因也影响到叶面积的大小。
水稻叶形控制基因的相关研究对于剖析水稻叶形性状的分子遗传机理具有重要的研究价值，并且通过对叶形控制基因的定位和克隆，应用分子标记辅助选择等技术手段，能够有效聚合有利基因，培育出包含叶形在内的众多优良农艺性状的水稻新品种。FANG等[6]从EMS处理的粳稻品种中花11群体中分离得到了一个水稻茎部发育提前终止的突变体mini1，与野生型相比，mini1的茎尖分生组织(SAM)***停止，导致地上部生长停止，作为控制叶长和叶宽的微效基因，参与叶片大小形态建成过程。CHEN等[7]利用粳稻品种D50(窄叶)和籼稻品种HB277(宽叶)构建重组自交系，共鉴定到5个控制剑叶宽的QTLs。并将多效QTLssqFLW4精细定位在RM17483-RM17486之间74.8kb的区间内，该区间包含窄叶基因NAL1。nal1突变体相比野生型而言，叶片纵脉数目减少，叶片变窄，叶片长度则没有差别，而倒3，4，5节间变短，倒1，2节间长度没有差异，整体植株矮小。LI等[8]从T-DNA***的转基因水稻中分离出一株窄叶突变体nal9突变体，定位于BAC片段OJ1212_C05上的分子标记V239B和V239G之间69.3kb的范围内，突变体nal9在整个生长时期都表现出窄叶、苗期叶片浅绿色、株高矮化、穗变小以及分蘖增加等表型。单子叶植物中存在一种补偿机制，即通过细胞膨胀来补偿细胞***减少带来的影响，如KRP1转基因植株表现出叶面积稍微变小，叶片稍微变短，叶表面细胞数减少等性状，但被细胞增大得以部分补偿[9]。
目前叶形各性状，各种多效基因之间组合而成的复杂调控网络的剖析以及相关分子遗传机理研究相对较少。因此，叶形相关性状的QTLs定位和基因克隆研究仍需更进一步的深入挖掘与分析，借助于日益发展的分子生物学与基因组学的研究手段与方法，有望实现新的突破。
上文中涉及的参考文献如下：
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供调控水稻叶片大小的多效QTLs qTLS-4的分子标记及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs，所述QTLs位点定位于水稻4号染色体DNA片段上，命名为qTLS-4，遗传距离为87.1-97.4cM，物理距离为28747360-29507404bp，对水稻剑叶叶片大小具有调控作用(较显著的调控作用)。
本发明还同时提供了调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs位点的qTLS-4分子标记：
qTLS-4分子标记包括紧密连锁的两对分子标记Indel Fls-1和Indel Fls-2；
所述分子标记Indel Fls-1的引物对为：
上游引物5’-CCCCGTCCTATAATATAGCAACC-3’，
下游引物5’-CTCTATACTCACTCCGTCCCA-3’；
所述分子标记Indel Fls-2的引物对为：
上游引物5’-AGATCCCAGGTAATGATGCGA-3’，
下游引物5’-CGCGCAATCCAAATCCATCA-3’。
上述引物对，标记多态性好，选择方便，高效。
本发明还同时提供了调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs的用途：利用分子标记方法来检测水稻品种或品系中是否具有调控水稻剑叶叶片大小的QTLs，从而加快水稻优异品种的选育进程。
作为本发明的调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs的用途的改进：培育剑叶叶片增大的水稻，优化水稻株型；从而提高光合效率促进水稻增产增收。
作为本发明的调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs的用途的进一步改进：提取待测水稻基因组DNA，用分子标记Indel Fls-1的引物对或者用分子标记Indel Fls-2的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。
本发明以粳稻热研/籼稻华占杂交组合的RIL群体为材料，进行了水稻剑叶叶片大小的QTL定位。
本发明的调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs，叶长LOD值高达6.92、叶宽LOD值高达4.51、叶面积LOD值高达6.37。由于水稻叶片大小是水稻理想株型的重要指标之一，对改良水稻株型、促进水稻增产增收具有重要意义，因此，通过开发该多效QTLs紧密连锁的分子标记，来检测水稻品种或品系中是否具有水稻剑叶叶片大小相关QTL，可加快水稻优异品种的选育进程。
本发明的与水稻剑叶叶片大小相关的多效QTLs的定位方法，包括以下步骤：
1)以热研、华占为亲本进行杂交，通过单粒传法，获得134个稳定遗传的株系(F13)，共同组成RIL群体；
2)考察重组自交系群体叶片大小相关表型数据；
3)利用实验室前期开发的大量SNP和Indel标记构建的遗传图谱，包括通过R-QTL专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将QTL逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应；若检测到LOD>3的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1个QTL。
本发明利用分子标记Indel Fls-1和Indel Fls-2的引物对，对待鉴定水稻材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则标志着调控水稻叶片大小的多效QTLs qTLS-4存在。
