CN112040985A - 用于递送治疗性蛋白质的方法和组合物 - Google Patents

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A·巴伊克
K·席格纳
M·普拉加斯提斯
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Abstract

公开了用于将治疗性蛋白质递送至中枢神经***(CNS)，以便治疗损害CNS的疾病和病症，如治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。提供了通过治疗有效量的跨血脑屏障(BBB)的核苷酸组合物递送的治疗性蛋白质，所述核苷酸组合物编码与细胞表面受体结合蛋白缀合的治疗性蛋白质。

Description

用于递送治疗性蛋白质的方法和组合物
关于通过EFS-WEB以文本文件形式提交的序列表的引用
编写在文件10457WO01_ST25.txt中的序列表是33.5千字节，于2019年1月29日创建，并以引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请大体上涉及用于将治疗性蛋白质递送至中枢神经***(CNS)以便治疗损害CNS的疾病和病症，如治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。本申请涉及提供治疗有效量的跨血脑屏障(BBB)的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物编码与一个或多个递送结构域缀合的治疗性蛋白质。
背景技术
已开发出药物递送方法来克服血脑屏障(BBB)，如纳米载体，不过，这些方法具有缺点。载体在血液循环中不稳定并且展现出不合需要的生物分布特征(Gelperina S等人,2005,《美国呼吸和重症护理医学杂志(Am J Respir Crit Care Med.)》172(12):1487-90；该参考文献以全文引用的方式并入本文中)。取决于BBB处的运输机制以及CNS疾病状态是否改变该屏障的完整性，靶向效率也受到影响。靶向部分或载体必须考虑实现这些运输机制的神经发炎状况进行适当选择。
在肝或其它组织中通过DNA表达来递送治疗性蛋白质提供了一种便利的方法，该方法不需要快速注射蛋白质并因此减少免疫原性问题。将治疗性蛋白质与受体结合蛋白，尤其是与细胞特异性受体缀合解决了使治疗剂靶向特定组织的问题。然而，仍然需要提供将治疗剂高效地提供至CNS的方法。
发明内容
申请人已发现，治疗性蛋白质，尤其是替代酶，当与受体结合蛋白缔合时可被有效地递送至中枢神经***中，并且使得循环血液水平随时间推移达到一致的水平。多结构域治疗性蛋白质可通过基因治疗载体递送至肝中，该载体含有治疗性蛋白质和结合蛋白复合物的编码序列。
一方面，本发明提供一种将治疗性蛋白质递送至受试者的中枢神经***(CNS)的方法，该方法包括通过肝靶向递送方法向所述受试者施用编码与细胞表面受体(CSR)-结合蛋白(CSR-BP)缀合的治疗性蛋白质(tpCSR-BP)的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物足以将治疗有效量的所述tpCSR-BP提供于所述CNS中。
在一个实施例中，CSR-BP是特异性结合至CSR的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，治疗性蛋白质是溶酶体酶。
在一个实施例中，所述酶具有水解酶活性，如糖基化酶，如糖苷酶，如α-葡糖苷酶或α-半乳糖苷酶A。在一个实施例中，细胞表面受体(CSR)-结合蛋白(CSR-BP)是结合至内化受体的抗原结合蛋白。在一个实施例中，内化受体是被胞吞并运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化受体是CD63分子。在一个实施例中，内化受体是ITGA7分子。在一个具体实施例中，CSR-BP是抗体、抗体片段或单链可变片段(scFv)，如结合CD63或ITGA7的scFv。
在一些实施例中，本文所描述的多结构域治疗性蛋白质包含一个或多个递送结构域和一个酶结构域，其中所述一个或多个递送结构域结合人转铁蛋白受体(hTfR)。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质还包含结合至内化效应物的第二递送结构域。在一些实施例中，所述第二递送结构域结合至(i)选自由以下组成的组的内化效应物：CD63、整合素α-7(ITGA7)、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(apelinreceptor，APLNR)、髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3及CD36；(ii)在若干组织类型中表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体；(iii)优先由骨和/或软骨表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1；(iv)优先由单核细胞、巨噬细胞或微神经胶质细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)；(v)优先由肾细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，内化效应物是肌肉特异性内化剂，如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白(Popeye domain-containing protein)3)；(vi)优先由肝细胞表达的内化效应物，任选地是ASGR1或ASGR2；(vii)优先由肌肉细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)，和/或(viii)选自由以下组成的组的内化效应蛋白：ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR。在一些实施例中，第二递送结构域结合至内化效应物CD63。在一些实施例中，所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含抗原结合蛋白。在一些实施例中，所述一个或多个递送结构域各自包含抗原结合蛋白。在一些实施例中，所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含半体。在一些实施例中，结合hTfR的递送结构域是scFv，其中半体结合CD63，其中酶结构域是GAA，并且其中GAA与结合CD63的半体的羧基末端缀合。在一些实施例中，所述一个或多个递送结构域各自包含scFv。在一些实施例中，至少一个scFv与Fc融合。在一些实施例中，Fc包含野生型人IgG4同型或其衍生物。在一些实施例中，GAA与Fc的羧基末端缀合。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含抗hTfR scFv和抗hCD63 scFv。在一些实施例中，抗hTfR scFv和抗hCD63 scFv都在其羧基末端连接至单一GAA酶。在一些实施例中，递送结构域是抗hTfR scFv，并且酶结构域连接至scFv的VL结构域的羧基末端。在一些实施例中，多结构域还包含连接至抗hTfR scFv的VH结构域的N末端的第二递送结构域。在一些实施例中，第二递送结构域是抗hCD63 scFV。在一些实施例中，酶结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
还提供了多结构域治疗性蛋白质，其包含至少两个递送结构域和至少一个酶结构域，其中该两个递送结构域各自独立地选自由抗体、半体和scFv组成的组，并且其中所述递送结构域中至少一个或多个与所述至少一个酶结构域缔合，优选地其中所述一个或多个递送结构域共价连接至所述至少一个酶结构域。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域。在一些实施例中，所述递送结构域中仅一个与所述至少一个酶结构域缔合。在一些实施例中，所述至少两个递送结构域各自共价连接至酶结构域。在一些实施例中，所述至少两个递送结构域各自共价连接至同一酶结构域。在一些实施例中，所述至少两个递送结构域各自共价连接至不同的酶结构域。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域，其中第一递送结构域包含半体，并且其中第二递送结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv与Fc融合。在一些实施例中，半体在其羧基末端共价连接至第一酶结构域，和/或其中scFv在其羧基末端共价连接至Fc，和任选地第二酶结构域。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域，其中第一递送结构域和第二递送结构域各自包含scFv。在一些实施例中，第一scFv和第二scFv都共价连接至酶结构域。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质自N末端至C末端包含：第一scFv、第二scFv和酶结构域。在一些实施例中，至少一个递送结构域结合溶酶体运输分子，并且至少一个递送结构域结合转胞吞作用效应物。在一些实施例中，溶酶体运输分子选自由以下组成的组：CD63、ITGA7、CD9、CD63、CD81、CD82或CD151，并且其中转胞吞作用效应物选自由以下组成的组：LDL受体、IgA受体、转铁蛋白受体、新生儿Fc受体、胰岛素受体、CD98及基础免疫球蛋白(Basigin)。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含如图1C、图1D、图1E或图1F所描绘的结构。
本文还提供了编码本文所描述的多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，本文所提供的多核苷酸还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列。在一些实施例中，多核苷酸还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列。在一些实施例中，多核苷酸还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，并且其中AAV核酸序列包含内部末端重复序列，和任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。在一些实施例中，多核苷酸还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，所述AAV核酸序列包括含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或两者的内部末端重复序列，和任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。在一些实施例中，多核苷酸还包括含如SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9所示的序列的组织特异性调控元件。
一方面，本发明提供一种基因治疗载体，如AAV载体，其含有编码与CSR-BP缀合或融合的治疗性蛋白质的核酸序列，例如本文所描述的多核苷酸。在一些实施例中，基因治疗载体选自由以下组成的组：病毒载体，任选地其中所述病毒载体是天然病毒、工程改造的病毒或嵌合病毒；和包含本文所描述的多核苷酸的裸多核苷酸、多核苷酸复合物，任选地其中所述多核苷酸复合物是包含根据权利要求20至25中任一项所述的多核苷酸和脂质的脂质纳米颗粒，及其任何组合。在一些实施例中，基因治疗载体是病毒载体，其选自由以下组成的组：逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒。在一些实施例中，基因治疗载体是AAV9、Anc80、AAV2/8嵌合体、和/或针对特定组织，例如针对肝或神经元组织假型化的AAV。
在一个实施例中，将治疗性蛋白质、编码该治疗性蛋白质的核苷酸、和/或包含编码该治疗性蛋白质的核苷酸的基因治疗载体用于治疗需要酶替代疗法的受试者，例如用于将治疗性蛋白质递送至受试者的中枢神经***(CNS)的方法中，所述方法包括通过肝靶向递送方法向所述受试者施用编码多结构域治疗性蛋白质的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物足以将治疗有效量的多结构域治疗性蛋白质提供至CNS中，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。在一些实施例中，受试者是动物。在一些实施例中，受试者是人。
一方面，将AAV载体施用给人或非人受试者，所述AAV载体含有编码scFv-水解酶融合蛋白的多核苷酸。随后，所述多核苷酸整合于肝中的基因组基因座处并产生编码的融合蛋白。在另一个实施例中，多核苷酸在肝中游离地转录并产生编码的融合蛋白。在一个具体实施例中，融合蛋白是抗CD63scFv-GAA融合蛋白或抗ITGA7scFv-GAA融合蛋白，人或非人受试者缺乏内源性GAA活性，并有效地恢复受试者体内的GAA活性。
一方面，本发明提供一种通过向患者施用基因治疗载体治疗患有酶缺乏症的受试者(人或非人受试者)的方法，所述基因治疗载体含有编码与CSR-BP缀合或融合的治疗性蛋白质的基因。
本文描述了将治疗性蛋白质递送至受试者的中枢神经***(CNS)的方法，所述方法包括通过肝靶向递送方法向所述受试者施用编码多结构域治疗性蛋白质的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物足以将治疗有效量的多结构域治疗性蛋白质提供至CNS中，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。在一些实施例中，递送结构域是特异性结合至内化效应物的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，治疗性蛋白质是溶酶体酶。在一些实施例中，溶酶体酶是GAA。在一些实施例中，核苷酸组合物是通过病毒载体施用。在一些实施例中，病毒载体是AAV载体。在一些实施例中，核苷酸组合物是以至少2×1012个病毒基因组/公斤(vg/kg)的剂量施用。在一些实施例中，内化效应物在细胞的表面上表达，所述细胞选自由以下组成的组：所述CNS中的细胞、上皮细胞和跨血脑屏障的细胞。在一些实施例中，递送结构域结合内化效应物。在一些实施例中，内化效应物(i)选自由以下组成的组：CD63、整合素α-7(ITGA7)、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3及CD36；(ii)在若干组织类型中表达，例如CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体，任选地其中受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：法布里氏病(Fabry disease)、戈谢氏病(Gaucher disease)、MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPSIIIB、MPS IIID、MPS IVB、MPS VI、MPS VII、MPS IX、庞贝氏病(Pompe disease)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病(Niemann-Pickdiseases)、α甘露糖苷贮积症、神经氨酸酶缺乏症、唾液酸贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、非典型性戈谢氏病、法伯氏脂肪肉芽肿病(Farberlipogranulomatosis)、岩藻糖苷贮积症及β甘露糖苷贮积症；(iii)优先由骨和/或软骨表达，例如胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1，任选地其中受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIID、MPS IVA、MPS IVB、MPS VI、MPSVII、MPS IX、β甘露糖苷贮积症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、法伯氏脂肪肉芽肿病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症及α甘露糖苷贮积症；(iv)优先由单核细胞、巨噬细胞或微神经胶质细胞表达，例如清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)，任选地其中受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症及法伯氏脂肪肉芽肿病；(v)优先由肾细胞表达，例如CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)，任选地其中受试者展现疾病的一种或多种症状或被诊断患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：法布里氏病、奥尔波特氏综合征(Alport syndrome)、多囊性肾病及血栓性血小板减少性紫癜；(vi)优先由肝细胞表达，例如ASGR1或ASGR2，任选地其中受试者展现疾病的一种或多种症状或被诊断患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、MPS VI、MPS VII、MPSII、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、法伯氏脂肪肉芽肿病；(vii)优先由肌肉细胞表达，例如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)，任选地其中受试者展现庞贝氏病的一种或多种症状或被诊断患有庞贝氏病；(viii)选自由以下组成的组：ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR；和/或(ix)是CD63。在一些实施例中，递送结构域是单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，细胞表面受体(CSR)-结合蛋白(CSR-BP)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含水解酶。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含糖基化酶。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含糖苷酶。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含α-葡糖苷酶。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或其片段。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含抗Aβ或抗τ抗体。在一些实施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:11的核酸序列。在一些实施例中，酶结构域包含α-葡糖苷酶，并且其中受试者的任何CNS组织中的糖原水平在治疗后降低达至少九个月。在一些实施例中，受试者患有庞贝氏病。在一些实施例中，施用的核苷酸组合物提供至少1μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含糖苷酶，如GAA(例如SEQ ID NO:1)或GLA(例如UniProtKB编号P06280，aa32-429，SEQ ID NO:13)，并且患者患有庞贝氏病或法布里氏病。在一些实施例中，CSR-BP是结合至如CD63或ITGA7之类内化受体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，CSR-BP是结合CD63的scFv分子。在一些实施例中，CSR-BP是结合ITGA7的scFv分子。在一些实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的AAV载体，所述多核苷酸编码抗CD63-GAA融合治疗性蛋白质。在一些实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的AAV载体，所述多核苷酸编码抗ITGA7-GAA融合治疗性蛋白质。
在一些实施例中，治疗性蛋白质包含GAA酶结构域，并且在施用基因治疗载体之后，高GAA血清水平在患者的血清中维持至少12周。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含GAA酶，并且在患者的CNS组织中的糖原水平明显降低。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含GAA酶，并且在施用基因治疗载体之后3个月、6个月或9个月，糖原水平维持在野生型水平。在一些实施例中，治疗性蛋白质包含GAA酶，并且在治疗之后，患者的肌肉强度恢复到野生型水平。
一方面，本发明提供一种通过施用基因治疗载体减少人或非人受试者的组织，特别是CNS组织中糖原累积的方法，所述基因治疗载体含有编码与CSR-BP融合的治疗性蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，基因治疗载体的施用剂量足以提供阈值血清水平的与CSR-BP融合的治疗性蛋白质。在一些实施例中，阈值水平是至少1μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少2μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少3μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少4μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少5μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少6μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少7μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少8μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少9μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少10μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少11μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少12μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少13μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少14μg/mL。在一些实施例中，阈值水平是至少15μg/mL。在一个实施例中，组织是小脑、脊髓或海马体。在一个实施例中，人或非人受试者患有庞贝氏病。在一个实施例中，治疗性蛋白质包含抗CD63 scFv-GAA融合蛋白。在另一个实施例中，治疗性蛋白质包含抗ITGA7 scFv-GAA融合蛋白。
附图说明
图1A示意性表示多结构域治疗性蛋白质。小图A描绘了包含双特异性抗体(ii)和替代酶(i)的多结构域治疗性蛋白质。小图B描绘了酶-Fc融合多肽(i)与内化效应物特异性半体(ii)缔合形成多结构域治疗性蛋白质。小图C描绘了与抗内化效应物抗体的重链的C末端共价连接的替代酶(六边形)。小图D描绘了与抗内化效应物抗体的重链的N末端共价连接的替代酶(六边形)。小图E描绘了与抗内化效应物抗体的轻链的C末端共价连接的替代酶(六边形)。小图F描绘了与抗内化效应物抗体的轻链的N末端共价连接的替代酶(六边形)。小图G描绘了与包含VH区(阴影条)和VL区(空心条)的单链可变片段(scFv)的C末端共价连接的替代酶(六边形)。小图H描绘了与以下两个scFv结构域共价连接的替代酶(六边形)：充当第一递送结构域的第一scFv(i)，以及充当第二递送结构域的第二scFv(ii)。图1A中未描绘的额外多结构域治疗性蛋白质包括但不限于包含两个或更多个递送结构域和至少一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。作为非限制性实例，本图的小图A-H中所描绘的抗体、半体和scFv结构域可表示任何类型的递送结构域，并且额外递送结构域或替代酶也可缔合以制备多结构域治疗性蛋白质。图1C、1D和1F中也描绘了包含两个或更多个递送结构域的多结构域治疗性蛋白质的非限制性实例，所述多结构域治疗性蛋白质包括共价连接至第一内化效应物特异性半体的替代酶(描绘为但不限于GAA)，所述第一内化效应物特异性半体与第二内化效应物特异性scFv-Fc融合物缔合，所述scFv-Fc融合物还可以或可以不共价连接至替代酶(描绘为但不限于GAA)，形成多结构域治疗性蛋白质(图1C和1D)；共价连接至抗内化效应物特异性半体各自的C末端的替代酶(描绘为但不限于GAA)，其用作第一递送结构域；和内化效应物特异性scFv-Fc融合物，其用作第二递送结构域，其中两个抗内化效应物特异性半体缔合在一起形成多结构域治疗性蛋白质(图1D)；以及共价连接至第一scFv的替代酶，其例如通过连接子连接至第二scFv(图1F)。
图1B提供了AAV基因治疗载体的非限制性示例性图示，所述AAV基因治疗载体各自编码图1A的小图G中表示的多结构域治疗性蛋白质，其中scFv是抗人CD63 scFv并且替代酶是GAA(例如抗hCD63scFv::hGAA；参见例如，如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列)。SEQ IDNO:10中的氨基酸1-117提供了H4H12450N抗体重链可变结构域(VH)的氨基酸序列；SEQ IDNO:10中的氨基酸118-132提供了在H4H12450N重链与轻链可变结构域之间的氨基酸连接子序列；SEQ ID NO:364中的氨基酸133-240提供了H4H12450N抗体的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列；SEQ ID NO:10中的氨基酸241-245提供了在抗hCD63scFv与GAA之间的氨基酸连接子序列；且SEQ ID NO:10中的氨基酸246-1128提供了替代酶GAA，或其生物活性部分的氨基酸序列。示例性5'ITR和3'ITR序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。本图的小图A提供了用于肝特异性表达的示例性载体，所述载体包含示例性肝特异性增强子(例如但不限于丝氨酸蛋白酶抑制因子1(Serpina1)；如SEQ ID NO:9所示)、示例性肝特异性启动子(例如但不限于TTR；如SEQ ID NO:8所示)、示例性信号肽；编码抗hCD63scFv::hGAA多治疗性结构域的核酸序列(SEQ ID NO:10)；及聚A尾。本图的小图B提供了与小图A中所示类似的示例性载体，该载体具有示例性泛在启动子代替肝特异性增强子和肝特异性启动子序列。本图的小图C提供了与图A中所示类似的示例性载体，该载体具有示例性神经元特异性启动子代替肝特异性增强子(例如丝氨酸蛋白酶抑制因子1)和启动子(例如TTR)。本图的小图D提供了与小图A中所示类似的示例性载体，该载体具有示例性神经元特异性启动子与肝特异性(例如丝氨酸蛋白酶抑制因子1)增强子和启动子(例如TTR)的组合。
图1C提供了表达载体的非限制性示例性图示，所述表达载体各自编码所描绘的多结构域治疗性蛋白质，其中半体是抗CD63抗体，scFv是抗人转铁蛋白受体scFv，并且其中替代酶是GAA(例如抗hTfRscFv::hGAA)。
图1D提供了表达载体的非限制性示例性图示，所述表达载体各自编码所描绘的多结构域治疗性蛋白质，其中半体是抗CD63抗体，其中scFv是抗人转铁蛋白受体(TfR)scFv且Fc结构域是人IgG4 Fc，并且其中替代酶是GAA(例如抗hTfRscFv::hGAA)。
图1E提供了表达载体的非限制性示例性图示，所述表达载体各自编码图1A的小图H中表示的多结构域治疗性蛋白质，其中两个scFv之一是抗人CD63 scFv，两个scFv中的另一个是抗人转铁蛋白受体(TfR)scFv，并且替代酶是GAA(例如抗hCD63scFv::hGAA::抗TfRscFV)，
图1F提供了表达载体的非限制性示例性图示，所述表达载体各自编码所描绘的多结构域治疗性蛋白质，其中两个scFv之一是抗人CD63 scFv，两个scFv中的另一个是抗人转铁蛋白受体(TfR)scFv，并且替代酶是GAA(例如抗hCD63scFv::抗TfRscFV::GAA或抗TfRscFV::抗hCD63scFv::GAA)。
图1G提供了表达载体的非限制性示例性图示，所述表达载体各自编码图1A的小图G中所描绘的多结构域治疗性蛋白质，其中scFv是抗人转铁蛋白受体(TfR)scFv，并且替代酶是GAA(例如抗TfRscFV::GAA)。
图2是条形图，描绘了以微克/毫克组织表示的贮积糖原的量随递送的酶的变化。X轴从左到右描绘了来自CD63hu/hu；GAA-/-小鼠的组织：心脏、四头肌、腓肠肌、膈肌、比目鱼肌和趾长伸肌(EDL)。第1道方框描绘了未治疗的小鼠庞贝氏病模型中贮积糖原的量。第6道方框描述了未治疗的野生型小鼠模型中贮积糖原的量。第2道方框描绘了在用1010vg剂量的AAV-hGAA(含编码人GAA的基因的腺相关病毒载体)治疗的小鼠庞贝氏病模型中贮积糖原的量。第3道方框描述了在用1011vg剂量的AAV-hGAA治疗的小鼠庞贝氏病模型中贮积糖原的量。第4道方框描述了在用1010vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA(含编码连接至人GAA的抗人CD63 scFv结构域的基因的腺相关病毒载体)治疗的小鼠庞贝氏病模型中贮积糖原的量。第5道方框描述了在用1011vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA治疗的小鼠庞贝氏病模型中贮积糖原的量。
图3是条形图，描绘了在注射AAV后3个月，在每只小鼠的骨骼肌组织中的平均糖原测量值(μg/mg)。绘制用特定剂量的特定酶构建体治疗的每只小鼠的每个测量值随GAA暴露(即血清水平)变化的图。实心正方形表示1010vg剂量的AAV-hGAA。实心锥形表示1011vg剂量的AAV-hGAA。实心倒锥形表示1010vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。实心菱形表示1011vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。
图4是点图，描绘了用特定剂量的特定酶构建体治疗的每只小鼠在AAV注射后3个月时心脏组织中的平均心肌糖原测量值(μg/mg)随GAA暴露(即血清水平)的变化。实心正方形表示1010vg剂量的AAV-hGAA。实心锥形表示1011vg剂量的AAV-hGAA。实心倒锥形表示1010vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。实心菱形表示1011vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。
图5是点图，描绘了用特定剂量的特定酶构建体治疗的每只小鼠在AAV注射后3个月时的抗GAA抗体效价随GAA暴露(即血清水平)的变化。空心正方形表示1010vg剂量的AAV-hGAA。空心圆形表示1011vg剂量的AAV-hGAA。空心菱形表示1010vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。六边形表示1011vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。
图6是点图，描绘了在AAV注射后3个月时的抗GAA抗体效价随酶构建体和剂量的变化。圆形表示接受空AAV载体的对照小鼠。正方形表示1010vg剂量的AAV-hGAA。锥形表示1011vg剂量的AAV-hGAA。倒锥形表示1010vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。菱形表示1011vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。
图7A是线图，描绘了GAA的血清水平(任意单位“a.u.”；y轴)随在基因治疗载体注射后的时间(以周为单位)的变化。正方形(底部线)表示1010vg剂量的AAV-hGAA。锥形(从顶部线起第二条线)表示1011vg剂量的AAV-hGAA。倒锥形(从顶部线起第三条线)表示1010vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。菱形(顶部线)表示1011vg剂量的AAV-抗hCD63scFv::hGAA。
图7B是条形图，描绘了向CD63 HumIn GAA KO小鼠(GAA-/-,CD63hu/hu小鼠)或GAA+/+,CD63hu/hu小鼠施用AAV构建体后的mRNA比率(hGAA mRNA相对于mGADPH mRNA)，如下所示：(1)未治疗对照、(2)AAV-肝特异性启动子-hGAA(1e10vg)、(3)AAV-肝特异性启动子-hGAA(1e11vg)、(4)AAV-肝特异性启动子-抗hCD63::hGAA(1e10vg)、(5)AAV-肝特异性启动子-抗hCD63::hGAA(1e11vg)、或(6)未治疗对照(GAA+/+,CD63hu/hu)。对于所有注射的AAV构建体，检测到GAA的肝表达。
图7C是方块图，比较了接受编码融合蛋白的AAV的小鼠(正方形)和接受编码GAA的AAV的小鼠中的血清GAA水平与GAA的RNA表达水平(两种构建体均提供肝特异性启动子(LSP)来驱动表达)。
图7D是条形图，显示了用肝特异性启动子驱动的编码hGAA、抗hCD63 scFv::GAA(融合构建体)或非结合融合构建体scFv::GAA对照的构建体瞬时转染的Huh-7人肝细胞。在转染后3天，两个scFv::GAA融合构建体在分泌的上清液中均具有高于单独hGAA的蛋白质比率。在实验期间向上清液中加入M6P以减少CI-MPR介导的摄取并不影响该比率。(*＝p<0.05，n＝3)。
图7E是条形图，描绘了GAA血清效价的量随递送的载体的变化。X轴描绘了来自针对CD63人源化的KO小鼠(GAA-/-；CD63hu/hu)的血清，所述小鼠被给与编码GAA或ScFv-GAA融合物的质粒，从左到右为：1)对照(无治疗)；2)AAV-LSP-hGAA治疗(1e10vg/小鼠)；3)AAV-LSP-hGAA治疗(1e11vg/小鼠)；4)AAV-LSP-抗CD63::hGAA治疗(1e10vg/小鼠)；以及5)AAV-LSP-抗CD63::hGAA治疗(1e11vg/小鼠)。
图8是荧光显微照片，描绘了用DAPI复染色以展示核的小鼠肌肉纤维中lamp1染色的溶酶体。小图A和A1描绘了来源于未治疗的野生型(GAA+/+)小鼠并且针对lamp1(小图A)和核(小图A1)染色的四头肌细胞。小图B和B1描绘了来源于未治疗的无GAA(GAA-/-)小鼠并且针对lamp1(小图B)和核(小图B1)染色的四头肌细胞。小图C和C1描绘了来源于用AAV-hGAA构建体治疗的GAA-/-小鼠并且针对lamp1(小图C)和核(小图C1)染色的四头肌细胞。小图D和D1描绘了来源于用AAV-hCD63scFv::hGAA构建体治疗的GAA-/-小鼠并且针对lamp1(小图D)和核(小图D1)染色的四头肌细胞。
