CN112089712B - 一种组合物及其在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途 - Google Patents

一种组合物及其在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组合物及其在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途。所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸1.0～6.0份，桃叶珊瑚苷1.0～3.0份，京尼平苷酸0.5～1.5份。实验结果表明，该组合物能够阻断猪瘟病毒的吸附与穿入，有效预防猪瘟病毒感染，并能抑制猪瘟病毒复制，杀伤猪瘟病毒，达到治疗猪瘟的作用；该组合物还能够有效治疗猪流行性腹泻，有效够抑制猪大肠杆菌。同时，本发明组合物还有效解决了传统抗病毒药物和抗生素治疗存在的副作用大、残留严重的问题。因此，本发明的组合物在制备抗猪瘟病毒、抑制猪大肠杆菌的药物，以及预防和/或治疗猪瘟、猪流行性腹泻和猪水肿病等猪病的药物中具有很好的应用前景。

Description

一种组合物及其在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种组合物及其在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途。
背景技术
现代大规模畜牧业饲养方式，提高了生产速度的同时，也带来了许多问题，畜产品品质降低和畜禽容易发生各种疾病。常见猪病主要包括仔猪白痢、仔猪黄痢、仔猪红痢、猪水肿病、猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪蓝耳病、猪细小病毒病、猪囊虫病、猪流感、猪蛔虫病、仔猪白肌病、仔猪营养性贫血、猪亚硝酸盐中毒、猪食盐中毒等。
猪瘟是一种黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种高传染性疾病，病猪是猪瘟的主要传染源，主要经消化道传播，也可呼吸道传染，猪瘟以高热、内脏器官眼中出血和高死亡率为特征。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种高度接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水，多发生在冬季；不同年龄、品种和性别的猪都易感，哺乳猪和架子猪及肥育猪的发病率通常为100％，母猪为10～90％。猪水肿病由病原性大肠杆菌产生的毒素引起的疾病；其主要发生于断奶后肥胖的体格强壮的仔猪，常突然发生，头部水肿，共济失调，迅速死亡，致死率高，在硒缺乏地区易发生该病。
目前，这些猪病主要是通过抗病毒药物和抗生素进行预防和治疗，在促进动物生长和提高生长性能方面曾经起到了重要作用。但随着抗病毒药物和抗生素的滥用，导致猪中的药物残留严重超标，给大众健康和环境带来了严重隐患。另外美国、欧盟和日本等进口国对药检要求不断升级，造成我国畜禽和肉食品出口严重受阻。
因此，从人类健康和出口需要等需求出发，研制出一种安全性高的兽药具有重要的意义。
绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸广泛存在于各种药用植物，如金银花和杜仲叶等，目前，已与相关技术对杜仲叶中的药用价值成分进行提取，专利CN104546992A提供了一种杜仲叶提取物，其中绿原酸含量不低于9％，京尼平苷酸不低于1％，桃叶珊瑚苷不低于1％。该杜仲叶提取物为中药提取物，副作用小，可长期使用，对机体不产生毒副作用，安全有效，提高患者的生活质量，对银屑病有显著的疗效。专利CN111281921A提供了一种治疗感冒、肺炎、肠炎、肾炎的肺形草银翘解毒消炎组合物，该组合物中包含绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，且该组合物具有治疗感冒、肺炎、肠炎、肾炎病症的用途。但是，现有技术没有给出以绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸三个化合物为活性成分组成的组合物具有预防和/或治疗猪病(例如猪瘟、猪流行性腹泻、猪水肿病等)的启示。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全无毒的组合物，及其在制备抗猪瘟病毒、抑制猪大肠杆菌的药物，以及预防和/或治疗猪瘟、猪流行性腹泻和猪水肿病等猪病的药物中的用途。
本发明提供了一种组合物，所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸1.0～6.0份，桃叶珊瑚苷1.0～3.0份，京尼平苷酸0.5～1.5份。
