ES2396693T3

ES2396693T3 - Heterodímero de integrina y subunidad del mismo

Info

Publication number: ES2396693T3
Application number: ES99919725T
Authority: ES
Inventors: Evy Lundgren-Akerlund
Original assignee: Xintela AB
Current assignee: Xintela AB
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2013-02-25
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: JP4912528B2; JP2014221055A; JP2002517182A; US20060178503A1; DK1068238T3; CA2324381A1; US10081666B2; EP1068238B1; CA2324381C; AU3738099A; US20130137118A1; JP5650038B2; JP2011217745A; AU761430B2; US8895253B2; US20170121386A1; US20120136141A1; US8048991B2; WO1999051639A1; EP1068238A1

Abstract

Subunidad α10 de integrina de unión a colágeno aislada o recombinante quecomprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1, o una variante decorte y empalme de la misma, o un fragmento de la mismaen la que: la variante de corte y empalme comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.2; y el fragmento se selecciona del grupo que consiste en fragmentos que comprendenla secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, fragmentos que comprendenla secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácidon.º 986 de SEQ ID No. 1 y fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidosdesde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1

Description

Heterodímero de integrina y subunidad del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un heterodímero de integrina aislado o recombinante que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, a la subunidad a10 del mismo, a homólogos y fragmentos de dicha integrina y de dicha subunidad a10 que tienen actividad biológica similar, a procedimientos de producción del mismo, a polinucleótidos y oligonucleótidos que codifican para el mismo, a vectores y células que comprenden el mismo, a entidades de unión que se unen específicamente al mismo, y al uso del mismo.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una gran familia de glicoproteínas transmembrana que median en interacciones célula-célula y célula-matriz (1-5). Todos los miembros conocidos de esta superfamilia son heterodímeros asociados no covalentemente compuestos por una subunidad ay una p. En la actualidad, se han caracterizado 8 subunidades p(p1-p8)

(6) y 16 subunidades a(a1-a9, av, aM, aL, aX, aIIb, aE y aD) (6-21), y estas subunidades se asocian para generar más de 20 integrinas diferentes. Se ha mostrado que la subunidad p1 se asocia con diez subunidades adiferentes, a1-a9 y av, y que media en interacciones con proteínas de la matriz extracelular tales como colágenos, lamininas y fibronectina. Las integrinas de unión a colágeno principales son a1p1 y a2p1 (22-25). Se ha notificado también que las integrinas a3p1 y a9p1 interaccionan con colágeno (26, 27) aunque esta interacción no se entiende bien (28). Las regiones N-terminales extracelulares de las subunidades de integrina ay pson importantes en la unión de ligandos (29, 30). La región N-terminal de las subunidades a está compuesta por una secuencia repetida siete veces (12, 31) que contiene secuencias consenso FG y GAP. Se pronostica que las repeticiones se pliegan en un dominio de hélice p(32) conteniendo las últimas tres o cuatro repeticiones supuestos sitios de unión de cationes divalentes. Las subunidades de integrina aa1, a2, aD, aE, aL, aM y aX contienen un dominio insertado de �200 aminoácidos, el dominio I (dominio A), que muestra similitud con secuencias en el factor de von Willebrand, la proteína de la matriz de cartílago y los factores del complemento C2 y B (33, 34). El dominio I se localiza entre las repeticiones de FG-GAP segunda y tercera, contiene un sitio de adhesión dependiente de ión metálico (MIDAS) y está implicado en la unión de ligandos (35-38).

Los condrocitos, el único tipo de células en el cartílago, expresan varias integrinas diferentes incluyendo a1p1, a2p1, a3p1, a5p1, a6p1, avp3 y avp5 (39-41). Se ha mostrado que a1p1 y a2p1 median en interacciones de condrocitos con colágeno tipo II (25) que es uno de los componentes principales en el cartílago. Se ha mostrado también que a2p1 es un receptor para la proteína de la matriz de cartílago condroadherina (42).

Holmvall et al (Exp. Cell Res. Vol. 221, 1995, págs. 496-503) describen la investigación de integrinas de condrocitos con afinidad por colágeno tipo II así como cambios en la expresión de ARNm que codifican para colágeno tipo II, agrecano y diversas subunidades de integrina en respuesta a estrés mecánico dinámico. Además, Camper et al. encontraron una integrina p1 de unión a colágeno tipo II con una subunidad aligeramente mayor que a2. Esta subunidad de integrina estaba presente tanto en condrocitos bovinos como células de condrosarcoma humanas pero no pudieron identificarla con ningún anticuerpo frente a a1, a2, a3, o a9. Este estudio no se realizó en condrocitos humanos.

Camper et al. (J. Biol. Chem., vol. 273, 1998, págs. 1159-1167) es un artículo publicado posteriormente que describe el aislamiento, la clonación y el análisis de secuencia de la subunidad a10 de integrina, una integrina de unión a colágeno asociada a p1 expresada en condrocitos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una integrina de unión a colágeno tipo II novedosa, que comprende una subunidad a10 en asociación con una subunidad p, especialmente una subunidad p1, pero también pueden contemplarse otras subunidades p. En realizaciones preferidas, esta integrina se ha aislado de condrocitos articulares bovinos o humanos, y células de condrosarcoma humanas.

La presente invención se refiere en particular a una subunidad a10 de integrina aislada

o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, y homólogos y o fragmentos de la misma según la reivindicación 1.

La invención se refiere además a un procedimiento de producción de una subunidad a10 de integrina recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o fragmentos de la misma, procedimiento que comprende las etapas de

a) aislar un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma,

b) construir un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado,

c) transformar una célula huésped con dicho vector de expresión,

d) cultivar dicha célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de la subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma, en dicha célula huésped transformada, y, opcionalmente,

e) aislar la subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma, a partir de dicha célula huésped transformada o dicho medio de cultivo.

La subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma, puede proporcionarse también mediante aislamiento a partir de una célula en la que está presente de manera natural.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende un nucleótido que codifica para subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma según la reivindicación 1, polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o partes de la misma.

La invención se refiere en un aspecto adicional a vectores que comprenden los polinucleótidos anteriores, y a células que contienen dichos vectores y células que tienen polinucleótidos u oligonucleótidos mostrados en SEQ ID No. 1 ó 2 integrados en su genoma.

La invención también se refiere a entidades de unión que tienen la capacidad de unirse específicamente a la subunidad a10 de integrina o fragmentos de la misma, tales como proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos, ligandos naturales, anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un heterodímero de integrina aislado

o recombinante que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, en el que la subunidad a10 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o fragmentos de la misma.

En una realización preferida de la misma, la subunidad p es p1.

La invención también se refiere a un procedimiento de producción de un heterodímero de integrina recombinante que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, en el que la subunidad a10 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, procedimiento que comprende las etapas de

a) aislar un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una subunidad a10 de un heterodímero de integrina y, opcionalmente, otro polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una subunidad p de un heterodímero de integrina, o fragmentos de la misma,

b) construir un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido aislado que codifica para dicha subunidad a10 en combinación con un vector de expresión que comprende dicho nucleótido aislado que codifica para dicha subunidad p,

c) transformar una célula huésped con dichos vectores de expresión,

d) cultivar dicha célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo, en dicha célula huésped transformada, y, opcionalmente,

e) aislar el heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo, a partir de dicha célula huésped transformada o dicho medio de cultivo.

El heterodímero de integrina, o fragmentos del mismo, también puede proporcionarse mediante aislamiento a partir de una célula en la que está presente de manera natural.

La invención se refiere además a una célula que contiene un primer vector, comprendiendo dicho primer vector un polinucleótido que codifica para una subunidad a10 de un heterodímero de integrina, o partes de la misma, polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 o partes de la misma, y, opcionalmente, un segundo vector, comprendiendo dicho segundo vector un polinucleótido que codifica para una subunidad p de un heterodímero de integrina, o fragmentos de la misma.

Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a entidades de unión que tienen la capacidad de unirse específicamente al heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo, preferiblemente en el que la subunidad p es p1. Entidades de unión preferidas son proteínas, péptidos, hidratos

de carbono, lípidos, ligandos naturales, anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un fragmento de la subunidad a10 de integrina, fragmento que es un péptido elegido del grupo que comprende péptidos del dominio citoplasmático, el dominio I y el dominio cortado y empalmado.

En una realización, dicho fragmento es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ.

En otra realización, dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 952 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1.

En una realización adicional, dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 140 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 337 en SEQ ID No. 1.

Otra realización de la invención se refiere a un polinucleótido u oligonucleótido que codifica para un fragmento de la subunidad a10 de integrina humana. En una realización, este polinucleótido u oligonucleótido codifica para un fragmento que es un péptido elegido del grupo que comprende péptidos del dominio citoplasmático, el dominio I y el dominio cortado y empalmado. En realizaciones adicionales, el polinucleótido u oligonucleótido codifica para los fragmentos definidos anteriormente.

La invención también se refiere a entidades de unión que tienen la capacidad de unirse específicamente a un fragmento de la subunidad a10 de integrina tal como se definió anteriormente.

La invención también se refiere a un procedimiento de uso de una subunidad a10 de integrina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o un heterodímero de integrina que comprende dicha subunidad a10 y una subunidad p, o un homólogo o fragmento de dicha integrina o subunidad que tiene actividad biológica similar, como marcador o molécula diana de células o tejidos que expresan dicha subunidad a10 de integrina, células o tejidos que son de origen animal incluyendo humano.

En una realización de este procedimiento, el fragmento es un péptido elegido del grupo que comprende péptidos del dominio citoplasmático, el dominio I y el dominio cortado y empalmado.

En realizaciones adicionales de dicho procedimiento, el fragmento es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, o un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 952 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1, o un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 140 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 337 de SEQ ID no. 1.

La subunidad p es preferiblemente p1. Las células se eligen preferiblemente del grupo que comprende condrocitos, células de músculo liso, células endoteliales, osteoblastos y fibroblastos.

Dicho procedimiento puede usarse durante estados patológicos que implican a dicha subunidad a10, tales como estados patológicos que comprenden daño de cartílago, o que comprenden traumatismo, artritis reumatoide y osteoartritis.

Dicho procedimiento puede usarse para detectar la formación de cartílago durante el desarrollo embrionario, o para detectar la reparación fisiológica o terapéutica de cartílago.

Dicho procedimiento puede usarse también para la selección y el análisis, o para la clasificación, el aislamiento o la purificación de condrocitos.

Una realización adicional de dicho procedimiento es un procedimiento para detectar la regeneración de cartílago o condrocitos durante el trasplante de cartílago o condrocitos.

Todavía una realización adicional de dicho procedimiento es un procedimiento para estudios in vitro de diferenciación de condrocitos.

La invención también comprende un procedimiento de uso de entidades de unión que tienen la capacidad de unirse específicamente a una subunidad a10 de integrina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o un heterodímero de integrina que comprende dicha subunidad a10 y una subunidad p,

o fragmentos del mismo, como marcadores o moléculas diana de células o tejidos que expresan dicha subunidad a10 de integrina, células o tejidos que son de origen animal incluyendo humano.

El fragmento en dicho procedimiento puede ser un péptido elegido del grupo que comprende péptidos del dominio citoplasmático, el dominio I y el dominio cortado y empalmado. En realizaciones preferidas, dicho fragmento es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, o un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 952 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1, o un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 140 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1.

El procedimiento puede usarse también para detectar la presencia de una subunidad a10 de integrina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o de un heterodímero de integrina que comprende dicha subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo.

En una realización adicional, dicho procedimiento es un procedimiento para determinar el estado de diferenciación de células durante el desarrollo embrionario, la angiogénesis o el desarrollo de cáncer.

Todavía en una realización adicional, este procedimiento es un procedimiento para detectar la presencia de una subunidad a10 de integrina, o fragmento de dicha subunidad de integrina, en células, mediante lo cual un polinucleótido u oligonucleótido elegido del grupo que comprende un polinucleótido u oligonucleótido elegido de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 se usa como marcador en condiciones de hibridación en las que dicho polinucleótido u oligonucleótido no puede hibridarse con un ADN o ARN que codifica para una subunidad a1 de integrina. Dichas células pueden elegirse del grupo que comprende condrocitos, células de músculo liso, células endoteliales, osteoblastos y fibroblastos. Dicho fragmento de integrina puede ser un péptido elegido del grupo que comprende péptidos del dominio citoplasmático, el dominio I y el dominio cortado y empalmado, tal como un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, o un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 952 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1, o un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 140 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1.

Todavía en una realización adicional, el procedimiento es un procedimiento para determinar el estado de diferenciación de células durante el desarrollo, en estados patológicos, en regeneración de tejidos o en reparación fisiológica y terapéutica de cartílago. Los estados patológicos pueden ser cualquier estado patológico que implique a la subunidad a10 de integrina, tales como artritis reumatoide, osteoartrosis o cáncer. Las células pueden elegirse del grupo que comprende condrocitos, células de músculo liso, células endoteliales, osteoblastos y fibroblastos.

La invención también se refiere a un procedimiento para determinar el estado de diferenciación de células durante el desarrollo, en estados patológicos, en regeneración de tejidos y en reparación fisiológica y terapéutica de cartílago, mediante lo cual un polinucleótido u oligonucleótido elegido de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 se usa como marcador en condiciones de hibridación en las que dicho polinucleótido u oligonucleótido no puede hibridarse con un ADN o ARN que codifica para una subunidad a1 de integrina. Realizaciones de este aspecto comprenden un procedimiento mediante el cual dicho polinucleótido u oligonucleótido es un polinucleótido u oligonucleótido que codifica para un péptido elegido del grupo que comprende péptidos del dominio citoplasmático, el dominio I y el dominio cortado y empalmado, tal como un polinucleótido u oligonucleótido que codifica para un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, o que comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 952 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1, o la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido n.º 140 hasta aproximadamente el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1. Dichos estados patológicos pueden ser cualquier estado patológico que implique a la subunidad a10 de integrina, tales como artritis reumatoide, osteoartrosis o cáncer, o aterosclerosis o inflamación. Dichas células pueden elegirse del grupo que comprende condrocitos, células de músculo liso, células endoteliales, osteoblastos y fibroblastos.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende como principio activo un agente farmacéutico o un anticuerpo que puede usar un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad a10, como molécula diana. Una realización de dicha composición farmacéutica está destinada para su uso en la estimulación, la inhibición o el bloqueo de la formación de cartílago, hueso o vasos sanguíneos. Una realización adicional comprende una composición farmacéutica para su uso en la prevención de la adhesión entre tendones/ligamentos y el tejido circundante tras infección, inflamación y tras intervención quirúrgica en la que la adhesión afecta a la función del tejido.

La invención también se refiere a una vacuna que comprende como principio activo un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad a10, o ADN o ARN que codifica para dicha subunidad a10 de integrina.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de la subunidad a10 de integrina tal como se definió anteriormente como marcador o diana en trasplante de cartílago o condrocitos.

Todavía un aspecto adicional de la invención se refiere a un método de uso de entidades de unión que tienen la capacidad de unirse específicamente a una subunidad a10 de integrina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o un heterodímero de integrina que comprende dicha subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo, para promover la adhesión de condrocitos y/o osteoblastos a superficies de implantes para estimular la integración ósea.

La invención se refiere también al uso de una subunidad a10 de integrina o un heterodímero de integrina que comprende dicha subunidad a10 y una subunidad p como diana para moléculas o fármacos antiadhesivos en tendón, ligamento, músculo esquelético u otros tejidos en los que la adhesión afecta a la función del tejido.

La invención también se refiere a un método de estimulación, inhibición o bloqueo de la formación de cartílago o hueso, que comprende la administración a un sujeto de una cantidad adecuada de un agente farmacéutico o un anticuerpo que puede usar un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad a10, como molécula diana.

En otra realización, la invención se refiere a un método de prevención de la adhesión entre tendones/ligamentos y el tejido circundante tras infección, inflamación y tras intervención quirúrgica en la que la adhesión afecta a la función del tejido, que comprende administración a un sujeto de una cantidad adecuada de un agente farmacéutico o un anticuerpo que puede usar un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad a10, como molécula diana.