图9描绘了线图，显示了用AAV-LSP hGAA或AAV-LSP抗hCD63::hGAA治疗的小鼠的握力和Rotarod测试性能。每月获得野生型GAA小鼠(倒三角形)、未治疗的对照(正方形)、AAV-LSP-hGAA治疗(1e11vg/小鼠)(三角形)或AAV-LSP-抗hCD63::hGAA治疗(1e11vg/小鼠)(圆形)的加速Rotarod测量值(A)和前肢握力测量值(B)，持续6个月。误差条是+/-SD。对于所有组，N＝8-10。
图10A和图10B描绘了使用其它膜蛋白作为向导，如使用抗ITGA7(整合素α-7)scFv融合蛋白引导GAA。图10A显示了在存在或不存在5mM M6P的情况下，与抗小鼠CD63-GAA或抗小鼠ITGA7-GAA一起培育过夜的C2C12小鼠成肌细胞的GAA活性(y轴)。图10B显示了针对CD63人源化的GAA KO小鼠(GAA-/-；CD63hu/hu)，所述小鼠通过流体动力学递送(HDD)给与编码抗hCD63::GAA的scFv::GAA形式(2)、或抗小鼠整合素α-7的全长IgG4::GAA形式(3)的质粒，然后在HDD后3周测量组织糖原水平。还测试了在未治疗的对照小鼠GAA-/-；CD63hu/hu(1)和未治疗的野生型GAA对照小鼠GAA+/+；CD63hu/hu(4)的相同组织中的糖原水平。
图11示出与WT CD63+/+小鼠相比，在CD63hu/hu小鼠体内与GAA(即全长IgG4抗体)融合的全长抗CD63抗体的血清清除情况。通过每只小鼠的尾静脉注射质粒，所述质粒表达与GAA融合的抗CD63抗体的重链和轻链。观察到抗CD63(全长IgG4)::GAA的血清PK在24小时内从血清清除。
图12A是点图，描绘了在AAV注射后一个月时GAA的血清水平(任意单位“a.u.”；y轴)随酶构建体和剂量的变化。正方形表示AAV-LSP-Δ8GAA。锥形表示AAV-抗hCD63scFv::GAA。两种构建体均提供肝特异性启动子(LSP)以驱动表达。剂量以每公斤(kg)小鼠的病毒基因组量(vg)提供。
图12B提供了斑点印迹，描绘了以微克/毫克组织(心脏、四头肌、膈肌或三头肌)表示的糖原水平随GAA血清水平的变化。正方形表示AAV-LSP-Δ8GAA。锥形表示AAV-抗hCD63scFv::GAA。两种构建体均提供肝特异性启动子(LSP)以驱动表达。
图13是条形图，描绘了以微克/毫克CNS组织表示的贮积糖原的量随递送的酶/载体的变化(9个月研究)。X轴描绘了从野生型小鼠比较器(每个第4道)、或未治疗或给与编码GAA(每个第2道)或ScFv-GAA融合物(每个第3道)的质粒的KO小鼠(GAA-/-)(每个第1道)取样的每个CNS组织(脊髓、小脑或海马体)。出人意料地发现，用融合蛋白治疗的小鼠展现CNS组织中的糖原贮积量相较于递送编码GAA且无任何融合结合域的载体稳固地减少。
图14A是描绘在AAV递送特定剂量的含GAA的特定载体构建体之后3个月，每毫克脊髓组织中贮积糖原的量(ug糖原/mg组织；y轴)(vg＝病毒基因组)的图。提供了野生型小鼠(第1道；x轴)与未治疗(第2道；x轴)、或给与编码GAA(每个第3道；x轴)或不同剂量的抗CD63ScFv-GAA融合物(第4-6道；x轴)的质粒的KO小鼠(GAA-/-)的糖原水平的比较。脊髓中贮积糖原水平随ScFv-GAA融合物的剂量增加而降低，其中1e11vg剂量对受试者提供的益处大于等效剂量的单独GAA(无融合物)。
图14B是描绘在AAV递送特定剂量含GAA的特定载体构建体之后3个月，每毫克脑组织中贮积糖原的量(ug糖原/mg组织；y轴)(vg＝病毒基因组)的图。提供了野生型小鼠(第1道；x轴)与未治疗(第2道；x轴)、或给与编码GAA(每个第3道；x轴)或不同剂量的抗CD63ScFv-GAA融合物(第4-6道；x轴)的质粒的KO小鼠(GAA-/-)的糖原水平的比较。脑中的贮积糖原水平随ScFv-GAA融合物剂量增加而降低，其中1e11vg剂量对受试者提供的益处大于等效剂量的单独GAA(无融合物)。
具体实施方式
本发明并不限于所述的特定实施例、组合物、方法和实验条件，因为这些实施例、组合物、方法和条件可变化。本文使用的术语只出于描述特定实施例的目的，而不打算作为限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书限制。
尽管可使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料实践或测试本发明，但现描述一些优选的方法和材料。本文引用的所有出版物都以全文引用的方式并入本文进行描述。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
“血脑屏障”是指将血液与中枢神经***中的脑和细胞外液隔开的半透膜屏障。屏障阻挡了某些物质至脑和脊髓的通路或选择性转运。血脑屏障是由脑内皮细胞形成。
“治疗有效量”是指递送至受试者以使受试者获得一致血液水平(血清/血浆水平)的所编码治疗性蛋白质的载体的量或剂量。一般来说，所述方法中可利用约1×109至约1×1016浓度的基因组载体。递送至肝的剂量可以是每1kg约1×1010至5×1013个AAV基因组。剂量将被调整成平衡跨血脑屏障实现分子所希望的作用的治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可取决于所用重组载体而变化。可通过提取血清或血浆监测血液循环中转基因的表达水平，以确定循环蛋白质达到稳态的载体的剂量频率。本领域普通技术人员可通过例如执行实验以确定在递送载体之后连续数天、数周或数月内治疗性蛋白质的一致血液水平来确定有效量的具体值。本领域中已知测试循环治疗性蛋白质的适合实验，包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、LC-MS等。在一个实例中，CNS中scFv-GAA融合蛋白的治疗有效量是产生足量scFv-GAA融合蛋白以减少CNS组织中，例如脊髓、小脑或海马体组织中贮积糖原的病毒载体的量。
CNS病症
各种脑部病症可得益于本文所述的治疗性蛋白质的递送模式。适合于蛋白质疗法的CNS病症和具有神经症状的病症包括但不限于：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's)、脑癌、***(Behcet's Disease)、狼疮脑、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、痴呆、癫痫症、脑炎、弗里德希氏共济失调(Friedreich's Ataxia)、吉兰-巴雷二氏综合征(Guillain-Barre Syndrome)、戈谢氏病、头痛、脑积水、亨廷顿氏病(Huntington'sdisease)、颅内高压、脑白质营养不良、偏头痛、重症肌无力、肌肉营养不良、多发性硬化、发作性睡病、神经病变、普拉德-威利二氏综合征(Prader-Willi Syndrome)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、瑞特氏综合征(Rett Syndrome)、腿不宁综合征、睡眠障碍、蛛网膜下出血、中风、创伤性脑损伤、三叉神经痛、短暂性缺血发作及希-林二氏综合征(VonHippel-Lindau Syndrome)(血管瘤病)。
将治疗性蛋白质与抗CD63融合物递送至CNS可因其遍在的表达、其作为细胞外囊泡(EV；例如外泌体)的膜蛋白的作用及与整合素的缔合而特别有益。具有与内化效应物类似的特性的其它细胞表面受体包括：ITGA7、CD9、CD63、CD81、CD82及CD151，并且可具有组织或细胞类型特异性，以便增强所希望位置的摄取，如本说明书通篇所论述。
经显示，将治疗性蛋白质与抗转铁蛋白融合物递送至CNS也特别有益。因此，通过使用递送机制，如将抗受体融合物递送至特定血脑屏障(BBB)靶，将增强治疗性蛋白质的运输和递送。经显示，一些BBB靶有利于CNS摄取(Zuchero等人,2016年1月6日,《神经元(Neuron)》,89(1):70-82；Boado,RJ等人,《分子药物学(Mol Pharm.)》,2014年8月4日；11(8):2928-2934；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。具有与转铁蛋白受体类似的BBB摄取特性的其它细胞表面受体包括但不限于：胰岛素受体、CD98和基础免疫球蛋白(Bsg)。
在一些实施例中，通过使用抗转铁蛋白受体或抗胰岛素受体、或抗CD98或抗Bsg将治疗性蛋白质靶向递送至CNS组织(例如脑)。如本说明书通篇所论述，治疗性蛋白质也可与内化效应物抗体融合。在一些实施例中，通过使用抗胰岛素受体递送结构域将治疗性蛋白质靶向递送至CNS和周围组织，以例如增强脑吸收以及周围吸收(Boado,RJ等人,2014年,同前述；Yu等人,2011年5月25日,《科学转化医学(Science Transl Med.)》3:84ra44，各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
本领域中众所周知可用作如本文所描述的多结构域治疗性蛋白质的一部分的示例性抗转铁蛋白受体、抗胰岛素受体、抗CD98和抗Bsg抗体及其部分(关于非限制性示例性抗转铁蛋白受体抗体，参见例如US20170174778；US20150196663；US9629801；US20180002433；WO2016081643；US20180134797；WO2014189973；US20150110791；US9708406；US20170260292；WO2016081640；US20180057604；US9611323；WO2012075037；WO2018210898；US20180344869；US20180282408；US20170051071；WO2016207240；WO2015101588；US20160324984；US20180222993；WO2017055542；US20180222992；WO2017055540；Cabezon,I.等人,《分子药物学》,2015年11月2日；12(11):4137-45；Yu YJ等人,《科学转化医学》(2014)6:261ra154；Couch等人,《科学转化医学》,2013年5月1日；5(183)：183ra57,1-12；以及Yu等人,2011,同前述；关于非限制性示例性抗CD98抗体，参见例如WO2017214456；WO2017214458；WO2017214462；WO2008017828；WO2015146132；WO2016094566；WO2013078377；WO2017026497；Hayes GM等人,《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》(2015)137:710-20；以及Bixby等人,《美国血液学会2015年大会摘要#3809(American Society Hematology 2015Meeting Abstract#3809)》；关于非限制性示例性抗BSG抗体，参见例如WO2011112566；US20110223176；US20140079711；WO2010036460；US8618264；WO2005092381；WO2018165619；及WO2017186182；关于非限制性示例性抗胰岛素受体抗体，参见例如US8974791；WO2013081706；US20160152719；US20160208006；US20170114152；Pardridge,WM等人,《生物药物(BioDrugs.)》2018年4月；32(2):169-176；Boado RJ等人,《分子药物学》(2016)13:3241-6；Cieniewicz AM等人,《糖尿病(Diabetes)》(2017)66:206-217；Bexwada,P.等人,《药理学与实验治疗学杂志(J Pharmacol ExpTher.)》2016年2月；356(2):466-73；以及Bedinger,DH等人,《药理学与实验治疗学杂志》2015年4月；353(1):35-43；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。熟练技术人员可以容易地将这些众所周知的抗体或其抗原结合部分(例如由其得到的scFv)连接至如本文所描述的治疗性蛋白质以制备和使用如本文所描述的多结构域治疗性蛋白质。
溶酶体贮积病
“酶缺乏疾病”包括非溶酶体贮积病，如克拉伯氏病(Krabbe disease)(半乳糖基神经酰胺酶)、苯酮酸尿症、半乳糖血症、枫糖浆尿病、线粒体病症、弗里德希氏共济失调、泽尔韦格氏综合征(Zellweger syndrome)、肾上腺脑白质营养不良、威尔逊氏病(Wilsondisease)、血色素沉着病、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、甲基丙二酸血症、丙酸血症及溶酶体贮积病。“溶酶体贮积病”包括由溶酶体功能缺陷引起的任何病症。目前，已鉴别出约50种溶酶体贮积病，其中最众所周知的包括泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs)、戈谢氏病和尼曼-皮克二氏病(Niemann-Pick disease)。该疾病的发病机制归于不完全降解产物在溶酶体中的积累，通常是由蛋白质功能丧失引起。溶酶体贮积病由正常功能降级或协调溶酶体内容物降解的蛋白质中的功能丧失或减弱变体引起。与溶酶体贮积病有关联的蛋白质包括酶、受体和其它跨膜蛋白(例如NPC1)、翻译后修饰蛋白(例如硫酸酯酶)、膜转运蛋白以及非酶辅因子和其它可溶性蛋白质(例如GM2神经节苷脂激活因子)。因此，溶酶体贮积病涵盖超过由缺陷酶本身引起的那些病症，并且还包括由任何分子缺陷引起的任何病症。因此，如本文所使用，术语“酶”意欲涵盖与溶酶体贮积病相关的其它蛋白质。
在很多情况下，分子损伤的性质影响疾病的严重程度，即完全功能丧失往往与出生前或新生儿发作相关，并且涉及严重症状；部分功能丧失与较轻(相对较轻)和晚发型疾病相关。一般来说，只需要恢复较小百分比的活性，以纠正缺陷细胞中的代谢缺陷。表1列出了一些较常见的溶酶体贮积病及其相关功能丧失蛋白。溶酶体贮积病一般在Desnick和Schuchman，2012中有描述。
溶酶体贮积病是影响溶酶体中许多底物降解的一类罕见疾病。这些底物包括鞘脂、粘多糖、糖蛋白、糖原和寡糖，它们可在患有疾病的人的细胞中累积，导致细胞死亡。受溶酶体贮积病影响的器官包括中枢神经***(CNS)、外周神经***(PNS)、肺、肝、骨、骨骼肌和心肌、以及网状内皮***。
治疗溶酶体贮积病的选择包括酶替代疗法(ERT)、底物减少疗法、药物分子伴侣介导的疗法、造血干细胞移植疗法及基因疗法。底物减少疗法的实例包括使用美格鲁特(Miglustat)或依利格鲁司特(Eliglustat)治疗1型戈谢氏病。这些药物通过阻断合酶活性起作用，由此减少后续底物的产生。例如，使用造血干细胞疗法(HSCT)改善和减缓患有某些形式MPS的患者中的阴性中枢神经***表型。参见R.M.Boustany,“溶酶体贮积病-范围扩大(Lysosomal storage diseases--the horizon expands)”,9(10)《自然综述：神经科学(Nat.Rev.Neurol.)》583-98,2013年10月，所述文献以全文引用的方式并入本文中。表1列出了一些溶酶体贮积病及其相关酶或其它蛋白质。
表1：溶酶体贮积病
Figure BDA0002701634710000191
Figure BDA0002701634710000201
最常见的两种LSD是庞贝氏病和法布里氏病。庞贝氏病的估计发病率是1/10,000，由缺陷型溶血体酶α-葡糖苷酶(GAA)引起，导致溶酶体糖原的缺陷性加工。溶酶体糖原的累积主要在骨骼、心脏和肝组织中发生。婴儿发作型庞贝氏病通常在2岁前导致心脏肥大、肌张力减退、肝肿大和由心肺衰竭引起的死亡。成人发作型庞贝氏病在晚至二十至六十岁时发生，并且通常只累及骨骼肌。目前可用的治疗包括Genzyme的
Figure BDA0002701634710000212
(阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa))，它是在CHO细胞中产生并通过静脉内输注施用的重组人α-葡糖苷酶。
法布里氏病包括轻度晚期发作病例，估计总发病率是1/3,000，由缺陷型溶酶体酶α-半乳糖苷酶A(GLA)引起，导致球形三酰神经酰胺在血管以及其它组织和器官中的累积。与法布里氏病相关的症状包括由神经损伤和/或小血管阻塞引起的疼痛；肾功能不全和最终的衰竭；心脏并发症，如高血压和心肌病；皮肤病症状，如血管角化瘤形成、无汗症或多汗症；以及眼部问题，如角膜涡状营养不良、轮辐状白内障、及结膜和视网膜血管异常。目前可用的治疗包括Genzyme的
Figure BDA0002701634710000213
(阿加糖酶β(agalsidase beta))，它是在CHO细胞中产生并通过静脉内输注施用的重组人α-半乳糖苷酶A；Shire的REPLAGALTM(阿加糖酶α)，它是在人成纤维细胞中产生并通过静脉内输注施用的重组人α-半乳糖苷酶A；以及Amicus的GALAFOLDTM(米加司他(migalastat)或1-脱氧半乳糖野尻霉素)，即经口施用的小分子伴侣，它将异常的α-半乳糖苷酶A的折叠转变为功能构象。
目前用于溶酶体贮积病的治疗不太理想。例如，ERT一般必须以高频率和高剂量施用，如每两周一次和高达40mg/kg。另外，一些替代的酶可以是在受试者中免疫交叉反应性(CRIM)、刺激产生IgG并因此阻碍酶通过甘露糖-6-磷酸(M6P)受体递送至溶酶体。IgG可遮蔽替代酶的M6P残基，并且抗原-IgG-抗体复合物可通过Fc受体摄取到细胞溶酶体内，由此优先将替代酶分流至巨噬细胞。
将替代酶递送至适当受累组织也是无效的(参见表2和Desnick&Schuchman,“用于溶酶体病的酶替代疗法：来自20年经验的教训和剩余难题(Enzyme replacement therapyfor lysosomal diseases:lessons from 20years of experience and remainingchallenges)”,13《基因组学与人类遗传学年评(Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.)》307-35,2012)，该文献以全文引用的方式并入本文中。例如，经历针对婴儿型庞贝氏病的长期酶替代治疗的患者仍然可能经受言语鼻音过重、残余肌肉无力、上睑下垂、骨量减少、听力丧失、误吸风险、咽下困难、心律失常和吞咽困难。替代酶的剂量常常必须随时间增加至每周一次或每两周一次40mg/kg。
表2：ERT的无效组织靶向
Figure BDA0002701634710000211
Figure BDA0002701634710000221
内源性甘露糖-6-磷酸受体(MPR)介导大多数重组酶转运至溶酶体。存在两种互补形式的MPR：阳离子非依赖性(CI-MPR)和阳离子依赖性(CD-MPR)。任一种形式的敲除都具有错位的(missorted)溶酶体酶。溶酶体水解酶是在内质网中合成，并且移动到顺面高尔基体网络，在该网络中，它们通过加入甘露糖-6-磷酸(M6P)基团进行共价修饰。这种标记物的形成取决于两种溶酶体酶的序贯效应：UDP-N-乙酰葡糖胺-l-磷酸转移酶(G1cNac-磷酸转移酶)和N-乙酰葡糖胺-l-磷酸二酯-α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(外显酶)。GlcNac-磷酸转移酶催化G1cNAc-1-磷酸残基从UDP-G1cNAc转移到水解酶的高甘露糖型寡糖中所选甘露糖的C6位。然后，外显酶去除末端G1cNAc，暴露出M6P识别信号。在反面高尔基体网络中，M6P信号允许通过选择性结合至M6P受体，将溶酶体水解酶与所有其它类型的蛋白质隔离。所产生的网格蛋白包被囊泡从反面高尔基体网络出芽脱落，并且与次级内体融合。在次级内体的低pH下，水解酶从M6P受体解离，并且空受体再循环到高尔基体用于更多轮转运。
除了通过甘露糖受体递送的β-葡糖脑苷脂酶之外，重组溶酶体酶包含M6P糖基化并且主要通过CI-MPR/IGF2R递送至溶酶体。然而，糖基化/CI-MPR介导的酶替代递送并未达到所有临床相关组织(表2)。酶替代疗法的改善集中在通过以下方式改善CI-MPR递送：(i)使用β2-激动剂克仑特罗(clenbuterol)增加CI-MPR的表面表达(Koeberl等人,“通过骨骼肌中甘露糖-6-磷酸受体的表达增强酶替代疗法在庞贝氏病中的功效(Enhanced efficacyof enzyme replacement therapy in Pompe disease through mannose-6-phosphatereceptor expression in skeletal muscle),”103(2)《分子遗传学与代谢(Mol.Genet.Metab.)》107-12,2011)；(ii)增加酶上M6P残基的量(Zhu等人,“含甘露糖-6-磷酸的寡糖与酸性α-葡糖苷酶缀合改善庞贝氏病小鼠中糖原的清除(Conjugation ofmannose-6-phosphate-containing oligosaccharides to acid alpha-glucosidaseimproves the clearance of glycogen in Pompe mice),”279(48)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》50336-41,2004)；或(iii)将IGF-II结构域与酶融合(Maga等人,“不依赖糖基化的溶酶体靶向酸性α-葡糖苷酶增进庞贝氏病小鼠中的肌肉糖原清除(Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid alpha-glucosidaseenhances muscle glycogen clearance in Pompe mice),”288(3)《生物化学杂志》1428-38,2013)。
大量溶酶体贮积病无法通过酶替代疗法或基因疗法充分治疗，主要是因为替代酶对相关组织或器官的不良靶向、受体宿主中的负面免疫反应以及低血清半衰期。需要改善的酶替代疗法，所述改善的酶替代疗法增强并促进酶的更佳组织生物分布和溶酶体摄取，尤其是脑和脊髓中酶的更佳组织生物分布和溶酶体摄取，无需不期望的胸内注射。申请人已开发出改善的酶替代疗法，该疗法使用不依赖CI-MPR的结合蛋白引导的酶递送和肝表达以将酶提供至靶受累组织，特别是CNS组织的溶酶体。
溶酶体贮积病可根据在缺陷型溶酶体内累积的产物类型进行分类。鞘脂类代谢障碍是影响鞘脂类代谢的一类疾病，鞘脂是含有与脂肪族氨基醇连接的脂肪酸的脂质(评述于S.Hakomori,“细胞相互作用、分化和癌发生中的鞘糖脂(Glycosphingolipids inCellular Interaction,Differentiation,and Oncogenesis),”50《生物化学年评(AnnualReview of Biochemistry)》733-764,1981年7月中；该参考文献以全文引用的方式并入本文中)。鞘脂类代谢障碍的累积产物包括神经节苷脂(例如泰伊-萨克斯二氏病)、糖脂(例如法布里氏病)和葡糖脑苷脂(例如戈谢氏病)。
粘多糖贮积症是影响糖胺聚糖(GAGS或粘多糖)代谢的一组疾病，所述糖胺聚糖是帮助构建骨、软骨、腱、角膜、皮肤和***的重复二糖的长未分支链(评述于J.Muenzer,“用于粘多糖贮积症的早期起始的酶替代疗法(Early initiation of enzymereplacement therapy for the mucopolysaccharidoses)”,111(2),《分子遗传学与代谢(Mol.Genet.Metab.)》63-72(2014年2月)；Sasisekharan等人,“用于研究粘多糖贮积症的结构-功能关系的糖组学方法(Glycomics approach to structure-functionrelationships of glycosaminoglycans)”,8(1)《生物医学工程年刊(Ann.Rev.Biomed.Eng.)》181-231(2014年12月)；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。粘多糖的累积产物包括硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、各种形式的硫酸软骨素和透明质酸。例如，A型莫奎欧氏综合征是由于溶酶体酶半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶缺陷，导致硫酸角蛋白和软骨素-6-硫酸酯的溶酶体累积引起。
糖原贮积病(又名糖原累积病)由细胞无法代谢(产生或分解)糖原引起。糖原代谢由各种酶或其它蛋白质调节，包括葡萄糖-6-磷酸酶、酸性α-葡糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白、醛缩酶A、β-烯醇酶和糖原合酶。示例性溶酶体贮积病/糖原贮积病是庞贝氏病，其中缺陷型酸性α-葡糖苷酶使糖原在溶酶体中累积。症状包括肝肿大、肌无力、心脏衰竭，并且在婴儿变体的情况下，在2岁时死亡(参见DiMauro和Spiegel,“肌肉糖原沉积症的进展和问题(Progress and problems in muscle glycogenosis)”,30(2)《肌肉病学文集(ActaMyol.)》96-102(2011年10月)；所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
“多结构域治疗性蛋白质”包括(i)含多个功能结构域的单个蛋白质；(ii)含多条多肽链的蛋白质；以及(iii)多种蛋白质或多种多肽的混合物。术语多肽一般视为意思指通过肽键连接在一起的单链氨基酸。术语蛋白质涵盖术语多肽，而且还包括更复杂的结构。也就是说，单个多肽是蛋白质，并且蛋白质可含有以更高级结构缔合的一种或多种多肽。例如，血红蛋白是含有四种多肽的蛋白质：两种α珠蛋白多肽和两种β珠蛋白多肽。肌红蛋白也是蛋白质，但它仅含有单一肌红蛋白多肽。
多结构域治疗性蛋白质包含一种或多种多肽以及提供两种功能的至少两个结构域。这些结构域之一是“酶结构域”，其提供了与酶缺乏症相关的缺陷型蛋白质活性的替代。这些结构域中的另一个是“递送结构域”，其提供了与内化效应物的结合。因此，提供酶替代活性和结合至内化效应物(又名内化效应物结合蛋白(递送结构域活性)的能力的单一多肽是多结构域治疗性蛋白质。另外，蛋白质混合物是多结构域治疗性蛋白质，在所述蛋白质混合物中，一种蛋白质提供酶功能，并且另一种蛋白质提供内化效应物结合活性。图1A描绘了多结构域治疗性蛋白质的各种示例。在一个实例(图1A小图A)中，多结构域治疗性蛋白质含有酶(由六边形表示)，以及结合酶(虚线)和内化效应物(实线)的双特异性抗体(IE-BP)。在此处，双特异性抗体的一个臂与酶非共价结合，而另一个臂与内化效应物非共价结合，由此使替代酶能够内化至细胞或亚细胞区室内。在另一个实例(小图B)中，多结构域治疗性蛋白质包括含两种多肽的单个蛋白质，其中一种多肽具有酶功能，并且另一种多肽具有递送结构域功能。在此处，该酶与免疫球蛋白Fc结构域或重链恒定区融合，其与酶半抗体的Fc结构域缔合形成双功能多结构域治疗性蛋白质。小图B中描绘的实施例类似于小图A中的实施例，不同之处在于该酶共价连接至半抗体之一，而不是通过在半抗体的免疫球蛋白可变结构域处的抗原-抗体相互作用共价连接至半抗体之一。
在其它实例中，多结构域治疗性蛋白质由共价连接(直接地或通过连接子间接地连接)至递送结构域的酶组成。在一个实施例中，所述酶连接至免疫球蛋白分子的C末端(例如重链或替代地轻链)。在另一个实施例中，所述酶连接至免疫球蛋白分子的N末端(例如重链或替代地轻链)。在这些示例中，免疫球蛋白分子是递送结构域。在又另一个实施例中，所述酶连接至结合内化效应物的scFv分子的C末端。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含至少两个，且在一些实施例中不超过两个递送结构域，所述递送结构域各自针对同一抗原上或两种不同抗原上的独特表位。在一个实施例中，第一递送结构域结合至溶酶体运输分子或其它内化效应物(例如CD63)或其它类似的细胞表面受体，如ITGA7、CD9、CD63、CD81、CD82或CD151。在另一个实施例中，第二递送结构域结合至转胞吞作用效应物，以促进多结构域治疗性蛋白质的跨细胞转运。在一个实施例中，转胞吞作用效应物尤其是LDL受体、IgA受体、转铁蛋白受体或新生儿Fc受体(FcRn)。在一个具体实施例中，转胞吞作用递送结构域包含结合至转铁蛋白受体的分子，如抗转铁蛋白受体抗体或抗转铁蛋白受体scFv分子。关于介导可用于本发明实践的转胞吞作用的细胞表面受体，Tuma和Hubbard，“转胞吞作用：跨细胞屏障(Transcytosis:CrossingCellular Barriers),”《生理学评论(Physiological Reviews)》,83(3):871-935(2003年7月1日)以引用的方式并入本文。在一个实施例中，第二递送结构域结合至转铁蛋白受体或其它类似的细胞表面蛋白，如胰岛素受体、CD98或基础免疫球蛋白(Bsg)。包含至少两个递送结构域的每一多结构域治疗性蛋白质还包含至少一个酶结构域，例如所述至少两个递送结构域各自可以或可以不独立地以本文所描述的方式(例如通过抗原-抗体相互作用、通过直接共价连接、通过间接共价连接等)缔合酶结构域，其中所述至少两个递送结构域中的至少一个与酶结构域缔合。此外，所述至少两个递送结构域各自可独立地包含抗体、半体或scFv(例如与Fc融合的scFv)。
“酶结构域”或“酶”指示与酶缺乏症的病因或生理效应相关的任何蛋白质。酶包括实际的酶、转运蛋白、受体或其它蛋白质，其是有缺陷的并且归因于引起疾病的分子损伤。酶还包括可提供类似或足够的生物化学或生理活性来替代或绕过疾病的分子损伤的任何蛋白质。例如，“同工酶”可用作酶。溶酶体贮积病相关蛋白质的实例包括表1中作为“涉及的酶/蛋白质”列出的那些蛋白质，以及任何已知或以后发现的蛋白质或其它分子，其绕过酶缺乏症的分子缺陷。
在一些实施例中，所述酶是水解酶，包括酯酶、糖基化酶、作用于醚键的水解酶、肽酶、线性酰胺酶、二磷酸酶、酮水解酶、卤化酶、磷酰胺酶、磺基水解酶、亚磺酸酶(sulfinase)、脱亚磺酸酶等等。在一些实施例中，所述酶是糖基化酶，包括糖苷酶和N-糖基化酶。在一些实施例中，所述酶是糖苷酶，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶、纤维素、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶、菊粉酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切-1,4-b-木聚糖酶、葡聚糖酶、几丁质酶、聚半乳糖醛酸酶、溶菌酶、外切-α-唾液酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α,α-海藻糖、β-葡萄糖醛酸酶、木聚糖内切-1,3-β-木糖苷酶、淀粉-α-1,6-葡糖苷酶、透明质酸葡糖胺酶、透明质酸葡萄糖醛酸酶等等。
在分子缺陷是α-葡糖苷酶活性缺乏的庞贝氏病的情况下，酶包括人α-葡糖苷酶和“同工酶”，如其它α-葡糖苷酶、工程改造的重组α-葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、重组葡糖苷酶、工程改造成水解末端非还原性1-4连接的α-葡萄糖残基以释放单个α-葡萄糖分子的任何蛋白质、任何EC 3.2.1.20酶、用于糖原或淀粉的天然或重组低pH值碳水化合物水解酶、以及葡糖基水解酶，如蔗糖酶异麦芽糖酶、麦芽糖酶葡糖淀粉酶、葡糖苷酶II和中性α-葡糖苷酶。
“内化效应物”包括能够被内化至细胞内或以其它方式参与或促成逆行膜运输的蛋白质，在一些情况下是受体蛋白。内化效应物(Internalization effector/internalizing effector)和内化受体(internalization receptor/internalizingreceptor)在本文可互换使用。在一些情况下，内化效应物是经历转胞吞作用的蛋白质；也就是说，蛋白质被内化于细胞的一侧上并且被转运至细胞的另一侧(例如顶端至基底)。在许多实施例中，内化效应蛋白是细胞表面表达的蛋白质或可溶性细胞外蛋白质。然而，本发明还涵盖内化效应蛋白在细胞内区室内表达的实施例，所述细胞内区室例如内体、内质网、高尔基体、溶酶体等。例如，涉及逆行膜运输(例如从早期/再循环内体至反面高尔基体网络的途径)的蛋白质可在本发明的各种实施例中充当内化效应蛋白。无论如何，递送结构域与内化效应蛋白的结合使得整个多结构域治疗性蛋白质以及与其相关的任何分子(例如酶)也变得内化至细胞中。如下文所解释，内化效应蛋白包括直接内化至细胞内的蛋白质，以及间接内化至细胞内的蛋白质。
直接内化至细胞内的内化效应蛋白包括具有至少一个细胞外结构域的膜相关分子(例如跨膜蛋白、GPI锚定蛋白等)，所述膜相关分子经历细胞内化，并且优选通过细胞内降解和/或再循环途径加工。直接内化至细胞内的内化效应蛋白的具体非限制性实例包括例如CD63、MHC-I(例如HLA-B27)、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质，又名VIP17)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体(例如SCARA1-5、SCARB1-3、CD36)等等。
在一个实施例中，内化效应物在若干组织类型中表达并且可用于希望靶向CNS和周边细胞类型的治疗。可用于运输至CNS和周边细胞类型的内化效应物包括但不限于：CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体。在某些实施例中，内化效应物是促乳素受体(PRLR)。已发现，PRLR不仅是某些治疗应用的靶，而且基于其高内化率和周转率，还是有效的内化效应蛋白。例如，W02015/026907中示出了PRLR作为内化效应蛋白的潜力，其中尤其证实了抗PRLR抗体在体外被PRLR表达细胞有效内化。
靶向由若干细胞类型表达的内化效应物可用于希望靶向CNS和周边细胞类型的情形，例如治疗疾病，如法布里氏病、戈谢氏病、MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPSIIID、MPS IVB、MPS VI、MPS VII、MPS IX、庞贝氏病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、α甘露糖苷贮积症、神经氨酸酶缺乏症、唾液酸贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、非典型性戈谢氏病、法伯氏脂肪肉芽肿病、岩藻糖苷贮积症及β甘露糖苷贮积症。
在另一个实施例中，内化效应物在几种组织类型中表达。在一个实例中，内化效应物可优先靶向骨和软骨。可用于运输至CNS以及运输至骨和软骨中任一种或两种的效应物包括但不限于胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1。这些效应物可用于希望靶向CNS以及骨架和软骨的治疗中。
优先由骨和软骨表达的靶向内化效应物可用于希望靶向CNS以及骨架和软骨的情形，例如治疗疾病，如MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIID、MPS IVA、MPS IVB、MPSVI、MPS VII、MPS IX、β甘露糖苷贮积症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、法伯氏脂肪肉芽肿病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症、粘多糖病及α甘露糖苷贮积症。
在又另一个实施例中，内化效应物优先在特定组织或细胞类型，如巨噬细胞、单核细胞和微神经胶质细胞中表达。可用于运输至CNS以及运输至巨噬细胞的效应物包括但不限于清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)。这些效应物可用于希望靶向CNS和巨噬细胞的治疗中。CNS巨噬细胞可称为微神经胶质细胞。
