CN112094755A - 一种草酸青霉hy181-2、制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种草酸青霉HY181‑2、制备方法及其用途。草酸青霉HY181‑2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61142。其具有防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的作用。

Description

一种草酸青霉HY181-2、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种草酸青霉HY181-2、制备方法及其用途。
背景技术
金线莲为多年生草本植物，是我国民间的珍稀药材，全草可入药，素有“药王”、“金草”等美称，产于我国浙江、福建、湖南、广东、海南等地。因其较高的药用价值，导致金线莲野生资源采挖现象严重，野生金线莲濒临灭绝，因此人工栽培的金线莲成为了当今市场的主要来源。随着金线莲人工栽培产业的发展，金线莲的相关病害也越发突出显著，福建省人工栽培过程中，发现金线莲的病害主要有炭疽病、软腐病、立枯病、茎腐病等(卓飞，王睿，林玲，等.海南省金线莲种植主要病虫害及防治[J].现代园艺，2019.3:162-163.)；其中尤以茎腐病和炭疽病较为严重。目前相关研究表明，金线莲茎腐病的致病菌为尖孢镰刀菌(赵云青，陈菁瑛，林晓军，等.金线莲茎腐病病原菌分离及分子鉴定[J].福建农业学报，2014,29(10)：995-999.)。目前国内仅有的也是最新的报道称金线莲炭疽病致病菌为长直孢炭疽菌(Colletotrichum gigasporum)(杨晓琦，等.金线莲炭疽病病原菌的分离鉴定及其对9种杀菌剂的敏感性[J].农药学学报，2020，22.)。但事实上，炭疽菌属的成员多是杂食性的，有广泛的寄主谱，它们可寄生或腐生于不同科属植物上，如黑线炭疽菌可侵染葡萄、萝卜、薯芋、大丽花、知母、枸杞和曼陀罗等不同科属的植物。另外，在一种植物上可同时被几种炭疽菌所侵染，如在紫山药上至少有6种炭疽菌同时寄生(韩晓勇,殷剑美,张培通,等,紫山药炭疽病病原菌鉴定[J],分子植物育种,2020,18(15):5010-5019))。
而针对金线莲相关病害的传统防治手段均是以化学农药进行喷施以达到防止或是治理病害(黄德贵,阮孔中.几种杀菌剂防治金线莲病害试验[J].福建热作科技,1998,23(1):4-7.)(王伟，苏明华，李惠华，等.6种杀菌剂对金线莲病害及生长的影响[J].亚热带植物科学，2013,42(3):249-251.)。但长期使用化学农药，极易出现耐药致病菌株，而且农残问题也制约着金线莲产业的发展。因此开发生物农药是农业发展的大趋势，特别是海洋来源的微生物。因海洋生态环境的特殊性导致海洋来源微生物次生代谢产物具有化学结构奇特、新颖，生物活性多样等特点。对于开发高特异性、高效、低毒副作用和防止耐药性的生物农药至关重要。
目前为止，尚未有将草酸青霉(Penicillium oxalicum)，特别是海洋来源的草酸青霉(Penicillium oxalicum)应用于防治金线莲病虫害的相关报道和专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2。
为实现上述目的，本发明提供一种具有防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61142。
本发明还提供一种所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2的分离方法，其特征在于，将福建东山珊瑚自然保护区的珊瑚样本在无菌超净台内敲碎，再将敲碎的珊瑚样本混匀后分别倒入PDA培养基摇床培养，取出摇瓶，将培养液做平板稀释涂布法，将涂好的平板放入28℃恒温箱避光培养，涂板的第三天筛选到一株丝状真菌，该菌株周边的其他菌株的生长较为困难，被影响的菌落呈现出一定的抑菌效果，随即用PDA培养皿对该丝状真菌进行多次纯化分离，将其命名为HY181-2；
优选的，摇床培养的条件为160转/分钟，28℃培养2-3天。
本发明还提供一种所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2的发酵培养方法，其特征在于，将菌株HY181-2在培养基平板上划线后25-31℃培养，然后用打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取菌块接种，每个500ml的瓶接种1-5块菌块；每个500ml的瓶装有100-200ml培养基，置于25-31℃摇床160-200rpm振荡培养4-13天；
优选的，将菌株HY181-2在PDA平板上划线厚25-31℃培养，培养5-7天后用打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取菌块接种，每个500ml的瓶接种1-5块菌块；每个500ml的瓶装有100-200ml PDS培养基，置于25-31℃摇床160-200rpm振荡培养4-13天；
更优选的，菌株HY181-2在PDA平板上划线，培养温度28℃，培养5-7d后用孔径6mm打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取1菌块接种PDS培养基，每500ml瓶装液200ml接种3块菌块，置于28℃摇床160rpm振荡培养8天。
本发明还保护所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2用于防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的用途。
进一步，将所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2发酵得到发酵液，再从发酵液中获得萃取物，将萃取物用二甲基亚砜稀释后直接喷施于患有金线莲茎腐病和/或炭疽病的金线莲叶片上或颈部即可。
进一步，所述从发酵液中获得萃取物的步骤为，加入与发酵液等体积的乙酸乙酯到发酵液中，充分振荡后静置；待完全分层后，取有机相溶液通过EYELA的旋转蒸发仪去除多余的乙酸乙酯，旋蒸瓶内所得的即为菌株HY181-2发酵液萃取物；
优选的，对发酵液进行3-5次重复萃取。
进一步，用于制备防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的药物的用途。
本发明还提供一种防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的药物制剂，其特征在于，包括10％HY181-2高孢粉，1％PEG8000，5％茶皂素，1％CaCO3，0.5％抗坏血酸，硅藻土补足100％；其中HY181-2高孢粉为将所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2发酵过滤离心后冷冻干燥所获得的的物质，其含菌量8-10×108个/ml，孢子萌发率>85％。