La invención también se refiere a un método de estimulación de la síntesis y reparación de la matriz extracelular mediante activación o bloqueo de un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o de la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad a10.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de detección in vitro de la presencia de entidades de unión a integrina, que comprende la interacción de un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad, con una muestra, provocando de ese modo que dicha integrina, subunidad a10, u homólogo o fragmento de la misma, module la unión a su ligando natural u otras proteínas de unión a integrina presentes en dicha muestra.

La invención también se refiere a un método de estudio in vitro de las consecuencias de la interacción de una integrina de heterodímero humana que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad, con una entidad de unión a integrina e iniciar de ese modo una reacción celular. Dichas consecuencias pueden medirse como alteraciones en funciones celulares.

La invención también se refiere a un método de uso de una integrina de heterodímero humana que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o la subunidad a10 del mismo, o fragmento de dicha integrina o subunidad, o un ADN o ARN que codifica para una subunidad a10 de integrina o fragmentos de la misma, como marcador o molécula diana durante la angiogénesis.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Purificación por afinidad de la subunidad de integrina a10 sobre colágeno tipo II-Sepharose.

Figura 2. Secuencias de aminoácidos de péptidos de la subunidad de integrina a10 bovina.

Figura 3a. Purificación por afinidad e inmunoprecipitación de la subunidad a10 de integrina a partir de condrocitos bovinos.

Figura 3b. Purificación por afinidad e inmunoprecipitación de la subunidad a10 de integrina a partir de condrocitos humanos.

Figura 3c. Purificación por afinidad e inmunoprecipitación de la subunidad a10 de integrina a partir de células de condrosarcoma humanas.

Figura 4. Un fragmento de PCR de 900 pb que corresponde a la subunidad a10 de integrina bovina.

Figura 5. Mapa esquemático de los tres clones de a10 solapantes.

Figura 6. Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida de la subunidad de integrina a10 humana.

Figura 7. Transferencia de tipo Northern de ARNm de integrina a10.

Figura 8. Inmunoprecipitación de la subunidad de integrina a10 a partir de condrocitos humanos usando anticuerpos contra el dominio citoplasmático de a10 (a). Inmunotransferencia de tipo Western de la cadena p asociada a a10 (b).

Figura 9. Inmunotinción de integrina a10 en cartílago articular humano.

Figura 10. Inmunotinción de integrina a10 en cartílago de extremidades de ratón de 3 días.

Figura 11. Inmunotinción de integrina a10 en embrión de ratón de 13,5 días.

Figura 12. Hibridación de ARNm de a10 en diversos tejidos humanos.

Figura 13. Inmunotinción de la fascia alrededor del tendón (a), músculo esquelético (b) y válvulas cardiacas (c) en extremidad de ratón de 3 días.

Figura 14. Fragmentos de PCR correspondientes a la subunidad de integrina a10 a partir de condrocitos humanos, células endoteliales humanas, fibroblastos humanos y tendón de rata.

Figura 15. Secuencia de nucleótidos genómica parcial de la subunidad a10 de integrina humana.

Figura 16. Regulación por incremento de la subunidad de integrina a10 en condrocitos cultivados en alginato.

Figura 17. Inmunoprecipitación de la subunidad de integrina a10 a partir de células de músculo liso humanas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención demuestra que los condrocitos humanos y bovinos expresan una integrina de unión a colágeno tipo II novedosa en la familia p1. Un estudio anterior presentó algunas pruebas de que células de condrosarcoma humanas también expresan esta integrina (25). Experimentos de inmunoprecipitación usando anticuerpos contra la subunidad p1 de integrina revelaron que esta subunidad de integrina a novedosa tenía un peso molecular aparente (Mr) de aproximadamente 160 kDa en condiciones reductoras, y era ligeramente mayor que la subunidad de integrina a2. Para aislar esta subunidad a, se purificaron por afinidad proteínas de unión a colágeno tipo II a partir de condrocitos bovinos. Se aplicó en primer lugar el lisado de condrocitos a una precolumna de fibronectina-Sepharose y entonces se aplicó la fracción no retenida a una columna de colágeno tipo II-Sepharose. Se eluyó específicamente una proteína con Mr de aproximadamente 160 kD con EDTA a partir de la columna de colágeno pero no a partir de la columna de fibronectina. El Mr de esta proteína correspondía con el Mr de la subunidad de integrina relacionada con p1 no identificada. Se cortó la banda de proteína de 160 kD del gel de SDS-PAGE, se digirió con tripsina y se analizaron las secuencias de aminoácidos de los péptidos aislados.

Cebadores que correspondían a péptidos aislados amplificaron un fragmento de PCR de 900 pb a partir de ADNc bovino que se clonó, se secuenció y se usó para examinar una biblioteca de ADNc /ZapII de condrocitos articulares humanos para obtener el homólogo de subunidad a de integrina humana. Se aislaron dos clones solapantes, hc1 y hc2, se subclonaron y se secuenciaron. Estos clones contenían 2/3 de la secuencia de nucleótidos incluyendo el extremo 3’ del ADNc. Se obtuvo un tercer clon que contenía el extremo 5’ del ADNc de a10, usando la técnica de RACE. El análisis de secuencia de la secuencia de proteína de 160 kD mostró que era un miembro de la familia de subunidades a de integrinas y la proteína se denominó a10.

Se encontró que la secuencia de aminoácidos deducida de a10 compartía la estructura general de las subunidades a de integrinas descrita en informes publicados previamente (6-21). La parte N-terminal extracelular grande de a10 contiene una secuencia repetida siete veces que se pronosticó recientemente que se pliega en un dominio de hélice p (32). La subunidad a10 de integrina contiene tres supuestos sitios de unión a catión divalente (DxD/NxD/NxxxD) (53), un único dominio que abarca la membrana y un dominio citoplasmático corto. En contraposición a la mayoría de las subunidades a de integrinas, el dominio citoplasmático de a10 no contiene la secuencia conservada KxGFF (R/K) R. La secuencia de aminoácidos pronosticada en a10 es KLGFFAH. Varios informes indican que los dominios citoplasmáticos de integrinas son cruciales en la transducción de señales (54) y que las regiones próximas a la membrana de los dominios citoplasmáticos de integrinas tanto a como p están implicados en la modulación de la conformación y el estado de afinidad de integrinas (55-57). Se sugiere que el motivo GFFKR en cadenas a es importante para la asociación de subunidades de integrinas y para el transporte de la integrina a la membrana plasmática (58). Se ha mostrado que el dominio KxGFFKR interacciona con la proteína intracelular calreticulina (59) y, de manera interesante, células madre embrionarias sin calreticulina son deficientes en la adhesión celular mediada por integrinas (60). Por tanto, es posible que la secuencia KLGFFAH en a10 tenga una función clave en la regulación de la afinidad entre a10B1 y proteínas de la matriz.

Se sabe que las subunidades a de integrinas comparten una identidad global del 2040% (61). El análisis de secuencia mostró que la subunidad a10 está lo más estrechamente relacionada con las subunidades a que contienen dominio I, con identidad máxima con a1 (37%) y a2 (35%). Las integrinas a1p1 y a2p1 son receptores conocidos para tanto colágenos como lamininas (24; 62; 63) y se ha demostrado también recientemente que a2p1 interacciona con la proteína de la matriz de cartílago condroadherina (42). Puesto que se aisló a10p1 sobre colágeno tipo II-Sepharose, se sabe que el colágeno tipo II es un ligando para a10p1. Se ha mostrado también mediante experimentos de purificación por afinidad que a10p1 interacciona con colágeno tipo I pero queda por ver si la laminina o condroadherina son también ligandos para esta integrina.

La cadena p asociada a a10 migró como la subunidad de integrina p1 en condiciones tanto reductoras como no reductoras. Para verificar que la cadena p asociada a a10 es de hecho p1, se inmunoprecipitaron lisados de condrocitos con anticuerpos contra a10

o p1 seguido por inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra la subunidad p1. Estos resultados demuestran claramente que a10 es un miembro de la familia de integrinas p1. Sin embargo, no puede excluirse la posibilidad de que a10 se combine también con otras cadenas p.

