CN117512188A - 与调控水稻结实率主效qtl连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与调控水稻结实率主效QTL连锁的分子标记，涉及水稻结实率分子标记筛选及应用技术领域，分子标记包括Indel ssr‑1和Indel ss r‑2；检测分子标记Indel ssr‑1的物质如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；检测分子标记Indel ssr‑2的物质如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；本发明的分子标记应用于辅助育种技术中，可以有效的解决相关基因认识不全面的问题，通过构建遗传连锁图谱和数量性状位点分析，能够高效寻找与水稻结实率的主效QTL紧密连锁的分子标记，使用这些标记可以对水稻后代进行筛选，在节约成本的同时可有效提高育种效率。
Description
技术领域
本发明涉及水稻结实率分子标记筛选及应用技术领域，更具体地说是涉及与调控水稻结实率主效QTL连锁的分子标记及应用。
背景技术
自水稻驯化以来，产量相关性状一直是育种家最关注的目标，也是衡量水稻品种优良与否的最重要指标之一。水稻产量主要由三个重要的构成因子直接决定：单位面积穗数、每穗实粒数和粒重，其中每穗实粒数由每穗总粒数和结实率共同决定，是产量构成因素中变异幅度最大，同时也最容易受栽培措施和环境影响的性状。因此，水稻结实率主效位点的挖掘与相关技术的发展，对于水稻单产的稳定与提高具有积极作用，同时可作为缓解粮食安全问题的根本措施之一，助力解决全球性环境问题引发的潜在隐患。
水稻结实率的相关研究需要以产量性状形成的分子机制和调控机理作为基础，更立足于相关QTL的定位和克隆。借助现代生物信息技术，目前科研工作者在水稻结实率分子机理和调控规律方面的探索初见成效，相关研究主要集中于转录因子与蛋白激酶途径等方面。Meina等研究挖掘含MYB结构域的转录因子OsPHR1、OsPHR2，若将其过量表达则会使植株在高磷条件下表现出结实率下降的现象；Ruifang等发现细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子OsiICK6可以与细胞周期蛋白OsCYCD和CDKA互作，受低温、ABA和渗透胁迫诱导，过表达时植株的花粉活力、结实率均降低。目前，科研人员克隆的水稻结实率相关基因大多是通过影响水稻花发育而间接影响结实率，这类基因在水稻生产上利用价值较小且应用途径受限。为寻找保持高结实率的主效基因，研究将在此基础上通过图位克隆等手段对一些重要QTL进行了互补验证和功能分析，优化水稻亲本材料的选育和配组，进一步推动水稻育种实践。
现今科研领域对水稻结实率的主效QTL定位与遗传机理的研究相对较少，相关QTL定位和基因克隆研究仍需更进一步的深入挖掘与分析。
因此，如何提供一种与水稻结实率相关的主效QTL并将其应用于水稻育种中是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了调控水稻结实率的主效QTL位点，与其连锁的分子标记及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
调控水稻结实率的主效QTL位点，位于水稻2号染色体上，遗传距离为128.62-147.53cM，物理距离为30004559～34415035bp；所述主效QTL位于分子标记Indel ssr-1和分子标记Indel ssr-2之间；
检测所述分子标记Indel ssr-1的物质为：
上游引物：5’-CCCGGGACTGATGAAGAAG-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物：5’-CTCACCCTTGACTGCAGATTC-3’，SEQ ID NO.2；
检测所述分子标记Indel ssr-2的物质为：
上游引物：5’-TGCCATAGATAACACCACTATGAAA-3’，SEQ ID NO.3；
下游引物：5’-CGCCAAACCATCAAAAATGT-3’，SEQ ID NO.4。
本发明还提供了调控水稻结实率的主效QTL位点的定位方法，包括以下步骤：1)以华占、热研为亲本进行杂交，通过单粒传法，获得120个稳定遗传的株系，共同组成RILs群体；2)考察重组自交系群体成熟期的结实率情况；3)利用实验室前期开发的大量SNP和Indel标记构建的遗传图谱，通过R-QTL专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将QTL逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到LOD>2.5的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1个QTL。
与调控水稻结实率主效QTL连锁的分子标记，所述分子标记包括Indel ssr-1和Indel ssr-2；
其中，检测所述分子标记Indel ssr-1的物质为：
ssr-1-F：5’-CCCGGGACTGATGAAGAAG-3’，SEQ ID NO.1；