与现有的以草酸青霉为原料制备的生物农药相比：
1、本发明所用原料来源广泛，且价格低廉，使用单一生防菌种，载体添加物为硅藻土，制剂当中其他组分均为市面上常见的，且性价比较高的生物材料。生产加工省时省力，使用的均为常规仪器设备。任何普通生物实验室都能具备研发的条件，更适宜厂家大规模生产，并且方便运输储存。
2、本发明所用草酸青霉为海洋来源菌株，相对陆生菌株其特异性更强，具有更多潜在的开发价值。
附图说明
图1是HY181-2在PDA上生长的菌落形态和显微镜镜检结果图。
图2是青霉属rDNA-ITS序列为基础的***发育树图。
图3是菌株HY181-2对JXL的平板对峙试验及JXL被抑制部分镜检结果图。
图4是菌株HY181-2对金线莲炭疽病致病菌TJ的平板对峙试验及菌株TJ被抑制部分镜检结果图。
图5是HY181-2发酵液萃取物溶液进行气相色谱-质谱分析，色谱结果图。
图6是不同培养基对HY181-2产孢量的影响图。
图7是不同糖源对HY181-2产孢量的影响图。
图8是温度对HY181-2发酵产孢的影响图。
图9是摇床转速对HY181-2发酵产孢的影响图。
图10是装液量对HY181-2发酵产孢的影响图。
图11是pH对HY181-2发酵产孢的影响图。
图12是接种量对HY181-2发酵产孢的影响图。
图13是HY181-2在发酵培养基中的生长曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所涉及的培养基及组分如下：
1、马铃薯葡萄糖(PD)培养基：新鲜土豆200g,加水煮30min后，纱布过滤，取滤液1000ml加葡萄糖20g灭菌备用；
2、马铃薯葡萄糖(PDA)培养基：新鲜土豆200g,加水煮30min后，纱布过滤，取滤液1000ml加葡萄糖20g和琼脂15g灭菌、倒板备用；
3、淘米水培养基：取淘米水用八层纱布过滤，灭菌备用；
4、土壤浸出液培养基：肥沃菜园土1000g，加水1000ml浸泡24h，过滤后加入CaCO35g/L灭菌备用；
5、玉米培养基：200g玉米碎，加水煮30min后，纱布过滤，取滤液用蒸馏水补足至1000ml灭菌备用。
实施例1：海洋来源草酸青霉的分离纯化
将珊瑚样本(福建东山珊瑚自然保护区珊瑚样本)在无菌超净台内敲碎，再将敲碎的珊瑚样本混匀后分别倒入(PD)培养基、淘米水培养基、土壤浸出液培养基、玉米培养基中，放入摇床(160转/分钟)28℃培养2-3天。取出摇瓶，将培养液做平板稀释涂布法，将涂好的平板放入28℃恒温箱避光培养。每天取出平板进行筛菌：分离同一个样品不同平板中长的不一样的菌落，或者有对周边其他菌株有抑制效果的菌株，并拍照记录选取菌株的生长情况。从分离的菌株中发现一株真菌将其命名为HY181-2，其周围其他菌株较难生长，并且抑菌圈较为明显。对该菌进行多次的平板划线分离纯化，经鉴定为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。
实施例2：海洋来源草酸青霉的鉴定
(1)菌体形态特征
菌株HY181-2形态学鉴定：将纯化后的菌株HY181-2接种至PDA培养基，28℃恒温箱中，避光培养4-5天，并观察记录各自的菌落特征，结合显微镜下拍照和培养性状以及相关文献进行鉴定。结果见图1。其中A为HY181-2菌落正面照片，B为HY181-2菌落反面照片，C为菌株HY181-2菌丝及孢子显微照片。
菌株HY181-2在PDA平板上见图1的A和B。可以看出，菌落整体较为平坦，菌落中间有明显的突起小环，菌落呈地毯式蔓延生长，菌落周边有一圈白色菌丝，质地绒状，菌落中间呈青绿色，而白色与青绿色交界处的菌丝呈现出淡黄绿色。HY181-2菌丝初期为白色，后浅黄至浅绿最后至青绿色，表面呈密毡状，分生孢子大量产生，且分生孢子极易飞扬；菌落反面呈淡黄色，周边无明显色素产生。
显微镜下菌株HY181-2的分生孢子结果如图1的C所示，分生孢子梗有分隔，具有帚状枝小梗，帚状枝通常双轮生，偶有三轮生或单轮生；孢子常为链状生长，多为球形，表面光滑；孢子形成后浅黄至浅绿最后至青绿色。
根据在PDA上生长的菌落形态和显微镜镜检结果，结合参照《中国真菌志》(孔华忠，中国真菌志-青霉属及其相关有性刑属[M].第35卷.北京:科学出版社，2004.)和《真菌鉴定手册》(魏景超，真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.)，菌株HY181-2符合青霉属的生长特性，初步确认该菌为青霉属(Penicillium)。
(2)ITS NDA分子生物学鉴定
菌株HY181-2分子生物学鉴定：分别收集菌株HY181-2的菌丝体，并采用FungalDNA Kit的方法提取DNA。将获得的DNA用通用引物ITS1/ITS4(White T,Bruns T,Lee S,etal.PCR protocols,a guide to methods and applications[M].New York:AcademicPress.1990.)扩增菌株的ITS序列，并将扩增产物回收并交付于上海捷瑞生物工程有限公司进行测序，将菌株HY181-2的基因序列与NCBI中相关序列BLAST比对，发现其与已发表的相关青霉属(Penicillium sp.)菌株的序列同源性为100％。利用软件MEGA6构建以青霉属rDNA-ITS序列为基础的***发育树(图2)，可以看出菌株HY181-2与草酸青霉(Penicilliumoxalicum，HM053477.1)的进化距离最近。结合形态学鉴定结果，最终将菌株HY181-2鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。
本发明的菌株HY181-2为草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2，已经保藏。
菌株名称：Penicillium oxalicum HY181-2；
保藏日期：2020年8月14日；
保藏单位：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)；
保藏编号：GDMCC No：61142。
并且根据进化树信息可明确断定，HY181-2与Penicillium oxalicum HQF 8021为草酸青霉的不同亚种。两者不是同一株菌株。
HY181-2碱基序列为：
ATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGAcTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT；SEQ ID NO:1。
实施例3海洋来源草酸青霉与金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌的拮抗作用