Un anticuerpo peptídico policlonal generado contra el dominio citoplasmático de a10 precipitó dos bandas de proteínas con Mr de aproximadamente 160 kD (a10) y 125 kD (p1) en condiciones reductoras. La inmunohistoquímica usando el anticuerpo frente a a10 mostró tinción de los condrocitos en secciones de tejido de cartílago articular humano. La tinción con anticuerpo era claramente específica puesto que la preincubación del anticuerpo con el péptido a10 suprimió completamente la tinción. La tinción inmunohistoquímica de secciones de extremidades de ratón a partir de tejido embrionario demostró que a10 se regula por incremento durante la condensación del mesénquima. Esto indica que la subunidad a10 de integrina es importante durante la formación de cartílago. En ratones de 3 días de edad, se encontró que a10 era la subunidad de integrina de unión a colágeno dominante, lo que apunta a que a10 tiene una función clave en el mantenimiento de las funciones del cartílago normal.

Estudios de expresión sobre el nivel de ARNm y proteína muestran que la distribución de a10 es bastante restrictiva. Análisis de inmunohistoquímica han mostrado que la subunidad de integrina a10 se expresa principalmente en cartílago aunque también se encuentra en pericondrio, periostio, surco de osificación de Ranvier, en la fascia que rodea al tendón y músculo esquelético y en estructuras similares a tendones en las válvulas cardiacas. Esta distribución apunta a que la subunidad de integrina a10 está presente también en fibroblastos y osteoblastos. La amplificación por PCR de ADNc a partir de diferentes tipos de células reveló la presencia de una subunidad de integrina a10 cortada y empalmada de manera alternativa. Esta a10 cortada y empalmada era dominante en fibroblastos, lo que sugiere que a10 en fibroblastos puede tener una función diferente en comparación con a10 presente en condrocitos.

Se encontró que la expresión de la subunidad a10 de integrina disminuía cuando se cultivaban condrocitos en monocapa. En contraposición, se encontró que la expresión de a10 aumentaba cuando se cultivaban las células en lechos de alginato. Puesto que se sabe que este último modelo de cultivo conserva el fenotipo de los condrocitos, los resultados sugieren que a10 puede funcionar como marcador para un condrocito diferenciado.

La adhesión entre tendones/ligamentos y el tejido circundante es un problema bien conocido tras infección, lesión y tras intervención quirúrgica. La adhesión entre el tendón y las vainas del tendón afecta a la función de deslizamiento y provoca problemas considerables especialmente durante la cicatrización de tendones en, por ejemplo, la mano y los dedos conduciendo a incapacidad funcional. La localización de la subunidad de integrina a10 en la fascia del tendón y el músculo esquelético hace que a10 sea una posible diana para fármacos y moléculas con propiedades antiadhesivas que podrían prevenir el deterioro de la función del tendón/ligamento. La subunidad a10 de integrina también puede ser una diana para fármacos o moléculas con propiedades antiadhesivas en otros tejidos en los que la adhesión es un problema.

Ejemplos

Ejemplo 1

Purificación por afinidad de la subunidad de integrina a10 sobre colágeno tipo II-Sepharose.

Materiales y métodos

Se aislaron condrocitos bovinos, condrocitos humanos o células de condrosarcoma humanas tal como se describió anteriormente [Holmvall et al, Exp Cell Res, 221, 496503 (1995), Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)]. Se aplicó un lisado en Triton X-100 de condrocitos bovinos a una precolumna de fibronectina-Sepharose seguido por una columna de colágeno tipo II-Sepharose y se eluyó la subunidad a10 de integrina de la columna de colágeno tipo II mediante EDTA (Camper et al, JBC, 273, 2038320389 (1998). Se precipitaron las proteínas eluidas mediante metanol/cloroformo, se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se tiñeron con azul de Coomassie. (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998). Se aislaron péptidos de la banda de proteína a10 mediante digestión en el gel con una tripsina y cromatografía en fase líquida y se secuenciaron mediante degradación de Edman (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998).

Resultados

La figura 1 muestra las proteínas eluidas mediante EDTA de la columna de fibronectina-Sepharose (A), la fracción no retenida de la columna de colágeno tipo II-Sepharose

(B) y las proteínas eluidas mediante EDTA de la columna de colágeno tipo II-Sepharose (C). La subunidad de integrina a10 (160 kDa) que se eluyó específicamente de la columna de colágeno tipo II se indica con una flecha. La figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos de seis péptidos que se aislaron a partir de la subunidad a10 de integrina bovina. Las figuras 3 a, b y c muestran que la subunidad de integrina a10 está presente en condrocitos bovinos (3a), condrocitos humanos (3b) y células de condrosarcoma humanas (3c). La afinidad por colágeno tipo II, la precipitación conjunta con la subunidad de integrina p1 y el peso molecular de 160 kDa en condiciones reductoras identifican la subunidad de integrina a10 en las diferentes células. Estos resultados muestran que a10 puede aislarse a partir de condrocitos y a partir de células de condrosarcoma.

Ejemplo 2

Amplificación de fragmento de PCR correspondiente a la subunidad de integrina a10 bovina.

Materiales y métodos

Se usaron los cebadores degenerados GAY AAY ACI GCI CAR AC (DNTAQT, directo) y TIA TIS WRT GRT GIG GYT (EPHHSI, inverso) en PCR (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998) para amplificar la secuencia de nucleótidos correspondiente al péptido bovino 1 (figura 2). Se amplificó entonces un fragmento de PCR de 900 pb a partir de ADNc bovino usando un cebador específico interno TCA GCC TAC ATT CAG TAT (SAYIQY, directo) correspondiente a la secuencia de nucleótidos clonada del péptido 1 junto con el cebador degenerado ICK RTC CCA RTG ICC IGG (PGHWDR, inverso) correspondiente al péptido bovino 2 (figura 2). Se usaron bases mixtas en posiciones que estaban degeneradas dos veces y se usaron inosinas en posiciones que estaban degeneradas tres o cuatro veces. Se realizaron el aislamiento de ARNm y la síntesis de ADNc tal como se describió anteriormente (Camper et al, JBC, 273, 2038320389 (1998)). Se clonó el fragmento purificado, se purificó y se secuenció tal como se describió anteriormente (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)).

Resultados

Se obtuvo la secuencia de nucleótidos del péptido 1 (figura 2) mediante amplificación por PCR, clonación y secuenciación de ADNc bovino. A partir de esta secuencia de nucleótidos, se diseñó un cebador exacto y se aplicó en la amplificación por PCR con cebadores degenerados correspondientes a los péptidos 2-6 (figura 2). Cebadores correspondientes a los péptidos 1 y 2 amplificaron un fragmento de PCR de 900 pb a partir de ADNc bovino (figura 4).

Ejemplo3

Clonación y análisis de secuencia de la subunidad de integrina a10 humana

Material y métodos

Se marcó con digoxigenina el fragmento de PCR de 900 pb clonado, correspondiente a integrina a10, según el kit de marcaje de ADN DIG (Boehringer Mannheim) y se usó como sonda para examinar una biblioteca de ADNc /ZapII de condrocitos articulares humanos (proporcionada por Michael Bayliss, The Royal Veterinary Basic Sciences, Londres, RU) (52). Se rescataron clones positivos que contenían el plásmido pBluescript SK+ con el inserto de ADNc a partir del vector ZAP mediante corte in vivo tal como se describe en el kit de síntesis ZAP-ADNc® (Stratagene). Se purificaron plásmidos seleccionados y se secuenciaron tal como se describió anteriormente (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)) usando cebadores específicos T3, T7 e internos. Para obtener ADNc que codificaba para el extremo 5’ de a10, se diseñó el cebador AAC TCG TCT TCC AGT GCC ATT CGT GGG (inverso; residuos 1254-1280 en ADNc de a10) y se usó para la amplificación rápida del extremo 5’ del ADNc (RACE) tal como se describe en el kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech INC., Palo Alto, CA).