ssr-1-R：5’-CTCACCCTTGACTGCAGATTC-3’，SEQ ID NO.2；
检测所述分子标记Indel ssr-2的物质为：
ssr-2-F：5’-TGCCATAGATAACACCACTATGAAA-3’，SEQ ID NO.3；
ssr-2-R：5’-CGCCAAACCATCAAAAATGT-3’，SEQ ID NO.4。
本发明还请求保护所述的与调控水稻结实率主效QTL连锁的分子标记在选育高结实率水稻中的应用。
本发明还请求保护一种高结实率的水稻的选育方法，过程包括：提取水稻DNA，使用权利要求1所述的检测分子标记Indel ssr-1和Indel ssr-2的物质对DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，通过带型分析水稻结实率。
在上述选育方法中，PCR扩增的反应体系为：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板1μL，Mix酶8μL；PCR扩增的反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸10s，扩增34个循环，最后72℃终延伸1min。
本发明还请求保护一种高结实率的水稻的选育试剂盒，包括所述检测分子标记Indel ssr-1和Indel ssr-2的物质。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明借助日益发展的分子生物学与基因组学的研究手段与方法，以粳稻品种热研为父本、籼稻品种华占为母本的杂交F1代连续自交后得到的120个重组自交系群体为材料，利用该群体已构建的加密遗传图谱对数据进行QTL作图分析，在2号染色体上检测到一个LOD值高达3.47的QTL，实现崭新突破。本发明的分子标记辅助育种技术可以有效的解决相关基因认识不全面的问题，通过构建遗传连锁图谱和数量性状位点(Quantitative Trait Locus，QTL)分析，能够高效寻找与水稻结实率的主效QTL紧密连锁的分子标记，使用这些标记可以对水稻后代进行筛选，在节约成本的同时可有效提高育种效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为调控水稻结实率的主效QTL定位过程中使用的遗传材料构建流程图；
图2附图为RIL群体结实率的频率分布图；
图3附图为调控水稻结实率的主效QTL qSSR2.1在第2号染色体上的位置；
图4附图为分子标记Indel ssr-1的引物对在亲本及其F1代和RIL群体中扩增产生的电泳图；其中，1为华占、2为热研、3为华占/热研杂交后代F1、4-11为华占/热研杂交组合的RILs群体；
图5附图为分子标记Indel ssr-2的引物对在亲本及其F1代和RIL群体中扩增产生的电泳图；其中，1为华占、2为热研、3为华占/热研杂交后代F1、4-11为华占/热研杂交组合的RILs群体；
图6附图为利用分子Indel ssr-1的引物对在亲本及其BC3F1代中扩增产生的电泳图；其中1为华占、2为日本晴，3为华占/日本晴杂交后代F1、4-10为华占/日本晴杂交的BC3F1群体；
图7附图为利用分子Indel ssr-2的引物对在亲本及其BC3F1代中扩增产生的电泳图；其中1为华占、2为日本晴，3为华占/日本晴杂交后代F1、4-10为华占/日本晴杂交的BC3F1群体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1调控水稻结实率的主效QTL定位
1、实验材料的获取
以华占为供体亲本，本地水稻品种热研为受体亲本，进行杂交构建RILs，利用单粒传法(即，对F1进行套袋单株受种处理，直至后代株系表型不发生分离)，最终得了120个稳定遗传的株系(F12，所有株系表型稳定)，如图1。
选取亲本与各株系种子(F12)各100粒，表面消毒后浸种2天，再用湿润的毛巾包裹，置于37℃恒温箱中催芽48h后，挑选露白一致的种子播种。30天后，选择生长状况相似的亲本及各株系秧苗各30株移栽，所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。
2、水稻结实率测定
待水稻成熟后，测量HZ、Nekken2及各株系结实率。成熟后收获群体各单穗的种子，计数该数出总粒数(含秕谷)和秕谷(无米空壳)，用总粒数减空壳数，等于实粒数，实粒数除总粒数计算出结实率。
结果如图2可知，水稻结实率数据呈正态分布且范围广泛，有较多超亲个体存在，表现出数量性状的遗传特点。
3、QTL定位分析
利用实验室前期开发的大量的SNP和Indel标记构建的遗传图谱，对水稻结实率进行数量性状座位(QTL)区间作图，通过R-QTL专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将QTL逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到LOD>2.5的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1个QTL。
