CN112094808A - 一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种装载有miR‑204的外泌体，其能够显著改善干眼症的症状和体征。通过将miR‑204在L929细胞中高表达，本发明获得了安全高产、来源稳定的装载miR‑204的外泌体，解决了MSC来源外泌体在实际应用上培养难、稳定性差等诸多限制，同时解决了脂质体转染转染效率不稳定、不同细胞间差异大、脂质体转染试剂毒性较大、作用时间较短、稳定性差的问题，推动了临床转化。

Description

一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

干眼（dryeye）又称角结膜干燥综合症(keratoconjunctivitissicca)，是指任何原因引起的泪液质或量的异常，或动力学异常导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和（或）眼表组织损害为特征的多种疾病的总称。干眼病因繁多，累及人群广泛，目前治疗效果有限，极大影响了患者的生活和工作，给社会带来沉重负担。

外泌体（exosomes）是一类由细胞分泌的携带胞质组分的纳米级别的膜性小泡，其中含有蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性物质，可通过膜融合的方式将miRNA等有效成分传递给其他细胞或调节其受体，作为细胞之间相互交流的桥梁。更重要的是，使用外泌体可以规避细胞治疗的致瘤性等潜在安全问题。

近年发现，间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)外泌体（MSC-exo）在诸多疾病中的治疗作用和潜在临床价值，它能缓解炎症，调节免疫反应及促进组织再生，被认为是潜在的药物载体，有望成为间充质干细胞细胞疗法的替代。但目前存在的突出问题包括：MSC细胞获取困难；培养难度大；传代不稳定等，难以提供稳定的外泌体来源，制约了该成果迈向临床。

脂质体转染是miRNA的重组表达质粒或合成的成熟miRNA序列进入细胞的常用技术手段。但是，利用脂质体转染其转染效率不稳定，不同细胞间存在差异，而且脂质体转染试剂毒性较大，作用时间较短，稳定性差。对此，人们又尝试用各种病毒载体将miRNA***到细胞基因组以解决脂质体转染效率问题。然而，病毒载体对人类基因组的安全仍具有威胁，可能引起免疫反应、整合入基因组的隐患及病毒具有复活毒性的可能等所造成的系列安全问题一直饱受争议。与人工构建的纳米载体相比，外泌体不仅具有体积小、结构稳定、能保护其内容物不被降解等特点，而且因其来源于细胞本身，天然具有无细胞毒性、低免疫原性、高生物相容性等优点，是一种理想的基因递送载体。

发明内容

针对上述存在问题和不足，本发明将表达miR-204的质粒导入L929细胞中，实现了稳定高表达miR-204的外泌体富集，并且在动物实验上实现了与MSC-exo类似的干眼症治疗效果，从而有效突破了MSC-exo在临床应用上的诸多限制，解决了miRNA体内直接应用的不稳定性的问题。

本发明是通过如下技术方案得以实现的：

本发明第一方面提供了一种预防和/或治疗干眼症的外泌体，所述外泌体中装载有miR-204（其全称为mmu-miR-204-5p，Gene ID：MIMAT0000237，miRNA成熟体序列(5'-3'):uucccuuugucauccuaugccu）。

作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体（MSC-exo）、人工改造外泌体中的一种或多种。

作为优选地，所述人工改造外泌体通过以下步骤制备得到：

（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的成纤维细胞内；

（2）筛选高表达miR-204的细胞株；

（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。

作为优选地，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞，即所述人工改造外泌体为装载miR-204的L929外泌体（L929-miR-204-exo）。

本发明第二方面提供了一种预防和/或治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括装载有miR-204的外泌体。

作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体（MSC-exo）、人工改造外泌体中的一种或多种。

作为优选地，所述人工改造外泌体通过以下步骤制备得到：

（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的L929细胞内；

（2）筛选高表达miR-204的细胞株；

（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。

作为优选地，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞。

本发明第三方面提供了miR-204在制备预防和/或治疗干眼症药物中的应用。

本发明第四方面提供了装载有miR-204的外泌体在制备预防和/或治疗干眼症药物中的应用。

作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体（MSC-exo）、人工改造外泌体中的一种或多种。

作为优选地，所述人工改造外泌体通过以下步骤改造得到：

（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的成纤维细胞内；

（2）筛选高表达miR-204的细胞株；

（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。

作为优选地，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞。

作为优选地，所述预防和/或治疗干眼症的机制为：通过miR-204下调角膜巨噬细胞表面IL-6R的表达、抑制STAT3通路激活、促炎型表型巨噬细胞减少、抑炎型表型增多、各种炎症因子表达减少，从而预防和/或治疗干眼症。