进一步地，所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸1.3～2.5份，桃叶珊瑚苷1.0～1.5份，京尼平苷酸1.0份。
进一步地，所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸2.0～2.5份，桃叶珊瑚苷1.0～1.5份，京尼平苷酸1.0份。
进一步地，所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸2.5份，桃叶珊瑚苷1.5份，京尼平苷酸1.0份。
本发明还提供了一种药物，它是以上述组合物为活性成分，加上药学领域可接受的辅料制得的制剂。
进一步地，所述制剂为注射剂或固体制剂；
优选的，所述制剂为注射剂，所述辅料包括支架剂和抗氧化剂中的一种或两种。
本发明还提供了上述组合物在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途。
进一步地，所述猪病为猪瘟、猪流行性腹泻或猪水肿病。
本发明还提供了上述组合物在制备抗猪瘟病毒的药物中的用途；优选的，所述药物能够阻断猪瘟病毒对细胞的吸附与穿入，和/或抑制猪瘟病毒增殖，和/或杀伤猪瘟病毒。
本发明还提供了上述组合物在制备抑制大肠杆菌的药物中的用途；优选的，所述大肠杆菌为猪大肠杆菌。
实验结果表明，本发明提供的由特定比例的绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸组成的组合物能够阻断猪瘟病毒的吸附与穿入，有效预防猪瘟病毒感染，并能同时抑制猪瘟病毒复制，杀伤猪瘟病毒，达到治疗猪瘟的作用；该组合物还能够有效治疗猪流行性腹泻；该组合物还能够有效抑制猪大肠杆菌，抑制效果取得了协同增效的作用，为猪水肿病的治疗及预防提供一种新的选择。同时，本发明组合物还有效解决了传统抗病毒药物和抗生素治疗存在的副作用大、残留严重的问题。因此，本发明的组合物在制备抗猪瘟病毒、抑制猪大肠杆菌的药物，以及预防和/或治疗猪瘟、猪流行性腹泻和猪水肿病等猪病的药物中具有很好的应用前景。
本发明的组合物原料易得，制备方法简单，适合工业化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1、正常的IBRS-2细胞的照片。
图2、猪瘟病毒感染后的IBRS-2细胞的照片。
图3、猪瘟病毒感染的IBRS-2细胞在受试药物6干预后的照片。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明组合物的制备
1、组合物一
处方：绿原酸400g、桃叶珊瑚苷300g、京尼平苷酸300g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
2、组合物二
处方：绿原酸400g、桃叶珊瑚苷400g、京尼平苷酸200g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
3、组合物三
处方：绿原酸500g、桃叶珊瑚苷250g、京尼平苷酸250g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
4、组合物四
处方：绿原酸500g、桃叶珊瑚苷300g、京尼平苷酸200g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
5、组合物五
处方：绿原酸500g、桃叶珊瑚苷350g、京尼平苷酸150g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
6、组合物六
处方：绿原酸600g、桃叶珊瑚苷200g、京尼平苷酸200g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
7、组合物七
处方：绿原酸600g、桃叶珊瑚苷300g、京尼平苷酸100g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
实施例2本发明组合物的注射制剂制备
1.注射制剂一
处方：绿原酸400g、桃叶珊瑚苷300g、京尼平苷酸300g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
2.注射制剂二
处方：绿原酸400g、桃叶珊瑚苷400g、京尼平苷酸200g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
3.注射制剂三
处方：绿原酸500g、桃叶珊瑚苷250g、京尼平苷酸250g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