最终在整个染色体组中我们找到位于第2染色体上的Indel ssr-1标记和Indelssr-2标记之间的一个主效QTL，结实率LOD值高达3.47。其遗传距离为128.62-147.53cM，物理距离为30004559～34415035bp，并命名为qSSR2.1，如图3。
实施例2分子标记辅助选择
在QTL位点qSSR2.1上下游分别设定分子标记Indel ssr-1和分子标记In delssr-2，并设计引物；
分子标记Indel ssr-1的引物对为：
上游引物5’-CCCGGGACTGATGAAGAAG-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物5’-CTCACCCTTGACTGCAGATTC-3’，SEQ ID NO.2；
分子标记Indel ssr-2的引物对为：
上游引物5’-TGCCATAGATAACACCACTATGAAA-3’，SEQ ID NO.3；
下游引物5’-CGCCAAACCATCAAAAATGT-3’，SEQ ID NO.4。
取亲本华占、热研及其F1代和RIL群体的水稻叶片，提取基因组DNA，利用上述分子标记对其基因组DNA进行PCR扩增；
PCR反应体系：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板1μL，Mix酶8μL；
反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸10s，扩增34个循环，最后72℃终延伸1min。
PCR扩增产物在4％琼脂糖凝胶电泳检测，部分结果如图4、5所示。
对电泳检测条带带型进行分析，其中，条带趋向于亲本华占，则说明该株系水稻结实率较好，若趋向热研则说明结实率较差。
将受试株系水稻结实率与通过带型分析预测的结果进行比对，显示预测结果与实际检测结果相吻合。
实施例3水稻结实率相关QTL连锁的分子标记在水稻育种中的应用
实施例2中设定的分子标记可应用于水稻分子辅助育种，具体实施方式为：将其他结实率较小的水稻品种日本晴，与华占进行杂交，获得相应的F1，以日本晴为轮回亲本进行回交，至BC3F1代。提取BC3F1代部分单株DNA，然后用Indel ssr-1和Indel ssr-2的引物进行PCR扩增，通过带型分析来确定是否存在相应的标记，存在标记的说明该株系的调控结实率能力较强。利用该方法进行筛选，定向选择，可获得调控结实率较强且保留了日本晴优良性状的水稻，大大提高了育种效率。
本实验室通过该分子标记将结实率较小的水稻品种日本晴，与华占进行回交，利用上述方法进行筛选定向选择，获得调控结实率较强且保留了日本晴优良性状的水稻子代，通过图6与图7可以看出，BC3F1代的偏向华占，说明保留了结实率较强的优良性状。
综上所述，本发明的调控水稻结实率的主效QTL可以有效地增加水稻调控能力，在育种过程中可以使水稻品质和产量得到有效提升，同时可加快优化水稻品种的进程。同时在水稻分子辅助育种的过程中可以培育产量较高的水稻品种，优化水稻品质和产量。此种方法简便易行，安全有效，有益于提高水稻品种的经济价值，兼顾经济与生态效益，适于大规模推广应用
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.与调控水稻结实率主效QTL连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括Indelssr-1和Indel ssr-2；
其中，检测所述分子标记Indel ssr-1的物质为：
ssr-1-F：5’-CCCGGGACTGATGAAGAAG-3’，SEQ ID NO.1；
ssr-1-R：5’-CTCACCCTTGACTGCAGATTC-3’，SEQ ID NO.2；
检测所述分子标记Indel ssr-2的物质为：
ssr-2-F：5’-TGCCATAGATAACACCACTATGAAA-3’，SEQ ID NO.3；
ssr-2-R：5’-CGCCAAACCATCAAAAATGT-3’，SEQ ID NO.4。
2.权利要求1所述的与调控水稻结实率主效QTL连锁的分子标记在选育高结实率水稻中的应用。
3.一种高结实率的水稻的选育方法，其特征在于，过程包括：提取水稻DNA，使用权利要求1所述的检测分子标记Indel ssr-1和Indel ssr-2的物质对DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，通过带型分析水稻结实率。
4.根据权利要求3所述的一种高结实率的水稻的选育方法，其特征在于，
PCR扩增的反应体系为：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板1μL，Mix酶8μL；
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸10s，扩增34个循环，最后72℃终延伸1min。
5.一种高结实率的水稻的选育试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测分子标记Indel ssr-1和Indel ssr-2的物质。
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