以下实施例的对比菌株：金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)JXL(以下简称病原菌JXL)和炭疽病病原菌胶孢炭疽菌，又名盘长孢状刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides)TJ(以下简称病原菌TJ),由本实验室从厦门、漳州和龙岩等地金线莲种植基地采集的金线莲病害植株中分离、纯化并保存。经过形状的比较，其中病原菌JXL：与菌株保藏编号CICC 41029为同一个菌株，病原菌TJ与菌株保藏编号CGMCC3.17360为同一个菌株。
病原菌JXL：菌株保藏编号：CICC 41029
中文名称：尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)
收藏时间：2007-03-05
特征特性：小型分生孢子假头状着生，大型分生孢子顶端细胞较长逐渐变细而窄。
培养基名称：马铃薯、葡萄糖琼脂培养基(PDA)
培养基成分：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，pH自然。[注]马铃薯提取液：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
培养温度：25-28℃
需氧类型：好氧。
病原菌TJ：CGMCC 3.17360(原始编号LF916)
拉丁学名：Colletotrichum gloeosporioides
中文译名：盘长孢状刺盘孢
菌株来源：中国科学院微生物研究所
保藏时间：6/18/2014
培养温度25-28℃
培养基0013：麦芽汁培养基
1、活菌平板初筛试验
将HY181-2菌块接种在PDA平板上，28℃避光恒温培养，观察到菌落生长较为迅速，特别是产孢能力极强，3天内HY181-2菌块上白色菌丝迅速产生大量分生孢子，并且孢子极易脱落，轻微的振动并可远距离传播，并迅速扎根生长，说明菌株HY181-2具有生防菌生长快的特点。结合试验前期粗筛结果，将菌株HY181-2与病原菌JXL和TJ进行平板对峙试验，进一步研究其生防能力。
见图3。其中A为菌株HY181-2对JXL的平板抑制试验背面；B为菌株HY181-2对JXL的平板抑制试验正面；C为菌株JXL菌落被抑制菌丝的显微照。A中左侧点为181-2菌块(见标注181-2)，中间点为尖孢镰刀菌菌块(见标注JXL)，右侧点为PDA琼脂空白对照。从图3可以看出，平板对峙试验结果表明，菌株HY181-2对病原菌JXL具有较强的抑制作用(图3的B)，呈现出明显的抑菌圈。病原菌JXL菌落被抑制的部分呈***，对菌丝进行镜检，发现被抑制部分的菌丝与未被抑制部分的菌丝有较大的区别，被抑制部分的菌丝提前进入成熟、老化阶段，产生大量的分生孢子。
结合对峙试验和镜检结果，表明菌株HY181-2对病原菌JXL具有拮抗作用，具有开发成生防菌的潜力。
见图4。其中A1和A2为菌株HY181-2对TJ的平板抑制试验背面，A1的平皿是空白对照组，A2的平皿是试验抑制组；B1和B2为菌株HY181-2对TJ的平板抑制试验正面，B1的平皿是空白对照组，B2的平皿是试验抑制组；C为菌株TJ菌落被抑制菌丝的显微照。A1平皿上标注为空的为PDA琼脂块，作为空白对照(见标注空，左边)，中间点为胶孢炭疽菌菌块(见标注TJ)；B1平皿上标注181-2的点为181-2菌块，作为试验组(位于左右两边，见标注181-2)，中间点为胶孢炭疽菌菌块(见标注TJ)。从图4可以看出，平板对峙试验结果表明，菌株HY181-2对病原菌TJ具有较强的抑制作用，呈现出明显的抑菌圈。病原菌TJ菌落被抑制的部分相较于未被抑制的部分生长极为缓慢，并且呈现出稀疏状。对菌丝进行镜检，发现被抑制部分的菌丝与未被抑制部分的菌丝有较大的区别，被抑制部分的菌丝提前进入成熟、老化阶段，生成大量膈膜，并产生分生孢子。
结合对峙试验和镜检结果，表明菌株HY181-2对病原菌TJ具有拮抗作用，具有开发成生防菌的潜力。
2、海洋来源草酸青霉次级代谢产物的获取及分析
HY181-2次级代谢产物色谱图。
为验证菌株HY181-2的次级代谢产物是否具有抑菌能力，将菌株HY181-2进行小量发酵，每升发酵液当中获得259mg的萃取物。将发酵液萃取物溶液进行气相色谱-质谱分析，色谱结果如图5。
通过图5的GC-MS研究发现，HY181-2的发酵萃取物中主要包括脂肪酸类、缩醛类、甾体类、蒽醌类、蒽酮类等多种成分。这些次级代谢产物具有抗氧化、抑菌、抑制体外肿瘤细胞生长、抑制酶活性等作用(Santamarina MP,Rosello J,Llacer R.Antagonisticactivity of Penicillium oxalicum Corrie and Thom,Penicillium decumbens Thomand Trichoderma harzianum Rifai isolates against fungi,bacteria and insectsin vitro[J].Rev Iberoam Micol,2002,19(2):99-103；Liu B,Wang HF,Zhang LH,etal.New compound with DNA Topo I inhibitory activity purified from Penicilliumoxalicum HSY05[J].Nat Prod Res,2015,29(23):2197-2202；Chen G,Jiang Z,Bai,etal.Isolation,structure determination,in vivo/vitro assay and docking study ofa xanthone with antitumor activity from fungus Penicillium oxalicum[J].RecNat Prod,2015,9(2):184-189)。
实施例4海洋来源草酸青霉HY181-2发酵萃取物和4种杀菌剂的室内毒力测定
4.1供试杀菌剂母液配制
用二甲基亚砜(DMSO)将HY181-2发酵萃取物稀释成所需系列质量浓度的10倍母液，用无菌超纯水将其他杀菌剂稀释成所需系列质量浓度的10倍母液，各杀菌剂母液浓度梯度为各杀菌剂有效成分的浓度梯度。依据前期预试验结果，设定各个杀菌剂浓度梯度。HY181-2发酵萃取物浓度梯度设定为0.1、1、10、50、100mg/L，25％吡唑醚菌酯浓度梯度设定为0.1、1、10、50、100mg/L，50％多菌灵可湿性粉剂浓度梯度设定为1、10、50、100、1000mg/L，10％苯醚甲环唑浓度梯度设定为0.1、1、10、50、100mg/L，80％代森锰锌可湿性粉剂浓度梯度设定为1、10、50、100、1000mg/L。
4.2梯度培养基的配制
按照设定的浓度梯度，将各杀菌剂母液以1：9的体积比例加入融化的PDA培养基中，混合均匀后倒入9cm培养皿，即为配制所需质量浓度的含毒培养基。同理将不含HY181-2发酵萃取物的DMSO也以1：9的体积比例加入融化的PDA培养基中，作为含HY181-2发酵萃取物的含毒培养基的阴性对照，并以不含杀菌剂的PDA培养基作空白对照(CK)。