4.注射制剂四
处方：绿原酸500g、桃叶珊瑚苷300g、京尼平苷酸200g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
5.注射制剂五
处方：绿原酸500g、桃叶珊瑚苷350g、京尼平苷酸150g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
处方：制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
6.注射制剂六
处方：绿原酸600g、桃叶珊瑚苷200g、京尼平苷酸200g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
7.注射制剂七
处方：绿原酸600g、桃叶珊瑚苷300g、京尼平苷酸100g、支架剂2667g、抗氧化剂67g。
制备方法：按照处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、支架剂、抗氧化剂，溶解于注射用水中，过滤除菌，冷冻干燥，得冻干粉针剂。
上述支架剂为甘露醇、乳糖或葡萄糖；抗氧化剂为亚硫酸氢钠、维生素C、谷胱甘肽或叶酸。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1本发明组合物的体外抗猪瘟病毒试验
1.试验材料
受试药物：
受试药物1：绿原酸；
受试药物2：桃叶珊瑚苷；
受试药物3：京尼平苷酸；
受试药物4：绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量比＝40:30:30的组合物；
受试药物5：绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量比＝50:25:25的组合物；
受试药物6：绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量比＝50:30:20的组合物。
由本公司按上述重量比例配置各受试药物；
猪瘟病毒株：CSFV Shimen株，购自中国兽药监察所。
细胞：猪肾传代细胞(IBRS-2)购自中国典型物保藏中心。
细胞营养液：用Dulbeeco’s Minimal essential medium(MEM，GIBCO BRL)配制，含10％的小牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。
细胞维持液：含2％小牛血清的Dulbecco’s MEM，其余同营养液。
2.试验方案
2.1IBRS-2细胞的培养
冻存的IBRS-2细胞首先要经过复苏，复苏方法是从液氮罐中取出冷冻管后迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1min内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。在1000rpm速度下离心5～10min，弃去上层液，加入适量细胞营养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×106/mL，置CO2培养箱37℃，5％CO2静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。培养瓶底部均匀长满单层IBRS-2细胞时即可传代。IBRS-2细胞在培养瓶底部长成均匀单层后，更换细胞维持液继续培养，在一周内细胞状态良好。
2.2CSFV Shimen病毒毒力测定
将CSFV Shimen病毒株悬液用细胞维持液逐步做10倍稀释，共得到10-1～10-7共8个稀释度，加入已接种单层IBRS-2细胞的96孔板中，每个病毒稀释度接种4孔，每孔200μl，37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，弃病毒液，用PBS液洗板两次，最后一次控干并加入200μl维持液，同时设正常细胞对照组，倒置显微镜下每天观察细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)。按Reed-Muench法计算组织培养半数感染TCID50(Tissue culture infectious dose50)。抗病毒实验时用100TCID50的病毒量用于细胞实验。
2.3本发明药物对IBRS-2细胞毒性的测定