其中，所述分子标记Indel Fls-1的引物对，对DNA进行扩增后，电泳能检测到与水稻品种热研相同位置的条带。
其中，所述分子标记Indel Fls-1的引物对，其为：
上游引物5’-CCCCGTCCTATAATATAGCAACC-3’
下游引物5’-CTCTATACTCACTCCGTCCCA-3’
其中，所述分子标记Indel Fls-2的引物对，对DNA进行扩增后，电泳能检测到与水稻品种热研相同位置的条带。
其中，所述分子标记Indel Fls-2的引物对，其为：
上游引物5’-AGATCCCAGGTAATGATGCGA-3’
下游引物5’-CGCGCAATCCAAATCCATCA-3’
其中，所述PCR的反应体系如下：
其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。
本发明提供的调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs qTLS-4位点的分子标记方法，能应用于选育剑叶片大小较大的水稻品种。
本发明的采用QTL位点的分子标记方法，筛选到与在水稻热研品种第4号染色体上定位到的调控水稻剑叶片大小多效QTLs qTLS-4紧密连锁的2对分子标记，预测水稻材料的剑叶叶片大小，加快水稻理想株型的选育。
综上所述，本发明以粳稻品种热研为母本、籼稻品种华占为父本的杂交F1代连续自交后得到的134个重组自交系群体为材料，对叶片的叶长、叶宽及叶，面积进行测量和分析，同时利用该群体已构建的加密遗传图谱对数据进行QTL作图分析，统计结果发现一个多效QTLs，在此处检测得到叶长LOD值高达6.92、叶宽LOD值高达4.51、叶面积LOD值高达6.37。本发明的技术优势在于：构建的遗传连锁图谱密度高，有4858个标记均匀分布于12条染色体上，QTL定位更精确；另外，标记多态性非常好，对水稻后代筛选更方便、高效；检测到的QTL效应值较大，是调控水稻叶片大小的多效QTLs，能有效提高育种效率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是调控水稻与剑叶叶片大小的多效QTLs定位方法中遗传材料构建流程图。
图2是分蘖期RIL群体叶长的频率分布(A)和QTL分析(B)。
图3是分蘖期RIL群体叶宽的频率分布(A)和QTL分析(B)。
图4是分蘖期RIL群体叶面积的频率分布(A)和QTL分析(B)。
图5是调控叶片大小多效QTLs qTLS-4在第4号染色体上的位置。
图6是分子标记Indel Fls-1的引物对在亲本及其F1代和RIL群体中扩增产生的电泳图。其中，1为热研、2为华占、3为热研/华占杂交后代F1、4-11为热研/华占杂交组合的RIL群体。
图7是分子标记Indel Fls-2的引物对在亲本及其F1代和RIL群体中扩增产生的电泳图。其中，1为热研、2为华占、3为热研/华占杂交后代F1、4-11为热研/华占杂交组合的RIL群体。
图8是分子标记Indel Fls-1的引物对在亲本热研、93-11及其F1代和以93-11为轮回亲本的BC3F1代中扩增产生的电泳图。其中，1为热研、2为93-11、3为热研/93-11杂交后代F1、4-10为以93-11为轮回亲本的BC3F1代中扩增产生的电泳图。
图9是分子标记Indel Fls-2的引物对在亲本热研、93-11及其F1代和以93-11为轮回亲本的BC3F1代中扩增产生的电泳图。其中，1为热研、2为93-11、3为热研/93-11杂交后代F1、4-10为以93-11为轮回亲本的BC3F1代中扩增产生的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、实验材料的获取
以华占为供体亲本，本地水稻品种热研为受体亲本，进行杂交构建RILs，利用单粒传法(即，对F1进行套袋单株受种处理，直至后代株系表型不发生分离)，最终得了134个稳定遗传的株系，如图1。
选取亲本与各株系种子(F13)各60粒，表面消毒后浸种2天，再用湿润的毛巾包裹，置于37℃恒温箱中催芽48h后，挑选露白一致的种子播种。30天后，选择生长状况相似的亲本及各株系秧苗各24株移栽，所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。
实施例2、叶片大小数据测定
分蘖期每株系(移栽的各亲本、株系秧苗)随机选择5个分蘖，分别测量剑叶的叶长、叶宽及叶面积。记录各组数据，计算平均值。
图2A、图3A、图4A中，RY代表水稻品种热研，HZ代表水稻品种华占；根据图2A、图3A、图4A可得知剑叶片叶长、叶宽及叶面积等数据表现为连续正态分布且范围广泛，有较多超亲个体存在，表现出数量性状的遗传特点。
实施例3、QTL定位分析
利用实验室前期开发的大量的SNP和Indel标记构建的遗传图谱，对水稻叶片大小进行数量性状座位(QTL)区间作图，通过R-QTL专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将QTL逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到LOD>3的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1个QTL。在整个染色体组中找到位于第4染色体上的Indel Fls-1标记和Indel Fls-2标记之间的一个多效QTLs，叶长LOD值高达6.92、叶宽LOD值高达4.51、叶面积LOD值高达6.37(图2B、图3B、图4B)。其遗传距离为87.1-97.4cM，物理距离为28747360-29507404bp，并命名为qTLS-4(图5)。