优先由巨噬细胞(单核细胞或微神经胶质细胞)表达的靶向内化效应物可用于希望靶向CNS和巨噬细胞(或微神经胶质细胞)的情形，例如治疗疾病，如溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症及法伯氏脂肪肉芽肿病。
在某些实施例中，内化效应物是肾特异性内化效应物，如CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)。
优先在肾中表达的靶向内化效应物可用于希望靶向CNS和肾的情形，例如治疗疾病，如法布里氏病、奥尔波特氏综合征、多囊性肾病及血栓性的血小板减少性紫癜。
在又另一个实施例中，内化效应物优先在特定组织或细胞类型，如肝中表达。可用于运输至CNS以及运输至肝的效应物包括但不限于ASGR1和ASGR2。这些效应物可用于希望靶向CNS和肝的治疗中。
优先在肝中表达的靶向内化效应物可用于希望靶向CNS和肝的情形，例如治疗疾病，如溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、MPS VI、MPS VII、MPS II、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、法伯氏脂肪肉芽肿病。
在一些实施例中，所述内化效应物是肌肉特异性内化剂，如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)。
优先由肌肉表达的靶向内化效应物可用于希望靶向CNS和肌肉组织的情形，例如治疗疾病，如庞贝氏病。
在一些实施例中，内化效应物是ITGA7、ITGA10、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR。针对ITGA7、ITGA10、CD9、CD63、APLP2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR的抗体是本领域中众所周知的(关于示例性非限制性抗IGTA7抗体，参见例如R&D Systems“整合素α7：产品(Integrin alpha 7:Products)”；关于抗ITGA10抗体的示例性非限制性实例，参见例如US8048991、US20120034625、US8563255、US20140099716、US20160319023、WO2018138322及US10087253；关于示例性非限制性抗CD63抗体，参见例如WO201102982、WO2014185908、US20160115229、WO2017134197、US9738717；及de Goeij BE等人,《分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)》(2016)11月；15(11):2688-2697；关于示例性非限制性抗APLP2抗体，参见例如US543153A、US5441931A、US5677146A和US5935854A；关于抗MSR1抗体的示例性非限制性实例，参见例如R&D Systems关于MAB27081的产品名录、R&D Systems关于AF2708的产品名录、AbCam产品名录ab1515707；Yu X等人,《生物化学杂志》,2011；286(21):18795-806；及N Nishijima等人,《免疫学前沿(Front Immunol)》,2017；8(0):379；关于抗ASGR1抗体的示例性非限制性实例，参见例如WO2017058944；关于非限制性示例性抗ASGR2抗体，参见例如Origene的针对ASGR2的抗体，可见于www.origene.com/category/antibodies？q＝ASGR2&sub_category＝Primary+Antibodies&reactivities＝Human；关于示例性非限制性抗PRLR抗体，参见例如US9649374；US9302015；US20130171147；US10106616；WO2015026907；US9777063；WO2011069795；US20130272968；US20140141003；WO2011069799；US20120315276；WO2012163932；US9241989；WO2012136519；WO2011069798；WO2019011719；US8883979；US20140065158；WO2015187596；US9353186；WO2018102304；US20130022606；US9688764；US20130129739；US20160002342；US20150056222；US20150056221；US20170008965；US20150093393；WO2011069797；US20160251442；US20180094066；WO2014036076；US20180185504；US20140271659；WO2011069794；WO2014143909；US20160319029；US9545451；US9023357；US20150252116；WO2011069796；Kelly MP等人,《分子癌症治疗学》(2017)7月；16(7):1299-1311；Otto C.等人,《内分泌学(Endocrinology)》(2015)156:4365-73 2017-01-20；及Andreev J等人,《分子癌症治疗学》(2017)4月；16(4):681-693；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。熟练技术人员可以容易地将这些众所周知的抗体或其抗原结合部分(例如由其得到的scFv)连接至如本文所描述的治疗性蛋白质以制备和使用如本文所描述的多结构域治疗性蛋白质。
在内化效应物(IE)直接内化至细胞中的实施例中，递送结构域可以是例如特异性结合IE的抗体或抗体的抗原结合片段，或者与IE特异性相互作用的配体或配体的一部分。例如，如果IE是Kremen-1或Kremen-2，则递送结构域可包含Kremen配体(例如DKK1)或其Kremen结合部分，或由其组成。作为另一个实例，如果IE是受体分子，如ASGR1，则递送结构域可包含受体特异性配体(例如脱唾液酸血清类粘蛋白[ASOR]或β-Ga1NAc)或其受体结合部分，或由其组成。
间接内化至细胞中的内化效应蛋白包括这样一类蛋白质和多肽，这些蛋白质和多肽自身并不内化，但在与直接内化至细胞中的第二蛋白质或多肽结合或以其它方式缔合后，变得内化至细胞内。间接内化至细胞中的蛋白质包括例如能够结合至内化性细胞表面表达的受体分子的可溶性配体。通过与内化性细胞表面表达的受体分子的相互作用(间接)内化至细胞中的可溶性配体的非限制性实例是转铁蛋白。在IE是转铁蛋白(或另一种间接内化的蛋白质)的实施例中，递送结构域与IE的结合以及IE与转铁蛋白受体(或另一种内化性细胞表面表达的受体分子)的相互作用，使得整个递送结构域以及与其相关的任何分子(例如酶)变得内化至细胞中，且同时进行IE和其结合搭配物的内化。
在IE间接内化至细胞中的那些实施例中，递送结构域可以是例如抗体、抗体的抗原结合片段、或特异性结合IE的scFv、或者与可溶性效应蛋白特异性相互作用的受体或受体的一部分。例如，如果IE是细胞因子，则递送结构域可包含相应细胞因子受体或其配体结合部分，或由其组成。
示例性IE是CD63，它是跨越细胞膜四次的细胞表面蛋白的四次跨膜蛋白超家族的成员。CD63在实际上所有组织中表达，并且被认为涉及信号传导复合物的形成和稳定化。CD63定位于细胞膜、溶酶体膜和次级内体膜。已知CD63与整合素缔合并且可涉及上皮-间充质转化。参见H.Maecker等人,“四次跨膜蛋白超家族：分子促进子(The tetraspaninsuperfamily:molecular facilitators),”11(6)FASEB J.428-42，1997年5月；以及M.Metzelaar等人,“由用于真核细胞中细胞内抗原的筛选程序克隆的CD63抗原-一种新颖的溶酶体膜糖蛋白(CD63antigen.A novel lysosomal membrane glycoprotein,clonedby a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells),”266《生物化学杂志》3239-3245,1991，各文献以全文引用的方式并入本文中。
另一个示例性IE是淀粉样β(A4)前体样蛋白质2(“APLP2”)，它是APP(淀粉样前体蛋白)家族的遍在表达的成员。APLP2是已知与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子(例如Kd)相互作用的膜结合蛋白。它在细胞表面处结合Kd，并且紧跟着以网格蛋白依赖性方式与Kd一起内化。参见Tuli等人,“淀粉样前体样蛋白质2增强主要组织相容性复合体I类分子降解的机制(Mechanism for amyloid precursor-like protein 2enhancement of majorhistocompatibility complex class I molecule degradation),”284《生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)》34296-34307(2009)；所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
另一个IE示例是促乳素受体(PRLR)。促乳素受体是I型细胞因子受体家族的成员，并且在配体结合且随后二聚化后激活“酪氨酸激酶Jak2、Fyn和Tec，磷酸酶SHP-2，鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav和信号传导抑制因子SOCS”(参见Clevenger和Kline,“促乳素受体信号转导(Prolactin receptor signal transduction),”10(10)《狼疮(Lupus)》706-18(2001),摘要；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。促乳素受体经历胞吞再循环并且可在溶酶体级分中发现。参见Genty等人,“在促乳素受体cDNA稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞中促乳素和其受体的胞吞作用和降解(Endocytosis and degradation of prolactin and itsreceptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactinreceptor cDNA),”99(2)《分子与细胞内分泌学(Mol.Cell Endocrinol.)》221-8(1994)；以及Ferland等人,“氯喹对大鼠肝中溶酶体促乳素受体的影响(The effect of chloroquineon lysosomal prolactin receptors in rat liver),”115(5)《内分泌学》1842-9(1984)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
如本文所使用，“免疫反应”一般是指患者对外部或‘非自身’蛋白质的免疫应答。这种免疫应答包括***反应和干扰替代酶有效性的抗体的产生。一些患者可能不会产生任何无功能的蛋白质，由此使替代酶成为“外来”蛋白质。例如，对缺乏GLA的法布里氏病患者重复注射重组GLA(rGLA)频繁导致***反应。在其它患者中，经显示，针对rGLA的抗体的产生可降低替代酶在治疗疾病中的有效性。参见例如Tajima等人,(“修饰的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(NAGA)在开发用于法布里氏病的酶替代疗法中的用途(Use of a Modified α-N-Acetylgalactosaminidase(NAGA)in the Development of Enzyme Replacement Therapyfor Fabry Disease),”85(5)《美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.)》569-580(2009))，其中论述了修饰的NAGA作为替代GLA的“同工酶”的用途。修饰的NAGA与GLA没有免疫交叉反应性，并且“不与来自用重组GLA重复治疗的法布里氏病患者的血清反应”。同上，摘要。
“免疫抑制剂”包括引起一般的免疫抑制作用的药物和/或蛋白质，并且可分别用于庞贝氏病或法布里氏病患者中预防针对替代酶(例如GAA或GLA)的交叉反应性免疫材料(CRIM)。免疫抑制剂的非限制性实例包括氨甲蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)DNA烷化剂、抗CD20抗体、抗BAFF抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体及其任何组合。
对组织，例如对肝具有特异性的调控元件，例如启动子，在具有该调控元件特异性的组织中增强处于此类调控元件控制下的核酸序列，例如基因的表达。肝特异性调控元件，例如肝特异性启动子的非限制性实例，可见于Chuah等人,(2014)《分子疗法(Mol.Ther.)》22:1605-13，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
术语“蛋白质”意指具有通过酰胺键共价连接的超过约20个氨基酸的任何氨基酸聚合物。蛋白质含有一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中一般称为“多肽”。因此，多肽可以是蛋白质，并且蛋白质可含有多种多肽以形成单一功能性生物分子。在一些蛋白质中可存在二硫桥(即，在半胱氨酸残基之间用于形成胱氨酸)。这些共价键可在单个多肽链内，或在两个个别多肽链之间。例如，二硫桥对于胰岛素、免疫球蛋白、鱼精蛋白等等的适当结构和功能是必需的。关于近期二硫键形成的综述，参见Oka和Bulleid,“内质网中二硫键的形成(Forming disulfides in the endoplasmic reticulum),”1833(11)《生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)》2425-9(2013)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
如本文所使用，“蛋白质”包括生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法中的重组蛋白质、陷阱蛋白质和其它Fc-融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、scFv融合蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素等等。可使用基于重组细胞的生产***如昆虫杆状病毒***、酵母***(例如毕赤酵母属物种(Pichia sp.))、哺乳动物***(例如CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)来产生蛋白质。关于论述生物治疗性蛋白质及其产生的最近综述，参见Ghaderi等人,“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台(Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.)非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Occurrence,impact,and challenges of non-humansialylation),”28《生物技术与遗传工程评论(Biotechnol Genet Eng Rev.)》147-75(2012)，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
如本文所使用，术语“抗体”包括含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区可以进一步细分成被称作互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其间散布有被称作构架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3。术语“高亲和力”抗体指对于其靶具有至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M、或至少10-12M的结合亲和力的那些抗体，所述结合亲和力是通过表面等离子体共振，例如BIACORETM或溶液亲和性ELISA测量。术语“抗体”可涵盖任何类型的抗体，例如单克隆或多克隆抗体。此外，抗体可为或来自任何来源，例如哺乳动物或非哺乳动物。在一个实施例中，抗体可为哺乳动物或禽类。在另一个实施例中，抗体可为或人来源，并且还可为人单克隆抗体。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体一般包含两条不同的重链，其中每条重链特异性结合两个不同分子(例如抗原)上或同一分子上(例如在同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对于第一表位的亲和力一般比第一重链对于第二表位的亲和力低至少一个到两个或三个或四个数量级，并且反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可在相同或不同的靶上(例如在相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可例如通过组合识别相同抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别相同抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且这样的序列可在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。通常的双特异性抗体具有两条重链以及免疫球蛋白轻链，所述两条重链各自具有三个重链CDR，随后为(N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性，但可与每条重链结合，或者可与每条重链结合并且可结合由重链抗原结合区结合的一个或多个表位，或者可与每条重链结合并且使得重链之一或两者能够与一个或两个表位结合。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括重链可变结构域。除非另外说明，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR以及其组合。典型重链在可变结构域之后具有(从N端到C端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能片段包括能够特异性识别抗原的片段(例如以在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别抗原)，其能够由细胞表达且分泌，并且包含至少一个CDR。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括人κ和λ轻链。除非另有说明，否则轻链可变(VL)结构域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般地，全长轻链从氨基末端到羧基末端包括含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的VL结构域和轻链恒定结构域。可用于本发明的轻链包括例如不选择性结合由抗原结合蛋白选择性结合的第一抗原或第二抗原的那些。适合的轻链包括可通过在现有抗体文库(湿文库或在计算机芯片上)中筛选最常用的轻链鉴别的轻链，其中所述轻链基本上不干扰抗原结合蛋白的抗原结合结构域的亲和力和/或选择性。适合的轻链包括可结合被抗原结合蛋白的抗原结合区结合的一个或两个表位的那些。
短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链(根据需要进行修饰)的氨基酸序列，其从N末端到C末端序贯包含下述氨基酸区(除非另有说明)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“可变结构域”包括能够折叠成具有双重β片层结构的经典结构域(VH或VL)的氨基酸序列，其中β片层通过第一β片层和第二β片层的残基之间的二硫键连接。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个构架区之间。CDR可由例如种系序列或者重排或未重排序列，以及例如天然或成熟的B细胞或T细胞编码。在一些情况下(例如对于CDR3)，CDR可由两个或更多个序列(例如生殖系序列)编码，所述两个或更多个序列是不邻接的(例如在未重排的核酸序列中)，但在B细胞核酸序列中是邻接的，例如由于剪接或连接序列而邻接(例如V-D-J重组形成重链CDR3)。
术语“抗体片段”指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。在术语“抗体片段”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含由在铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)《自然(Nature)》241:544-546)；(vi)分离的CDR，以及(vii)scFv，其由Fv片段的两个结构域，即VL和VH通过合成连接子接合形成单一蛋白质链组成，其中VL与VH区配对形成单价分子。其它形式的单链抗体，如双功能抗体，也涵盖在术语“抗体”内(参见例如Holliger等人(1993)PNAS USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994)《结构(Structure)》2:1121-1123，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
短语“含Fc的蛋白质”包括抗体、双特异性抗体、免疫粘附素和其它结合蛋白，其包含免疫球蛋白CH2和CH3区的至少一个功能部分。“功能部分”是指可结合Fc受体(例如FcγR；或FcRn，即新生儿Fc受体)和/或可参与补体激活的CH2和CH3区。如果CH2和CH3区含有使其不能与任何Fc受体结合并且也不能激活补体的缺失、置换和/或***或其它修饰，则CH2和CH3区是无功能的。
含Fc的蛋白质可包含免疫球蛋白结构域中的修饰，包括影响结合蛋白的一种或多种效应子功能的修饰(例如影响FcγR结合、FcRn结合并由此影响半衰期和/或CDC活性的修饰)。参考免疫球蛋白恒定区的EU编号，此类修饰包括但不限于以下修饰及其组合：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
例如，但不作为限制，结合蛋白是含Fc的蛋白质，并且展现出增强的血清半衰期(与没有所述修饰的相同含Fc的蛋白质相比)，并且在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处具有修饰；或在428和/或433(例如L/R/SI/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处具有修饰；或在250和/或428处具有修饰；或在307或308(例如308F、V308F)和434处具有修饰。在另一个实例中，修饰可包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、2591(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；307和/或308修饰(例如308F或308P)。
如本文所使用，术语“抗原结合蛋白”指特异性识别抗原上的表位的多肽或蛋白质(在功能单元中复合的一种或多种多肽)，所述抗原例如细胞特异性抗原和/或本发明的靶抗原。抗原结合蛋白可为多特异性的。关于抗原结合蛋白的术语“多特异性”意指蛋白质识别不管是在相同的抗原上还是在不同的抗原上的不同表位。本发明的多特异性抗原结合蛋白可为单个多功能多肽，或者它可为彼此共价或非共价缔合的两个或更多个多肽的多聚复合物。术语“抗原结合蛋白”包括可与另一个功能分子，例如另一种肽或蛋白质连接或共表达的本发明抗体或其片段。例如，抗体或其片段可与一个或多个其它分子实体，如蛋白质或其片段功能性连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。
如本文所使用，术语“表位”指被多特异性抗原结合多肽识别的抗原的一部分。单个抗原(例如抗原性多肽)可具有超过一个表位。表位可以定义为结构性或功能性的。功能表位一般是结构表位的子集，并且定义为直接促成抗原结合多肽与抗原之间相互作用的亲和力的那些残基。表位还可以是构形性的，即，由非线性氨基酸构成。在某些实施例中，表位可以包括作为分子的化学活性表面基团的决定子，所述基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可以具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。由邻接氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。
术语“结构域”指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何部分。优选地，本发明的结构域结合至细胞特异性抗原或靶抗原。如本文所使用，细胞特异性抗原或靶抗原结合结构域等等包括任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传工程改造的特异性结合抗原的多肽或糖蛋白。
术语“半体”或“半抗体”可互换使用，意思指抗体的一半，其基本上含有一条重链和一条轻链。抗体重链可形成二聚体，因此一个半体的重链可与缔合不同分子(例如另一个半体)或另一个含Fc多肽的重链缔合。两个略微不同的Fc-结构域可“异源二聚化”，如在双特异性抗体或其它异源二聚体、-三聚体、-四聚体等等的形成中。参见Vincent和Murini，“当前抗体工程改造策略：Fc工程改造和pH依赖性抗原结合、双特异性抗体和抗体药物缀合物(Current strategies in antibody engineering:Fc engineering and pH-dependentantigen binding,bispecific antibodies and antibody drug conjugates),”7《生物技术杂志(Biotechnol.J.)》1444-1450(20912)；以及Shimamoto等人,“肽体：抗体的柔性替代形式(Peptibodies:A flexible alternative format to antibodies),”4(5)MAbs 586-91(2012)，各参考文献以全文引用的方式并入本文。
在一个实施例中，半体可变结构域特异性识别内化效应物，并且半体Fc-结构域与包含替代酶(例如肽体)的Fc-融合蛋白二聚化，同上，586。
术语“单链可变片段”或“scFv”包括含有免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)的单链融合多肽。在一些实施例中，VH和VL通过10至25个氨基酸的连接子序列连接。ScFv多肽还可包括其它氨基酸序列，例如CL或CH1区。ScFv分子可通过噬菌体展示来制造，或可通过直接从杂交瘤或B细胞亚克隆重链和轻链来制备。关于通过噬菌体展示和抗体结构域克隆制备scFv片段的方法，Ahmad等人,《临床与发育免疫学(Clinical andDevelopmental Immunology)》,第2012卷,文章ID 98025，以引用的方式并入本文。
“α-葡糖苷酶(Alpha-glucosidase)”(或“α-葡糖苷酶(α-glucosidase)”)、“α-葡糖苷酶活性”、“GAA”和“GAA活性”可互换使用，并且指促进糖原和淀粉的1,4-α键水解成葡萄糖的任何蛋白质。GAA尤其又称为EC 3.2.1.20、麦芽糖酶、葡糖转化酶、葡糖苷蔗糖酶、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶、α-吡喃葡糖苷酶、葡糖苷转化酶、α-D-葡糖苷酶、α-葡糖苷水解酶、α-1,4-葡糖苷酶和α-D-葡糖苷葡糖水解酶。GAA可在溶酶体中和小肠的刷状缘处发现。患有庞贝氏病的患者缺乏功能性溶酶体α-葡糖苷酶。参见S.Chiba,“α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶的分子机制(Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase),”61(8)《生物科学、生物技术与生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)1233-9(1997)；以及Hesselink等人,“特别涉及II型糖原贮积病的肌肉中的溶酶体功能障碍(Lysosomaldysfunction in muscle with special reference to glycogen storage disease typeII),”1637(2)《生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta.)》164-70(2003)，所述参考文献以全文引用方式并入本文中。
“α-半乳糖苷酶A(Alpha-galactosidase A)”(或“α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A)”)、“α-半乳糖苷酶A活性”、“α-半乳糖苷酶”、“α-半乳糖苷酶活性”、“GLA”和“GLA活性”是可互换使用，并且指促进来自糖脂和糖蛋白的末端α-半乳糖基部分水解，且还水解α-D-岩藻糖苷的任何蛋白质。GLA尤其又称为EC3.2.1.22、蜜二糖酶、α-D-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、α-半乳糖苷半乳糖水解酶、α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。GLA是由X连锁GLA基因编码的溶酶体酶。GLA中的缺陷可导致法布里氏病，其中称为球形三酰神经酰胺(又名Gb3、GL-3或三己糖苷神经酰胺)的糖脂在血管内累积(即，显著的血管病变)，导致肾、心脏、皮肤和/或脑血管组织以及其它组织和器官的疼痛和功能受损。参见例如Prabakaran等人,“肾内皮细胞中甘露糖6-磷酸受体和分拣蛋白介导的α-半乳糖苷酶A胞吞作用(Mannose 6-phosphate receptor and sortilin mediated endocytosis of α-galactosidase A in kidney endothelial cells),”7(6)《公共科学图书馆：综合(PLoSOne)》e39975第1-9页(2012)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
一方面，本发明提供了通过向患者施用“多结构域治疗性蛋白质”，来治疗患有溶酶体贮积病的患者(或受试者)的方法。多结构域治疗性蛋白质进入患者的细胞，并且向溶酶体中递送酶或酶促活性(即，“替代酶”)，所述酶或酶促活性替代与LSD相关的酶(即“内源酶”)或酶促活性。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质经由基因治疗载体递送至患者，所述基因治疗载体含有编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸。
LSD包括鞘脂类代谢障碍、粘多糖贮积病和糖原贮积病。在一些实施例中，LSD是法布里氏病、I型戈谢氏病、II型戈谢氏病、III型戈谢氏病、A型尼曼-皮克二氏病、B型尼曼-皮克二氏病、GM1-神经节苷脂贮积症、桑德霍夫氏病、泰伊-萨克斯二氏病、GM2-激活因子缺乏症、GM3-神经节苷脂贮积症、异染性脑白质营养不良、鞘脂激活因子缺乏症、施艾氏病、贺勒-施艾二氏病、贺勒氏病、韩特氏病、A型圣菲利波氏病、B型圣菲利波氏病、C型圣菲利波氏病、D型圣菲利波氏病、A型莫奎欧氏综合征、B型莫奎欧氏综合征、马-拉二氏综合征、史莱氏病、MPS IX和庞贝氏病。在一个具体实施例中，LSD是法布里氏病。在另一个实施例中，LSD是庞贝氏病。
在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含(a)替代酶，以及(b)结合内化效应物的分子实体(递送结构域)。在一些情况下，替代酶是以下任一种或多种：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鞘脂激活蛋白C激活因子、神经酰胺酶、鞘磷脂酶、β-氨基己糖苷酶、GM2激活因子、GM3合酶、芳基硫酸酯酶、鞘脂激活因子、α-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸酶-2-硫酸酯酶、肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰-α-氨基葡糖苷酶、α-葡糖酰胺N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶及透明质酸酶。
在一些情况下，患者无法制备足够的蛋白质，使得替代酶被患者识别为“非自身的”，并且免疫反应在施用替代酶后跟着发生。这是不希望的。因此，在一些实施例中，以避免在受试者中诱导免疫反应的方式设计或生产替代酶。一种这样的解决方案是使用“同工酶”作为替代酶。同工酶足够接近于患者的“自身”蛋白质，但具有足以改善LSD症状的替代酶活性。
在LSD是庞贝氏病并且内源性酶是α-葡糖苷酶(GAA)的一个特定实施例中，同工酶可为酸性α-葡糖苷酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶(SI)、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(MGAM)、葡糖苷酶II(GANAB)和中性α-葡糖苷酶(C GNAC)中的任一种。在LSD是法布里氏病并且内源性酶是α-半乳糖苷酶A(GLA)的另一个特定实施例中，同工酶可为工程改造成具有GLA活性的α-N-乙酰半乳糖胺酶。
本文提供了除使用同工酶外，减少针对替代酶的交叉反应性免疫材料(CRIM)的方法。如图5和6中证实的，包含内化效应物结合结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质(例如通过基因治疗载体)的施用，减少针对施用对照治疗性蛋白质(缺乏内化效应物结构域且包含酶结构域)所包含的替代酶的CRIM水平。因此，在一个实施例中，或减少酶缺乏症患者中针对酶的CRIM包括向患者施用多结构域治疗性蛋白质(或编码其的核酸，例如含有编码多结构域治疗性蛋白质的基因的基因治疗载体，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域(例如内化效应物结合蛋白)和酶结构域。
多结构域治疗性蛋白质具有内化效应物结合蛋白组分，其使替代酶能够摄取到细胞中。因此，在一些实施例中，内化效应物可为CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR(促乳素受体)、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白，又名VIP17)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体、SCARA1-5、SCARB1-3及CD36。在某些实施例中，内化效应物是肾特异性内化剂，如CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，内化效应物是肌肉特异性内化剂，如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)。在一些具体实施例中，内化效应物是ITGA7、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2或PRLR。