4.3室内毒力测定方法
采用菌丝生长速率法测定，将尖孢镰刀菌和胶孢炭疽菌分别接种至空白PDA培养皿中，26℃培养5天。使用打孔器选取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，并接种于含毒培养皿、阴性对照培养皿和空白对照PDA培养皿中央，每个处理做3次重复，26℃恒温倒置培养。试验根据致病菌的不同分为尖孢镰刀菌组和胶孢炭疽菌组，尖孢镰刀菌组培养5天，胶孢炭疽菌组培养10天。5天后取出尖孢镰刀菌组，10天后取出胶孢炭疽菌组，均应用十字交叉法测量每个培养基的菌落直径，将测得的各菌落直径减去原菌饼直径(7mm)，得出最终菌落纯生长直径，用于计算供试杀菌剂每个处理对致病菌菌丝生长的抑制率。计算公式如下：
菌丝生长平均抑制率(％)＝[空白(CK)对照纯生长直径—试验处理组纯生长直径]/空白(CK)对照纯生长直径x100；
运用Microsoft Excel求出抑制率机率值(y)与浓度对数(x)之间的毒力回归方程、每种杀菌剂的抑制中浓度EC50及相关系数(r)。
4.4室内毒力测定结果
为更加直观的了解菌株HY181-2次级代谢产物的抑菌能力，进行了室内毒力测定。
由表1、表2可知，菌株HY181-2发酵萃取物与其他4种化学杀菌剂对金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌JXL均有抑制作用。但病原菌菌丝对不同的杀菌剂敏感度差异较大，而DMSO对菌丝生长的抑制率仅为1.1％，几乎可以忽略。10％苯醚甲环唑的抑菌效果最好，EC50值为0.16mg/L，且对菌丝生长的抑制较为敏感，浓度仅为0.1mg/L时，抑制率就已达44.66％。HY181-2发酵萃取物和25％吡唑醚菌酯的抑菌效果次之，EC50值分别为2.72mg/L和2.02mg/L；但吡唑醚菌酯随着浓度的升高，对菌丝生长的抑制效果提高的并不明显，浓度从0.1mg/L升至100mg/L，抑制率仅提高了14.96％。80％代森锰锌可湿性粉剂的EC50为244.02mg/L；相比之下50％多菌灵可湿性粉剂的抑制效果最差，金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌对80％代森锰锌可湿性粉剂的敏感度最低，其EC50值高达2794.24mg/L。以毒力指数为指标，菌株HY181-2发酵萃取物在此次室内毒力测定试验中效果仅次于10％苯醚甲环唑。但菌株HY181-2发酵萃取物为微生物生长代谢所得，相较于化学杀菌剂而言，来源安全、健康、无农残，并且可以随着微生物的生长源源不断的获取。
表1 5种杀菌剂对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果表
Figure BDA0002694278820000081
Figure BDA0002694278820000091
表2 5种杀菌剂对尖孢镰刀菌的室内毒力回归方程表
Figure BDA0002694278820000092
由表3、表4可知，菌株HY181-2发酵萃取物与其他4种化学杀菌剂对金线莲炭疽病病原菌胶孢炭疽菌TJ均有抑制作用。但病原菌菌丝对不同的杀菌剂敏感度差异较大，而DMSO对菌丝生长的抑制率仅为1.0％，几乎可以忽略。50％多菌灵可湿性粉剂的抑菌效果最好，对菌丝生长的抑制效果最为显著，浓度仅为0.1mg/L时，抑制率就已达98.59％。HY181-2发酵萃取物和25％吡唑醚菌酯的抑菌效果次之，EC50值分别为1.21mg/L和0.35mg/L。10％苯醚甲环唑的EC50为2.14mg/L；80％代森锰锌可湿性粉剂的EC50为14.75mg/L。以毒力指数为指标，菌株HY181-2发酵萃取物在此次室内毒力测定试验中表现良好，对胶孢炭疽菌菌丝生长的抑制作用有着不输于化学农药的效力。但菌株HY181-2发酵萃取物为微生物生长代谢所得，相较于化学杀菌剂而言，来源安全、健康、无农残，并且可以随着微生物的生长源源不断的获取。
表3 5种杀菌剂对胶孢炭疽菌菌丝生长的抑制效果表
Figure BDA0002694278820000093
Figure BDA0002694278820000101
表4 5种杀菌剂对胶孢炭疽菌的室内毒力回归方程表
Figure BDA0002694278820000102
Figure BDA0002694278820000111
由表1、表2、表3、表4可知菌株HY181-2发酵萃取物对尖孢镰刀菌JXL和胶孢炭疽菌TJ均有较好的抑制作用。
实施例4海洋来源草酸青霉发酵优化
5.1培养基
选择5种常用真菌产孢子培养基：
(1)察氏培养基：3g蔗糖，0.3g NaNO3，0.1g K2HPO4，0.05g MgSO4·7H2O，0.001gFeSO4·7H20,1000ml蒸馏水灭菌备用；
(2)玉米培养基：200g玉米碎，加水煮30min后，纱布过滤，取滤液用蒸馏水补足至1000ml灭菌备用；
(3)马铃薯葡萄糖(PD)培养基：新鲜土豆200g,加水煮30min后，纱布过滤，取滤液1000ml加葡萄糖20g灭菌备用；其中将PD培养基中的葡萄糖改为可溶性淀粉制成PDS培养基；
(4)淘米水培养基：取淘米水用八层纱布过滤，灭菌备用。
(5)土壤浸出液培养基：肥沃菜园土1000g，加水1000ml浸泡24h，过滤后加入CaCO35g/L灭菌备用；
5.2初始培养条件
菌株HY181-2发酵优化初始培养条件：菌株HY181-2在PDA平板上划线，培养温度28℃，培养5-7d后用孔径6mm打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取1菌块接种PD培养基，每500ml瓶装液200ml接种1块菌块，置于28℃摇床160rpm振荡培养。
5.3发酵指标的测定
菌株HY181-2发酵液含孢量的测定：取发酵液稀释一定倍数后，用血细胞计数板在显微镜下测定其孢子数,共三次重复。
菌株HY181-2菌丝干重测定:每次三瓶，从三角瓶中倒出所有菌液，滤过双层纱布，烘干，称重，将数值换算成1000ml的重量。
5.4.菌株HY181-2发酵培养基及发酵条件的优化
5.4.1培养基对菌株HY181-2产孢量的影响
选择5种常用真菌产孢子培养基(培养基配方见4.1)，每种培养基三个重复，摇床28℃，180rpm振荡培养7d后，血细胞计数板检测每种培养基发酵液中的含孢量，以及每种培养基发酵后的菌丝干重。
5.4.2碳源对菌株HY181-2产孢量的影响
将PD培养基中的葡萄糖分别改为加入20g/L的蔗糖(Sucrose)、葡萄糖(Glucose)、麦芽糖(Maltose)、乳糖(Lactose)、可溶性淀粉(Starch)，每个处理三个平行，各培养基中接种1块菌株HY181-2菌块，置于摇床28℃，180rpm振荡培养7d后，血细胞计数板检测每种培养基发酵液中的含孢量，以及每种培养基发酵液中菌丝干重。