实施例4、分子标记辅助选择
在QTL位点qTLS-4上下游分别设定分子标记Indel Fls-1和分子标记Indel Fls-2。
分子标记Indel Tal-1的引物对为：
上游引物GCCAGCAGTTTGCATTGTTA，
下游引物TACCCCACATGGGTTGATCT；
分子标记Indel Tal-2的引物对为：
上游引物GTCAACGCGGATACAACAAC，
下游引物ATAGCACCAATTTGGGTGGA。
取亲本热研、华占及其F1代和RIL群体(包括F13在内的134个株系)的水稻叶片，提取基因组DNA，利用上述分子标记对其基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系：上游引物(浓度为10μM)1μL，下游引物(浓度为10μM)1μL，DNA模板(浓度为10μM)2μL，mix酶5μL，ddH2O 1μL。反应程序为DNA94℃预变性3min，94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物在4％琼脂糖凝胶电泳检测。通过带型分析来确定是否存在相应的标记，若条带趋向于亲本热研，则说明该株系水稻剑叶片大小较大，若趋向华占则说明较小(图6、图7)。随后对受试株系水稻剑叶片大小实际角度与预测结果进行比对，结果显示预测结果与实际检测结果相吻合。
具体如下：
当选用分子标记Indel Tal-1的引物对时，所得电泳图如图6所述，热研的条带为1，华占的条带为2，F1代的条带为3，RIL群体的条带为3-11(趋向于热研)；
当选用分子标记Indel Tal-2的引物对时，所得电泳图如图7所述，热研的条带为1，华占的条带为2，F1代的条带为3，RIL群体的条带为3-11(趋向于热研)；
而根据实际对水稻剑叶片大小的检测(于水稻成长至成熟时期进行检测)：热研的叶面积为31.14cm2，华占的叶面积为29.21cm2，RIL的叶面积如图4所示，呈正态分布；
因此，预测结果与实际检测结果相吻合。
实施例5、水稻叶片大小QTL在水稻育种中的应用
实施例4中设定的分子标记可应用于水稻分子辅助育种，将其他叶片大小较小的水稻品种，如93-11，与热研进行杂交，获得相应的F1，以93-11为轮回亲本进行回交，至BC3F1代。提取BC3F1代部分单株DNA，然后用Indel标记Fls-1和Fls-2的引物进行PCR扩增，通过带型分析来确定是否存在相应的标记(存在QTL位点)，存在标记的说明该株系的剑叶叶片大小较大(图8、图9)。利用该方法进行筛选，定向选择，可获得叶片大小较大且保留了93-11优良性状的水稻，大大提高了育种效率。
综上所述，本发明的调控水稻叶片大小的多效QTLs可以有效地增加水稻剑叶叶片大小，在育种过程中可以使水稻光合效率得到有效提升，同时可加快优化水稻品种的进程。同时在水稻分子辅助育种的过程中可以培育叶片大小较大的水稻，优化水稻株型。此种方法简便易行，安全有效，有益于提高水稻品种的经济价值，适于大规模推广应用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 调控水稻叶片大小的多效QTLs位点 qTLS-4的分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccgtccta taatatagca acc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctatactc actccgtccc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatcccagg taatgatgcg a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgcaatcc aaatccatca 20
Claims (3)
1.检测调控水稻剑叶叶片大小的多效QTLs位点的紧密连锁分子标记Indel Fls-1或Indel Fls-2的引物对在培育剑叶叶片增大的水稻中的用途，其特征在于：
所述分子标记Indel Fls-1的引物对序列为：
上游引物5’-CCCCGTCCTATAATATAGCAACC-3’，
下游引物5’- CTCTATACTCACTCCGTCCCA-3’；
所述分子标记Indel Fls-2的引物对序列为：
上游引物5’- AGATCCCAGGTAATGATGCGA-3’，
下游引物5’- CGCGCAATCCAAATCCATCA-3’；
上述QTLs位点定位于水稻4号染色体DNA片段上，命名为qTLS-4，遗传距离为87.1-97.4cM，物理距离为28747360-29507404 bp；
提取待测水稻基因组DNA，用分子标记Indel Fls-1的引物对或者用分子标记IndelFls-2的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物电泳检测，若条带位置与热研相同，则该水稻剑叶叶片大小较大；若条带位置与华占相同，则该水稻剑叶叶片大小较小；所述待测水稻为华占或其杂交后代。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，PCR的反应体系：上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板2μL、Mix酶5μL和ddH2O 1μL。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。
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