CN112034186A - 一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于生物素‑链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，涉及生物医学诊断技术领域，基于现有的糖化血红蛋白试剂盒抗冻融性能差的问题提出的。试剂盒包括试剂R1和试剂R2，试剂R1包括甘氨酸缓冲液、胶乳微球、表面活性剂、盐、稳定剂、防腐剂和抗冻融剂；试剂R2包括MES缓冲液、盐、稳定剂、生物素、链霉亲和素、HbA1c单克隆抗体和防腐剂。本发明还公开了一种基于生物素‑链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒的制备方法。本发明相比现有技术的优点在于：本发明的试剂盒R1中含有无任何修饰的聚苯乙烯微球，能够快速吸附血液中糖化血红蛋白，试剂中添加了抗冻融剂，能够提高试剂盒的抗冻融稳定性，添加抗冻融剂后反复冻融R1测试值明显趋于稳定。

Description

一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒及 其制备方法
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，尤其涉及一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒及其制备方法。
背景技术
据国际糖尿病联盟(InternationaleDiabetesFederation，IDF)统计，2019年全球糖尿病患者约有4.63亿人，其中中国糖尿病患者人数排名第一，约为1.164亿人。研究发现糖化血红蛋白(HbA1c)是糖尿病患者疾病控制程度的一项良好指标，它反映的是患者在检测前120天内的平均血糖水平。HbA1c作为血糖控制的金标准，所有糖尿病患者，无论用什么方法反应血糖的变化，最终都要以HbA1c的变化作为最终评价一种药物或一个治疗方案的有效检测指标。因此，HbA1c检测的临床意义非常重要。
目前HbA1c的检测方法主要包括色谱法、免疫法和电泳法。其中色谱法包括高效液相阳离子交换色谱法和高效液相硼酸亲和色谱法等。作为HbA1c检测的金标准，高效液相阳离子交换色谱法一向是临床上最具应用价值、最精确的方法。然而，在用液相离子交换色谱法测定HbA1c的研究时，样本(例如全血样本、全血稀释样本、全血冻干样本等)保存后再进行HbA1c检测时，测定值会随着样本的保存时间的推移而变动。
专利CN101595230A的发明专利公开了一种HbA1c测定方法，同时也指出了含Hb试样保存后再进行HbA1c检测时，将得到比使用刚采集的含Hb试样的测定值低的值。该专利采用在样本中加入抑制剂的方法来避免因保存样本而引起的HbA1c测定值的变动，但是，该方法需要测量者的直接参与，使测量过程复杂化，从而大大降低了检测效率。专利CN107991500A公开了一种糖化血红蛋白检测试剂盒，该试剂盒包含试剂R1和试剂R2，试剂R1包含胶乳、缓冲液A和表面活性剂；试剂R2包含抗体、缓冲液B和表面活性剂。该试剂盒可以消除个体血红蛋白含量差异在糖化血红蛋白检测中的影响，而且稳定性好，便于使用和保存。上述技术存在的问题如下：抗冻融性能差、灵敏度低、线性范围差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种抗冻融性能好、线性范围广的糖化血红蛋白浓度的基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的，一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0002669822860000021
试剂R2：
Figure BDA0002669822860000022
Figure BDA0002669822860000031
本发明的试剂盒R1中含有无任何修饰的聚苯乙烯微球，能够快速吸附血液中糖化血红蛋白，试剂中添加了抗冻融剂，能够提高试剂盒的抗冻融稳定性，添加抗冻融剂后反复冻融R1测试值明显趋于稳定；采用双试剂，操作简单，灵敏度高，线性范围广R2＝0.9898，可以广泛应用于各种透射或者散射分析仪，包括普通生化分析仪、特定蛋白分析仪等。
优选地，所述甘氨酸缓冲液的pH＝8.0。
优选地，所述MES缓冲液的pH＝7.5。
优选地，所述表面活性剂包括NP40、曲拉通X-100、十二烷基硫酸钠中的一种、两种或两种以上的组合。
优选地，所述盐包括氯化钠或氯化钾。
优选地，所述防腐剂包括叠氮化钠或Proclin-300。
优选地，所述抗冻融剂包括甜菜碱、甘油中的一种或是两种组合。
优选地，所述稳定剂包括牛血清白蛋白、蔗糖或海藻糖。
优选地，所述胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球；所述胶乳微球直径为100-400nm。
一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
将胶乳微球在甘氨酸缓冲液中稀释至浓度为0.15％，室温下搅拌，搅拌2小时后37℃老化12h，再按照上述配比将表面活性剂、盐、防腐剂和抗冻融剂溶于其中，即制得试剂R1液；
(2)配制试剂R2
先将生物素和HbA1c抗体按照上述配比混合，将生物素标记到抗体上，再按照比例加入链霉亲和素，室温下反应2h后放入均质机中进行分散10min，制得生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物；将生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物溶于MES缓冲液中，搅拌均匀；再按照上述配比将表面活性剂、盐、防腐剂溶于其中，即制得试剂R2液。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明的试剂盒R1中含有无任何修饰的聚苯乙烯微球，能够快速吸附血液中糖化血红蛋白，试剂中添加了抗冻融剂，能够提高试剂盒的抗冻融稳定性，添加抗冻融剂后反复冻融R1测试值明显趋于稳定；采用双试剂，操作简单，灵敏度高，线性范围广R2＝0.9898，可以广泛应用于各种透射或者散射分析仪，包括普通生化分析仪、特定蛋白分析仪等。
(2)本发明利用亲和素-链霉亲和的强结合作用，与抗糖化血红蛋白单克隆抗体结合形成牢固稳定的生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物，能够有效放大胶乳比浊的程度。