Resultados

Se aislaron dos clones solapantes, hc1 y hc2 (figura 5), se subclonaron y se secuenciaron. Estos clones contenían 2/3 de la secuencia de nucleótidos incluyendo el extremo 3’ del ADNc. Se obtuvo un tercer clon (race1; figura 5), que contenía el extremo 5’ del ADNc de a10, usando la técnica de RACE. A partir de estos tres clones solapantes de ADNc de a10, se secuenciaron 3884 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la figura 6. La secuencia contiene un marco de lectura abierto de 3504 nucleótidos que se pronostica que codifica para una proteína madura de 1167 aminoácidos. El sitio de escisión del péptido señal está marcado con una flecha, los homólogos humanos de secuencias de péptidos bovinos están subrayados y el dominio I está recuadrado. Se indican sitios de unión de ión metálico con un subrayado discontinuo, se indican sitios de N-glicosilación potenciales mediante un asterisco y el supuesto dominio transmembrana está doblemente subrayado. La secuencia citoplasmática conservada de manera normal se indica mediante un punto y un subrayado discontinuo punteado.

El análisis de secuencia demuestra que a10 es un miembro de la familia de subunidades a de integrinas.

Ejemplo4

Identificación de un clon que contiene una variante de corte y empalme de a10

Un clon que se aisló a partir de la biblioteca de condrocitos humanos (véase el ejemplo 3) contenía una secuencia que era idéntica a la secuencia de la subunidad de integrina a10 excepto porque se delecionaron los nucleótidos entre las posiciones de nt 2942 y 3055. Se verificó la variante de corte y empalme de a10 en experimentos de PCR usando cebadores que flanqueaban a la región de corte y empalme (véase la figura 14).

Ejemplo 5

Identificación de la subunidad de integrina a10 mediante transferencia de tipo Northern

Material y métodos

Se purificó ARNm de condrocitos bovinos usando un kit de purificación de ARNm QuickPrep®Micro (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), se separó en un gel de agarosa-formaldehído al 1%, se transfirió a membranas de nailon se inmovilizó mediante reticulación por UV. Se marcaron con 32P sondas de ADNc con el kit de marcaje de ADN Random Primed (Boehringer Mannheim). Se hibridaron previamente los filtros durante 2-4 horas a 42ºC en 5x SSE, 5x disolución de Denhart, SDS al 0,1%, ADN de esperma de salmón 50 /g/ml y formamida al 50% y entonces se hibridaron durante la noche a 42ºC con la misma disolución que contenía la sonda específica (0,5-1 x 106 cpm/ml). Se analizaron sondas de ADN específicamente unidas usando el sistema Phosphoimager (Fuji). Se separaron los filtros lavando en SDS al 0,1%, durante 1 hora a 80ºC antes de volver a estudiar con sonda. Se aisló la sonda de ADNc de integrina a10 a partir del plásmido que contenía race1 usando las enzimas de restricción BamHI (GIBCO BRL) y NcoI (Boehringer Mannheim). La sonda de ARNc de integrina p de rata era un gentil regalo de Staffan Johansson, Uppsala, Suecia.

Resultados

El análisis de transferencia de tipo Northern de ARNm de condrocitos bovinos mostró que una sonda de ADNc de a10 humana se hibridaba con un único ARNm de aproximadamente 5,4 kb (figura 7). Como comparación, se usó una sonda de ADNc correspondiente a la subunidad a1 de integrina. Esta sonda de ADNc se hibridaba con una banda de ARNm de aproximadamente 3,5 kb en el mismo filtro. Estos resultados muestran que puede usarse una sonda de ADNc contra a10 para identificar la subunidad de integrina a10 al nivel del ARNm.

Ejemplo 6

Preparación de anticuerpos contra la subunidad a10 de integrina

Se sintetizó un péptido correspondiente a parte del dominio citoplasmático de a10, Ckkipeeekreekle (véase la figura 6) y se conjugó con hemocianina de lapa californiana (KLH). Se inmunizaron conejos con el conjugado de péptido-KLH para generar antisuero contra la subunidad a10 de integrina. Se purificaron por afinidad anticuerpos que reconocían a10 en una columna con péptidos acoplados (Innovagen AB).

Ejemplo 7

Inmunoprecipitación de la subunidad a10 de integrina a partir de condrocitos

Material y métodos

Se marcaron con 125I condrocitos humanos, se lisaron con Triton X-100 y se inmunoprecipitaron tal como se describió anteriormente (Holmvall et al, Exp Cell Res, 221, 496-503 (1995), Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)). Se inmunoprecipitaron lisados en Triton X-100 de condrocitos humanos marcados con 125I con anticuerpos policlonales contras las subunidades de integrinas p1, a1, a2, a3 o a10. Se separaron las proteínas inmunoprecipitadas mediante SDS-PAGE (4-12%) en condiciones no reductoras y se visualizaron usando un Phosphoimager. Se separaron lisados en Triton X100 de condrocitos humanos inmunoprecipitados con a10 o p1 mediante SDS-PAGE (8%) en condiciones no reductoras y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo policlonal frente a p1 y detección quimioluminiscente tal como se describió en Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998).

Resultados

El anticuerpo peptídico policlonal, generado contra el dominio citoplasmático de a10, precipitó dos bandas de proteínas con Mr de aproximadamente 160 kD (a10) y 125 kD (p1) en condiciones reductoras. La cadena p asociada a a10 migró como la subunidad de integrina p1 (figura 8a). Para verificar que la cadena p asociada a a10 en condrocitos es de hecho p1, se inmunoprecipitaron lisados de condrocitos con anticuerpos contra a10 o p1 seguido por inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra la subunidad p1 (figura 8b). Estos resultados demuestran claramente que a10 es un miembro de la familia de integrinas p1. Sin embargo, los resultados no excluyen la posibilidad de que a10 pueda asociarse con otras cadenas p en otras situaciones.

Ejemplo 8

Tinción inmunohistoquímica de la subunidad a10 de integrina en cartílago humano y de ratón

Material y métodos

Se fijaron secciones congeladas de cartílago adulto (surco troclear) obtenidas durante cirugía (proporcionadas por Anders Lindahl, Salgrenska Hospital, Gotemburgo, Suecia) y secciones congeladas de extremidad de ratón de 3 días de edad y se prepararon para la inmunohistoquímica tal como se describió anteriormente (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)). Se analizó la expresión de la subunidad de integrina a10 usando el anticuerpo policlonal contra el dominio citoplasmático como anticuerpo primario (véase el ejemplo 6) y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa.

Resultados

Las figuras 9 muestran la inmunotinción de cartílago articular adulto humano.

El anticuerpo frente a a10 que reconoce el dominio citoplasmático de a10 tiñó los condrocitos en secciones de tejido de cartílago articular humano (A). La tinción se redujo cuando el anticuerpo se preincubó con el péptido a10 (B). Un anticuerpo de control que reconocía la subunidad de integrina a9 no se unía al condrocito (C).

Las figuras 10 muestran que el anticuerpo frente a a10 tiñe la mayoría de los condrocitos en el primordio óseo en crecimiento (a y b). El anticuerpo frente a a10 también reconocía células en el surco de osificación de Ranvier (b), especialmente los osteoblastos en la corteza ósea que están revistiendo el cartílago en la metáfisis son altamente positivos para a10. Se cree que las células en la ranura de osificación de Ranvier son importantes para el crecimiento en diámetro del hueso. La subunidad a10 de integrina se expresa también altamente en pericondrio y periostio. Probablemente, las células en estos tejidos son importantes en la reparación del tejido de cartílago. La localización descrita de la subunidad a10 de integrina sugiere que esta integrina es importante para la función del tejido de cartílago.

Ejemplo 9

Tinción inmunohistoquímica de la subunidad a10 de integrina durante el desarrollo del ratón

Material y métodos

Se investigaron secciones congeladas de embriones de ratón (13,5 días) para determinar la expresión de a10 mediante inmunohistoquímica tal como se describe en Camper

et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998). Se analizó la expresión de la subunidad de integrina a10 usando el anticuerpo policlonal contra el dominio citoplasmático como anticuerpo primario (véase el ejemplo 6) y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Se investigaron también las secciones de embriones para determinar la expresión de la subunidad a1 de integrina (anticuerpo monoclonal de Pharmingen) y colágeno tipo II (anticuerpo monoclonal, gentil regalo del Dr. John Mo, Lund University, Suecia).