5.4.3温度对菌株HY181-2产孢量的影响
本试验采用PDS培养基。实验设4个温度处理：22℃、24℃、28℃、31℃、37℃，每个处理设3个重复，500ml锥形瓶装瓶量200ml，接种直径6mm的菌块1个，摇瓶转速160rpm，于恒温摇床中培养振荡培养7天，镜检计数孢子含量。
5.4.4转速对HY181-2产孢量的影响
本试验采用PDS培养基。500ml锥形瓶装200ml，每个处理设3个重复。培养温度28℃，接种直径6mm的菌块1个，摇瓶转速设置为120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm，于恒温摇床中培养振荡培养7天，镜检计数孢子含量。
5.4.5装液量对HY181-2产孢量的影响
本试验采用PDS培养基。500ml锥形瓶分别装100ml，200ml，300ml，400ml，每个处理设3个重复。培养温度28℃，接种直径6mm的菌块1个，摇瓶转速160rpm，于恒温摇床中培养振荡培养7天，镜检计数孢子含量。
5.4.6 pH对HY181-2产孢量的影响
本试验采用PDS培养基。以NaOH或HCL调节培养基pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，每种pH三个重复，接种直径6mm的菌块1个，摇瓶转速160rpm，于恒温摇床中培养振荡培养7天，镜检计数孢子含量。
5.4.7接种量对HY181-2产孢量的影响
本试验采用PDS培养基。分别在500ml锥形瓶中装液200ml发酵培养基，分别接种1、3、5、7、9块6mm打孔器打出的HY181-2新鲜菌块，每个水平三个平行。摇瓶转速160rpm，于恒温摇床中培养振荡培养7天，镜检计数孢子含量。
5.4.8 HY181-2生长曲线的测定
本试验采用PDS培养基。500ml锥形瓶中装液200ml发酵培养基，接种直径6mm的菌块1个，摇瓶转速160rpm，于恒温摇床中培养振荡培养，从第3天起每天取样3瓶，血细胞计数板检测发酵液中的含孢量，以及菌丝干重。培养至稳定期，然后以时间(h)为横坐标，含孢量、菌丝干重为纵坐标绘制HY181-2生长曲线。
5.5结果与分析
5.5.1 HY181-2发酵培养基优化结果
5.5.1.1 HY181-2发酵培养基筛选
不同培养基的筛选结果见下(图6)，从结果中看出HY181-2在PD培养基培养7天后菌丝生长良好，孢子含量能达到7.4x108/mL。其次HY181-2在淘米水培养基生长产孢较好；在玉米培养基中也有较高的含孢量，在土壤浸出液培养基中产孢量最少。说明HY181-2能充分利用土豆中的营养物质，生物来源的培养基比化学配制的培养基更利于真菌产孢。随着培养基中孢子的不断产生，培养液色泽也逐渐加深，如PD培养基颜色摇培3天可见白色菌丝球出现，第5天开始大量产孢，到第7天产孢达到一个小高潮，随后在第10天产孢达到最大。随着培养时间的延长，菌丝球从白色最终变成浅青绿色，液体培养基颜色也相应地变青色。
HY181-2在PD培养基中产孢好，为进一步提高产孢率，将PD培养基中的葡萄糖改为其他不同糖源来促进HY181-2生长及产孢。
5.5.1.2 HY181-2发酵糖原筛选
图7结果表明，添加不同糖源的PD培养基对HY181-2产孢量有不同影响，添加蔗糖能较大程度提高HY181-2菌丝干重；将PD培养基中的葡萄糖改为可溶性淀粉制成PDS培养基具有最高的含孢量，达到了1.02×109/ml。PDS配方简单价格便宜，适合大量发酵，所以选择PDS培养基作为HY181-2的产孢培养基。
5.5.2 HY181-2发酵条件优化结果
5.5.2.1温度对HY181-2发酵产孢的影响
图8为温度对HY181-2发酵产孢的影响结果图。从图7看出：HY181-2菌丝干重最大是在31℃，该温度下HY181-2菌丝生长最好，但是产孢量最大的温度是28℃，发酵主要为了获得真菌孢子，故选择28℃作为HY181-2发酵温度。
5.5.2.2摇床转速对HY181-2发酵产孢的影响
图9结果表明转速对HY181-2培养过程菌丝干重变化有显著影响。总体上，高转速设置的菌丝干重增长较快。显然，不同转速对HY181-2培养过程产孢量变化也有显著影响。总体趋势为随着摇床转速增加产孢量缓慢上升，转速达到160rpm后孢子量产量进入跃升期，超过200rpm后略有下降。提高摇床转速可增大培养液的湍流程度，降低传质阻力，从而提高氧的传递速率，但过高的震荡速率会产生一定的剪切作用，不利于菌丝积累和孢子生成。
5.5.2.3装液量对HY181-2发酵产孢的影响
通气量与装瓶量成反比，从图10可以看出随着通气量的减小，产孢量逐渐减小，500mL摇瓶装液100mL时产孢量最大，装液200mL HY181-2菌丝生长最好，产孢量比100mL稍差一点，综合来看装液200mL为最佳通气量，说明HY181-2为好氧型菌株。因此，减少装瓶量有助于增加产孢量。
5.5.2.4 pH对HY181-2发酵产孢的影响
随着pH值变化，其产孢量在酸性pH基本一致，pH值小于3时不利于产孢，HY181-2最佳产孢pH值为7。菌丝干重随着pH增加而增长，低于3不适合其生长，pH超过9以后菌丝干重急剧下降，表明HY181-2在碱性环境不能生存，在此可以得出HY181-2适合在中性及偏酸性环境中生长繁殖。见图11。
5.5.2.5接种量对HY181-2发酵产孢的影响
从图12中可以看出随接种量的增加其产孢能力先增加再减小，主要是因为在同一液体培养基下，通气量等条件一致的情况下，接种量越大，孢子浓度越容易先达到最大，即达到饱和。所以在工业化生产中，为了节约动力消耗，可以增加接种量。对HY181-2来说，接种3个菌块能获得最大的发酵孢子量。
5.6 HY181-2在发酵培养基中的生长曲线
根据HY181-2在发酵培养基PDS中每天检测产孢量和菌丝干重的结果制成生长曲线。从图13生长曲线图看出：在生长期内HY181-2的菌丝生长与产孢量呈现较好的正相关性；接种前3天是HY181-2的停滞适应期，菌丝生长缓慢基本没有产孢子；从第4天开始真菌进入对数期，菌丝大量生长，同时产孢量急剧上升，对数期延续到第7天；第8天接近生长平台稳定期，菌丝干重和发酵液含孢量呈相对稳定状态，不再有剧烈变化。在实际生产中可选择发酵8天，既能获得最大的产孢量又能节省发酵时间。
实施例6生防菌的可湿性粉剂配方筛选
6.1材料与方法
6.1.1材料
HY181-2高孢粉由实验室摇瓶发酵过滤离心后冷冻干燥获得，含菌量8-10×108个/ml，孢子萌发率>85％。
6.1.2助剂筛选方法
参照化学农药产品国家标准试验测定各项指标。
HY181-2为真菌采用血细胞计数板统计孢子萌发率及各项测定的指标。
6.1.2.1载体的筛选
HY181-2与载体生物相容性的测定：将各种供试载体与孢子粉按质量比9：1混合均匀，黑暗处放置14d后，取100mg混合物加入50ml的PD营养液中，振荡均匀置于摇床28℃，180rpm振荡培养12h-15h后，显微镜下计数孢子的萌发率。以不加载体的纯高孢粉为对照。每处理设置3个重复。结果见表5。
