CN103205372B - 一种蜂房芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜂房芽孢杆菌，分类命名为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei），株号为ZJUB2011-1，保藏号为CCTCC M2012448。本发明还公开了一种含有所述蜂房芽孢杆菌的菌剂。本发明还公开了所述蜂房芽孢杆菌在拮抗尖孢镰刀菌以及防治西红花球茎腐烂病上的应用。与现有技术相比，本发明的蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1可高效抑制尖孢镰刀菌的生长，可用于防治由尖孢镰刀菌侵染引起的西红花球茎腐烂病等植物病害，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，尤其涉及一种蜂房芽孢杆菌及其应用。
背景技术
西红花（藏红花）作为一种名贵的药材能给种植户带来非常可观的经济效益，目前西红花已成为全国不少县（市）的农业支柱产业之一，然而近年西红花种球腐烂病的频发给这一产业带来了不容忽视的损失。西红花球茎被害后叶发黄、变褐色、萎蔫枯死，球茎发黑腐烂留下空壳。据调查和统计，浙江省一般年份西红花球茎发生腐烂的比例为5%左右，严重年份部分种植户西红花球茎腐烂达40%以上，甚至全部腐烂。
对罹病球茎的致病菌进行分离鉴定结果表明，西红花球茎腐烂病是由一种尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和一种炭疽菌（Anthracnose sp.）的交互侵染导致的。西红花球茎腐烂病前期主要是尖孢镰刀菌侵染导致，而后炭疽菌侵染，加重病情。
西红花球茎腐烂病严重影响球茎和西红花的品质，目前防治这种病害的主要手段是使用化学杀菌剂。然而由于长期大量使用农药造成抗药性增强、自然生态环境污染及农药残留的问题越来越突出，寻求作物病害防治的新途径一直是人们努力的目标。
利用生物防治手段防治作物病害能有效地避免上述缺点，因而具有广阔的发展前途。其中拮抗细菌作为一类重要的生物防治制剂，在植物病害的综合防治中占有重要的一席之地。
细菌在生物防治应用中的主要优势在于：（1）细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；（2）细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；（3）具有惊人的繁殖速度；（4）许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；（5）细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；（6）有些细菌不仅能防治病害而且具有促生作用，可以增加作物产量。
多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的模式种，类芽孢杆菌属是芽孢杆菌属分类上的新发展，1993年由Ash等将11个种从芽孢杆菌中分出来。同其他种类的用于植物病害生物防治的芽孢杆菌相似，类芽孢杆菌也能产生多种抗菌物质并产生芽孢，具有很强的繁殖能力，对一些植物病原菌有明显的抑制作用，因此能够进一步开发出生物农药。
发明内容
本发明公开了一种蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1，该菌能高效拮抗尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），可用于防治由尖孢镰刀菌侵染引起的西红花球茎腐烂病等植物病害。
一种蜂房芽孢杆菌，分类命名为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei），株号为ZJUB2011-1，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期为2012年11月6日，保藏号为CCTCCM2012448。
该菌株为革兰氏阳性兼性厌氧菌。在营养琼脂平板上生长时，无可溶性色素，菌落圆形、白色、扁平、表面光滑、湿润、边缘整齐；在液体培养基中静置培养时，菌液浑浊，有沉淀物，并常在菌液表面形成一层菌膜。该菌株的生长温度为15～45℃，最适生长温度为30～35℃；最适生长pH为7左右。
对蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1的显微形态进行观察发现，该菌株的菌体为杆状，大小为0.6～0.8μm×2.2～4.5μm，无荚膜。芽孢为椭圆形，位于菌体中央或亚顶端，芽孢大小为0.7～0.9μm×1.8～2.2μm。
所述蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1分离自西红花表皮，提取所述蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1的DNA，进行PCR扩增获得其16S rDNA序列，该16S rDNA序列如SEQ No.1所示。
本发明还提供了一种包含所述蜂房芽孢杆菌的菌剂。该菌剂通过将蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1与适宜的载体混合而成。所述蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1的浓度优选为107～108cfu/mL。
本发明还提供了所述蜂房芽孢杆菌在拮抗尖孢镰刀菌中的应用。本发明的蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1对尖孢镰刀菌具有较显著的抑制作用，在一个具体实施方式中，抑制率为73%，高于阳性对照枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）生防菌1。
本发明还提供了所述蜂房芽孢杆菌在防治西红花球茎腐烂病中的应用，利用蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1对尖孢镰刀菌的抑制作用，可将蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1应用于防治由尖孢镰刀菌侵染引起的西红花球茎腐烂病等植物病害。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1可高效抑制尖孢镰刀菌的生长，可用于防治由尖孢镰刀菌侵染引起的西红花球茎腐烂病等植物病害，应用前景广阔。
附图说明
图1为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1的革兰氏染色结果图；
图2为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1营养体的透射电镜观察图；
图3为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1在营养琼脂平板上的生长状态图；
图4为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1在液体培养基内的生长状态图；
图5为生防菌对尖孢镰刀菌的离体拮抗作用图；其中，1、2、3号为蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1，4号为枯草芽孢杆菌1，5为不接生防菌的阴性对照。