Resultados

La figura 11 muestra que la subunidad de integrina a10 no está regulada en la extremidad cuando las células mesenquimatosas experimentan condensación para formar cartílago (a). Especialmente el borde del cartílago recién formado tiene alta expresión de a10. La formación de cartílago se verifica mediante la alta expresión del colágeno tipo II específico de cartílago (b). El anticuerpo de control contra la subunidad de integrina a1 mostró sólo una débil expresión en el cartílago (c). En otros experimentos, se encontró expresión de a10 en todos los tejidos que contenían cartílago en el ratón de 3 días de edad incluyendo extremidades, costillas y vértebras. La regulación por incremento de a10 durante la formación de cartílago sugiere que esta subunidad de integrina es importante tanto en el desarrollo de cartílago y hueso como en la reparación de tejido de cartílago dañado.

Ejemplo 10

Expresión de ARNm de a10 en tejidos distintos de cartílago articular

Material y métodos

Se examinó la expresión de la subunidad de integrina a10 al nivel del ARNm en diferentes tejidos humanos. Se hibridó una transferencia de tipo Northern con ARNm inmovilizado a partir de los tejidos enumerados en la figura 12 con una sonda de ADNc de integrina a10 aislada a partir del plásmido que contenía race 1 usando las enzimas de restricción BamH1 y Nco1. Se analizó el grado de hibridación usando un Phosphoimager. Los siguientes símbolos indican el nivel de ARNm en orden creciente: -, +, ++, +++, ++++.

Resultados

El análisis del ARNm hibridado mostró que a10 se expresaba en aorta, tráquea, médula espinal, corazón, pulmón y riñón (figura 12). Todos los otros tejidos aparecían negativos para la expresión de a10. Estos resultados apuntan a una distribución restringida de la subunidad de integrina a10.

Ejemplo 11

Tinción inmunohistoquímica de a10 en fascia alrededor del tendón y músculo esquelético y en estructuras de tendón en válvulas cardiacas.

Materiales y métodos

Resultados

Tal como se muestra en las figuras 13, se encontró expresión de a10 en la fascia que rodea al tendón (a) y músculo esquelético (b) y en las estructuras de tendón en las válvulas cardiacas (c). Esta localización sugiere que a10 puede unirse a otras moléculas de la matriz además de al colágeno tipo II específico de cartílago. La localización de la integrina a10 en la superficie de tendones indica que a10 puede estar implicada en la adhesión no deseada que se produce a menudo entre tendones/ligamentos y el tejido circundante tras infección, lesión o tras cirugía.

Ejemplo 12

Expresión de ARNm de la subunidad de integrina a10 en condrocitos, células endoteliales y fibroblastos.

Material y métodos

Se realizaron el aislamiento de ARNm, la síntesis de ADNc y la amplificación por PCR tal como se describió anteriormente (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)).

Resultados

La figura 14 muestra la amplificación por PCR de ADNc de a10 a partir de condrocitos articulares humanos (carriles A6 y B1), células endoteliales de vena umbilical humana (carril A2), fibroblastos humanos (carril A4) y tendón de ratón (figura 14b, carril B2). Los carriles 1, 3 y 5 en la figura 14A muestran fragmentos amplificados correspondientes a la subunidad a2 de integrina en células endoteliales, fibroblastos y condrocitos, respectivamente. Se usaron cebadores de ADNc correspondientes a las posiciones en la secuencia de a10 nt 2919-2943 (directo) y nt 3554-3578 (inverso) (véase la figura 6) para amplificar ADNc de a10 a partir de diferentes células. La figura muestra que se amplificó a10 en los tres tipos de células. Se amplificaron dos fragmentos de a10 que representan la forma intacta de a10 (fragmento más grande) y una variante de corte y empalme (fragmento más pequeño). El fragmento más grande era dominante en condrocitos mientras que el fragmento más pequeño estaba más pronunciado en tendón (B2).

Ejemplo 13

Construcción de un vector de expresión de mamíferos de a10.

Se insertó la secuencia codificante de proteína de longitud completa de a10 (combinada a partir de 3 clones, véase la figura 6) en el vector de expresión de mamíferos

pcDNA3.1/Zeo (Invitrogen). El vector contiene el promotor de SV40 y una secuencia de selección con zeocina. Se transfectó el vector de expresión que contiene a10 en células que expresan la subunidad de integrina p1 pero que carecen de expresión de la subunidad a10. La expresión de la subunidad de integrina a10 en la superficie celular puede analizarse mediante inmunoprecipitación y/o citometría de flujo usando anticuerpos específicos para a10. La capacidad de unión a ligando y la función de la subunidad de integrina a10 insertada pueden demostrarse en el experimento de adhesión celular y en experimentos de señalización.

Ejemplo 14

Construcción de un vector de expresión de mamíferos que contiene una variante de corte y empalme de a10.

Se insertó la secuencia codificante de proteína de longitud completa de a10 (nt 2942-nt 3055 delecionados) en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3 (véase el ejemplo 13). La expresión y función de la variante de corte y empalme puede analizarse tal como se describe en el ejemplo 13 y compararse con la subunidad de integrina a10 intacta.

Ejemplo 15

Aislamiento parcial y caracterización del ADN genómico de integrina a10

Material y métodos

Se marcó con 32P ADNc de a10 humano, aislado a partir de plásmido que contiene race1 usando las enzimas de restricción BamHI (GIBCO BRL) y NcoI (Boehringer Mannheim), y se usó como sonda para examinar una biblioteca de cósmidos 129 de ratón (proporcionada por Reinhard Fässler, Lund University). Se aislaron clones positivos y se subclonaron. Se purificaron plásmidos seleccionados y se secuenciaron tal como se describió anteriormente (Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)) usando cebadores específicos T3, T7 e internos. Se construyeron entonces cebadores correspondientes a ADN genómico de ratón y se usaron en PCR para amplificar e identificar la secuencia genómica de a10 a partir de los clones de cósmidos.

Resultados

La figura 15 muestra 7958 nt del gen de a10. Esta secuencia de ADN genómico parcial de la integrina a10 contiene 8 exones y una secuencia Kozak. Se usó la secuencia de a10 genómica de ratón para generar un vector de direccionamiento para experimentos de inactivación.

Ejemplo 16

Regulación por incremento de la subunidad de integrina a10 en condrocitos cultivados en lechos de alginato

Material y métodos

Se desprendieron condrocitos humanos cultivados en monocapa durante 2 semanas con tripsina-EDTA y se introdujeron en lechos de alginato. Se sabe que los condrocitos cultivados en alginato conservan su fenotipo mientras que condrocitos cultivados en monocapa se desdiferencian. Tras 11 días, se aislaron condrocitos cultivados o bien en alginato o bien en monocapa y se marcaron en la superficie con 125I. Entonces se inmunoprecipitó la subunidad de integrina a10 con anticuerpos policlonales que reconocían el dominio citoplasmático de a10 (véase el ejemplo 6 y Camper et al, JBC, 273, 20383-20389 (1998)).

Resultados

Tal como se muestra en la figura 16, condrocitos cultivados en lechos de alginato (carriles 3 y 4) regulaban por incremento su expresión de proteína de a10p1. Esto estaba en contraposición a condrocitos cultivados en monocapa (carriles 1 y 2) que tenían una expresión muy baja de a10p1. Se muestra la inmunoprecipitación con anticuerpo de control ac en los carriles 1 y 3. Se sabe que los condrocitos conservan su producción de matriz específica de cartílago en cultivos en alginato pero no en cultivos en monocapa, lo que apunta a que el alginato conserva el fenotipo de los condrocitos. Estos resultados apoyan que la subunidad de integrina a10 puede usarse como marcador para condrocitos diferenciados.

Ejemplo 17

Inmunoprecipitación de la subunidad de integrina a10 a partir de células de músculo liso humanas.