载体润湿时间的测定：按照中华人民共和国国家标准GB/T 5451-2001《农药可湿性粉剂润湿性测定方法》测定载体的润湿性能。
6.1.2.2润湿剂的筛选
试样的配制：HY181-2试样，高孢粉10％，润湿剂3％，硅藻土87％的比例配制成只有润湿剂种类不同的试样。
按照中华人民共和国国家标准GB/T 5451-2001《农药可湿性粉剂润湿性测定方法》测定样品的润湿性能。具体方法如下：
取标准硬水100mL±1m L，注入250m L烧杯中，将此烧杯置于25℃±1℃的恒温水浴中，使其液面与水浴的水平面平齐。待硬水至25℃±1℃时，称取5g±0.1g的试样(试样应为有代表性的均匀粉末，而且不允许成团、结块)，置于表面皿上，将全部试样从与烧杯口齐平的位置一次性均匀地倾倒在该烧杯的液面上，但不要过分地扰动液面。加试样时立即用秒表记时，直至试样全部润湿为止(留在液面上的细粉膜可忽略不计)。记下润湿时间(精确至秒)。如此重复5次，取其平均值，作为该样品的润湿时间。
生物相容性测定：润湿剂与HY181-2生物相容性测定
将上述HY181-2各样品加入灭菌的土豆煮出液中，使其终浓度为103个孢子/mL。将孢子液在28℃下振荡(180r/min)培养15h，取样稀释用血球计数板计数萌发液中萌发与未萌发的孢子数，计算孢子萌发率。每浓度重复3次，以不加润湿剂的孢子悬液作为对照。结果见表6。
6.1.2.3分散剂的筛选
试样的配制
HY181-2试样 按高孢粉10％，润湿剂PEG8000 3％，分散剂5％，硅藻土82％的比例配制成只有分散剂种类不同的试样。
按照中华人民共和国国家标准GB/T 14825-2006《农药悬浮率测定方法》测定样品的悬浮性能。具体方法如下：
精确称取1.000g样品，置于盛有50mL 30℃±2℃标准硬水的200mL烧杯中，用手摇荡作圆周运动，约每分钟120次，进行2min，将该悬浮液在同一温度的水浴中放置13min；然后用30℃±2℃的标准硬水将其全部洗入250mL的量筒中，加水到250mL刻度，塞上塞子，以量筒底部为轴心，将量筒在1min内上下颠倒30次。打开塞子，再垂直放入无振动的恒温水浴中，避免阳光直射，静置30min。用吸管在10-15s内将内容物的的9/10(即225mL)悬浮液移出，不要摇动或挑起量筒内的沉降物确保吸管的顶端总是在液面下几毫米处。
按规定方法测定试样和留在量筒底部25mL悬浮液中的有效成分质量。
悬浮率w1(％)计算见公式：
Figure BDA0002694278820000151
式中：
m1—配制悬浮液所取试样中有效成分质量，单位为(cfu，个)；
m2—留在量筒底部25mL悬浮液中有效成分质量，单位为(cfu，个)；
10/9—换算系数。
生物相容性测定
分散剂与HY181-2生物相容性测定方法同上。
6.1.2.4稳定剂的筛选
试样的配制：
HY181-2试样：按HY181-2高孢粉10％，润湿剂PEG8000 3％，分散剂茶皂素5％，备选稳定剂1％，硅藻土81％的重量比例配制成只有稳定剂种类不同的试样。
稳定效能的测定：将配制好的可湿性粉剂初样放置于54±1℃，2周后检查HY181-2各样品的孢子萌发率。
生物相容性测定
稳定剂与HY181-2生物相容性测定：将上述HY181-2各样品加入灭菌的土豆煮出液中，使其终浓度为103个孢子/mL。将孢子液在28℃下振荡(180r/min)培养15h，取样稀释用血球计数板计数萌发液中萌发与未萌发的孢子数，计算孢子萌发率。每浓度重复3次，以不加分散剂的孢子悬液作为对照。结果见表7。
6.1.2.5紫外保护剂的筛选
试样的配制：
HY181-2试样：按HY181-2高孢粉10％，润湿剂PEG8000 3％，分散剂茶皂素5％，稳定剂CaCO3 1％，硅藻土81％的比例配制成可湿性粉剂初样。
HY181-2保护效能测定：称样配制成浓度为106个孢子/mL的孢子悬液。然后，将四种供试的紫外保护剂加入孢子悬液中，使各保护剂的终浓度为0.30％。用移液器吸取0.01mL上述孢子液于无菌盖玻片上，涂抹均匀。然后，将各盖玻片置于紫外灯(16w，254nm)下20cm处照射20min后，将玻片平放在培养皿底部，皿中用湿润的滤纸保湿。培养皿在28℃下黑暗培养，以免孢子光复活，24h后，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。以不加紫外保护剂的可湿粉剂孢子悬液作照射和不照射的对照处理，并分别作为残存活孢率和理论活孢率的对照。按下式计算保护效能指数：
Figure BDA0002694278820000161
结果见表8。
6.1.2.6正交试验确定助剂配比
将经过各单因子测定筛选出最合适的润湿剂、分散剂、稳定剂、紫外保护剂，按照正交试验设计要求配成不同比例配方的剂型样品(见表9)，按照国家标准方法分别测定各组样品的润湿时间、悬浮率、热贮稳定性、紫外防护效能等参数，以不加助剂只含有10％孢子粉的粗样作对照。确定生防菌的可湿性粉剂配方比例。结果见表10、表11。
表9 HY181-2可湿性粉剂配方的L9(34)正交设计因素表
Figure BDA0002694278820000162
6.1.3剂型质量检测方法
6.1.3.1有效成分的含量测定
6.1.3.2润湿时间的测定
参见4.1.2.2所示方法。
6.1.3.3悬浮率的测定
参见4.1.2.3所示方法。
6.1.3.4细度的测定
按照中华人民共和国国家标准GB/T 1615-1995《农药可湿性粉剂细度测定方法》测定样品的细度。具体方法如下：
用自来水将烧杯中润湿的试样稀释至约150mL，搅拌均匀，然后全部倒入润湿的标准筛中，用自来水洗涤烧杯，洗涤水也倒入筛中，直至烧杯中粗颗粒完全移至筛中为止。用直径为9-10mm的橡皮管导出的平缓自来水流冲洗筛上试样，水流速度控制在4-5L/min，橡皮管末端出水口保持与筛缘平齐为度。在筛洗过程中，保持水流对准筛上的试样，使其充分洗涤(如试样中有软团块可用玻璃棒轻压，使其分散)，一直洗到通过试验筛的水清亮透明为止。再将试验筛移至盛有自来水的盆中，上下移动洗涤筛缘始终保持在水面之上，重复至2min内无物料过筛为止。弃去过筛物，将筛中残余物，先冲至一角再转移至已恒重的100mL烧杯中。静置，待烧杯中颗粒沉降至底部后，倾去大部分水，加热，将残余物蒸发近干，于100℃(或根据产品的物化性能采用其他适当温度)烘箱中烘至恒重，取出烧杯置于干燥器中冷却至室温，称重。
可湿性粉剂的细度(Y)％按公式计算：
Figure BDA0002694278820000171
式中：n1-可湿性粉剂试样的质量(g)；n2-烧杯中残余物的质量(g)。
6.1.3.5含水率的测定
按照中华人民共和国国家标准GB/T 1600-2001《农药水分测定方法》测定样品的含水率。具体方法如下：
称取0.3g-1.0g(精确至0.01g)的样品，加入到圆底烧瓶中，再加入100mL的甲苯和几支长约10mm的毛细管，在冷凝器管顶部塞入一棉花团，防止空气中水分的冷凝，控制加热回流速度大约2-5滴/秒，一直蒸馏到除刻度管底部而外，玻璃仪器的任何部位，看不到到冷凝水，并且接收器内水的体积固定不变时再保持加热5min后后停止。用甲苯溶液冲洗冷凝器，直至没有水滴落下，冷却后，测定接收器内水的体积。