将各受试药物用纯化水稀释成10mg/ml的初始浓度，用细胞维持液将受试药物作2-1～2-9倍比稀释，加入已接种单层IBRS-2细胞(浓度为1×105个/ml的细胞悬液100μ1)的96孔板中，同时设立正常细胞对照。将细胞培养板置37℃，5％CO2培养箱中培养四天，每天2次用倒置显微镜观察细胞生长情况。最终以能维持细胞正常生长的最高稀释浓度作为该药物对细胞的安全浓度。并按Reed—Muench法计算50％毒性浓度TD50(Toxic dose 50)和最大无毒浓度TD0(Toxic dose 0)，并以TD0作为细胞实验时的药物起始浓度。
2.4本发明药物体外对猪瘟病毒的影响
药物浓度的设置：将各受试药物组从TD0开始十倍稀释各3个浓度。每一浓度4孔，每孔50μl。同时设正常对照组，病毒对照组，正常对照组只加维持液，病毒对照组只加100TCID50的病毒液，每孔50μl。待96孔细胞培养板中的IBRS-2细胞基本长成单层时，根据药物、病毒、细胞作用的三种不同方式，实验分三组：
2.4.1药物对病毒的治疗作用(治疗给药方式)
即细胞先感染病毒后加药物，研究药物对细胞内病毒复制的抑制作用。
取已长成单层细胞的细胞培养板，倒掉培养液，每孔分别接种100TCID50的病毒液50μl，置37℃，5％CO2培养箱中吸附lh感染细胞，弃去病毒液，用PBS液洗板两次，控干。然后分别加入安全浓度的药物及维持液作2倍稀释的相应稀释度的药液50μl/孔，每一浓度加4孔。于37℃，5％CO2培养箱中培养。将板中的培养液弃去，用PBS液洗板两次，控干，加入维持液每孔100μl，观察细胞病变。每12h观察细胞生长情况，同时设置病毒对照组及正常对照组。待细胞对照组细胞生长正常，病毒对照组CPE达到++++时记录实验结果。
2.4.2药物与病毒的直接作用(直接作用给药方式)：
即药物与病毒先作用一段时间再感染细胞，研究药物对病毒的直接杀伤作用。
将100TCID50的病毒液50μl分别与等量不同浓度的本发明药物混合，并于室温下作用lh，然后接种于长满单层细胞的细胞培养板中，每个浓度4个孔，于37℃，5％CO2培养。每12h观察细胞生长情况，同时设置病毒对照组及正常对照组。待细胞对照组细胞生长正常，病毒对照组CPE达到++++时记录实验结果。
2.4.3药物对病毒的预防作用(预防给药方式)
即细胞先与药物作用一段时间后再感染病毒，研究药物对病毒吸附细胞的阻断作用。
将各浓度本发明药物加入已长满单层细胞的细胞培养板中，每孔50μl，于37℃，5％CO2中培养。将板中的培养液弃去，用PBS液洗板两次，控干，用维持液稀释浓度为100TCID50的病毒液50μl，加入已接种药物的细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中吸附1h感染细胞，弃病毒液，用PBS液洗板两次，控干。加入维持液，每孔100μl，观察细胞病变。每12h观察细胞生长情况，同时设置病毒对照组及正常对照组。待细胞对照组细胞生长正常，病毒对照组CPE达到++++时记录实验结果。
2.5观察指标
2.5.1细胞病变效应(CPE)的观察标准
细胞病变：倒置生物显微镜观察细胞形态，分为以下五级。
“-”：细胞呈多边形，分布均匀，细胞间排列紧密；
“+”：细胞收缩、变圆，病变细胞约小于细胞总数的25％；
“++”：细胞收缩、变圆，有聚集倾向，病变细胞数25％～50％；
“+++”：大量细胞聚集成团，病变细胞数小于总数的50％～75％；
“++++”：细胞成片聚集，病变细胞数超过细胞总数的75％。
2.5.2MTT法
将上述培养的细胞板，小心弃去培养液，用PBS冲洗3遍，每孔加入含0.5％MTT的培养液，37℃、5％CO2培养箱中继续培养4h后，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl的DMSO，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪测定每个孔的D492nm值，使用SPSS18.0对数值进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。D492nm值指待测样本在492nm波长下有最大吸光度值，DMSO能溶解细胞中的甲瓒，通过测定的吸光度值可间接反映活细胞数量。
2.6TCID50和TD0测试结果
2.6.1CSFV Shimen病毒毒力测定的测定
随着病毒稀释度的增加，病毒量的减少，由病毒引起的细胞病变逐渐减轻，病变孔数减少。按Reed—Muench法计算半数感染量TCID50，CSFV Shimen株的TCID50＝10-5.5/0.2ml。
2.6.2本发明药物对IBRS-2细胞的毒性实验