作为优选地，所述预防和/或治疗是指能够减轻、抑制、改善或缓解以下任意一种或多种症状、体征：

（1）眼干涩感、异物感、灼烧感、畏光、视物模糊和视觉疲劳等眼不适感；

（2）泪河变窄或中断，睑裂区角膜上皮点状脱落，角膜上皮缺损区荧光素着染；

（3）角膜缘上皮细胞功能障碍、角膜变薄、溃疡甚至穿孔。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

（1）本发明发现了MSC来源的外泌体在改善干眼症状方面的突出效用，并进一步发现MSC-exo中的miR-204是其主要作用成分。鉴于MSC-exo在临床应用上的诸多限制，本发明利用慢病毒构建了稳定高表达miR-204的L929细胞，收集富含miR-204的外泌体，并在干眼症动物模型中实现了与MSC-exo类似的治疗效果。

（2）本发明提供的包载miR-204的外泌体，能够显著改善干眼症的症状和体征。通过将miR-204在L929细胞中高表达，本发明获得了安全高产、来源稳定的装载miR-204的外泌体，解决了MSC来源外泌体在实际应用上培养难、稳定性差等诸多限制，同时解决了脂质体转染转染效率不稳定、不同细胞间差异大、脂质体转染试剂毒性较大、作用时间较短、稳定性差的问题，推动了临床转化。

附图说明

图1为用mmu-miR-204precursor转染L929细胞及转染效率图。

图2为高表达miR-204的L929外泌体与其他外泌体治疗后，泪液分泌量及荧光素钠染色评分的统计图。

图3为成纤维细胞外泌体和MSC外泌体干预的苯扎氯铵模型后角膜组织中miR-204的水平。

图4为MSC与L929细胞中miR-204水平。

图5为高表达miR-204的L929外泌体与其他外泌体治疗效果对比的眼前段照相白光及荧光素钠染色钴蓝光图

图6为高表达miR-204的L929外泌体治疗后，角膜染色显示巨噬细胞分型结果图。

图7为qPCR结果图反应高表达miR-204的L929外泌体治疗后，炎症因子的表达水平。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1装载miR-204的外泌体的制备

一种装载有miR-204的外泌体，其制备方法包括如下步骤：

（1）合成miR-204前体的双链寡聚核苷酸序列，克隆至pHBLV质粒中构建表达载体，并转染给239T细胞，转染后72h收集病毒上清，以0.45μm过滤器过滤，72000×g离心120min后获得浓缩慢病毒；用制备好的病毒转染L929细胞；

（2）培养扩增并用puromycin进行药物筛选，并通过GFP荧光流式分选筛出稳定高表达miR-204的L929细胞株。

（3）收集步骤（2）中所得的细胞培养液，并利用超高速离心对外泌体进行差速离心分离提取，得到装载miR-204的L929-exo。

实验结果显示：用mmu-miR-204precursor转染L929细胞转染效率佳，成功转染的细胞表达绿色荧光，通过流式筛选滴度为40的组获得高表达miR-204的L929细胞（如图1所示）。

实施例2小鼠干眼模型制备及外泌体干预

（1）选取6-8周龄C57小鼠，裂隙灯检查无异常，泪液分泌量及角膜荧光素染色未见异常。采用随机分组法分为2组，每组15只；

（2）对2组小鼠分别予以双眼点眼药水，其中组1给予0.2%苯扎氯铵+0.2ug/uL装载有miR-204的L929-exo（由实施例1制备得到），组2给予0.2%苯扎氯铵+0.2ug/uLMSC-exo，每次5ul/眼，连续点7天。

实施例3干眼指标检测

滴眼药水治疗7天后，于第8天对两组小鼠通过腹腔注射4.3%水合氯醛，注射剂量为10ul/g，以麻醉小鼠，检测干眼诱导后泪液分泌量的测量、眼前段照相、泪膜破裂时间和角膜上皮荧光素染色评分。

（1）检测泪液分泌量：用眼科显微镊将酚红棉线放置于小鼠下睑结膜囊中外1/3处，1min后取出读值，用毫米单位测量记录酚红棉线红色部分。每眼按上述方法测试2次，最后结果为2次测量结果的平均值。

（2）泪膜破裂时间：将1%的液态荧光素钠1μl滴至小鼠结膜囊，3次辅助眨眼后，自最后一次瞬目后睁眼至角膜出现第1个黑斑的时间即为BUT。每眼按上述方法测试2次，最后结果为2次测量结果的平均值。

（3）角膜荧光染色评分：记录完泪膜破裂时间后，使用钴兰光在裂隙灯下观察每眼角膜上皮损害分级。角膜分成四个区域，分别记录每个区域的分值，最后的分值为4个区域分值的总和。

评分标准：缺乏，0分；

少于30个点的轻微点状着色，1分；

大于30个点的点状着色，2分；

弥散着染严重，但没有明显成片状，3分；

明显的片状染色，4分。

治疗后荧光素染色评分结果如图2所示。实验结果显示干眼组的角膜上皮呈现大面积成片状的荧光素着染；MSC-exo治疗后，角膜上皮呈现轻微点状着色，荧光素着染的面积明显减少，L929-exo治疗后无明显改善；装载有miR-204的L929-exo治疗后，荧光素着染面积较L929-exo治疗组明显减少，染色评分与MSC-exo治疗组相近。