试样中水的质量分数X(％)按公式计算：
Figure BDA0002694278820000172
式中：V-接收器中水的体积(mL)；m-试样的质量(g)。
6.1.3.6pH测定方法
按照中华人民共和国国家标准GB/T 1601-1993《农药pH值的测定方法》测定样品的pH值。具体方法如下：称1g试样于100mL烧杯中，加入100mL水，剧烈搅拌1min，静置1min，测定上清液的pH。
6.1.3.7加速贮存实验
采用“GB/T 19136/2003农药可湿性粉剂产品标准编写规范”中的加速贮存试验为参考标准：配制一定量生防菌可湿性粉剂完全配方样品。样品装入玻璃瓶中密封置于54±2℃的恒温箱中，贮存14d后取出，放入干燥器中，使试样冷至室温。于24h内完成对有效成分含量等规定项目的检验。即测定HY181-2孢子萌发率。
6.1.3.8制剂稳定性的测定
冷贮稳定性：在(4±2)℃条件下贮存14d后测定孢子萌发率。
室温贮藏稳定性：在25℃条件下贮存14d后测定孢子萌发率。
热贮稳定性：进行热贮(54±2)℃，14d后测定孢子萌发率。
6.2结果与分析
6.2.1可湿性粉剂助剂筛选
6.2.1.1载体的筛选
表5 HY181-2剂型载体的筛选表
载体 载体比例 萌发率 润湿时间(s)
高岭土 10％ 65.7％ 27
硅藻土 10％ 86.1％ 17
滑石粉 10％ 76.9％ 15
轻质碳酸钙 10％ 71.4％ 38
空白对照 0 70.2％ 58
表5结果说明HY181-2的孢子如果不加任何载体即对照组中放置一定时间后孢子萌发率下降较多，跟各种载体混合后萌发率受到较大影响，其中高岭土能对HY181-2孢子造成较大的伤害，明显影响HY181-2孢子萌发；而硅藻土和滑石粉能有一定程度的保持或提高HY181-2孢子的萌发率，说明硅藻土与HY181-2的孢子能很好的相处，硅藻土的生理生化性质不会对HY181-2孢子造成伤害，是合适的剂型载体。
6.2.1.2润湿剂、分散剂的筛选
润湿剂、分散剂是农药常见剂型配方中必需的辅助成分，多数植物表层的角膜含有腊质，决定了低能的表面张力。而多数农药一般以水做溶剂，而水的表面张力较大，通常情况下与植物表面接触并不容易润湿。因此，必需选择合适的润湿剂降低其表面张力，增加润湿性和靶标的接触能力，提高药效。
生物农药颗粒悬浮于水中形成的分散体系属于热力学不稳定体系，由于其比表面积较大，颗粒会通过自动聚集而降低其表面自由能，形成热力学稳定体系。因此需要借助分散剂保持颗粒分散悬浮于水中，防治颗粒的聚集，保持较长时间的分散。分散剂通过在油/界面或颗粒与水界面之间形成电荷或空间位阻发挥分散悬浮作用。本发明的发明人进行了不同润湿剂和分散剂的润湿时间，悬浮效能，不同助剂对生防菌剂型的影响实验，结果见表6。
对HY181-2，根据表6知道，Morwet D-500对HY181-2润湿时间最短为20s，其次为PEG8000，虽然Morwet D-500的悬浮率略高于PEG8000但是PEG8000也HY181-2生物相容性远好于Morwet D-500，综合考虑选择PEG8000是最佳润湿剂。对HY181-2孢子悬浮率最好的是木质素磺酸钠高达84.5％，其次是茶皂素76.1％。木质素磺酸钠润湿时间也短生物相容性好，但是在试验中发现木质素磺酸钠与HY181-2加入水中不能分散悬浮，样品沉降在水底，不适合做剂型助剂。综合比较下茶皂素对HY181-2各项指标均衡，润湿时间短，孢子悬浮率高于70％生物相容性也较高，可以用作剂型助剂。
表6 HY181-2助剂润湿时间及悬浮率表
Figure BDA0002694278820000181
Figure BDA0002694278820000191
6.2.1.3稳定剂的筛选
表7 HY181-2的稳定剂筛选结果表
Figure BDA0002694278820000192
稳定剂筛选结果见表7，从表中得知四种稳定剂对HY181-2的孢子萌发率影响都很小，经过一段时间的热贮后CaCO3的损失率最小，而且在剂型载体筛选过程中发现CaCO3能促进HY181-2孢子的生长，相同条件下加有CaCO3的孢子萌发率更高，萌发生长的菌丝远长于其他载体及稳定剂。故选择CaCO3作为A65剂型的稳定剂。
6.2.1.4紫外保护剂的筛选
在16W 254nm的紫外灯下20cm处测定生防菌的紫外保护剂保护效能，从结果表8知，各种不同的紫外保护剂的生物相容性均较好，但是各自防护效果不同，换算出防护效能可知抗坏血酸对HY181-2具有最佳的防护效能，最低的损失率。故选择抗坏血酸作为HY181-2剂型的紫外保护剂。
表8 HY181-2紫外保护剂筛选结果表
Figure BDA0002694278820000193
6.2.1.5正交试验确定可湿性粉剂的配方
完成单因素的筛选之后，可以确定PEG8000是HY181-2可湿性粉剂的最适合的润湿剂，茶皂素是最适合的分散剂，CaCO3是最合适的稳定剂，抗坏血酸是最好的紫外线保护剂。再选用这些最佳助剂进行正交试验确定可湿性粉剂的最佳配方。
表10 HY181-2剂型配方正交试验安排及结果表
Figure BDA0002694278820000194
Figure BDA0002694278820000201
表11 HY181-2剂型配方正交试验的极差分析结果表
Figure BDA0002694278820000202
直观分析表10、11，要考察的主要指标为润湿时间和悬浮率。各因子对润湿时间的影响程度大小为：A>C>B＝D，最佳配方组合A2B12C2D23；对悬浮率的影响程度大小B>A>C>D，A1B2C2D3；对热贮存活率的影响大小C>B>D>A，A1B1C3D1；对紫外防护效能的影响大小D>C>B>A，A3B1C3D3。对因子A(PEG8000)，在四个最优水平组合中俩组最优水平是A1，故选择A1；对因子B(茶皂素)在四个最优水平组合中两组最主要指标因素都是选取B2，故选择B2；对因子C(CaCO3)，在四个最优水平组合中主要指标因素润湿时间和悬浮率中都是C2，故选择C2；对因子D(抗坏血酸)，在四个最优水平组合中，三个指标因素选优都是D3水平，故选择D3。综合考虑为：A1B2C2D3，也即10％HY181-2高孢粉，1％PEG8000，5％茶皂素，1％CaCO3，0.5％抗坏血酸，硅藻土补足100％。
6.2.2生防菌可湿性粉剂质量检测结果
按照各项国家标准对实验优化获得的生防菌可湿性粉剂进行质量检测，其中润湿性能按照中华人民共和国国家标准GB/T 5451-2001《农药可湿性粉剂润湿性测定方法》测定，悬浮性能按照国家标准GB/T 14825-2006《农药悬浮率测定方法》测定，细度采用国家标准GB/T 1615-1995《农药可湿性粉剂细度测定方法》测定，含水率按照国家标准GB/T 1600-2001《农药水分测定方法》测定，pH值按照国家标准GB/T 1601-1993《农药pH值的测定方法》测定，加速贮存试验参考GB/T 19136/2003农药可湿性粉剂产品标准编写规范”。结果如表12所示，检测结果表明生防菌HY181-2可湿性粉剂各项指标均符合国家标准。