在一些实施例中，内化效应物结合蛋白包含抗原结合蛋白，其包括例如受体-融合分子、陷阱分子、受体-Fc融合分子、抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、CDR3肽、受限的FR3-CDR3-FR4肽、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体、单价纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、骆驼科抗体(VHH重链同型二聚体抗体)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
在一个实施例中，结合内化效应物的分子实体是抗体、抗体片段或其它抗原结合蛋白。例如，分子实体可为双特异性抗体，其中一个臂结合内化效应物(例如ITGA7、CD9、CD63、PRLR、APLP2、ASGR1、ASGR2)，并且另一个臂结合替代酶。在此处，多结构域治疗性蛋白质包含双特异性抗体和替代酶(图1A)。在一个具体实施例中，所治疗的疾病是法布里氏病，并且多结构域治疗性蛋白质包含GLA以及结合GLA和CD63的双特异性抗体。在一个具体实施例中，所治疗的疾病是法布里氏病，并且多结构域治疗性蛋白质包含GLA以及结合GLA和ITGA7的双特异性抗体。在另一个具体实施例中，所治疗的疾病是庞贝氏病，并且多结构域治疗性蛋白质包含GAA以及结合GAA和CD63的双特异性抗体。在另一个具体实施例中，所治疗的疾病是庞贝氏病，并且多结构域治疗性蛋白质包含GAA以及结合GAA和ITGA7的双特异性抗体。
在另一个实施例中，结合内化效应物的分子实体包含半抗体，并且替代酶含有Fc结构域(酶-Fc融合多肽)。在一个实施例中，酶-Fc融合多肽的Fc结构域与内化效应物特异性半体的Fc结构域缔合形成多结构域治疗性蛋白质(图1B)。
在其它实施例中，替代酶与内化效应物结合蛋白共价连接。由于Fc二聚体可通过一个或多个二硫桥固定，故在先前段落中描述的酶-Fc融合物:半体实施例(也参见图1B)在该类别内。酶活性结构域或多肽与内化结合结构域或多肽之间的共价连接可为任何类型的共价键，即，涉及共用电子的任何键。在一些情况下，共价键是两个氨基酸之间的肽键，使得替代酶和内化效应物结合蛋白全部或部分形成如融合蛋白中的连续多肽链。在一些情况下，替代酶部分与内化效应物结合蛋白直接连接。在其它情况下，使用连接子栓系两个部分。参见Chen等人,“融合蛋白连接子：特性、设计和功能(Fusion protein linkers:property,design and functionality),”65(10)《先进药物递送评论(Adv Drug DelivRev.)》1357-69(2013)。
术语“连接子”或“间隔子”是指通常允许融合蛋白的一个或多个连接组分适当折叠，例如VH连接至scFv的VL、治疗性蛋白质(例如替代酶)连接至如本文所描述的多结构域治疗性蛋白质的递送结构域(例如抗内化效应物抗体)的短(例如2至25个氨基酸)多肽。连接子提供了融合蛋白的组分的柔性接合区，允许分子两端独立地移动，并且可在保持两个部分的适当功能中的每一个方面起到重要作用。因此，在一些情况下，接合区用作将所述两个部分组合在一起的连接子，以及允许所述两个部分各自形成其自身的生物结构且不干扰另一部分的间隔子。此外，接合区应产生表位，该表位不会被受试者的免疫***识别为外来的，换句话说，不会被视为具有免疫原性。连接子选择也可能对融合分子结合活性具有影响。(参见Huston等人,1988,PNAS,85:16:5879-83；Robinson和Bates,1998,PNAS 95(11):5929-34；Arai等人,2001,PEDS,14(8):529-32；及Chen,X.等人,2013,《先进药物递送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》65:1357-1369。)在一个实施例中，递送结构域通过一个或多个肽连接子连接至治疗性多肽或其片段。在另一个实施例中，scFv抗体的可变区通过一个或多个肽连接子彼此连接，或其片段。
连接子链的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸残基，但通常在5与25个残基之间。连接子的实例包括聚甘氨酸连接子，如Gly-Gly、Gly-Gly-Gly(3Gly)、4Gly、5Gly、6Gly、7Gly、8Gly或9Gly。连接子的实例还包括Gly-Ser肽连接子，如Ser-Gly、Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n及(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n，其中n＝1至10。(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n和(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n分别又称为(G4S)n和(S4G)n。
在一些实施例中，治疗性蛋白质，例如替代酶共价连接至抗内化效应物抗体的重链的C末端(参见图1C)或轻链的C末端(图1E)。在一些实施例中，替代酶共价连接至抗内化效应物抗体的重链的N末端(参见图1D)或轻链的N末端(图1F)。在一些实施例中，所述酶连接至抗内化效应物scFv结构域的C末端(图1G)。
在一些情况下，尤其是在治疗性蛋白质，例如替代酶通常在溶酶体中不进行蛋白水解加工的情况下，将可切割连接子加入包含抗体-酶融合物的多结构域治疗性蛋白质的实施例中。在一些实施例中，将组织蛋白酶可切割连接子***抗体与替代酶之间，以促进溶酶体中抗体的去除，以便a)可能通过去除在空间上较大的抗体来帮助保持酶促活性，和b)可能增加溶酶体酶的半衰期。
在一个特定实施例中，将多结构域治疗性蛋白质以基因治疗载体递送至患者或细胞，所述基因治疗载体包含编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。在一个具体实施例中，递送结构域结合内化效应物，如CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3或CD36。在一个实施例中，递送结构域是结合至CD63的单链可变片段(scFv)(即，抗CD63 scFv)。在另一个实施例中，递送结构域是结合至ITGA7的单链可变片段(scFv)(即，抗ITGA7 scFv)。
在一个特定实施例中，多结构域治疗性蛋白质的酶结构域包含水解酶。在一个具体实施例中，酶结构域包含的水解酶是糖基化酶。在一个更具体的实施例中，酶结构域包含的糖基化酶是糖苷酶。在一个更具体的实施例中，酶结构域是糖苷酶，其为α-葡糖苷酶。
一般地，本文公开了包含多核苷酸的组合物和多核苷酸在溶酶体贮积病的治疗中的用途，例如用于减少庞贝氏病患者中的糖原和/或增强对于GAA的免疫耐受性，所述多核苷酸例如(m)RNA、DNA及其修饰形式，其编码包含内化效应物结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。
术语“多核苷酸”包括核苷酸的聚合物(例如RNA或DNA)，其编码至少一种多肽，包括融合多肽，例如包含内化效应物结构域和酶结构域的多结构域治疗性多肽。如本文所使用，多核苷酸涵盖包含修饰的和未修饰的核苷酸两者的聚合物。多核苷酸可包含一个或多个编码区和非编码区。多核苷酸可从天然来源中纯化，使用重组表达***产生，并且任选地纯化、化学合成等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，多核苷酸可包含核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有说明，否则多核苷酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施例中，多核苷酸是或包含天然核苷(例如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；***碱基；修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、***糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基(例如硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键合)。
在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可包括例如5-甲基-胞苷("5mC")、假尿苷("ψU")和/或2-硫代尿苷("2sU")。关于此类残基及其并入多核苷酸中的论述，参见例如美国专利号8,278,036或WO2011012316，其各自以全文引用的方式并入。非标准核苷酸残基的存在可使多核苷酸比对照多核苷酸更稳定和/或免疫原性更低，所述对照多核苷酸具有相同序列但仅包含标准残基。在其它实施例中，多核苷酸可包含选自以下的一个或多个非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶，以及这些修饰和其它核碱基修饰的组合。某些实施例可还包括对呋喃糖环或核碱基的另外修饰。另外的修饰可包括例如糖修饰或取代(例如2'-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)中的一个或多个)。在一些实施例中，多核苷酸可与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA))复合或杂交。在糖修饰是2'-O-烷基修饰的实施例中，此类修饰可包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在某些实施例中，这些修饰中的任一种可个别地或组合存在于0-100％的核苷酸中，例如超过0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成核苷酸中。在一些实施例中，多核苷酸包含信使RNA(mRNA)分子，其可以或可以不通过众所周知的方法进行修饰，例如其可包含或不包含修饰的核苷酸，以增加其稳定性和/或降低其免疫原性。在一些实施例中，多核苷酸包含DNA分子，其可以或可以不通过众所周知的方法进行修饰，例如其可包含或不包含修饰的核苷酸，以增加其稳定性和/或降低其免疫原性。
在一些实施例中，多核苷酸还包括“基因座靶向核酸序列”。基因座靶向序列使得编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸能够整合到受体宿主细胞的基因组内。在一些实施例中，基因座靶向序列包括侧翼同源臂，以允许同源重组。在一些实施例中，基因座靶向序列包括向导RNA序列和II型Cas酶，以促进整合(即，CRISPR-Cas9方法)。在一些实施例中，基因座靶向序列包括向导锌指核酸酶(ZFN)识别序列，以促进整合。在一些实施例中，基因座靶向序列包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)识别序列，以促进整合。在又其它实施例中，基因座靶向序列包括由BuD源性核酸酶使用的单个残基至核苷酸密码，以促进整合。
在一些实施例中，整合了编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸的基因组基因座是“安全港基因座”。在一个实施例中，“安全港基因座”使得多结构域治疗性蛋白质的高表达成为可能，而不干扰必需基因的表达或者促进癌基因或其它有害基因的表达。在一个实施例中，基因组基因座在以下处或附近：肝表达的白蛋白(Alb)基因座、EESYR基因座、SARS基因座、人染色体1的位置188,083,272或其非人哺乳动物直系同源物、人染色体10的位置3,046,320或其非人哺乳动物直系同源物、人染色体17的位置67,328,980或其非人哺乳动物直系同源物、染色体上的腺相关病毒位点1(AAVS1)、AAV病毒在人染色体19或其非人哺乳动物直系同源物上的天然存在的整合位点、趋化因子受体5(CCR5)基因、编码HIV-1共受体的趋化因子受体基因、或小鼠Rosa26基因座或其非鼠哺乳动物直系同源物。在一个实施例中，基因组基因座是腺相关病毒位点。在一个实施例中，有关用于基因治疗载体整合的安全港基因组基因座的逐步选择，根据Papapetrou和Schambach,《分子疗法杂志(J.MolecularTherapy)》,第24卷(4):678-684,2016年4月，选择用于整合的基因组基因座，所述参考文献以引用的方式并入本文；有关无启动子基因靶向进入肝表达的白蛋白([g1]Alb[/g1])基因座内，还参见Barzel等人,《自然》，第517卷:360-364，以全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中，多核苷酸，例如DNA，还包含与多结构域治疗性蛋白质编码核酸序列可操作连接的启动子。在一个具体实施例中，启动子是组织特异性启动子，其在特定组织中驱动基因表达。在一个实施例中，组织特异性启动子是源自丝氨酸蛋白酶抑制剂1的肝特异性增强子/启动子(例如SEQ ID NO:9)和/或是TTR启动子(SEQ ID NO:8)。在其它实施例中，启动子是CMV启动子。在其它实施例中，启动子是泛素C启动子。
在一个实施例中，编码多结构域治疗性蛋白质的“基因治疗载体”是能够将编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸递送给宿主，例如患者的任何载体。在一些实施例中，基因治疗载体靶向特定的宿主细胞或器官，例如用于局部递送，例如组织特异性递送。通常，局部递送需要由mRNA编码的蛋白质(例如多结构域治疗性蛋白质)主要在器官(例如肝)中和/或由器官(例如肝)翻译和表达，从而由此形成储库，例如用于蛋白质生产(和分泌)的肝储库。在一些实施例中，基因治疗载体将多结构域治疗性蛋白质多核苷酸递送至患者的肝，以形成肝储库。参见例如DeRosa等人,《基因疗法(Gene Therapy)》,第10卷:699-707，其以全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，基因治疗载体将编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸递送至患者的肌肉组织。在一些实施例中，基因治疗载体将编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸递送至患者的大脑。
任何目前已知或将来开发的、天然或工程改造的基因治疗递送载体都可用于本发明的实践中。在一些实施例中，基因治疗载体是病毒载体，例如包含病毒、病毒衣壳、病毒基因组等。在一些实施例中，基因治疗载体是裸多核苷酸，例如附加体。在一些实施例中，基因治疗载体包含多核苷酸复合物。用作基因治疗载体的示例性非限制性多核苷酸复合物包括脂质复合物、聚合物囊泡(polymersome)、polypexes、树枝状聚合物、无机纳米颗粒(例如多核苷酸包被的金、二氧化硅、氧化铁、磷酸钙等)。在一些实施例中，如本文所述的基因治疗载体包含病毒载体、裸多核苷酸和多核苷酸复合物的组合。
在一个实施例中，基因治疗载体是病毒，包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒。在一个实施例中，基因治疗载体是腺相关病毒(AAV)，包括血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11、或其工程改造的或天然选择的变体。
在一个实施例中，多核苷酸还包含腺相关病毒(AAV)核酸序列。在一个实施例中，基因治疗载体是包含来自两种或更多种血清型的遗传元件的嵌合腺相关病毒。例如，具有来自AAV1的rep基因和来自AAV2的cap基因的AAV载体(称为AAV1/2或AAV RC1/2)可用作基因治疗载体，以将多结构域治疗性蛋白质多核苷酸递送至细胞或有需要的患者的细胞。在一个实施例中，基因治疗载体是AAV1/2、AAV1/3、AAV1/4、AAV1/5、AAV1/6、AAV1/7、AAV1/8、AAV1/9、AAV1/10、AAV1/11、AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2/10、AAV2/11、AAV3/1、AAV3/2、AAV3/4、AAV3/5、AAV3/6、AAV3/7、AAV3/8、AAV3/9、AAV3/10、AAV3/10、AAV4/1、AAV4/2、AAV4/3、AAV4/5、AAV4/6、AAV4/7、AAV4/8、AAV4/9、AAV4/10、AAV4/11、AAV5/1、AAV5/2、AAV5/3、AAV5/4、AAV5/6、AAV5/7、AAV5/8、AAV5/9、AAV5/10、AAV5/11、AAV6/1、AAV6/2、AAV6/3、AAV6/4、AAV6/5、AAV6/7、AAV6/8、AAV6/9、AAV6/10、AAV6/10、AAV7/1、AAV7/2、AAV7/3、AAV7/4、AAV7/5、AAV7/6、AAV7/8、AAV7/9、AAV7/10、AAV7/11、AAV8/1、AAV8/2、AAV8/3、AAV8/4、AAV8/5、AAV8/6、AAV8/7、AAV8/9、AAV8/10、AAV8/11、AAV9/1、AAV9/2、AAV9/3、AAV9/4、AAV9/5、AAV9/6、AAV9/7、AAV9/8、AAV9/10、AAV9/11、AAV10/1、AAV10/2、AAV10/3、AAV10/4、AAV10/5、AAV10/6、AAV10/7、AAV10/8、AAV10/9、AAV10/11、AAV11/1、AAV11/2、AAV11/3、AAV11/4、AAV11/5、AAV11/6、AAV11/7、AAV11/8、AAV11/9、AAV11/10、嵌合病毒粒子或其衍生物。关于可用作基因治疗载体的AAV载体和嵌合病毒粒子以及其构建和用途，Gao等人,“作为人基因治疗载体的来自猕猴的新颖腺相关病毒(Noveladeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human genetherapy),”PNAS 99(18):11854-11859,2002年9月3日，以引用的方式并入本文。
在一个更具体的实施例中，基因治疗载体是具有血清型2rep基因序列和血清型8cap序列的嵌合AAV载体(“AAV2/8”或“AAV RC2/8)。
在一些实施例中，基因治疗载体是已被假型化(例如工程改造)以靶向特定细胞，例如肝细胞的病毒载体。使用病毒载体进行靶向基因疗法的许多进展可总结为病毒载体的非重组(非基因)或重组(基因)修饰，其引起病毒载体的天然向性的假型化、扩增和/或再靶向。(评述于Nicklin和Baker(2002)《现代基因疗法(Curr.Gene Ther.)》2:273-93；Verheiji和Rottier(2012)《病毒学进展(Advances Virol)》2012:1-15；各参考文献以全文引用的方式并入本文)。非遗传方法通常利用衔接子，其识别野生型(未修饰的)病毒表面蛋白和靶细胞两者。可溶性假受体(对于野生型病毒)、聚合物如聚乙二醇、以及抗体或其一部分已用作衔接子的病毒结合结构域，而天然肽或维生素配体、以及抗体及其一部分已用于上述衔接子的细胞结合结构域。例如，在载体:衔接子复合物与靶细胞的表面上表达的蛋白质，例如细胞表面蛋白质的结合后，可完成病毒载体对靶细胞的重新靶向。此类方法已用于AAV(Bartlett等人(1999)《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》74:2777-2785)、腺病毒(Hemminki等人(2001)《癌症研究(Cancer Res.)》61:6377-81；van Beusechem等人(2003)《基因疗法(Gene Therapy)》10:1982-1991；Einfeld等人(2001)《病毒学杂志(J.Virol.)》75:11284-91；Glasgow等人(2009)《公共图书馆：综合(PLOS One)》4:e8355)、疱疹病毒(Nakano等人(2005)《分子疗法(Mol.Ther.)》11:617-24)、以及副粘病毒(Bian等人(2005)《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》12:295-303；Bian等人(2005)《国际癌症杂志(Int.J.Oncol.)》29:1359-69)、冠状病毒(Haijema等人(2003)《病毒学杂志(J.Virol.)》77:4528-4538；Wurdinger等人(2005)《基因疗法(Gene Therapy)》12:1394-1404；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
更流行的方法已是病毒衣壳蛋白的重组基因修饰，并且因此是病毒衣壳的表面的重组基因修饰。在间接重组方法中，病毒衣壳用异源“支架”进行修饰，所述异源“支架”然后连接至衔接子。衔接子与支架和靶细胞结合。(Arnold等人(2006)《分子疗法(Mol.Ther.)》5:125-132；Ponnazhagen等人(2002)《病毒学杂志(J.Virol.)》76:12900—907；还参见WO97/05266，各参考文献以全文引用的方式并入本文中)支架，如(1)Fc结合分子(例如Fc受体、蛋白质A等)，其结合至抗体衔接子的Fc；(2)(链菌素)抗生物素蛋白，其结合至生物素化衔接子；(3)生物素，其结合至与(链菌素)抗生物素蛋白融合的衔接子；及(4)蛋白质:蛋白质结合对，其形成等距肽键，如结合Spy标记的衔接子的SpyCatcher，已被并入以下中：Ad(Pereboeva等人(2007)《基因疗法(Gene Therapy)》14:627-637；Park等人(2008)《生物化学与生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)》366:769-774；Henning等人(2002)《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》13:1427-1439；Banerjee等人(2011)《生物有机与药物化学快报(Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters)》21:4985-4988)、AAV(Gigout等人(2005)《分子疗法(Molecular Therapy)》11:856-865；Stachler等人(2008)《分子疗法》16:1467-1473)、以及披膜病毒(Quetglas等人(2010)《病毒研究(Virus Research)》153:179-196；Ohno等人(1997)《自然-生物技术(Nature Biotechnology)》15:763-767；Klimstra等人(2005)《病毒学(Virology)》338:9-21；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
在直接重组靶向方法中，将靶向配体直接***病毒衣壳内或联接至病毒衣壳，即，修饰蛋白质病毒衣壳以表达异源配体。配体接着重定向(例如结合)优先或仅仅表达于靶细胞上的受体或标记。(Stachler等人(2006)《基因疗法(Gene Ther.)》13:926-931；White等人(2004)《循环(Circulation)》109:513-519；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。直接重组方法已用于以下中：AAV(Park等人(2007)《生物科学前沿(Frontiers inBioscience)》13:2653-59；Girod等人(1999)《自然-医学(Nature Medicine)》5:1052-56；Grifman等人(2001)《分子疗法》3:964-75；Shi等人(2001)《人类基因疗法(Human GeneTherapy)》12:1697-1711；Shi和Bartlett(2003)《分子疗法》7:515--525；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)、逆转录病毒(Dalba等人,《现代基因疗法(Current GeneTherapy)》5:655-667；Tai和Kasahara(2008)《生物科学前沿》13:3083-3095；Russell和Cosset(1999)《基因医学杂志(Journal of Gene Medicine)》1:300-311；Erlwein等人(2002)《病毒学(Virology)》302:333-341；Chadwick等人(1999)《分子生物学杂志(Journalof Molecular Biology)》285:485-494；Pizzato等人(2001)《基因疗法》8:1088-1096)、痘病毒(Guse等人(2011)《生物疗法专家观点(Expert Opinion on Biological Therapy)》11:595-608；Galmiche等人(1997)《普通病毒学杂志(Journal of General Virology)》78:3019-3027；Paul等人(2007《病毒免疫学()Viral Immunology)》20:664-671)、副粘病毒(Nakamura和Russell(2004)《生物疗法专家观点(Expert Opinion on BiologicalTherapy)》4:1685-1692；Hammond等人(2001)《病毒学杂志(Journal of Virology)》75:2087-2096；Galanis(2010)《临床药理学和治疗学(Clinical Pharmacology andTherapeutics)》88:620-625；Blechacz和Russell(2008)《现代基因疗法(Current GeneTherapy)》8:162-175；Russell和Peng(2009)《微生物学与免疫学当前课题(CurrentTopics in Microbiology and Immunology)》330:213-241)、以及疱疹病毒(Shah和Breakefield(2006)《现代基因疗法(Current Gene Therapy)》6:361-370；Campadelli-Fiume等人(2011)《医学病毒学评述(Reviews in Medical Virology)》21:213-226；各参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，将如本文所述的基因治疗载体针对那些组织假型化，所述组织特别适合于生成针对例如替代酶的调节应答例如耐受性。此类组织包括但不限于粘膜组织，例如肠相关淋巴样组织(GALT)、造血干细胞和肝。在一些实施例中，基因治疗载体或如本文所述的编码多结构域治疗性蛋白质的基因在对那些组织具有特异性的启动子，例如肝特异性启动子的控制下表达。
在一些实施例中，本文所述的基因治疗载体包含裸多核苷酸。例如，在一些实施例中，可将编码多结构域治疗性多肽的多核苷酸例如肌肉内直接注射至器官内用于形成储库，静脉内注射等。众所周知的用于增强裸多核苷酸递送的另外方法包括但不限于电穿孔、声纳穿孔、使用基因枪射击多核苷酸包被的金颗粒、磁转染和流体动力学递送。
在一些实施例中，如本文所述的基因治疗载体包含多核苷酸复合物，例如但不限于纳米颗粒(例如多核苷酸自组装纳米颗粒、基于聚合物的自组装纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质纳米颗粒、半导体/金属纳米颗粒)、凝胶和水凝胶、具有阳离子和阴离子的多核苷酸复合物、微粒及其任何组合。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可配制为自组装纳米颗粒。作为非限制性实例，多核苷酸可用于制备可用于多核苷酸的递送***中的纳米颗粒(参见例如国际公开号WO2012125987；以全文引用的方式并入本文)。在一些实施例中，多核苷酸自组装纳米颗粒可包含本文公开的多核苷酸的核和聚合物壳。聚合物壳可为本文描述的任何聚合物，并且是本领域已知的。在一个另外的实施例中，聚合物壳可用于保护核中的多核苷酸。
在一些实施例中，这些自组装纳米颗粒可为由多核苷酸发夹的长聚合物形成的微海绵，其在自组装成微海绵之前形成为结晶‘褶皱’片层。这些微海绵是紧密堆积的海绵状微粒，其可充当有效载体，并且可将货物递送到细胞。微海绵的直径可为1μm至300nm。微海绵可与本领域已知的其它试剂复合，以形成更大的微海绵。作为非限制性实例，微海绵可与试剂复合以形成外层以促进细胞摄取，例如聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)。该复合物可形成直径250nm的颗粒，所述颗粒可在高温(150℃)下保持稳定。(Grabow和Jaegar,《自然-材料(Nature Materials)》2012,11:269-269；以全文引用的方式并入本文)。另外，这些微海绵能够显示出非凡程度的保护，以免被核糖核酸酶降解。在另一个实施例中，基于聚合物的自组装纳米颗粒，如但不限于微海绵，可为完全可编程的纳米颗粒。可精确地控制纳米颗粒的几何形状、大小和化学计量，以产生用于递送货物例如但不限于多核苷酸的最佳纳米颗粒。
在一些实施例中，多核苷酸可在无机纳米颗粒中配制(美国专利号8,257,745，以全文引用的方式并入本文)。无机纳米颗粒可包括但不限于水可溶胀的粘土物质。作为非限制性实例，无机纳米颗粒可包括由简单的硅酸盐制成的合成蒙脱石粘土(参见例如美国专利号5,585,108和8,257,745，其各自以全文引用的方式并入本文)。
在一些实施例中，多核苷酸可在包含半导体或金属材料的水可分散的纳米颗粒中配制(美国公开号20120228565；以全文引用的方式并入本文)，或在磁性纳米颗粒中形成(美国公开号20120265001和20120283503；其各自以全文引用的方式并入本文)。水可分散的纳米颗粒可为疏水性纳米颗粒或亲水性纳米颗粒。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可被封装到本领域已知的任何水凝胶内，当注射到受试者内时，所述水凝胶可形成凝胶。水凝胶是亲水性聚合物链的网络，并且有时作为水是分散介质的胶体凝胶发现。水凝胶是高吸收性(它们可包含99％以上的水)天然或合成聚合物。由于含水量极大，故水凝胶还具有与天然组织极其相似的柔性程度。本文所述的水凝胶可用于包封其为生物相容性、可生物降解和/或多孔的脂质纳米颗粒。
作为非限制性实例，水凝胶可为适体官能化的水凝胶。适体官能化的水凝胶可使用多核苷酸杂交进行编程，以释放一种或多种多核苷酸。(Battig等人,《美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Society.)》2012,134:12410-12413；以全文引用的方式并入本文)。在一些实施例中，多核苷酸可被包封在脂质纳米颗粒中，然后脂质纳米颗粒可被包封在水凝胶内。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可被包封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶内。在另一个实施例中，在被包封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶内之前，多核苷酸可在脂质纳米颗粒或快速消除的脂质纳米颗粒中配制。在又另一个实施例中，在被包封到纤维蛋白凝胶、水凝胶或纤维蛋白胶内之前，多核苷酸可配制为脂质复合物。纤维蛋白凝胶、水凝胶和胶包含两种组分：纤维蛋白原溶液和富含钙的凝血酶溶液(参见例如Spicer和Mikos,《控制释放杂志(Journal of Controlled Release)》2010.148:49-55；Kidd等人,《控制释放杂志》2012.157:80-85；其各自以全文引用的方式并入本文)。可改变纤维蛋白凝胶、水凝胶和/或胶的组分浓度，以改变凝胶、水凝胶和/或胶的特征、网眼尺寸和/或降解特征，例如但不限于改变纤维蛋白凝胶、水凝胶和/或胶的释放特征。(参见例如Spicer和Mikos,《控制释放杂志》2010.148:49-55；Kidd等人,《控制释放杂志》2012.157:80-85；Catelas等人,《组织工程改造(Tissue Engineering)》2008.14:119-128；其各自以全文引用的方式并入本文)。当用于递送本文公开的多核苷酸时，这个特征可能是有利的。(参见例如Kidd等人,《控制释放杂志》2012.157:80-85；Catelas等人,《组织工程改造》2008.14:119-128；其各自以全文引用的方式并入本文)。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可包括阳离子或阴离子。在一个实施例中，所述制剂包括金属阳离子，如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+及其组合。作为非限制性实例，制剂可包括与金属阳离子络合的聚合物和多核苷酸(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，其各自以全文引用的方式并入本文)。
在一些实施例中，多核苷酸可在纳米颗粒和/或微粒中配制。这些纳米颗粒和/或微粒可被模制成任何大小的形状和化学性质。例如，纳米颗粒和/或微粒可通过LIQUIDATECHNOLOGIES.RTM.(Morrisville,N.C.)，使用
Figure BDA0002701634710000531
技术来制备(参见例如国际公开号WO2007024323；以全文引用的方式并入本文)。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可由Keystone Nano(State College,Pa.)在NanoJackets和纳米脂质体(NanoLiposome)中配制。NanoJackets由体内天然发现的化合物包括钙、磷酸盐制成，并且还可包括少量硅酸盐。NanoJackets的大小范围可为5至50nm，并且其可用于递送亲水性化合物和疏水性化合物，如但不限于多核苷酸、初级构建体和/或多核苷酸。纳米脂质体由脂质制成，所述脂质例如但不限于体内天然存在的脂质。纳米脂质体的大小范围可为60-80nm，并且其可用于递送亲水性化合物和疏水性化合物，例如但不限于多核苷酸、初级构建体和/或多核苷酸。一方面，本文公开的多核苷酸在纳米脂质体，例如但不限于神经酰胺纳米脂质体中配制。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质是抗CD63 scFv-GAA融合蛋白或抗ITGA7scFv-GAA融合蛋白。通过AAV递送施用抗CD63 scFv-GAA融合蛋白或抗ITGA7 scFv-GAA融合蛋白，提供了在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后，在患者的血清中的GAA的长期稳定产生。在一个实施例中，在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后1个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，受体患者的血清中的GAA水平为接受未与递送结构域连接的GAA的患者血清水平的≥1.5倍至100倍、≥1.5倍至10倍、≥2.5倍、2.5倍-3倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一个实施例中，通过AAV递送施用抗CD63 scFv-GAA融合蛋白或抗ITGA7 scFv-GAA融合蛋白，在患有庞贝氏病的患者中提供了贮积糖原水平中的长期稳定减少。在一个实施例中，患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平减少至野生型(非疾病)水平。在一个实施例中，在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平维持在野生型水平下。