实验结果显示，药物浓度不同，对细胞的影响也不同，质量浓度越大，对细胞的毒性也越大。当受试药物1的质量浓度>5mg/ml，受试药物2的质量浓度>2.5mg/ml，受试药物3的质量浓度>2.5mg/ml，受试药物4的质量浓度>2.5mg/ml，受试药物5的质量浓度>5mg/ml，受试药物6的质量浓度>5mg/ml时，与单层IBRS-2细胞接触2h后，即可引起细胞成片脱落；当其各质量浓度降至：受试药物1：2-4×10mg/ml，受试药物2：2-4×10mg/ml，受试药物3：2-4×10mg/ml，受试药物4：2-3×10mg/ml，受试药物5：2-3×10mg/ml，受试药物6：2-3×10mg/ml时，未发现IBRS-2细胞的生长有异常表现，与不加药物的对照组细胞生长一致。因此，该浓度可定为各药物组对IBRS-2细胞的安全浓度，即最大无毒浓度TD0。
计算后的各受试药物的TD50和TD0(见表1)。以不引起病变的药物浓度TD0作为抗病毒的起始药物浓度。
表1本发明药物对IBRS-2细胞的毒性作用
药物 TD<sub>50</sub>(*10mg/ml) TD<sub>0</sub>(*10mg/ml)
受试药物1 2<sup>-1.5</sup> 2<sup>-3</sup>
受试药物2 2<sup>-2.5</sup> 2<sup>-4</sup>
受试药物3 2<sup>-2.5</sup> 2<sup>-4</sup>
受试药物4 2<sup>-2.5</sup> 2<sup>-4</sup>
受试药物5 2<sup>-1.5</sup> 2<sup>-3</sup>
受试药物6 2<sup>-1.5</sup> 2<sup>-3</sup>
3.本发明药物体外对猪瘟病毒的影响结果
3.1本发明药物体外对猪瘟的治疗作用
本方案评价病毒量指标为细胞病变效应(CPE)和D492nm值。
正常细胞对照组细胞培养液清亮，细胞圆型或卵圆型，排列整齐紧密，里上皮形，胞浆清楚(见图1)。感染猪瘟病毒后，病毒对照组对IBRS-2细胞的CPE表现为：细胞出现空泡，细胞形态肿胀、变圆，细胞间隙增大，胞核圆缩和破裂，严重时细胞部分或全部坏死脱落(见图2)。而药物干预后，受试药物5在1.25mg/ml浓度下，受试药物6在1.25×10-2～1.25mg/ml浓度范围下，细胞形态明显偏正常，仅有部分细胞出现病变的特征，呈皱缩状，或串状或重叠或脱落，多数细胞呈正常的上皮形态，说明药物在一定程度上抑制了病毒在细胞内的复制增殖(见图3)，其他各浓度下的受试药物组与病毒对照组相比无显著差异。
同时根据MTT法(表2)，受试药物5在1.25mg/ml浓度下，受试药物6在1.25×10-2～1.25mg/ml浓度范围下，与病毒对照组相比，有显著差异(P<0.05)，说明受试药物5、6在一定浓度条件下具有阻断病毒吸附细胞的作用。
实验结果表明，1.25mg/ml的受试药物5，1.25×10-1～1.25mg/ml的受试药物6可以有效抑制细胞内猪瘟病毒增殖，对病毒感染有明显的治疗作用。
3.2本发明药物体外直接杀伤猪瘟病毒的作用
受试药物6在1.25×10-1～1.25mg/ml浓度范围下能阻断或减轻病毒所致的CPE形成，且同时根据MTT法(表2)，该浓度范围内的受试药物6与病毒对照组相比，有显著差异(P<0.05)，说明1.25×10-1～1.25mg/ml的受试药物6本发明药物可直接杀伤猪瘟病毒，增加活细胞数量。
3.3本发明药物对猪瘟的预防作用
长成单层的IBRS-2细胞，在经1.25mg/ml浓度下的受试药物1，1.25×10-1～1.25mg/ml浓度范围下的受试药物5，1.25×10-2～1.25mg/ml浓度范围下受试药物6吸附后可阻断或减轻病毒所致细胞的CPE形成，且同时根据MTT法(表2)，该浓度范围内的药物组与病毒对照组相比，有显著差异(P<0.05)，说明1.25mg/ml浓度下的受试药物1，1.25×10-1～1.25mg/ml浓度范围下的受试药物5，1.25×10-2～1.25mg/ml浓度范围下受试药物6均能够在体外有效预防病毒感染。
表2MTT法测定D492nm值
Figure GDA0003719125850000091
注：*与病毒对照组比较p＜0.05。
4结论
本实验分别通过先感染病毒后加药的方式观察药物是否具有抑制细胞内病毒增殖的作用；通过感染病毒同时加药的方式观察药物是否具有直接接触抑制病毒的作用；先加药后感染病毒的方式观察药物是否能预防病毒感染。实验结果显示，针对CSFV Shimen株，1.25mg/ml的受试药物5，1.25×10-1～1.25mg/ml的受试药物6可以抑制细胞内猪瘟病毒增殖，对病毒感染有明显的治疗作用；1.25×10-1～1.25mg/ml的受试药物6可直接杀伤猪瘟病毒，增加活细胞数量；1.25mg/ml浓度下的受试药物1，1.25×10-1～1.25mg/ml浓度范围下的受试药物5，1.25×10-2～1.25mg/ml浓度范围下受试药物6有预防病毒感染的作用。