表12生防菌HY181-2可湿性粉剂质量检测结果表
检测项目 实测值 国家指定值
润湿时间(s) 13 ≦180
悬浮率(％) 86.56 ≦70
细度(％) 96 95
含水率 2.98 4
pH值 6.77 5-7
热贮分解率(％) 14.84 30
有效成分含量(CFU/g) 1.02×10<sup>9</sup> 无
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0002694278820000221
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省亚热带植物研究所
<120> 一种草酸青霉HY181-2、制备方法及其用途
<130> YRDZ-20001-CNI
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 550
<212> DNA
<213> Penicillium axalicum HY181-2
<400> 1
attaccgagt gagggccctc tgggtccaac ctcccacccg tgtttatcgt accttgttgc 60
ttcggcgggc ccgcctcacg gccgccgggg ggcatccgcc cccgggcccg cgcccgccga 120
agacacacaa acgaactctt gtctgaagat tgcagtctga gtacttgact aaatcagtta 180
aaactttcaa caacggatct cttggttccg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240
aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc 300
ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag cgtcattgct gccctcaagc acggcttgtg 360
tgttgggctc tcgccccccg cttccggggg gcgggcccga aaggcagcgg cggcaccgcg 420
tccggtcctc gagcgtatgg ggcttcgtca cccgctctgt aggcccggcc ggcgcccgcc 480
ggcgaacacc atcaatctta accaggttga cctcggatca ggtagggata cccgctgaac 540
ttaagcatat 550

Claims (8)

1.一株具有防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的草酸青霉Penicillium oxalicumHY181-2，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61142。
2.一种权利要求1所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2的分离方法，其特征在于，将福建东山珊瑚自然保护区的珊瑚样本在无菌超净台内敲碎，再将敲碎的珊瑚样本混匀后分别倒入PDA培养基摇床培养，取出摇瓶，将培养液做平板稀释涂布法，将涂好的平板放入28℃恒温箱避光培养，涂板的第三天筛选到一株丝状真菌，该菌株周边的其他菌株的生长较为困难，被影响的菌落呈现出一定的抑菌效果，随即用PDA培养皿对该丝状真菌进行多次纯化分离，将其命名为HY181-2；
优选的，摇床培养的条件为160转/分钟，28℃培养2-3天。
3.一种权利要求1所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2的发酵培养方法，其特征在于，将菌株HY181-2在培养基平板上划线后25-31℃培养，然后用打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取菌块接种，每个500ml的瓶接种1-5块菌块；每个500ml的瓶装有100-200ml培养基，置于25-31℃摇床160-200rpm振荡培养4-13天；
优选的，将菌株HY181-2在PDA平板上划线厚25-31℃培养，培养5-7天后用打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取菌块接种，每个500ml的瓶接种1-5块菌块；每个500ml的瓶装有100-200ml PDS培养基，置于25-31℃摇床160-200rpm振荡培养4-13天；
更优选的，菌株HY181-2在PDA平板上划线，培养温度28℃，培养5-7d后用孔径6mm打孔器在平板选取菌丝生长均匀处打孔，取1菌块接种PDS培养基，每500ml瓶装液200ml接种3块菌块，置于28℃摇床160rpm振荡培养8天。
4.权利要求1所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2用于防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，将权利要求1所述草酸青霉Penicilliumoxalicum HY181-2发酵得到发酵液，再从发酵液中获得萃取物，将萃取物用二甲基亚砜稀释后直接喷施于患有金线莲茎腐病和/或炭疽病的金线莲叶片上或颈部即可。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述从发酵液中获得萃取物的步骤为，加入与发酵液等体积的乙酸乙酯到发酵液中，充分振荡后静置；待完全分层后，取有机相溶液通过EYELA的旋转蒸发仪去除多余的乙酸乙酯，旋蒸瓶内所得的即为菌株HY181-2发酵液萃取物；
优选的，对发酵液进行3-5次重复萃取。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，用于制备防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的药物的用途。
8.一种防治金线莲茎腐病和/或炭疽病的药物制剂，其特征在于，包括10％HY181-2高孢粉，1％PEG8000，5％茶皂素，1％CaCO3，0.5％抗坏血酸，硅藻土补足100％；其中HY181-2高孢粉为将权利要求1所述草酸青霉Penicillium oxalicum HY181-2发酵过滤离心后冷冻干燥所获得的的物质，其含菌量8-10×108个/ml，孢子萌发率>85％。
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