在一个实施例中，经由AAV递送施用抗CD63 scFv-GAA融合蛋白或抗ITGA7 scFv-GAA融合蛋白，在患有庞贝氏病的患者中提供了肌肉强度的长期恢复。在一个实施例中，在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，如通过握力测量的患者强度恢复到正常(即，无疾病正常水平)。
在另一个方面，本发明提供了包含酶活性和抗原结合蛋白的组合物，其中所述酶与酶缺乏症(LSD)和内化效应物结合蛋白相关。与溶酶体贮积病相关的酶(其包括本身无催化性的蛋白质)包括例如任何和所有水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鞘脂激活蛋白C激活因子、神经酰胺酶、鞘磷脂酶、β-氨基己糖苷酶、GM2激活蛋白、GM3合酶、芳基硫酸酯酶、鞘脂激活因子、α-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸酶-2-硫酸酯酶、肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰-α-氨基葡糖苷酶、α-葡糖酰胺N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、透明质酸酶等等。
内化效应物结合蛋白例如包括受体-融合分子、陷阱分子、受体-Fc融合分子、抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、CDR3肽、受限的FR3-CDR3-FR4肽、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体、单价纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、骆驼科抗体(VHH重链同型二聚体抗体)、鲨鱼可变IgNAR结构域、其它抗原结合蛋白等等。
内化效应物包括例如CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR(促乳素受体)、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白，又名VIP17)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体、SCARA1-5、SCARB1-3及CD36。在某些实施例中，内化效应物是肾特异性内化剂，如CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，内化效应物是肌肉特异性内化剂，如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)。在一些具体实施例中，内化效应物是ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、ASGR1、ASGR2或PRLR。
在一些实施例中，酶共价连接(即，原子间共用的电子)至抗原结合蛋白。在一个特定实施例中，内化效应物结合蛋白由半体组成或包含半体；该酶与Fc-融合结构域融合(例如在C末端处)；并且共价连接至酶的Fc结构域与抗原结合蛋白的Fc结构域缔合，使得缔合含有一个或多个二硫桥。图1A小图B中示意性描绘了这一特定实施例。
在另一个特定实施例中，内化效应物结合蛋白(递送结构域)由抗体或抗体片段组成或者包含抗体或抗体片段，并且该酶共价连接至抗体或抗体片段。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体，并且该酶共价连接(通过肽键直接地，或经由连接子间接地)至抗体的重链或轻链的C末端(分别为图1A，小图C或E)。在另一个具体实施例中，递送结构域是抗体，并且该酶共价连接(通过肽键直接地，或经由连接子间接地)至抗体的重链或轻链的N末端(分别为图1A，小图D或F)。
在一些实施例中，酶和递送结构域不是共价连接的，而是在混合物中组合。递送结构域和酶可通过非共价力结合形成复合物。例如，在一个特定实施例中，递送结构域是双特异性抗体，其中抗体的一个臂结合内化效应物，并且另一个臂结合酶。图1A小图A中示意性描绘了该实施例。
在一些实施例中，酶是GAA或包含GAA活性(例如具有GAA活性的同工酶)，并且内化效应物是ITGA7、CDH15、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2或PRLR。在一个特定实施例中，酶是GAA或包含GAA活性，内化结构域是CD63，并且递送结构域是对于CD63和GAA具有特异性的双特异性抗体。在一个特定实施例中，酶是GAA或包含GAA活性，内化结构域是ITGA7，并且递送结构域是对于ITGA7和GAA具有特异性的双特异性抗体。
在一些实施例中，酶是GLA或包含GLA活性(例如具有GAA活性的同工酶)，并且内化效应物是ITGA7、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2或PRLR。在一个特定实施例中，酶是GLA或包含GLA活性，内化结构域是CD63，并且递送结构域是对于CD63和GLA具有特异性的双特异性抗体。在一个特定实施例中，酶是GLA或包含GLA活性，内化结构域是ITGA7，并且递送结构域是对于ITGA7和GLA具有特异性的双特异性抗体。
药物组合物及其施用
药物制剂可另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所使用，该赋形剂包括如适合所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等。《雷明登氏药学的理论和实践(Remington's The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006；以全文引用的方式并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。除非任何常规的赋形剂介质与某种物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望有的生物效应或以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则其使用考虑在本发明的范围内。
在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施例中，赋形剂被批准用于在人体中使用以及用于兽医学用途。在一些实施例中，赋形剂获美国食品和药物管理局(United States Food andDrug Administration)批准。在一些实施例中，赋形剂是药物级的。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制造药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或制粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可任选地包括在药物组合物中。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
示例性制粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、皂粘土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉羟乙酸钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝
Figure BDA0002701634710000571
月桂基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如***胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、角叉菜属(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体粘土(例如膨润土[硅酸铝]和
Figure BDA0002701634710000572
[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomers)(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯[
Figure BDA0002701634710000573
20]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇[
Figure BDA0002701634710000575
60]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[
Figure BDA0002701634710000574
80]、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯[
Figure BDA0002701634710000576
40]、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯[
Figure BDA0002701634710000577
60]、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯[
Figure BDA0002701634710000578
65]、甘油单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯
Figure BDA0002701634710000579
)、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯[
Figure BDA00027016347100005710
45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和
Figure BDA00027016347100005711
)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如
Figure BDA00027016347100005712
)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[
Figure BDA00027016347100005713
30])、聚(乙烯-吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、
Figure BDA00027016347100005714
F 68、
Figure BDA00027016347100005715
188、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、多库酯钠(docusate sodium)等，和/或其组合。
示例性粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成胶(例如***胶、海藻酸钠、爱尔兰藓提取物、潘瓦尔胶(panwar gum)、茄替胶、依莎贝果壳粘液(mucilage ofisapol husk)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯-吡咯烷酮)、硅酸镁铝
Figure BDA0002701634710000581
和落叶松***半乳聚糖)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；等；及其组合。
示例性防腐剂可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴硝醇、西曲溴铵、西吡氯铵、氯己定、三氯叔丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、丙三醇、海克替啶、咪唑烷基脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、三氯叔丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去氧肟酯、西曲溴铵、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT
Figure BDA0002701634710000582
Figure BDA0002701634710000583
对羟基苯甲酸甲酯、
Figure BDA0002701634710000584
115、
Figure BDA0002701634710000585
II、NEOLONE.TM.、KATHON.TM.和/或
Figure BDA0002701634710000586
示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、二碱式磷酸钙、磷酸、三碱式磷酸钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇等和/或其组合。
示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等、及其组合。
示例性油包括但不限于杏仁油、苦杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、佛手柑油、黑醋栗籽油、琉璃苣油、杜松油、甘菊油、芥花油、葛缕子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鳕鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸异丙酯油、荷荷巴油、夏威夷核果油、杂薰衣草油、熏衣草油、柠檬油、山苍子油、澳洲坚果油、锦葵油、芒果仁油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、橙鲷鱼油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油、夏香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油、岩兰草油、核桃油和小麦胚芽油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
根据配方师的判断，组合物中可存在赋形剂，如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。
递送
考虑到药物递送科学中的可能进展，本公开涵盖通过任何适当途径递送基因治疗载体(例如多核苷酸)。递送可为裸露的或配制的。
裸露递送
本发明的多核苷酸可裸露地递送至细胞。如本文所使用，“裸露的”是指递送不含促进转染的试剂的多核苷酸。例如，递送至细胞的多核苷酸可不含修饰。可使用本领域已知的和本文描述的施用途径，将裸多核苷酸递送至细胞。
配制的递送
可使用本文所述的方法配制多核苷酸。制剂可包含多核苷酸，并且还可包括但不限于细胞渗透剂、药学上可接受的载体、递送剂、生物可侵蚀或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送储库。可使用本领域已知的和本文描述的施用途径，将配制的多核苷酸mRNA递送至细胞。
施用
可通过产生治疗有效结果的任何途径来施用本发明的多核苷酸。这些包括但不限于肠内、胃肠道、硬膜外、经口、经皮、硬膜外(硬膜外的)、脑内(进入大脑内)、脑室内(进入脑室内)、表皮(施加于皮肤上)、皮内(进入皮肤本身内)、皮下(在皮肤下)、鼻施用(通过鼻施用)、静脉内(进入静脉内)、动脉内(进入动脉内)、肌肉内(进入肌肉内)、心内(进入心脏内)、骨内输注(进入骨髓内)、鞘内(进入椎管内)、腹膜内(输注或注射到腹膜内)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵体内注射(进入***根部)、***内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(扩散通过完整皮肤用于全身分布)、经粘膜(扩散通过粘膜)、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠剂、滴眼剂(施加到结膜上)或滴耳剂中。在具体实施例中，组合物可通过允许其穿过血脑屏障、血管屏障或其它上皮屏障的方式施用。用于本发明的多核苷酸、初级构建体或mRNA的非限制性施用途径在下文描述。
肠胃外和可注射施用
用于肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分之外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于肠胃外施用的某些实施例中，将组合物与增溶剂如
Figure BDA0002701634710000601
醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
根据已知技术，使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂，可配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液。无菌可注射制剂可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可采用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发性油照常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于注射剂的制备中。
可注射制剂可例如通过以下进行灭菌：经由细菌截留过滤器过滤，和/或并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的效应，经常希望减慢来自皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率依次又可取决于晶体大小和结晶形式。替代地，通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中，来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成药物的微胶囊基质，来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中，来制备储库可注射制剂。
储库施用
如本文所述，在一些实施例中，组合物在用于延长释放的储库中配制。一般地，靶向特定器官或组织(“靶组织”)用于施用。
在本发明的一些方面，多核苷酸在空间上保留在靶组织内或邻近靶组织。本发明提供的是通过在这样的条件下使靶组织(其含有一种或多种靶细胞)与组合物接触，向哺乳动物受试者的靶组织提供组合物的方法，所述条件使得组合物，特别是组合物的核酸组分基本上保留在靶组织中，这意味着至少10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的组合物保留在靶组织中。有利地，通过测量进入一个或多个靶细胞的组合物中存在的核酸量来确定保留。例如，施用于受试者的至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的核酸在施用后的一段时间内在细胞内存在。例如，使用含有多核苷酸和转染试剂的水性组合物，执行对哺乳动物受试者的肌内注射，并且通过测量存在于肌肉细胞中的核糖核酸的量来确定组合物的保留。
本发明的方面涉及通过在这样的条件下使靶组织(含有一种或多种靶细胞)与组合物接触，向哺乳动物受试者的靶组织提供组合物的方法，所述条件使得组合物基本上保留在靶组织中。组合物包含有效量的多核苷酸，从而目的多肽在至少一个靶细胞中产生。组合物一般包含细胞渗透剂和药学上可接受的载体，尽管也考虑了“裸”核酸(例如不含细胞渗透剂或其它试剂的核酸)。
在一些情况下，希望增加由组织中的细胞产生的蛋白质的量。优选地，蛋白质生产中的这种增加在空间上限于靶组织内的细胞。因此，本发明提供的是增加哺乳动物受试者的组织中的目的蛋白质产生的方法。本发明提供的是包含多核苷酸的组合物，其特征在于已确定单位数量的组合物，以在预定体积的靶组织内包含的相当大百分比的细胞中产生目的多肽。
在一些实施例中，组合物包括多种不同的多核苷酸，其中一种或多于一种多核苷酸编码目的多肽。任选地，组合物还包含细胞渗透剂，以辅助该组合物的细胞内递送。做出关于所需的组合物剂量的确定，以在预定体积的靶组织内包含的相当大百分比的细胞中产生目的多肽(一般地，而不在与预定体积相邻或对靶组织远端的组织中诱导目的多肽的显著产生)。在这种确定之后，将确定的剂量直接引入哺乳动物受试者的组织内。
在一个实施例中，本发明提供了打算在多于一次注射中或通过分剂量注射递送的多核苷酸。
在一个实施例中，使用小型一次性药物贮积器、贴片泵或渗透泵，可将本发明保留在靶组织附近。贴片泵的非限制性实例包括由以下制造和/或销售的那些泵：
Figure BDA0002701634710000621
(Franklin Lakes,N.J.)、Insulet Corporation(Bedford,Mass.)、SteadyMedTherapeutics(San Francisco,Calif.)、Medtronic(Minneapolis,Minn.)(例如MiniMed)、UniLife(York,Pa.)、Valeritas(Bridgewater,N.J.)和SpringLeaf Therapeutics(Boston,Mass.)。渗透泵的非限制性实例包括由
Figure BDA0002701634710000622
(Cupertino,Calif.)(例如
Figure BDA0002701634710000623
和
Figure BDA0002701634710000624
)制造的那些泵。
给药
本发明提供了包括向有需要的受试者施用基因治疗载体，以及任选地随后施用多结构域治疗性多肽的方法，所述基因治疗载体包含编码多结构域治疗性多肽的多核苷酸。在一些实施例中，方法包括向有需要的患者施用包含治疗有效量的包含编码多结构域治疗多肽的多核苷酸的基因治疗载体，其中所述治疗有效量足以避免多结构域治疗多肽的后续施用。相应地，在一些实施例中，治疗缺乏酶的有需要的患者，例如减少庞贝氏病患者中的糖原水平和/或减少针对GAA的CRIM的方法，包括向患者施用以治疗有效量的包含多核苷酸的基因治疗载体，所述多核苷酸编码包含替代酶的多结构域治疗性蛋白质，例如抗CD63scFv::GAA融合蛋白，例如包含如SEQ ID NO:11所示序列的多结构域治疗性蛋白质，其中所述治疗有效量取消了替代酶例如GAA或其衍生物对患者的后续施用。在一些实施例中，治疗缺乏酶且有需要的患者，例如减少庞贝氏病患者中的糖原水平和/或减少针对GAA的CRIM的方法，包括向患者施用以治疗有效量的包含多核苷酸的基因治疗载体，所述多核苷酸编码包含替代酶的多结构域治疗性蛋白质，例如抗CD63 scFv::GAA融合蛋白，例如包含如SEQID NO:11所示序列的多结构域治疗性蛋白质，并且还包括向患者施用治疗有效量的替代酶。使用有效预防、治疗、诊断或成像疾病、病症和/或病况(例如与工作记忆缺陷有关的疾病、病症和/或病况)的任何量和任何施用途径，可将核酸、蛋白质或复合物，或者其药学、成像、诊断或预防组合物施用于受试者。
取决于受试者的物种、年龄和一般状况，疾病的严重程度，特定组合物，其施用模式，其活性模式等等，所需的确切量因受试者而异。
达成所希望的作用或“治疗作用”(例如替代酶的某一血清浓度)所需AAV病毒载体的剂量，例如单位是载体基因组剂量/公斤体重(vg/kg)将基于若干因素而变化，包括但不限于：AAV施用途径、达成治疗作用所需的表达水平、所治疗的特定疾病或病症及表达多结构域治疗性蛋白质的稳定性。本领域的普通技术人员可基于前述因素，以及本领域中众所周知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的受试者的AAV病毒粒子剂量范围，参见例如CDER“在对成年健康志愿者进行的治疗剂初始临床试验中行业估计的最大安全起始剂量(Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)”,2005年7月，以全文引用的方式并入本文中。AAV的有效量一般在每名受试者约10μl至约100ml含有约109至1016个基因组拷贝的溶液范围内。也可使用其它体积的溶液。所用体积通常将取决于受试者的体格、AAV的剂量和施用途径。在一些实施例中，在每名受试者约1010至1012个AAV病毒基因组之间的剂量是适当的。在一些实施例中，AAV的施用剂量是每名受试者1010、1011、1012、1013、1014、或1015个基因组拷贝。在一些实施例中，AAV的施用剂量是1010、1011、1012、1013或1014个病毒基因组/公斤。在一些实施例中，施用至少2×1012个病毒基因组/公斤(vg/kg)。在一些实施例中，施用的剂量提供阈值多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，阈值治疗性蛋白质血清水平是至少1μg/mL。在一些实施例中，施用的剂量提供大于2μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于3μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于4μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于5μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于6μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于7μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于8μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于9μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于10μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于11μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于12μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于13μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于14μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。在一些实施例中，施用的剂量提供大于15μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。
为了易于施用和剂量均一，根据本发明的组合物通常以剂量单位形式配制。然而，应理解，本发明的组合物的每日总用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体的治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和***速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
非限制性和示例性实施例列于下。
实施例1.一种将治疗性蛋白质递送至受试者的中枢神经***(CNS)的方法，所述方法包括通过肝靶向递送方法向所述受试者施用编码多结构域治疗性蛋白质的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物足以将治疗有效量的所述多结构域治疗性蛋白质提供至所述CNS中，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中所述递送结构域是特异性结合至内化效应物的抗体或其抗原结合片段。
实施例3.根据实施例1或实施例2所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是溶酶体酶。
实施例4.根据实施例3所述的方法，其中所述溶酶体酶是GAA。
实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中所述核苷酸组合物是通过病毒载体施用，任选地其中所述核苷酸组合物是以至少2×1012个病毒基因组/公斤(vg/kg)的剂量施用。
实施例6.根据实施例5所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述内化效应物在细胞的表面上表达，所述细胞选自由以下组成的组：CNS中的细胞、上皮细胞和跨血脑屏障的细胞。
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述递送结构域结合内化效应物，所述内化效应物
(i)选自由以下组成的组：CD63、整合素α-7(ITGA7)、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3及CD36；
(ii)在若干组织类型中表达，其任选地选自由以下组成的组：CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体；
任选地其中所述受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：法布里氏病、戈谢氏病、MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIID、MPS IVB、MPS VI、MPSVII、MPS IX、庞贝氏病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、α甘露糖苷贮积症、神经氨酸酶缺乏症、唾液酸贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、非典型性戈谢氏病、法伯氏脂肪肉芽肿病、岩藻糖苷贮积症及β甘露糖苷贮积症；
(iii)优先由骨和/或软骨表达，其任选地选自由以下组成的组：胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1，
任选地其中所述受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：MPSI、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIID、MPS IVA、MPS IVB、MPS VI、MPS VII、MPS IX、β甘露糖苷贮积症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、法伯氏脂肪肉芽肿病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症及α甘露糖苷贮积症；
(iv)优先由单核细胞、巨噬细胞或微神经胶质细胞表达，其任选地选自由以下组成的组：清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)，
任选地其中所述受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症及法伯氏脂肪肉芽肿病；
(v)优先由肾细胞表达，其任选地选自由以下组成的组：CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)，
任选地其中所述受试者展现一种或多种症状或被诊断患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：法布里氏病、奥尔波特氏综合征、多囊性肾病及血栓性血小板减少性紫癜；
(vi)优先由肝细胞表达，任选地是ASGR1或ASGR2，
任选地其中所述受试者展现一种或多种症状或被诊断患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、MPS VI、MPS VII、MPS II、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、法伯氏脂肪肉芽肿病；
(vii)优先由肌肉细胞表达，其任选地选自由以下组成的组：BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)，
任选地其中所述受试者展现一种或多种症状或被诊断患有庞贝氏病；
(viii)选自由以下组成的组：ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR；或
(ix)是CD63。
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，所述递送结构域是单链可变片段(scFv)。
实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体(CSR)-结合蛋白(CSR-BP)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含水解酶。
实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含糖基化酶。
实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含糖苷酶。
实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含α-葡糖苷酶。
实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或其片段。
实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含抗Aβ或抗τ抗体。
实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO:11的核酸序列。
实施例18.根据实施例1至17中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含α-葡糖苷酶，并且其中所述受试者的任何CNS组织中的糖原水平在治疗后降低达至少九个月。
实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的方法，其中所述受试者患有庞贝氏病。
实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的方法，其中所施用的核苷酸组合物提供至少1μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。
实施例21.一种包含一个或多个递送结构域和一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域结合人转铁蛋白受体(hTfR)。
实施例22.根据实施例21所述的多结构域治疗性蛋白质，其还包含结合至内化效应物的第二递送结构域。
实施例23.根据实施例22所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述第二递送结构域结合至