实施例4 机制验证

第8天，小鼠断颈处死后，取眼球在磷酸盐缓冲液中分离角膜组织，置于trizol中，通过超声波粉碎角膜组织。通过氯仿、异丙醇提取RNA，并用75%酒精清洗1次后，将RNA离心至管底，弃酒精，待酒精晾干后，加入适量分子生物学超纯水溶解RNA。测定RNA浓度后做realtimePCR分析，检测miR-204的差异。同时取RNA样本送公司做测序分析，明确其中miRNA富集情况。

实验结果显示：测序及qPCR发现MSC-exo干预后的角膜组织较L929exo或PBS干预的苯扎氯铵模型角膜组织的miR-204升高（如图2所示）。qPCR中MSC比L929的miR-204高，测序及qPCR中MSC-exo比L929exo的miR-204高；从而提示miR-204是有效成分（如图4所示）

实施例5 装载有miR-204的L929-exo对干眼症的作用

（1）根据实施例2所述构建小鼠干眼模型，随机分为5组，每组15只；

（2）对每组小鼠分别给予双眼点眼药水，其中：组1予PBS，组2给予0.2%苯扎氯铵+PBS，组3予0.2%苯扎氯铵+0.2ug/uL 空白L929-exo，组4予0.2%苯扎氯铵+0.2ug/uLMSC-exo，组5予0.2%苯扎氯铵+0.2ug/uL装载有miR-204的L929-exo（由实施例 1制备得到）。每次5ul/眼，连续点7天；

（3）第8天时，对小鼠予以断颈处死，取眼球，置于4%多聚甲醛中固定60min，用5%BSA+0.3%Trition封闭液封闭后，1：100稀释CD86及CD206抗体，4℃敷育过夜，染二抗后及DAPI染核后封片，confocal共聚焦显微镜下评估CD86或CD206的共染情况，评估角膜巨噬细胞的极化类型；

（4）在磷酸盐缓冲液中分离角膜组织；real-timePCR定量检测角膜组织中IL-6、IL-1β等炎症因子及促炎表型巨噬细胞标记物CD86表达水平的变化。

实验结果显示：组4相较于对照组促炎型角膜巨噬细胞减少，抑炎型巨噬细胞增多，炎症因子减少。组5干眼指标明显好转，提取高表达miR-204的L929细胞外泌体，并与其他外泌体比较干预效应，效果近似MSC-exo。眼前段照相及荧光素钠染色钴蓝光图显示呈现高表达miR-204的L929分泌的外泌体治疗作用近似MSC外泌体（如图2、图5所示）。组5干眼相关细胞学及细胞生物学指标明显好转。经高表达miR-204的L929外泌体治疗后（组5），角膜染色显示巨噬细胞活化减少，巨噬细胞促炎表型（CD86+）数量减少，抑炎表型（CD206+）巨噬细胞数量增多（如图6所示），qPCR证明高表达miR-204的L929外泌体治疗后（组5），炎症因子IL-6、IL-1b表达水平显著下降（如图7所示）。

由此可见，本发明所提供的装载有miR-204的外泌体，能够显著改善干眼症的症状和体征。通过将miR-204在L929细胞中高表达，本发明获得了安全高产、来源稳定的装载miR-204的外泌体，解决了MSC来源外泌体在实际应用上培养难、稳定性差等诸多限制，同时解决了脂质体转染转染效率不稳定、不同细胞间差异大、脂质体转染试剂毒性较大、作用时间较短、稳定性差的问题，推动了临床转化。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种预防和/或治疗干眼症的外泌体，所述外泌体中装载有miR-204。

2.根据权利要求1所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体，其特征在于，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体、人工改造外泌体中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体，其特征在于，所述人工改造外泌体通过以下步骤制备得到：

（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的成纤维细胞内；

（2）筛选高表达miR-204的细胞株；

（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。

4.根据权利要求3所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体，其特征在于，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞。

5.一种预防和/或治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括装载有根据权利要求1-4任一项所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体。

6.根据权利要求5所述的预防和/或治疗干眼症的药物组合物，其特征在于，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体、人工改造外泌体中的一种或多种。

7.miR-204在制备预防和/或治疗干眼症药物中的应用。

8.装载有miR-204的外泌体在制备预防和/或治疗干眼症药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体、人工改造外泌体中的一种或多种。

10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗干眼症的机制为：通过miR-204下调角膜巨噬细胞表面IL-6R的表达、抑制STAT3通路激活、促炎型表型巨噬细胞减少、抑炎型表型增多、各种炎症因子表达减少，从而预防和/或治疗干眼症。

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