Material y métodos

Se aislaron células de músculo liso humanas de aorta humana. Tras una semana en cultivo, se marcaron las células con 125I, se lisaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra la subunidad p1 de integrina (carril 1), a1 (carril 2), a2 (carril 3), a10 (carril 4), a3 (carril 5), control (carril 6) (figura 17). Se realizó el experimento tal como se describe en el ejemplo 7.

Resultados

El anticuerpo frente a a10 precipitó dos bandas a partir de las células de músculo liso correspondientes a la subunidad de integrina a10 y p1 (figura 17).

Ejemplo 18

Construcción de un vector de expresión bacteriano que contiene la secuencia para la región de corte y empalma de a10.

Se construyó un plásmido para la expresión intracelular en E. coli de la región cortada y empalmada de manera alternativa (pos. de aminoácido 952-986, SEQ. ID 1) tal como se describe. Se realizó la retrotraducción de la región cortada y empalmada de manera alternativa usando la tabla de codones de alta frecuencia de E. coli, creando una secuencia de ADNc del 96% de identidad con la secuencia original (SEQ. ID 1 pos. de nucleótido 2940-3044). Usando extensión por solapamiento de secuencia (Horton et al.,

Biotechniques 8:528, 1990), se usó el cebador a10pfor (tab. I) y a10prev (tab. I) para

generar un fragmento bicatenario que codifica para la secuencia de aminoácidos de

a10. Se usó este fragmento como molde de PCR con los cebadores a10pfor2 (tab. I) y

5 a10prev2 (tab. I) con el fin de generar un sitio de enzimas de restricción para la subclo

nación en un vector pET que contenía el dominio Z de la proteína A de estafilococos,

creando una fusión de la región cortada y empalmada de a10 con el dominio la parte

amino terminal del dominio Z encontrándose el sitio de escisión de trombina entreme

dias. Se muestra el fragmento generado en la segunda reacción de PCR (SEQ ID No. 10 3) indicando también las enzimas de restricción únicas usadas para la subclonación en

el vector de expresión.

Tabla 1

a10pfor

a10pfor2: 5’-GGGGCATATGGTTCAGAACCTGGGTTGCTACGTTG-3’

a10prev

a10prev2

Bibliografía

: 15 1. Springer, T.A. (1990) Nature 346, 425-434

2.: Ruoslahti, E. (1991) J.Clin.Invest. 87, 1-5

3.: Hynes, R.O. (1992) Cell 69, 11-25

4.: Hemler, M.E. (1988) Immunol.Today 9, 109-113

5.: Yamada, K.M. (1991) J.Biol.Chem. 266, 12809-12812

: 20 6. Palmer, E.L., Ruegg, C., Ferrando, R., Pytela, R., and Sheppard, D. (1993) J.Cell Biol. 123, 1289-1297

7.: Takada, Y., Elices, M.J., Crouse, C., and Hemler, M.E. (1989) EMBO J. 8, 1361-1368

8.: Poncz, M., Eisman, R., Heidenreich, R., Silver, S.M., Vilaire, G., Surrey, S., Schwartz, E., and Bennett, J.S. (1987) J.Biol.Chem. 262, 8476-8482

: 25 9. Larson, R.S., Corbi, A.L., Berman, L., and Springer, T. (1989) J.Cell Biol. 108, 703712

10.: Corbi, A.L., Kishimoto, T.K., Miller, ’L.J., and Springer, T.A. (1988) J.Biol.Chem. 263, 12403-12411

11.: Argraves, W.S., Suzuki, S., Arai, H., Thompson, K., Pierschbacher, M.D., and Ruoslahti, E. (1987) J.Cell Biol. 105, 1183-1190.

12.: Corbi, A.L., Miller, L.J., O’Connor, K., Larson, R.S., and Springer, T.A. (1987) EMBO J. 6, 4023-4028

13.: Briesewitz, R., Epstein, M.R., and Marcantonio, E.E. (1993) J.Biol.Chem. 268, 2989

14.: Ziober, B.L., Vu, M.P., Waleh, N., Crawford, J., Lin, C.S., and Kramer, R.H. (1993) J.Biol.Chem. 268, 26773-26783

15.: Hogervorst, F., Kuikman, I., van Kessel, A.G., and Sonnenberg, A. (1991) Eur.J.Biochem. 199, 425-433

16.: Takada, Y. and Hemler, M.E. (1989) J.Cell Biol. 109, 397-407

17.: Takada, Y., Murphy, E., Pil, P., Chen, C., Ginsberg, M.H., and Hemler, M.E. (1991) J.Cell Biol. 115, 257-266

18.: Van der Vieren, M., Le Trong, H., Wood, C.L., Moore, P.F., St.John, T., Staunton, D.E., and Gallatin, W.M. (1995) Immunity. 3, 683-690

19.: Schnapp, L.M., Breuss, J.M., Ramos, D.M., Sheppard, D., and Pytela, R. (1995) J.Cell Sci. 108, 537-544

20.: Shaw, S.K., Cepek, K.L., Murphy, E.A., Russell, G.J., Brenner, M.B., and Parker,

C.M. (1994) J.Biol.Chem. 269, 6016-6025

21.: Suzuki, S., Argraves, W.S., Arai, H., Languino, L.R., Pierschbacher, M.D., and Ruoslahti, E. (1987) J.Biol.Chem. 262, 14080-14085

22.: Ignatius, M.J., Large, T.H., Houde, M., Tawil, J.W., Barton, A., Esch, F., Carbonetto, S., and Reichardt, L.F. (1990) J.Cell Biol. 111, 709-720

23.: Gullberg, D., Gehlsen, K.R., Turner, D.C., Åhlén, K., Zijenah, L.S., Barnes, M.J., and Rubin, K. (1992) EMBO J. 11, 3865-3873

24.: Staaz, W.D., Rajpara, S.M., Wayner, E.A., Carter, W.G., and Santoro, S.A. (1989) J.Cell’ Biol. 108, 1917-1924

25.: Holmvall, K., Camper, L., Johansson, S., Rubin, K., Kimura, J.H., and Lundgren-Åkelund, E. (1995) Exp.Cell Res. 221, 496-503

26.: Forsberg, E., Ek, B., Engström, Å., and Johansson, S. (1994) Exp.Cell Res. 213, 183-190

27.: Wayner, E.A. and Carter, W.G. (1987) J.Cell Biol. 105, 1873-1884

28.: Weitzman, J.B., Pasqualini, R., Takada, Y., and Hemler, M.E. (1993) J.Biol.Chem. 268, 8651-8657

29.: Elices, M.J. and Hemler, M.E. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86, 9906-9910

30.: Languino, L.R., Colella, S., Zanetti, A., Andrieux, A., Ryckewaert, J.J., Charon, M.H., Marchisio, P.C., Plow, E.F., Ginsberg, M.H., Marguerie, G., and et al (1989) Blood 73, 734-742

31.: Tuckwell, D.S., Humphries, M.J., and Brass, A. (1994) Cell Adhes.Commun. 2, 385402

32.: Springer, T.A. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94, 65-72

33.: Colombatti, A., Bonaldo, P., and Doliana, R. (1993) Matrix 13, 297-306

34.: Lee, C.H., Bradley, G., and Ling, V. (1995) Cell Growth Differ. 6, 347-354

35.: Calderwood, D.A., Tuckwell, D.S., and Humphries, M.J. (1995) Biochem.Soc.Trans. 23, 504S

36.: Kern, A., Eble, J., Golbik, R., and Kuhn, K. (1993) Eur.J.Biochem. 215, 151-159

37.: Tuckwell, D.S., Reid, K.B., Barnes, M.J., and Humphries, M.J. (1996) Eur.J.Biochem. 241, 732-739

38.: Kamata, T. and Takada, Y. (1994) J.Biol.Chem. 269, 26006-26010

39.: Dürr, J., Goodman, S., Potocnik, A., von der Mark, H., and von der Mark, K. (1993) Exp.Cell Res. 207, 235-244

40.: Salter, D.M., Hughes, D.E., Simpson, R., and Gardner, D.L. (1992) Br.J.Rheumatol. 31, 231-234