(i)选自由以下组成的组的内化效应物：CD63、整合素α-7(ITGA7)、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3及CD36；
(ii)在若干组织类型中表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体；
(iii)优先由骨和/或软骨表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白-1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1；
(iv)优先由单核细胞、巨噬细胞或微神经胶质细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)；
(v)优先由肾细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，所述内化效应物是肌肉特异性内化剂，如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)；
(vi)优先由肝细胞表达的内化效应物，任选地是ASGR1或ASGR2；
(vii)优先由肌肉细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)，或
(viii)选自由以下组成的组的内化效应蛋白：ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR。
实施例24.根据实施例21至23中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述第二递送结构域结合至所述内化效应物CD63。
实施例25.根据实施例21至24中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含抗原结合蛋白。
实施例26.根据实施例25所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域各自包含抗原结合蛋白。
实施例27.根据实施例21至26中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含单链可变片段(scFv)。
实施例28.根据实施例21至27中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含半体。
实施例29.根据实施例28所述的多结构域治疗性蛋白质，其中结合hTfR的所述递送结构域是scFv，其中所述半体结合CD63，其中所述酶结构域是GAA，并且其中GAA与结合CD63的所述半体的羧基末端缀合。
实施例30.根据实施例27所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域各自包含scFv。
实施例31.根据实施例27至30中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中至少一个scFv与Fc融合。
实施例32.根据实施例31所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述Fc包含野生型人IgG4同型或其衍生物。
实施例33.根据实施例31至32中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中GAA与所述Fc的羧基末端缀合。
实施例34.根据实施例30所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含抗hTfR scFv、抗hCD63 scFv。
实施例35.根据实施例34所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述抗hTfR scFv和抗hCD63 scFv都在其羧基末端连接至单一GAA酶。
实施例36.根据实施例21至27中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域是抗hTfR scFv，并且所述酶结构域连接至所述scFv的VL结构域的羧基末端。
实施例37.根据实施例36所述的多结构域治疗性蛋白质，其还包含连接至所述抗hTfR scFv的VH结构域的N末端的第二递送结构域。
实施例38.根据实施例37所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述第二递送结构域是抗hCD63 scFV。
实施例39.根据前述实施例中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
实施例40.一种多核苷酸，其编码根据实施例21至39或实施例50至64中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质。
实施例41.根据实施例40所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列。
实施例42.根据实施例40或实施例41所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列。
实施例43.根据实施例40至42中任一项所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，并且其中所述AAV核酸序列包括内部末端重复序列，和任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。
实施例44.根据实施例40至43中任一项所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，所述AAV核酸序列包括含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或两者的内部末端重复序列，和任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。
实施例45.根据实施例40至44中任一项所述的多核苷酸，其还包括含如SEQ IDNO:8和/或SEQ ID NO:9所示的序列的组织特异性调控元件。
实施例46.一种基因治疗载体，其包含根据实施例40至45中任一项所述的多核苷酸。
实施例47.根据实施例46所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体选自由以下组成的组：
病毒载体，任选地其中所述病毒载体是天然病毒、工程改造的病毒或嵌合病毒，
裸多核苷酸，其包含根据实施例20至25中任一项所述的多核苷酸，
多核苷酸复合物，任选地其中所述多核苷酸复合物是包含根据实施例20至25中任一项所述的多核苷酸和脂质的脂质纳米颗粒，及
其任何组合。
实施例48.根据实施例46或实施例47所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是病毒载体，其选自由以下组成的组：逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒。
实施例49.根据实施例47或实施例48所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是AAV9、Anc80、AAV2/8嵌合体、和/或针对特定组织，例如针对肝或神经元组织假型化的AAV。
实施例50.一种包含至少两个递送结构域和至少一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，其中所述两个递送结构域各自独立地选自由抗体、半体和scFv组成的组，并且其中所述递送结构域中至少一个或多个与所述至少一个酶结构域缔合，优选地其中所述一个或多个递送结构域共价连接至所述至少一个酶结构域。
实施例51.根据实施例50所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含不超过两个递送结构域。
实施例52.根据实施例50或实施例51所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域中仅一个与所述至少一个酶结构域缔合。
实施例53.根据实施例50至52中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述至少两个递送结构域各自共价连接至酶结构域。
实施例54.根据实施例53所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述至少两个递送结构域各自共价连接至同一酶结构域。
实施例55.根据实施例53所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述至少两个递送结构域各自共价连接至不同酶结构域。
实施例56.根据实施例50至55中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域，其中第一递送结构域包含半体，并且其中第二递送结构域包含scFv。
实施例57.根据实施例56所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述scFv与Fc融合。
实施例58.根据实施例56或实施例57所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述半体在其羧基末端共价连接至第一酶结构域，和/或其中所述scFv在其羧基末端共价连接至Fc，和任选地第二酶结构域。
实施例59.根据实施例50至55中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域，其中所述第一递送结构域和所述第二递送结构域各自包含scFv。
实施例60.根据实施例59所述的多结构域治疗性蛋白质，其中第一scFv和第二scFv都共价连接至酶结构域。
实施例61.根据实施例59所述的多结构域治疗性蛋白质，其自N末端至C末端包含：所述第一scFv、所述第二scFv和所述酶结构域。
实施例62.根据实施例50至61中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中至少一个递送结构域结合溶酶体运输分子并且至少一个递送结构域结合转胞吞作用效应物。
实施例63.根据实施例62所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述溶酶体运输分子选自由以下组成的组：CD63、ITGA7、CD9、CD63、CD81、CD82或CD151，并且其中所述转胞吞作用效应物选自由以下组成的组：LDL受体、IgA受体、转铁蛋白受体、新生儿Fc受体、胰岛素受体、CD98及基础免疫球蛋白。
实施例64.根据实施例50至63中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含如图1C、图1D、图1E或图1F所描绘的结构。
实施例65.一种编码根据实施例21至39和50至64中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质的核苷酸、根据实施例40至45中任一项所述的多核苷酸或根据实施例46至49中任一项所述的基因治疗载体在根据实施例1至20中任一项所述的方法中的用途。
提供以下实例以进一步说明本发明的方法。这些实例只是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：抗hCD63 ScFv::GAA多核苷酸和基因治疗载体的构建
使用标准的三重转染方案(Gray等人，2011；还参见“重组腺相关病毒载体的制造及其在体外和体内施用中的用途(Production of recombinant adeno-associated viralvectors and use in vitro and in vivo administration)”,《神经科学实验室指南(Current Protocols in Neuroscience)》,John Wiley&Sons,New York(1999),第4.17.1-4.17.25页,第1卷)，产生AAV2/8病毒，所述病毒编码表达人GAA(hGAA；SEQ ID NO:1；核酸序列由SEQ ID NO:12表示)、或在C末端与人GAA融合的抗人CD63单链可变片段(ScFv)(抗hCD63 ScFv-hGAA；SEQ ID NO:10；核酸序列由SEQ ID NO:11表示)。对于产生，将1×107个HEK293细胞涂铺至15cm板上。次日，使用PEIpro(Polyplus transfection,New York,NY目录号115-100)介导的转染，以1:1的(1ul PEIpro:1μg DNA)比率，用(A)8μg包含肝特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子1增强子(SEQ ID NO:9)且编码TTR驱动的人GAA的对照pAAV载体，或包含肝特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子1增强子(SEQ ID NO:9)且编码TTR驱动的hCD63 ScFv-hGAA的测试pAAV(参见图1B)，以及(B)pAAV RC2/8源性载体(Gao，2002)和16μg pHelper(Agilent，目录号240074)转染细胞。在转染后七十二小时，收集细胞，并使用标准冻融法，在包含20mM Tris-HCl、1mM MgCl2、2.5mM KCl，100mM NaCl的缓冲液中裂解细胞。接下来，将苯甲酸酶(Sigma，目录号E1014-25KU)以0.5U/μL最终浓度加入样品中，然后将其在37℃下培育60分钟。然后，如(Zolotukhin等人,1999,《基因疗法(Gene Ther)》1999；6:973-985)中所述，使用碘克沙醇(iodixanol)梯度超速离心法纯化病毒，随后通过qPCR进行滴定。
AAV样品在37℃下用DNaseI(Thermofisher Scientific，目录号EN0525)处理一小时，并使用DNA提取用All Reagents(Thermofisher Scientific目录号4403319)裂解。使用针对AAV2 ITR的引物，使用QuantStudio 3实时PCR***(Thermofisher Scientific)，定量衣壳化的病毒基因组。AAV2 ITR引物的序列是5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′(正向ITR；SEQ ID NO:3)和5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′(反向ITR；SEQ ID NO:4)(Aurnhammer等人，2012)，分别是源自AAV的左侧内部反向重复(ITR)序列(SEQ ID NO:6)和源自AAV的右侧内部反向重复(ITR)序列(SEQ ID NO:7)。AAV2 ITR探针的序列是5′-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3′(SEQ ID NO:5)(Aurnhammer C.,Haase M.,Muether N.等人,2012,《人类基因治疗方法(Hum.Gene Ther.Methods)》23,18-28)。在10分钟的95℃激活步骤后，两步PCR循环在95℃下执行15秒并在60℃下执行30秒，共40个循环。在qPCR中使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Thermofisher Scientific，目录号4304437)。DNA质粒(Agilent，目录号240074)用作测定绝对效价的标准。
抗人CD63抗体及其融合物使用H5C6小鼠抗人CD63可变结构域(SEQ ID NO:10的氨基酸1-119提供了H5C6抗体的重链可变结构域(VH)的氨基酸序列，并且SEQ ID NO:10的氨基酸135-245提供了H5C6抗体的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列)。此处使用的抗hCD63ScFv(SEQ ID NO:2)源自H5C6克隆，该克隆是小鼠抗hCD63单克隆IgG1，κ轻链抗体(H5C6在位于爱荷华大学(University of Iowa)的发育研究杂交瘤库(Developmental StudiesHybridoma Bank)保藏至八月，J.T./Hildreth,J.E.K.(DSHB杂交瘤产品H5C6；DSHB目录号h5c6,RRID:AB 528158)。抗体的ScFv形式以重链-轻链次序用可变结构域克隆，其中甘氨酸-丝氨酸连接子位于重链-轻链之间(5'-VH-Gly-Ser-VL-3')
实例2：AAV后鼠类庞贝氏病模型中的糖原含量
为了确定AAV递送的抗hCD63 ScFv-GAA融合物相对于AAV递送的GAA在相关糖原贮积体内模型中的作用，将两种疗法都递送至庞贝氏病小鼠模型，其中小鼠对于小鼠GAA基因缺失是纯合的，并且对于代替小鼠CD63的人CD63的表达是纯合的，具有75％C57BL/6；25％129SvJ的品系背景。这些小鼠在本文中称为CD63 HumIn GAA KO小鼠或替代地称为CD63hu/hu；GAA-/-小鼠。
对于该实验，通过尾静脉注射向2月龄的CD63 HumIn GAA KO小鼠施用含有基因组的任一种AAV2/8病毒，所述基因组具有驱动人GAA的TTR肝特异性启动子(AAV-hGAA；如实例1中描述)，或驱动在C末端处与人GAA融合的抗人CD63 ScFv的TTR肝特异性启动子(AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA；如实例1中描述)。两种AAV2/8病毒以两种剂量之一递送：每只小鼠1e10vg或每只小鼠1e11 vg。作为对照，测定中包括未治疗的CD63 HumIn GAA KO小鼠和未治疗的具有完整小鼠GAA基因的CD63 HumIn。小鼠在治疗后饲养3个月，并且在此期间，以增量(每月)抽血，用于测量血清中的GAA水平和抗GAA抗体。3个月后，处死所有小鼠，并收集各种组织用于糖原测量、PAS-H染色、中央核的定量、溶酶体增殖的测量和LC3b表达的测量。表3中显示了关于各组小鼠的实验给药和治疗方案。
表3：关于各组小鼠的实验给药和治疗方案
组 小鼠 小鼠数目 治疗 剂量
1 CD63 HumIn GAA KO 4 无 不适用
2 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-hGAA 每只小鼠1e10 vg
3 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-hGAA 每只小鼠1e11 vg
4 CD63 HumIn GAA KO 5 AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA 每只小鼠1e10 vg
5 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA 每只小鼠1e11 vg
6 CD63 HumIn GAA WT 2 无 不适用
结果也描绘于图2中，图中显示抗hCD63scFv::GAA使骨骼肌中的糖原下降至野生型水平，与单独的GAA不同。与单结构域GAA替代酶相比，用含两个结构域的抗hCD63scFv::GAA多结构域治疗性蛋白质处理导致贮积糖原大幅减少。通过将各个小鼠在三个月内的四头肌糖原水平(图3)或心脏糖原水平(图4)对GAA或scfv-GAA的总血清表达作图，观察到即使在类似血清水平下，抗hCD63scFv::GAA融合蛋白也去除比单独GAA酶更多的糖原(图3和4)。
实例3：针对GAA的免疫应答
为了测量抗人GAA抗体血清水平，按照制造商的说明书，使用血清分离器管(BDBiosciences，目录号365967)，将来自所有治疗组的血清自在最终抽血期间收集的血液分离。单独地，用在PBS中稀释的20μg hGAA(R&D Systems，目录号8329-GH-025)涂覆96孔高蛋白结合板(ThermoFisher，目录号15041)过夜。将板用PBS+0.05％Tween(PBS-T)洗涤3次。用含0.5％BSA的PBS-T封闭板，并将范围自1:300至1:5.1e7的小鼠血清连续稀释液加入板中过夜。使用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Immuno Research，目录号115-035-164)和BD Opt EIA底物试剂盒，测量总抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)。使用1N磷酸来终止显色反应。然后，在Spectramax i3板读取器(Molecular Devices)上，在450nm下读取吸光度。将稀释曲线与S形曲线拟合，并由该曲线计算效价。表4中显示了以平均总IgG效价+/-SD表示的效价。
如表4中所示，未接受治疗的小鼠显示平均水平是1.1E+03的平均背景效价。用含AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA或AAV-hGAA的低剂量病毒(每只小鼠1e10 vg)治疗的小鼠展示高效价，而在用高剂量(每只小鼠1e11 vg)治疗的小鼠中，效价较低。在血清中具有最高水平的GAA的用1e11 vg AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗的小鼠具有的效价在未治疗小鼠的范围内。
表4：血清抗GAA抗体水平
Figure BDA0002701634710000761
在AAV施用后较高水平的GAA或抗hCD63scFv::GAA对应较低的抗GAA效价。在注射后三个月的过程中，用高或低效价的AAV-抗hCD63scFv::GAA或AAV-GAA治疗的无GAA小鼠的血清就抗GAA抗体进行评价。图5描绘了各个小鼠的血清抗GAA抗体效价随GAA暴露量(即，在3个月内GAA或scfv-GAA的总血清表达)的变化，其展示抗体效价与针对GAA的血清暴露之间呈负相关，展示具有高GAA暴露量的小鼠对GAA耐受。同样地，图6绘制用编码GAA或抗hCD63scFv::GAA蛋白质的AAV感染的各组的抗GAA抗体效价，展示较高剂量的构建体导致较低效价的抗GAA。
实例4：血清GAA
为了测量在整个实验过程中的人GAA血清水平，在每月一次的时间点，通过尾部抽血收集样品。按照制造商的说明书，使用血清分离器管(BD Biosciences，目录号365967)从血液中分离血清。然后，将1μL分离的血清上样到4-20％Novex楔形孔(wedgewell)预制凝胶上，在220V下跑胶45分钟，并使用标准程序，在200mA下转印至硝酸纤维素膜，保持1小时。然后，硝酸纤维素膜用在12mL中以1:2000稀释度使用的抗GAA一抗(Abcam,#ab137068)、以及以1:1000稀释度使用的抗GAPDH抗体(Abcam,#AB9484)进行探测，并在4℃下培育过夜。在一抗培育后，将膜用1x TBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。然后，将在12mL中以1:15000稀释的抗兔IgG(LiCor,926-32211)和抗小鼠IgG(LiCor,925-68070)(LiCor,Lincoln,NE)二抗加入膜中，并在室温下培育1小时。在二抗培育后，将膜用1x TBST洗涤两次，每次洗涤5分钟，并用1x TBS洗涤一次，共5分钟。然后，使用LiCor Odyssey仪器(LI-COR Biotechnology)，对膜进行成像和定量。表5中显示任意单位的以平均值+/-标准差(SD)表示的GAA血清水平。
如表5中所示，用测试的高剂量(每只小鼠1011vg)的AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA或AAV-hGAA治疗的CD63 HumIn GAA KO小鼠展示在实验过程中血清中GAA的持续水平，其中GAA的血清水平在AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗的小鼠中高于AAV-hGAA治疗的小鼠。在用低剂量(每只小鼠1010vg)的AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA或AAV-hGAA治疗的小鼠中，GAA的水平在实验过程中下降，到12周时间点时，在某些小鼠中接近可忽略不计的水平。
表5：血清GAA水平
Figure BDA0002701634710000771
Figure BDA0002701634710000781
GAA或抗hCD63scfv::GAA的表达在接受高剂量AAV(每只小鼠1011vg)的小鼠中随时间推移得到维持，但在接受较低剂量(每只小鼠1010vg)的小鼠中下降。图7A描绘了绘制在用编码GAA或抗hCD63 scfv与GAA的融合物的AAV感染的各个组中如通过蛋白质印迹法探测的GAA血清水平随时间变化的图。与不含递送结构域的GAA酶相比，融合蛋白(scFv::GAA)展示始终较高水平(例如2.5至3倍)的血清GAA(图7A)。
在注射后3个月，肝、心脏和四头肌裂解产物中的表达的实时PCR定量显示于图7B中。对于AAV构建体的所有注射都检测到肝表达，其中对于AAV-hGAA和AAV-抗hCD63::hGAA两者(两者均由肝特异性启动子LSP驱动)，每只小鼠注射1e11vg具有最高水平。还做出了血清GAA水平与GAA的RNA表达水平的比较(图7C)，并且结果显示接受编码融合蛋白的AAV的小鼠在3个月时存在定位于肝的较低GAA RNA表达，然而，GAA血清水平在该特定小鼠中较高。当RNA水平在肝中较低时，AAV-LSP-hGAA注射不呈现高血清GAA水平。参见图7C。这一数据提示编码融合蛋白(并且表达由肝特异性启动子驱动)的AAV获得关于GAA的改善分泌谱。
还观察到在Huh-7肝细胞中，抗体::hGAA相对于单独hGAA的较高分泌/细胞内比率。在一个实验中，用肝特异性启动子驱动的编码hGAA、抗hCD63 scFv::GAA融合物、或非结合scFv::GAA融合对照的构建体瞬时转染Huh-7人肝细胞。在转染后3天，两种scFv::GAA融合构建体在分泌的上清液中具有比单独hGAA更高比率的蛋白质(统计学显著至p<0.05，n＝3)。在实验期间向上清液中加入M6P减少CI-MPR介导的摄取并不影响该比率。
实例5：糖原的组织测量和肌肉组织的组织学表征
糖原的组织测量：为测量各个组织中的糖原含量，在CO2窒息后立即从来自各组的小鼠中解剖出心脏、四头肌、腓肠肌、膈肌、比目鱼肌和EDL组织，然后，将其在液氮中速冻，并在-80℃下贮存。在台式匀浆器上，用不锈钢珠将约50mg的每种组织在蒸馏水中以1mg/25μL水的比率裂解，用于糖原测量。糖原分析裂解产物在105℃下加热15分钟，并以21000x g离心以清除碎片。根据制造商关于荧光测定的说明书，使用Glycogen Assay Kit(Sigma-Aldrich,#MAK016)执行糖原测量。在荧光板读取器(Molecular Devices,Spectramax i3)上，在535nm激发和587nm发射下，测量每个样品的荧光。使用制造商提供的以下公式计算糖原的计算量。然后，对来自每个治疗组中每种组织的糖原的计算量取平均值，并在表6中以平均值+/-标准差(SD)表示。
如表6中所示，与GAA WT小鼠相比，Gaa损失导致测量的所有组织内平均糖原水平的大量增加。用每只小鼠1011vg的AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗将测试的所有组织中的糖原减少至WT或接近WT水平，与用AAV-GAA治疗不同，该治疗仅部分减少贮积糖原。低剂量的任一病毒也减少糖原，但减少程度低于高剂量。每只小鼠1010vg剂量的AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA以与每只小鼠1011vg剂量的AAV-GAA类似的方式减少糖原水平。
表6：在心脏、四头肌、腓肠肌、膈肌、比目鱼肌和EDL中测量的平均值+/-SD糖原水平
Figure BDA0002701634710000791
用于组织病理学和定量的四头肌收集物：除低剂量(每只小鼠1e10vg)治疗组外，将来自各组小鼠的四头肌组织样品在解剖后立即在液氮中速冻，并在-80℃下贮存用于定量LC3b表达，或放置于含有O.C.T培养基(Tissue-Tek,#4583)的块上。
将O.C.T培养基中的组织样品送至Histoserv,Inc(Germantown,MD)用于切片和过碘酸希夫(PAS)染色，以检测多糖。制备另外的切片并且返回，用于中央核的染色和溶酶体增殖。
PAS染色：使用Leica玻片扫描仪以20x放大率，对PAS染色切片进行成像。由每个治疗组的代表性小鼠得到的图像显示于图8中。
如图8中所示，与展示较高PAS染色水平的未治疗的CD63 HumIn GAA KO小鼠和用AAV-hGAA治疗的CD63 HumIn GAA KO小鼠相比，用AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗的CD63HumIn GAA KO在3个月时展示染色明显减少。这进一步指出，用AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗可减少CD63 HumIn GAA KO小鼠中的多糖累积，并且可在肌肉纤维中以均一的方式实现这点。
中央核的定量和溶酶体增殖：将来自Histoserv的未染色切片从冷冻器中取出，然后在染色室中用含4％多聚甲醛的PBS固定15分钟。然后将固定的载玻片在PBS中洗涤两次，每次5分钟，然后在室温下与封闭缓冲液(eBiosciences,00-4953-54)一起培育1小时。然后，载玻片在潮湿染色室中的同时，用在封闭缓冲液中以1:50稀释的大鼠抗Lamp-1抗体(Abcam,#AB25245)、在封闭缓冲液中以1:1000稀释的兔抗层粘连蛋白抗体(Sigma,#L9393)、或未加入抗体的封闭缓冲液进行染色，然后转移至4℃用于过夜培育。次日，然后将载玻片在PBS中洗涤两次，每次5分钟，随后在染色室中用与Alexa Fluor 647缀合的山羊抗兔IgG(H+L)超克隆二抗(Life Tech Thermo,#A27040)、或与Alexa Fluor 555缀合的山羊抗大鼠IgG(H+L)交叉吸附的二抗(Life Tech Thermo,#A21434)进行染色，然后使其在室温下培育1小时。然后，将染色的载玻片在PBS中清洗两次，每次5分钟，随后将它们用含DAPI的Fluoromount-G(Life Tech Thermo,#00-4959-52)封片，并在Zeiss LSM710仪器(CarlZeiss Microscopy GmbH)上成像。使用Halo软件(Indica Labs,NM)对中央核的数目进行定量，并且以显示中央核的纤维百分比+/-标准差表示，显示于表7中。溶酶体增殖在图8中描绘。
表7：中央核的定量
Figure BDA0002701634710000801
LC3b表达的定量：为了定量LC3b表达，将速冻的样品解冻，匀浆化，然后在RIPA缓冲液中以1mg组织/25μL RIPA缓冲液比率(150mM NaCl、1.0％
Figure BDA0002701634710000812
CA-630、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris，pH 8.0，Sigma Aldrich，R0278)通过珠粒撞击45秒(MPBiomedical)进行裂解。通过以21,000xg离心将裂解产物中的不溶性材料清除，然后将RIPA缓冲液中的300μg裂解产物上样到4-20％Novex楔形孔预制凝胶上，转印到硝酸纤维素膜上，并使用与先前关于血清GAA水平分析所描述类似的方案，使用识别小鼠LC3b-I和LC3b-II的一抗(Sigma,#L7543)取代针对GAA的一抗，通过蛋白质印迹进行分析。然后，使用LiCorOdyssey仪器(LI-COR Biotechnology)，对膜进行成像和定量。表8中显示以任意单位的(平均值+/-标准差)表示的LC3b-I和LC3b-II水平。
如表8中所示，与CD63 HumIn GAA WT小鼠相比，缺乏GAA的小鼠中平均LC3b-I和LC3b-II水平都出现显著增加。用AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗将CD63 HumIn GAA KO中的平均LC3b-I和LC3b-II水平降低至WT或接近WT水平。与CD63 HumIn GAA KO小鼠相比，用AAV-hGAA治疗的CD63 HumIn GAA KO展示略微下降的平均LC3b-I和LC3b-II水平，但这种下降并不像AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA治疗那样明显。
表8：在小鼠四头肌中的LC3b-I和LC3b-II水平
Figure BDA0002701634710000811
实例6：AAV抗hCD63::GAA治疗导致肌肉强度和协调测试中的显著进步
用AAV-LSP hGAA或AAV-LSP抗hCD63::hGAA治疗(参见上文)的小鼠的握力和Rotarod测试性能。野生型GAA小鼠、未治疗对照、AAV-LSP-hGAA(每只小鼠1e11vg)、或AAV-LSP-抗hCD63::hGAA治疗(每只小鼠1e11vg)的加速Rotarod测量(图9A)和前肢握力测量(图9B)以每月一次的间隔进行6个月。误差条是+/-SD。对于所有组，N＝8-10。
实例7：作为将GAA引导至组织的“向导”的其它膜蛋白
测试其它膜蛋白，如抗ITGA7(整合素α-7)融合蛋白，以将GAA导向组织，替代酶缺乏症小鼠中的GAA。在存在或不存在5mM M6P的情况下，将C2C12小鼠成肌细胞与抗mCD63-GAA或抗ITGA7-GAA一起培育过夜。对于两种融合蛋白，随时间推移，在成肌细胞裂解产物中均检测到活性GAA酶(图10A)。在进一步的实验中，针对CD63人源化的GAA KO小鼠(GAA-/-；CD63hu/hu)通过流体动力递送(HDD(给予编码抗hCD63::GAA的scFv::GAA形式、或抗整合素α-7的全长IgG4::GAA形式的质粒，并在HDD后3周处死小鼠。在心脏、四头肌、腓肠肌和膈肌中测量组织糖原水平。还在相同条件下测试未治疗的对照小鼠GAA-/-xCD63hu/hu和未治疗的野生型GAA对照小鼠GAA+/+；CD63hu/hu(4)。如在野生型小鼠中，糖原水平在抗hCD63::GAA治疗的小鼠组和抗ITGA7::GAA治疗的小鼠组两者中均处于非常低的水平。参见图10B。
实例8：在相当的血清水平下，AAV抗CD63::GAA治疗比具有优化的GAA构建体的AAV更有效
用AAV感染的CD63 HumIn GAA KO小鼠(GAA-/-x CD63hu/hu)在肌肉强度和协调测试中展现显著进步，所述AAV含有肝特异性增强子(丝氨酸蛋白酶抑制因子1；SEQ ID NO:9)和肝特异性启动子(LSP；TTR；SEQ ID NO:8)驱动抗hCD63::GAA多结构域治疗剂(SEQ ID NO:10)的表达，其使用胰凝乳蛋白酶原B2信号肽(SP7)，并且包含人GAA的氨基酸36-952(Δ8GAA)。对于每种病毒给予三种不同剂量：5e11vg/kg、2e12vg/kg和4e12vg/kg。定期地通过下颌下抽血来收集血清。AAV感染后一个月，处死小鼠。收集心脏和骨骼肌组织样品，并在液氮中速冻，并且保持在-80℃进行贮存。通过在蒸馏水中用珠粒撞击使组织匀浆化，来测量组织中的糖原。将样品煮沸并离心，并且将上清液用于商业糖原测定试剂盒中。如先前实例中所述，使用蛋白质印迹用针对人GAA的抗体定量血清。对于每只小鼠，将每种组织中的糖原水平针对在1个月时构建体的血清水平作图。使用4-参数曲线拟合确定每种组织中两种治疗的EC50。
用编码抗hCD63::GAA或sp7-Δ8GAA且含有肝特异性启动子(LSP)的AAV感染在每个感染剂量下提供了相当的GAA血清水平。图11。然而，在测定的每种肌肉组织中，当使用抗hCD63::GAA对比sp7-Δ8GAA时，观察到EC50有约2.2倍减少，展示在相等的血清水平下，相较于不与抗体融合的修饰的GAA表达构建体，抗CD63::GAA更有效地清除糖原。参见图12。