因此，本发明特定重量比例的绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸组成的药物组合物，特别是绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸重量比例为50:30:20的药物组合物能够有效阻断猪瘟病毒的吸附与穿入，有效预防猪瘟病毒感染，并能同时抑制猪瘟病毒复制，杀伤猪瘟病毒，达到治疗猪瘟病毒感染的作用。
实验例2本发明组合物的体内治疗猪流行性腹泻试验
1.试验材料
1.1受试药物
受试药物1：绿原酸；
受试药物2：桃叶珊瑚苷；
受试药物3：京尼平苷酸；
受试药物4：以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸：甘露醇：亚硫酸氢钠重量配比＝40：30：30：26.7：0.7为处方制得的注射制剂；
受试药物5：以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸：甘露醇：亚硫酸氢钠重量配比＝50：25：25：26.7：0.7为处方制得的注射制剂；
受试药物6：以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸：甘露醇：亚硫酸氢钠重量配比＝50：30：20：26.7：0.7为处方制得的注射制剂；
受试药物7：以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量配比＝50：30：20为处方制得的口服制剂；
阳性药物：庆大霉素。
以上各注射制剂的制备方法为：按处方配比称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、甘露醇、亚硫酸氢钠，溶解于注射用水，过滤除菌，冷冻干燥，得组合物标示量为30mg/支的冻干粉针剂。
口服制剂的制备方法为：按处方称取绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸，混合均匀后，分装成散剂。
临用前各受试药物及阳性药物均以生理盐水稀释溶解至所需浓度。
1.2动物
选择来自湖南省娄底市的如松猪场12～24日龄体重相近的腹泻仔猪，共65头。
2.试验方案
2.1试验分组
根据给药方式及剂量，将腹泻仔猪按体重相近的原则，分为13组，分别为：
(1)阴性对照组：肌肉注射生理盐水，每日2次，连续给药7天；
(2)受试药物1组：肌肉注射受试药物1，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(3)受试药物2组：肌肉注射受试药物2，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(4)受试药物3组：肌肉注射受试药物3，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(5)受试药物4低剂量组：肌肉注射受试药物4，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(6)受试药物4高剂量组：肌肉注射受试药物4，6mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(7)受试药物5低剂量组：肌肉注射受试药物5，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(8)受试药物5高剂量组：肌肉注射受试药物5，6mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(9)受试药物6低剂量组：肌肉注射受试药物6，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(10)受试药物6高剂量组：肌肉注射受试药物6，6mg/kg/次，每日2次，连续给药7天；
(11)受试药物7低剂量组：口服注射受试药物7，3mg/kg/次，每日3次，连续给药7天；
(12)受试药物7高剂量组：口服注射受试药物7，6mg/kg/次，每日3次，连续给药7天；
(13)阳性药物组：肌肉注射庆大霉素，3mg/kg/次，每日2次，连续给药7天。
2.2评价指标
每天观察所有仔猪的体温、精神、食欲、饮水、排便、运动、腹泻是否复发、毒副反应和死亡情况，测量仔猪质量并记录。
3.试验结果
各试验组仔猪体重变化见表3，各试验组对猪流行性腹泻的治疗效果见下表4。
表3各药物组的仔猪体重变化
Figure GDA0003719125850000111
Figure GDA0003719125850000121
注：与阴性组比较*p＜0.01；与阳性药物组比较△p＜0.01。
表4各药物组对猪流行性腹泻的治疗效果
Figure GDA0003719125850000122