具体实施方式
一、病原真菌分离纯化
从浙江省建德市三都镇和村黄泥山实地采集了室内培植阶段的西红花健康种球和患西红花球茎腐烂病的发病种球。依据Koch法则，采用组织表面分离法，从西红花种球腐烂部位分离纯化得到该病的病原真菌——尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
二、拮抗细菌筛选
切取5g西红花表皮放入45mL无菌水中震荡20min，然后从中吸取1mL放至盛有9mL无菌水带塞试管中充分振荡，制成10-1稀释液；以此类推，制成为10-2、10-310-4、10-5、10-6的稀释；分别取0.1mL10-4、10-5、10-6浓度的稀释液涂板（NA培养基），于30℃条件下培养48h；然后挑取培养特征各异的单菌落进行划线培养直至得到纯培养，备用。
以步骤1中从西红花发病种球上分离得到的尖孢镰刀菌为指示菌，采用平板对峙法，从获得的纯培养中筛选对尖孢镰刀菌具有抑制作用的菌株。
挑取纯化后生长旺盛的尖孢镰刀菌菌丝块（直径约7mm）置于PDA平板中央，将分离到的纯培养菌株点接在平板边缘距中心25mm处，每个培养皿接4点，28℃培养3d，获得一株对尖孢镰刀菌具有抑制效果的菌株。
三、生防菌株鉴定
对步骤2中分离得到的西红花种球腐烂病生防细菌的形态及生物学特征进行鉴定。
如图1所示，该菌株为革兰氏阳性兼性厌氧菌；电镜显微形态观察发现，该菌株的菌体为短杆状，大小为0.6～0.8μm×2.2～4.5μm（图2），无荚膜。芽孢为椭圆形，位于菌体中央或亚顶端，芽孢大小为0.7～0.9μm×1.8～2.2μm。
该菌株在营养琼脂平板上生长时，菌落圆形、白色、扁平、表面光滑、湿润、边缘整齐（图3）；在液体培养基中静置培养时，菌液浑浊，有沉淀物，并常在菌液表面形成一层菌膜（图4）。该菌株的生长温度为15～45℃，最适生长温度为30～35℃；最适生长pH为7.0左右。
提取该菌株基因组DNA；以基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得16S rDNA序列，并在NCBI上的Genbank进行序列比对，结合上述观察得到的生理生化特征，将该菌株鉴定为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillusalvei），编号为蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1。
四、生防菌离体抑菌活性测定
用打孔直径为7mm的打孔器打取生长旺盛的尖孢镰刀菌菌饼，转接于PDA平板中央，在与其相距2cm的四个角上分别点接筛选所得的蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1，将培养皿置于28℃恒温箱中培养6d，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生防菌1为阳性对照菌，未接拮抗菌为阴性对照，每个处理重复3次。抑制结果如图5所示。
采用DPS软件对各组结果进行统计分析。分析结果显示，蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1对尖孢镰刀菌具有较显著的抑制能力，抑制率达到73.00%，高于阳性对照菌。实验结果如下表1所示。
表1.蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1离体抑菌效果
| 处理 | 菌落直径（mm） | 抑制率(%) |
| 蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1 | 27.2±0.93c | 73.00 |
| 芽孢杆菌1 | 32.3±1.16b | 66.18 |
| 未接拮抗菌 | 81.7±0.89a | 0 |
注：1.表中数字右上角字母表示邓肯氏多重差异分析结果，同列不同字母表示差异显著（P<0.05）；
2.抑制率(%)=100×（阴性对照菌落直径—处理菌落直径）/（阴性对照菌落直径—7mm）。
五、生防菌活体防病效果测定
将蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1制成浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，选取无病虫危害、无伤口、成熟度和大小一致的西红花种球浸入菌悬液中，浸泡时间为30min，间隔时间12h后在西红花种球上接种尖孢镰刀菌。
同时设置对照组，对照组包含三个对照：以常规农药50%多菌灵可湿性粉剂的300倍稀释液浸种后接种尖孢镰刀菌为阳性对照1（化学农药）；以浓度为1×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生防菌1悬液浸种后接种尖孢镰刀菌为阳性对照2（生物农药）；以无菌水浸种后接种尖孢镰刀菌为空白对照。置28℃的培养箱内培养，10d后调查发病情况。每个处理设置3个重复，取平均值。结果如表2所示。
表2.各处理液对西红花球茎腐烂病的活体防治效果
| 处理 | 病情指数 | 防治效果（%） |
| 蜂房芽孢杆菌ZJUB2011-1 | 40.00a | 57.14 |
| 50%多菌灵 | 43.33ab | 53.57 |
| 芽孢杆菌1 | 45.33ab | 51.43 |
| 无菌水 | 93.33c | 0 |
西红花球茎腐烂病的病情分级标准为：
（1）0级:：无症状；
（2）1级：球茎腐烂面积占整个球茎的0～1/5；
（3）2级：球茎腐烂面积占整个球茎的1/5～2/5；
（4）3级：球茎腐烂面积占整个球茎的2/5～3/5；
（5）4级：球茎腐烂面积占整个球茎的3/5～4/5；
（6）5级：球茎完全腐烂。
病情指数=（∑各级病片数×病情级别值）/（调查总片数×最高级别值）×100；
防治效果（%）=（阴性对照病情指数—处理病情指数）/阴性对照病情指数×100%。
综上所述，本发明的蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1对引起西红花种球腐烂的尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用，且在活体防病试验中，其菌悬液对西红花种球腐烂病有较好的防治效果，具有较好的生产应用前景。
Claims (5)
1.一种蜂房芽孢杆菌，其特征在于，命名为蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）ZJUB2011-1，保藏号为CCTCC NO：M2012448。
2.一种包含权利要求1所述蜂房芽孢杆菌的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，蜂房芽孢杆菌的浓度为107～108cfu/mL。
4.如权利要求1所述的蜂房芽孢杆菌在拮抗尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）中的应用。
5.如权利要求1所述的蜂房芽孢杆菌在防治西红花球茎腐烂病中的应用。
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| CN108179125A (zh) * | 2018-01-26 | 2018-06-19 | 中国科学院南京土壤研究所 | 赤杆菌h7及其应用 |
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