实例9：用各种GAA构建体和剂量进行AAV治疗后鼠类庞贝氏病模型的CNS中的糖原含量
通过尾静脉注射向两月龄的CD63 HumIn GAA KO小鼠施用含有基因组的任一种AAV2/8病毒，所述基因组具有驱动人GAA的TTR肝特异性启动子(AAV-hGAA；如实例1中描述)或驱动在C末端与人GAA融合的抗人CD63 ScFv的TTR肝特异性启动子(AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA；如实例1中描述)。两种AAV2/8病毒均以每只小鼠1e11vg递送。作为对照，测定中包括未治疗的CD63 HumIn GAA KO(Gaa-/-)小鼠和具有完整小鼠GAA基因的未治疗CD63 HumIn(野生型小鼠)。治疗之后，将小鼠饲养9个月，之后係所有小鼠并收集各个组织用于测量糖原。在AAV转导之后9个月，在冰上解剖出CNS组织并迅速地速冻。使用珠粒撞击，使脊髓、小脑和海马体组织在蒸馏的去离子水中匀浆化，并使用商购的荧光测定糖原测定试剂盒测量组织裂解产物上清液中的糖原(图13)。
在另一项类似实验中，用编码GAA(1e11 vg)或抗CD63ScFv-GAA融合物(剂量1e10vg、5e10 vg或1e11 vg)的AAV构建体治疗基因剔除小鼠。在AAV递送之后3个月，检查野生型小鼠和每毫克CNS组织中贮积糖原的量(脊髓：图14A；脑：图14B)。对于在相同持续时间(3个月)内CNS组织中的贮积糖原水平，使用野生型小鼠和未治疗的KO小鼠(GAA-/-)作为比较器。
在每只小鼠1e11 vg剂量下，ScFv-GAA融合构建体在降低患病小鼠中贮积糖原水平方面比单独GAA有效(图13-14)。5e10 vg剂量的ScFv-GAA融合物提供的糖原贮积水平降低相当于较高剂量的单独GAA构建体(图14A-14B)。Hordeaux等人2017显示，这些减少的糖原贮积水平有效(例如在鞘内注射AAV GAA的小鼠中糖原减少和肌肉强度改善)。在接受1e11 vg的小鼠中，在5e10 vg和超过15ug/mL下可检测到相关的ScFv-GAA融合蛋白血清水平(表9)。
表9：以重量计的剂量与血清中抗CD63::GAA水平的相关性。
Figure BDA0002701634710000831
不受任一理论束缚，可检测的血清水平，例如高于1ug/mL的跨血脑屏障的连接至递送结构域的GAA的血清水平，被视为具有治疗性。
实例10：包含至少两个递送结构域的多结构域治疗性蛋白质的表达
用图1C-1G中所描绘的表达构建体转染CHO细胞，并确认各构建体的表达(数据未示出)。此外，通过ELISA确认4W1和4M1(图1F)所编码的一些多结构域治疗性蛋白质与CD63的结合(数据未示出)。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
A·巴伊克
K·席格纳
M·普拉加斯提斯
<120> 用于递送治疗性蛋白质的方法和组合物
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<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 952
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys
1 5 10 15
Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu
20 25 30
His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val
35 40 45
Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly
50 55 60
Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr
65 70 75 80
Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys
85 90 95
Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro
100 105 110
Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser
130 135 140
Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu
165 170 175
Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu
180 185 190
Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu
195 200 205
Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg
210 215 220
Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe
225 230 235 240
Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr
245 250 255
Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser
260 265 270
Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly
275 280 285
Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly
290 295 300
Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val
305 310 315 320
Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile
325 330 335
Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln
340 345 350
Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly
355 360 365
Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr
370 375 380
Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val
385 390 395 400
Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe
405 410 415
Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His
420 425 430
Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser
435 440 445
Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg
450 455 460
Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val
465 470 475 480
Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu
485 490 495
Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe
500 505 510
Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly
515 520 525
Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val
530 535 540
Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser
545 550 555 560
Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly
565 570 575
Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly
580 585 590
Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg
595 600 605
Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu
610 615 620
Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro
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Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu
645 650 655
Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg
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Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser
675 680 685
Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala
690 695 700
Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly
705 710 715 720
Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser
725 730 735
Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile
740 745 750
Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro
755 760 765
Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly
770 775 780
Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser
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820 825 830
Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr
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Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala
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Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly
885 890 895
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Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
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cggcctcagt gagcga 16
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cactccctct ctgcgcgctc g 21
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gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
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<220>
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<220>
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<400> 10
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130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu
180 185 190
Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala His Pro Gly Arg Pro
245 250 255
Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp
260 265 270
Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly
275 280 285
Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly
290 295 300
Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu
305 310 315 320
Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr
325 330 335
Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val
340 345 350
Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala
355 360 365
Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg
370 375 380
Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly
385 390 395 400
Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr
405 410 415
Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser
420 425 430
Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu
435 440 445
Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu
450 455 460
Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu
465 470 475 480
Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser
485 490 495
Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg
500 505 510
Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro
515 520 525
Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met
530 535 540
Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His
565 570 575
Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg
580 585 590
Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met
595 600 605
Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp
610 615 620
Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp
625 630 635 640
Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro
645 650 655
Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr
660 665 670
Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His
675 680 685
Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser
690 695 700
Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu
705 710 715 720
Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala
725 730 735
Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu
740 745 750
His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu
755 760 765
Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe
770 775 780
Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser
785 790 795 800
Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn
805 810 815
Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly
820 825 830
Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe
835 840 845
Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu
850 855 860
Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu
865 870 875 880
Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln
885 890 895
Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe
900 905 910
Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly
915 920 925
Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val
930 935 940
Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro
945 950 955 960
Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu
965 970 975
Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu
980 985 990
Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln
995 1000 1005
Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala
1010 1015 1020
Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu
1025 1030 1035
Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala
1040 1045 1050
Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn
1055 1060 1065
Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln
1070 1075 1080
Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu
1085 1090 1095
Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr
1100 1105 1110
Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe
1115 1120 1125
Leu Val Ser Trp Cys
1130
<210> 11
<211> 3489
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 11
atgcacagac ctagacgtcg tggaactcgt ccacctccac tggcactgct cgctgctctc 60
ctcctggctg cacgtggtgc tgatgcagaa gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta 120
gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcaacct ctggattcac tttcagtgac 180
tattacatgt cttgggttcg ccagactcca gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt 240
agtagtagtg gtggtagcac ctattattca gacactgtaa agggccaatt caccatctcc 300
agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca 360
gccatgtatt actgtgcaag acgagaagat tacgacggaa gacttactta ctggggccaa 420
gggactctgg tcaccatctc tgcaggagga agtggtggag gcgggtcagg aggtggcggg 480
agcggcggtg acattgtgct gacacagtct cctgcttcct tagctgtatc tctggggcag 540
agggccacca tctcctgcag ggccagcaaa agtgtcagta catctggtta tagttatatg 600
aactggtacc aacagaaacc aggacagcca cccaaagtcc tcatctatct tgcatccaaa 660
ctagaatctg gggtccctgc caggttcagt ggcagtgggt cagggacaga cttcaccctc 720
aacatccatc ctgtggagga ggaggatgct gcaacctatt actgtcagca cagtagggag 780
cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaaa ctggaaataa aaggtggtgg cggttcagca 840
caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc 900
gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac 960
atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc cagatggggc agccctggtg cttcttccca 1020
cccagctacc ccagctacaa gctggagaac ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc 1080
accctgaccc gtaccacccc caccttcttc cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac 1140
gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc 1200
tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc cacagccggg caccgtcccc actctacagc 1260
gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg 1320
ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc tttgcggacc agttccttca gctgtccacc 1380
tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc 1440
accagctgga ccaggatcac cctgtggaac cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac 1500
ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg 1560
ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg 1620
aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg 1680
gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc 1740
ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc accgctatca cccgccaggt ggtggagaac 1800
atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc cagtggaacg acctggacta catggactcc 1860
cggagggact tcacgttcaa caaggatggc ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag 1920
ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc 1980
cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac 2040
gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc 2100
accaacccca cagccctggc ctggtgggag gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg 2160
cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac gagccttcca acttcatcag gggctctgag 2220
gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg 2280
accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc agccaccagt ttctctccac acactacaac 2340
ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct 2400
cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc 2460
ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa 2520
atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg 2580
ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc 2640
atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg 2700
gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac 2760
acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag 2820
ttccccaagg actctagcac ctggactgtg gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg 2880
ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc 2940
acatggtacg acctgcagac ggtgccagta gaggcccttg gcagcctccc acccccacct 3000
gcagctcccc gtgagccagc catccacagc gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc 3060
ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct gggtacatca tccccctgca gggccctggc 3120
ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt 3180
ggggaggccc gaggggagct gttctgggac gatggagaga gcctggaagt gctggagcga 3240
ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta 3300
cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc 3360
acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc 3420
gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc 3480
tggtgttag 3489
<210> 12
<211> 2859
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc 60
ttggcaaccg ctgcactcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga 120
gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc 180
agcagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca 240
cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag 300
gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc 360
cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac 420
ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc 480
cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac 540
ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc 600
cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg 660
atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc 720
tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc 780
gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac 840
cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg 900
ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg 960
gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac 1020
atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac 1080
ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc 1140
accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc 1200
cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc 1260
ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg 1320
atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag 1380
ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta 1440
tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag 1500
gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac 1560
gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac 1620
ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc 1680
agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc 1740
atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc 1800
tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc 1860
tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct 1920
ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc 1980
tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg 2040
ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc 2100
ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg 2160
gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg 2220
gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag 2280
gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccagta 2340
gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc 2400
gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct 2460
gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc 2520
atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct gttctgggac 2580
gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc 2640
aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag 2700
ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt 2760
gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg 2820
ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag 2859
<210> 13
<211> 398
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp
1 5 10 15
Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys
20 25 30
Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu
35 40 45
Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp
50 55 60
Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln
65 70 75 80
Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys
85 90 95
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala
100 105 110
Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe
115 120 125
Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp
130 135 140
Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
165 170 175
Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys
180 185 190
Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile
195 200 205
Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp
210 215 220
Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly
225 230 235 240
Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp
245 250 255
Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile
260 265 270
Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile
275 280 285
Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp
290 295 300
Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val
305 310 315 320
Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile
325 330 335
Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe
340 345 350
Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp
355 360 365
Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu
370 375 380
Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu
385 390 395
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种将治疗性蛋白质递送至患者的中枢神经***(CNS)的方法，所述方法包括将编码多结构域治疗性蛋白质的核苷酸组合物递送至所述患者的肝中以形成肝贮库，用于在递送后连续数天、数周或数月内产生和分泌至少1μg/mL的一致血清水平的所述多结构域治疗性蛋白质，由此将治疗有效量的所述多结构域治疗性蛋白质提供于所述CNS中，
其中所述多结构域治疗性蛋白质包含结合CD63或ITGA7的抗体或其抗原结合部分以及酶结构域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是溶酶体酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶酶体酶是GAA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核苷酸组合物是通过病毒载体施用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体，任选地其中所述核苷酸组合物是以至少2×1012个病毒基因组/公斤(vg/kg)的剂量施用。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合蛋白包含单链可变片段(scFv)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合蛋白包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含水解酶。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含糖基化酶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含糖苷酶。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含α-葡糖苷酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的氨基酸序列、或其片段。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:11的核酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含α-葡糖苷酶，并且其中受试者的任何CNS组织中的糖原水平在治疗后降低达至少九个月。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述受试者患有庞贝氏病。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述血清水平是至少2μg/mL。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分结合CD63或ITGA7的细胞外结构域。
18.一种包含一个或多个递送结构域和一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的一个结合人转铁蛋白受体(hTfR)，并且其中所述一个或多个递送结构域中的另一个包含结合CD63或ITGA7的抗体或其抗原结合蛋白。
19.根据权利要求18所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域各自包含抗原结合蛋白。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个是单链可变片段(scFv)。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含半体。
22.根据权利要求21所述的多结构域治疗性蛋白质，其中结合hTfR的所述递送结构域是scFv，其中所述半体结合CD63，其中所述酶结构域是GAA，并且其中GAA与结合CD63的所述半体的羧基末端缀合。
23.根据权利要求22所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域各自包含scFv。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中至少一个scFv与Fc融合。
25.根据权利要求24所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述Fc包含野生型人IgG4同型或其衍生物。
26.根据权利要求24至25中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中GAA与所述Fc的羧基末端缀合。
27.根据权利要求23所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含抗hTfR scFv、抗hCD63scFv。
28.根据权利要求27所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述抗hTfR scFv和抗hCD63scFv均在其羧基末端连接至单一GAA酶。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域是抗hTfR scFv，并且所述酶结构域连接至所述scFv的VL结构域的羧基末端。
30.根据权利要求29所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含连接至所述抗hTfR scFv的VH结构域的N末端的另一个递送结构域。
31.根据权利要求30所述的多结构域治疗性蛋白质，其中第二递送结构域是抗hCD63scFv。
32.根据权利要求18至31中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
33.一种包含至少两个递送结构域和至少一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，其中所述两个递送结构域各自独立地选自由抗体、半体和scFv组成的组，并且其中所述递送结构域中的至少一个或多个与所述至少一个酶结构域缔合，优选地其中所述一个或多个递送结构域共价连接至所述至少一个酶结构域。
34.根据权利要求33所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含如图1C、图1D、图1E或图1F中所描绘的结构。
35.一种多核苷酸，其编码根据权利要求18至34中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质。
36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，并且其中所述AAV核酸序列包含内部末端重复序列，以及任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，所述AAV核酸序列包括含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或两者的内部末端重复序列，以及任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的多核苷酸，其还包括含如SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9所示的序列的组织特异性调控元件。
41.一种基因治疗载体，其包含根据权利要求35至40中任一项所述的多核苷酸。
42.根据权利要求41所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体选自由以下组成的组：
病毒载体，任选地其中所述病毒载体是天然病毒、工程改造的病毒或嵌合病毒，
裸多核苷酸，其包含根据权利要求35至40中任一项所述的多核苷酸，
多核苷酸复合物，任选地其中所述多核苷酸复合物是包含根据权利要求34至39中任一项所述的多核苷酸和脂质的脂质纳米颗粒，以及
其任何组合。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是选自由以下组成的组的病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是AAV9、Anc80、AAV2/8嵌合体和/或针对特定组织，例如针对肝或神经元组织假型化的AAV。
45.一种编码根据权利要求18至34中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质的核苷酸、根据权利要求35至40中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求41至44中任一项所述的基因治疗载体在根据权利要求1至17中任一项所述的方法中的用途。

Claims (65)

1.一种将治疗性蛋白质递送至受试者的中枢神经***(CNS)的方法，所述方法包括通过肝靶向递送方法向所述受试者施用编码多结构域治疗性蛋白质的核苷酸组合物，所述核苷酸组合物足以将治疗有效量的所述多结构域治疗性蛋白质提供至所述CNS中，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述递送结构域是特异性结合至内化效应物的抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是溶酶体酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述溶酶体酶是GAA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述核苷酸组合物是通过病毒载体施用。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体，任选地其中所述核苷酸组合物是以至少2×1012个病毒基因组/公斤(vg/kg)的剂量施用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述内化效应物在细胞的表面上表达，所述细胞选自由以下组成的组：所述CNS中的细胞、上皮细胞和跨血脑屏障的细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述递送结构域结合内化效应物，所述内化效应物
(i)选自由以下组成的组：CD63、整合素α-7(ITGA7)、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3及CD36；
(ii)在若干组织类型中表达，
其任选地选自由以下组成的组：CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体；
任选地其中所述受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：法布里氏病、戈谢氏病、MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIID、MPS IVB、MPS VI、MPS VII、MPS IX、庞贝氏病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、α甘露糖苷贮积症、神经氨酸酶缺乏症、唾液酸贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、非典型性戈谢氏病、法伯氏脂肪肉芽肿病、岩藻糖苷贮积症及β甘露糖苷贮积症；
(iii)优先由骨和/或软骨表达，
其任选地选自由以下组成的组：胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1，
任选地其中所述受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIID、MPS IVA、MPS IVB、MPS VI、MPS VII、MPS IX、β甘露糖苷贮积症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、法伯氏脂肪肉芽肿病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症及α甘露糖苷贮积症；
(iv)优先由单核细胞、巨噬细胞或微神经胶质细胞表达，
其任选地选自由以下组成的组：清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)，
任选地其中所述受试者展现选自由以下组成的组的疾病的一种或多种症状：溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症及法伯氏脂肪肉芽肿病；
(v)优先由肾细胞表达，
其任选地选自由以下组成的组：CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)，
任选地其中所述受试者展现一种或多种症状或被诊断患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：法布里氏病、奥尔波特氏综合征、多囊性肾病及血栓性血小板减少性紫癜；
(vi)优先由肝细胞表达，
任选地是ASGR1或ASGR2，
任选地其中所述受试者展现一种或多种症状或被诊断患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、戈谢氏病、MPS VI、MPS VII、MPS II、A型、B型和C2型尼曼-皮克二氏病、唾液酸贮积症、神经氨酸酶缺乏症、非典型性戈谢氏病、联合鞘脂激活蛋白缺乏症、法伯氏脂肪肉芽肿病；
(vii)优先由肌肉细胞表达，
其任选地选自由以下组成的组：BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)，
任选地其中所述受试者展现一种或多种症状或被诊断患有庞贝氏病；
(viii)选自由以下组成的组：ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR；或
(ix)是CD63。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述递送结构域是单链可变片段(scFv)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体(CSR)-结合蛋白(CSR-BP)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含水解酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含糖基化酶。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含糖苷酶。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含α-葡糖苷酶。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或其片段。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含抗Aβ或抗τ抗体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:11的核酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含α-葡糖苷酶，并且其中所述受试者的任何CNS组织中的糖原水平在治疗后降低达至少九个月。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述受试者患有庞贝氏病。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所施用的核苷酸组合物提供至少1μg/mL的多结构域治疗性蛋白质血清水平。
21.一种包含一个或多个递送结构域和一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域结合人转铁蛋白受体(hTfR)。
22.根据权利要求21所述的多结构域治疗性蛋白质，其还包含结合至内化效应物的第二递送结构域。
23.根据权利要求22所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述第二递送结构域结合至
(i)选自由以下组成的组的内化效应物：CD63、整合素α-7(ITGA7)、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、IGF2R、空泡型H+ATP酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3及CD36；
(ii)在若干组织类型中表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：CD63、MHC-I、空泡型H+ATP酶、IGF2R、整合素α-7(ITGA7)、LRP5、LRP6、LRP8、Kremen-2、LDL-受体、LDL相关蛋白质1受体、淀粉样前体蛋白样蛋白质-2(APLP2)、爱帕琳肽受体(APLNR)、PRLR、MAL(髓磷脂和淋巴细胞蛋白质(MAL)、白喉毒素受体、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体、瘦素受体及叶酸受体；
(iii)优先由骨和/或软骨表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：胶原蛋白X、整合素α10(ITGA10)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体同功异型物C(FGFR3C)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白-1(CRTL1)、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II及Kremen-1；
(iv)优先由单核细胞、巨噬细胞或微神经胶质细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：清道夫受体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、CD36、MSR1(巨噬细胞清道夫受体1)、MRC1(巨噬细胞甘露糖受体1)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4)、CD68(巨噬唾液酸蛋白)及CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)；
(v)优先由肾细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：CDH16(钙粘蛋白-16)、CLDN16(紧密连接蛋白-16)、KL(Klotho)、PTH1R(甲状旁腺激素受体)、SLC22A13(溶质载体家族22成员13)、SLC5A2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)及UMOD(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，所述内化效应物是肌肉特异性内化剂，如BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)；
(vi)优先由肝细胞表达的内化效应物，任选地是ASGR1或ASGR2；
(vii)优先由肌肉细胞表达的内化效应物，其任选地选自由以下组成的组：BMPR1A(骨形态发生蛋白受体1A)、m-钙粘蛋白、CD9、MuSK(肌肉特异性激酶)、LGR4/GPR48(G蛋白偶合受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、CDH15(钙粘蛋白-15)、ITGA7(整合素α-7)、CACNG1(L型钙通道亚基γ-1)、CACNAlS(L型钙通道亚基α-15)、CACNG6(L型钙通道亚基γ-6)、SCN1B(钠通道亚基β-1)、CHRNA1(ACh受体亚基α)、CHRND(ACh受体亚基δ)、LRRC14B(含富亮氨酸重复序列的蛋白质14B)、肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)及POPDC3(含大力水手结构域蛋白3)，或
(viii)选自由以下组成的组的内化效应蛋白：ITGA7、CD9、CD63、ALPL2、MSR1、ASGR1、ASGR2或PRLR。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述第二递送结构域结合至所述内化效应物CD63。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含抗原结合蛋白。
26.根据权利要求25所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域各自包含抗原结合蛋白。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含单链可变片段(scFv)。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域中的至少一个包含半体。
29.根据权利要求28所述的多结构域治疗性蛋白质，其中结合hTfR的所述递送结构域是scFv，其中所述半体结合CD63，其中所述酶结构域是GAA，并且其中GAA与结合CD63的所述半体的羧基末端缀合。
30.根据权利要求27所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述一个或多个递送结构域各自包含scFv。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中至少一个scFv与Fc融合。
32.根据权利要求31所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述Fc包含野生型人IgG4同型或其衍生物。
33.根据权利要求31至32中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中GAA与所述Fc的羧基末端缀合。
34.根据权利要求30所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含抗hTfR scFv、抗hCD63scFv。
35.根据权利要求34所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述抗hTfR scFv和抗hCD63scFv都在其羧基末端连接至单一GAA酶。
36.根据权利要求21至27中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域是抗hTfR scFv，并且所述酶结构域连接至所述scFv的VL结构域的羧基末端。
37.根据权利要求36所述的多结构域治疗性蛋白质，其还包含连接至所述抗hTfR scFv的VH结构域的N末端的第二递送结构域。
38.根据权利要求37所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述第二递送结构域是抗hCD63 scFV。
39.根据前述权利要求中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
40.一种包含至少两个递送结构域和至少一个酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，其中所述两个递送结构域各自独立地选自由抗体、半体和scFv组成的组，并且其中所述递送结构域中至少一个或多个与所述至少一个酶结构域缔合，优选地其中所述一个或多个递送结构域共价连接至所述至少一个酶结构域。
41.根据权利要求40所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含不超过两个递送结构域。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域中仅一个与所述至少一个酶结构域缔合。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述至少两个递送结构域各自共价连接至酶结构域。
44.根据权利要求43所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述至少两个递送结构域各自共价连接至同一酶结构域。
45.根据权利要求43所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述至少两个递送结构域各自共价连接至不同酶结构域。
46.根据权利要求40至45中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域，其中第一递送结构域包含半体，并且其中第二递送结构域包含scFv。
47.根据权利要求46所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述scFv与Fc融合。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述半体在其羧基末端共价连接至第一酶结构域，和/或其中所述scFv在其羧基末端共价连接至Fc，和任选地第二酶结构域。
49.根据权利要求40至45中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含不超过两个递送结构域，其中所述第一递送结构域和所述第二递送结构域各自包含scFv。
50.根据权利要求49所述的多结构域治疗性蛋白质，其中第一scFv和第二scFv都共价连接至酶结构域。
51.根据权利要求49所述的多结构域治疗性蛋白质，其自N末端至C末端包含：所述第一scFv、所述第二scFv和所述酶结构域。
52.根据权利要求40至51中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其中至少一个递送结构域结合溶酶体运输分子并且至少一个递送结构域结合转胞吞作用效应物。
53.根据权利要求52所述的多结构域治疗性蛋白质，其中所述溶酶体运输分子选自由以下组成的组：CD63、ITGA7、CD9、CD63、CD81、CD82或CD151，并且其中所述转胞吞作用效应物选自由以下组成的组：LDL受体、IgA受体、转铁蛋白受体、新生儿Fc受体、胰岛素受体、CD98及基础免疫球蛋白。
54.根据权利要求40至53中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质，其包含如图1C、图1D、图1E或图1F所描绘的结构。
55.一种多核苷酸，其编码根据权利要求21至54中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质。
56.根据权利要求55所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，并且其中所述AAV核酸序列包含内部末端重复序列，和任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的多核苷酸，其还包含病毒核酸序列和基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(AAV)核酸序列，所述AAV核酸序列包括含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或两者的内部末端重复序列，和任选地组织特异性调控元件，如肝特异性启动子或神经元特异性启动子。
60.根据权利要求55至59中任一项所述的多核苷酸，其还包括含如SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9所示的序列的组织特异性调控元件。
61.一种基因治疗载体，其包含根据权利要求55至60中任一项所述的多核苷酸。
62.根据权利要求61所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体选自由以下组成的组：
病毒载体，任选地其中所述病毒载体是天然病毒、工程改造的病毒或嵌合病毒，
裸多核苷酸，其包含根据权利要求20至25中任一项所述的多核苷酸，
多核苷酸复合物，任选地其中所述多核苷酸复合物是包含根据权利要求20至25中任一项所述的多核苷酸和脂质的脂质纳米颗粒，以及
其任何组合。
63.根据权利要求61或权利要求62所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是病毒载体，其选自由以下组成的组：逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒。
64.根据权利要求62或权利要求63所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是AAV9、Anc80、AAV2/8嵌合体、和/或针对特定组织，例如针对肝或神经元组织假型化的AAV。
65.一种编码根据权利要求21至54中任一项所述的多结构域治疗性蛋白质的核苷酸、根据权利要求55至60中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求61至64中任一项所述的基因治疗载体在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中的用途。
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