从表3可以看出，绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸单独使用及各比例组合物的注射剂和口服制剂都可以有效减轻腹泻病猪的体重衰减，与阴性对照组具有显著性差异；与阳性对照组相比，受试药物6的低、高剂量和受试药物7的高剂量有显著差异，而且病猪体重呈逐渐增长趋势。
从表4中可以看出，绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸单独使用对猪流行性腹泻没有治疗效果，而其组合物可以有效治疗猪流行性腹泻，其中以受试药物6的注射制剂效果最为显著，即绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸组合物的重量比例为50:30:20时，该组合物的注射制剂能够显著提高对猪流行性腹泻的治疗效果。
4.结论
以上试验说明绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸的组合物可以用于猪流行性腹泻的预防及治疗，其中以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸＝50:30:20的药物组合物效果最佳。
实验例3本发明组合物的体外抑菌(猪大肠杆菌)试验
猪水肿病的主要致病菌为猪大肠杆菌，故本方案体外试验选用猪大肠杆菌。
1.试验材料
1.1受试药物
受试药物1：绿原酸；
受试药物2：桃叶珊瑚苷；
受试药物3：京尼平苷酸；
受试药物4：绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量比＝40:30:30的组合物；
受试药物5：绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量比＝50:25:25的组合物；
受试药物6：绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸重量比＝50:30:20的组合物；
阳性药物：恩诺沙星，购自拜耳(四川)动物保健有限责任公司。
按上述比例配置各受试药物。
1.2菌种
猪大肠杆菌强毒株K88ac，购自中国兽医药品检查所兽医微生物保藏中心。
1.3培养基
鲜血琼脂培养基：购自郑州博赛生物技术有限公司；
LB肉汤培养基：购自北京奥博星生物技术责任有限公司。
2.试验方案
2.1菌种的培养
先预将保存的菌种接种于鲜血琼脂培养基中，37℃培养18h，取出将菌落接种于LB肉汤培养基，37℃培养14h。取出用比浊法测定菌液浓度约为9×108CFU/ml，将菌液用生理盐水按照1:10倍比稀释法将浓度稀释到9×105CFU/m1，作为抑菌实验浓度。
2.2受试药物分组
根据受试药物的浓度及种类分为8组，包括：阴性对照组、受试药物1～6组、阳性药物组；其中阴性药物组为生理盐水，各组药物用超纯水溶解，使终浓度均为20mg/ml。
2.3体外抑菌
2.3.1杯碟法
取直径为90mm，高16～17mm的平底双碟，经高压灭菌后，在无菌操作下分别注入已熔化的2％琼脂培养基20ml，均匀摊布碟底，放置水平台，待凝固后再分别加入已培养的菌种4～5ml，然后在每一平底双碟中置入内径为6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm牛津杯3只，将各供试药液分别滴入各组牛津杯内，以杯满(不能溢出杯外)为准，置37℃隔水式电热恒温箱中培养24小时，用游标卡尺测量抑菌环直径。
2.3.2抑菌强度判定标准
按《抗生素药品检验》和《中药制用经验录》的判定作用标准。即抑菌环直径在8.00mm或以下为不敏感(一)；抑菌环直径在8.10～13.00mm为低度敏感(+)；抑菌环直径在13.10～19.00mm为中度敏感(++)；抑菌环直径在19.10～25.00mm为高度敏感(+++)。
2.3.3二倍稀释法测定药物抑菌效价
每组取13x100mm灭菌有棉塞的试管11支，并编号排列于试管架上，在无菌操作下于每管中先加无菌LB肉汤培养液2.0ml，然后于第1支管中加入灭菌的受试药液2.0ml，混匀后取2.0ml放入第2管中，依次类推，直到第9管取出2.0ml弃去，使1：2、1：4、1：8、1：16、1：32……等各种浓度。第10管不加药物只加菌作为对照，以便观察培养基是否适合于细菌生长。第11管中加入受试药物混匀取出2.0ml弃去，不加受试菌，以便观察受试药物是否被污染。再用无菌肉汤将受试菌液稀释成10-3浓度，取0.1m分别加入上述l～10管中，混匀后置37℃隔水式电热恒温箱中培养16～24小时观察结果。若肉汤混浊，表示细菌生长(++、+++)；若肉汤完全清亮，表示无细菌生长(一)。
3.试验结果
3.1杯碟法