41.: Woods, V.L.J., Schreck, P.J., Gesink, D.S., Pacheco, H.O., Amiel, D., Akeson, W.H., and Lotz, M. (1994) Arthritis Rheum. 37, 537-544

42.: Camper, L., Heinegård, D., and Lundgren-Åkerlund, E. (1997) J.Cell Biol 138, 11591167

43.: Hemler, M.E., Sanchez Madrid, F., Flotte, T.J., Krensky, A.M., Burakoff, S.J., Bhan, A.K., Springer, T.A., and Strominger, J.L. (1984) J.Immunol. 132, 3011-3018

44.: Bottger, B.A., Hedin, U., Johansson, S., and Thyberg, J. (1989) Differentiation. 41, 158-167

45.: Sommarin, Y. and Heinegård, D. (1983) Biochem.J. 214, 777-784

46.: Häuselmann, H.J., Aydelotte, M.B., Schumacher, B.L., Kuettner, K.E., Gitelis, S.H., and Thonar, E.J.M.A. (1992) Matrix 12, 116-129

47.: Miller, E.J. (1972) Biochemistry 11, 4903-4909

48.: Wessel, D. and Flugge, U.I. (1984) Anal.Biochem. 138, 141-143

49.: Blobel, G. and Dobberstein, B. (1975) J.Cell Biol. 67, 835-851

50.: Hellman, U. (1997) in Protein structure analysis. Preparation, characterization, and microsequencing (Kamp, R.M., Choli-Papadopoulou, T., and Wittmann-Liebold, B., eds) pp. 97-104, Spriner-Verlag, Heidelberg

51.: Charles, I.G., Palmer, R.M., Hickery, M.S., Bayliss, M.T., Chubb, A.P., Hall, V.S., Moss, D.W., and Moncada, S. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90, 11419-11423

52.: Tuckwell, D.S., Brass, A., and Humphries, M.J. (1992) Biochem.J. 285, 325-331

53.: Dedhar, S. and Hannigan, G.E. (1996) Curr.Opin.Cell Biol. 8, 657-669

54.: Hughes, P.E., O’Toole, T.E., Ylanne, J., Shattil, S.J., and Ginsberg, M.H. (1995) J.Biol.Chem. 270, 12411-12417

55.: Puzon McLaughlin, W., Yednock, T.A., and Takada, Y. (1996) J.Biol.Chem. 271, 16580-16585

: 5 56. O’Toole, T.E., Katagiri, Y., Faull, R.J., Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loftus, J.C., Shattil, S.J., and Ginsberg, M.H. (1994) J.Cell Biol. 124, 1047-1059

57. De Melker, A.A., Kramer, D., Kuikman, I., and Sonnenberg, A. (1997) Biochem J 529-537

58.: Rojiani, M.V., Finlay, B.B., Gray, V., and Dedhar, S. (1991) Biochemistry 30, 985910 9866

59.: Coppolino, M.G., Woodside, M.J., Demaurex, N., Grinstein, S., St Arnaud, R., and Dedhar, S. (1997) Nature 386, 843-847

60.: Hynes, R.O. (1992) Curr.Opin.Genet.Dev. 2, 621-624

61.: Santoro, S.A. (1986) Cell 46, 913-920 15 62. Languino, L.R., Gehlsen, K.R., Wayner, E., Carter, W.G., Engvall, E., and Ruoslahti,

E. (1989) J.Cell Biol. 109, 2455-2462

63. Yokosaki, Y., Monis, H., Chen, J., and Sheppard, D. (1996) J.Biol.Chem. 271, 24144-24150

Lista de secuencias

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3884 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico y aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: doble 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO MOLECULAR: ADNc

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(E) ORGANISMO: ser humano

(F): TIPO DE CÉLULA: condrocito 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO. 1:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3779 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico y aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(E)

(i): TIPO MOLECULAR: ADNc 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(E): ORGANISMO: ser humano

(F): TIPO DE CÉLULA: condrocito

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO. 2:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 143 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico y aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(iii) TIPO MOLECULAR: ADNc

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(E): ORGANISMO: ser humano

(F): TIPO DE CÉLULA: condrocito

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO. 3:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Subunidad a10 de integrina de unión a colágeno aislada o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1, o una variante de corte y empalme de la misma, o un fragmento de la misma

en la que:

la variante de corte y empalme comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y el fragmento se selecciona del grupo que consiste en fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1 y fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1.
2.

Subunidad a10 de integrina, según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1.
3.

Variante de corte y empalme según la reivindicación 1.
4.

Variante de corte y empalme según la reivindicación 3, consistiendo la variante de corte y empalme en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 2.
5.

Fragmento según la reivindicación 1.
6.

Fragmento según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ.
7.

Fragmento según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1.
8.

Fragmento según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1.
9.

Polinucleótido aislado que codifica para una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10.

Polinucleótido aislado según la reivindicación 9, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 ó 2.
11.

Vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.
12.

Célula que comprende un vector según la reivindicación 11.
13.

Procedimiento para producir una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, procedimiento que comprende las etapas de:

(a)

aislar un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10;

(b)

construir un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado;

(c)

transformar una célula huésped con dicho vector de expresión; y

(d)

cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de una subunidad a10 de integrina de unión a colágeno, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
14.

Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además la etapa (e) de aislar la subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento a partir de dicha célula huésped transformada o medio de cultivo.
15.

Heterodímero de integrina aislado o recombinante que comprende una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y una subunidad p.
16.

Heterodímero de integrina según la reivindicación 15, en el que la subunidad p es p1.
17.

Procedimiento para producir un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16, procedimiento que comprende las etapas de:

(a)

aislar un primer polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 y un segundo polinucleótido que codifica para una subunidad p;

(b)

construir uno o más vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos primero y segundo;

(c)

transformar una célula huésped con dicho(s) vector(es) de expresión; y

(d)

cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de un heterodímero de integrina.
18.

Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la subunidad p es p1.
19.

Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, que comprende además la etapa (e) de aislar el heterodímero de integrina a partir de dicha célula huésped transformada o medio de cultivo.
20.

Célula que comprende un primer vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica para una subunidad p.
21.

Célula según la reivindicación 20, en la que la subunidad p es p1.
22.

Entidad de unión que tiene la capacidad de unirse específicamente a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID no. 1, o a una variante de corte y empalme de la misma mostrada en SEQ ID no. 2, o a un fragmento de la misma

en la que:

el fragmento se selecciona del grupo que consiste en fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácido n.º 986 de SEQ ID no. 1 y fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID no. 1, y siendo la entidad de unión un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
23.

Entidad de unión según la reivindicación 22, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
24.

Composición farmacéutica que comprende una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 o una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23.
25.

Composición farmacéutica según la reivindicación 24, siendo la composición una composición de vacuna.
26.

Subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en medicina.
27.

Polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, para su uso en medicina.
28.

Heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16, para su uso en medicina.
29.

Entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23, para su uso en medicina.
30.

Uso de una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 o una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 en la preparación de un agente de diagnóstico para detectar células o tejidos que expresan dicha subunidad a10 de integrina.
31.

Uso de una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 en la preparación de un medicamento para seleccionar como diana moléculas de células o tejidos durante estados patológicos que comprenden daño de cartílago, traumatismo, cáncer, artritis reumatoide, inflamación u osteoartritis.
32.

Uso según la reivindicación 30, en el que el agente de diagnóstico comprende una composición farmacéutica según la reivindicación 24 ó 25.
33.

Uso según la reivindicación 30 ó 31, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en condrocitos, células de músculo liso, células endoteliales, osteoblastos y fibroblastos.
34.

Uso según la reivindicación 30, para determinar el estado de diferenciación de las células.
35.

Uso de una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 in vitro para detectar la formación de cartílago.
36.

Uso de una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 in vitro para determinar el estado de diferenciación de las células.
37.

Uso de una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 o una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 in vitro para selección, análisis, clasificación, aislamiento o purificación de condrocitos.

5 38. Uso de una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 in vitro para identificar entidades que se unen a dicha subunidad a10 de integrina.
39. Método para estimular, inhibir o bloquear la formación de cartílago o hueso in 10 vitro que comprende tratamiento con una entidad de unión según la reivindicación 22 ó
23.