各受试药物对猪大肠杆菌的抑菌实验结果见表5所示，阴性对照组无抑菌效果，绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸的单独使用对细菌低度敏感，三者的组合物对细菌的抑制效果较为显著；组合物中，受试药物5组与阳性药物组效果相当，受试药物6组效果优于阳性药物组，抑菌效果最佳。
表5各受试药物对猪大肠杆菌的抑菌实验结果
Figure GDA0003719125850000151
因此，绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸的药物组合物对猪大肠杆菌有较强的抑制作用，其中以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸＝50:30:20效果最佳。
3.2二倍稀释法试管测定药物抑菌效价试验
各受试药物对猪大肠杆菌抑菌效价测定结果见表6，阴性对照组无抑菌效果，绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸单独使用的效价均为1:2，三者比例为40:30:30的组合物效价为1:8，比例为50:25:25的组合物效价与恩诺沙星效价相当，为1:16，比例为50:30:20的组合物效价为1:64，抑菌效果最强。
表6各受试药物对猪大肠杆菌抑菌效价测定结果
Figure GDA0003719125850000152
Figure GDA0003719125850000161
因此，绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸的药物组合物对猪大肠杆菌有显著增强的抑制作用，取得了协同增效的效果，其中以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸＝50:30:20效果最佳。
4.结论
绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸单独使用时抑制猪大肠杆菌的作用较弱，但是三者的组合物抑菌作用明显增强，取得了协同增效的作用，其中尤以绿原酸：桃叶珊瑚苷：京尼平苷酸＝50:30:20的抑菌作用最强，为猪水肿病的治疗及预防提供了一种新的选择。
综上，本发明提供了一种由特定比例的绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸组成的组合物及其在制备预防和/或治疗猪病的药物中的用途。实验结果表明，本发明组合物能够阻断猪瘟病毒的吸附与穿入，有效预防猪瘟病毒感染，并能同时抑制猪瘟病毒复制，杀伤猪瘟病毒，达到治疗猪瘟的作用；该组合物还能够有效治疗猪流行性腹泻；该组合物还能够有效抑制猪大肠杆菌，抑制效果取得了协同增效的作用，为猪水肿病的治疗及预防提供了一种新的选择。同时，本发明组合物还有效解决了传统抗病毒药物和抗生素治疗存在的副作用大、残留严重的问题。因此，本发明的组合物在制备抗猪瘟病毒、抑制猪大肠杆菌的药物，以及预防和/或治疗猪瘟、猪流行性腹泻和猪水肿病等猪病的药物中具有很好的应用前景。

Claims (8)

1.一种组合物在制备抗猪瘟病毒的药物中的用途；所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸1.0～6.0份，桃叶珊瑚苷1.0～3.0份，京尼平苷酸0.5～1.5份。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸1.3～2.5份，桃叶珊瑚苷1.0～1.5份，京尼平苷酸1.0份。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸2.0～2.5份，桃叶珊瑚苷1.0～1.5份，京尼平苷酸1.0份。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述组合物是由以下重量份数的原料制得的：绿原酸2.5份，桃叶珊瑚苷1.5份，京尼平苷酸1.0份。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够阻断猪瘟病毒对细胞的吸附与穿入，和/或抑制猪瘟病毒增殖，和/或杀伤猪瘟病毒。
6.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物是以所述组合物为活性成分，加上药学领域可接受的辅料制得的制剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述制剂为注射剂或固体制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述制剂为注射剂，所述辅料包括支架剂和抗氧化剂中的一种或两种。
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