附图说明
图1是本发明实施例的HbA1c抗体标记结果图；
图2是本发明实施例1中胶乳试剂建立的定标曲线；
图3是本发明的试剂盒供胶乳增强免疫比浊法使用的交联反应图；
图4是本发明实施例的试剂盒的线性范围结果图；
图5是本发明实施例的试剂盒的临床相关性结果图；
图6是本发明实施例1的试剂盒的抗冻融性能检测结果图；
图7是本发明对比例1的试剂盒的抗冻融性能检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0002669822860000051
试剂R2：
Figure BDA0002669822860000052
Figure BDA0002669822860000061
所述甘氨酸缓冲液的pH＝8.0。
所述MES缓冲液的pH＝7.5。
所述表面活性剂包括NP40、曲拉通X-100、十二烷基硫酸钠中的一种、两种或两种以上的组合。
所述盐包括氯化钠或氯化钾。
所述防腐剂包括叠氮化钠或Proclin-300。
所述抗冻融剂包括甜菜碱、甘油中的一种或是两种组合。
所述稳定剂包括牛血清白蛋白、蔗糖或海藻糖。
所述胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球；所述胶乳微球直径为100-400nm。
本发明的胶乳微球选自厂家JSRLifeSciencesCorporatiion的P2116。
实施例1
本实施例的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0002669822860000062
试剂R2：
Figure BDA0002669822860000071
所述胶乳微球的粒径为125nm的表面无任何修饰的聚苯乙烯胶乳微球。
实施例2
本实施例的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0002669822860000072
试剂R2：
Figure BDA0002669822860000073
Figure BDA0002669822860000081
所述胶乳微球的粒径为125nm的表面无任何修饰的聚苯乙烯胶乳微球。
实施例3
本实施例的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0002669822860000082
试剂R2：
Figure BDA0002669822860000083
Figure BDA0002669822860000091
实施例4
制备上述基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒的方法，包括以下步骤：
(1)配制试剂R1
将胶乳微球在甘氨酸缓冲液中稀释至浓度为0.15％，室温下搅拌，搅拌2小时后37℃老化12h，再按照上述配比将表面活性剂、盐、防腐剂和抗冻融剂溶于其中，即制得试剂R1液；
(2)配制试剂R2
先将生物素和HbA1c抗体按照上述配比混合，将生物素标记到抗体上，再按照比例加入链霉亲和素，室温下反应2h后放入均质机中进行分散10min，制得生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物；将生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物溶于MES缓冲液中，搅拌均匀；再按照上述配比将表面活性剂、盐、防腐剂溶于其中，即制得试剂R2液。
HbA1c抗体标记过程的原理：链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子能结合4个生物素标记的抗体，即完成HbA1c抗体标记过程，标记结果如图1所示。
(3)标准品的制备
将市售的HbA1c抗原用标准品稀释液配制成一系列标准品，浓度分别为0L、4.3％、5.6％、8.3％、11.5％、15％的标准品稀释液，标准品稀释液的组成是50mMPBSpH7.4，0.1％Proclin300，0.1％曲拉通X-100，1.8％氯化钠，1％牛血清白蛋白。
(4)质控品的制备
将高浓度的HbA1c样品(15％)用标准品稀释液稀释成5.0％和10％，分别作为低值质控品和高值质控品。
在生化仪上建立定标曲线将6个HbA1c标准品，浓度从0到15％，放于生化仪(本例中使用日立全自动生化仪7180)中样品盘内，分别与配制的HbA1c试剂R1和反应液R2反应，样本：R1：R2＝3ul:150ul:50ul，进行检测，记录反应度，试剂参数设置完成和试剂位置放置正确后，生化分析仪自动完成吸取试剂和采样步骤，整个过程大约耗时10-12min。检测波长为800/660nm，采用两点终点法，反应时间5min，计算两点反应度差值。根据浓度和反应度差值可以建立定标曲线。图2是实施例1中胶乳试剂建立的定标曲线。
实施例6
本发明提供的试剂盒是供胶乳增强免疫比浊法使用，该方法是利用糖化血红蛋白吸附在R1中胶乳微球上的，然后用生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物去捕捉糖化血红蛋白吸附的胶乳微球，形成微粒之间的交联，改变了溶液的散射度或者透射吸光度，如图3所示。
实施例7
本实施例用以评价上述实施例中基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒：
(1)灵敏度验证
使用实施例1的试剂，选用零值标准品作为空白样本测试，测定3份浓度接近5.5％的样品，在全自动生化分析仪(日立7180)上测试，温度37℃，800/660nm波长，1cm光径条件下，重复测定10次，计算该样产生的吸光度改变与空白吸光度改变的差值(△A)等比换算出浓度为5.5％的糖化血红蛋白所产生吸光度差值(△A)。根据图3建立的标准曲线，计算20次测试结果的平均值和标准差(SD)，3组测试结果如表1所示，显示分析灵敏度分别为0.1350、0.1376和0.1370，证明单抗标记生物素-链霉亲能够提升试剂的灵敏度。糖化血红蛋白蛋白(HbA1c)的检测临床参考值在5.0-8.0％左右，本发明试剂的灵敏度比参考值要小一个数量级，完全符合使用的需要。
表1分析灵敏度的测试
编号 样本1(5.3％) 样本2(5.5％) 样本3(5.4％)
1 0.1346 0.1398 0.1385
2 0.1348 0.1385 0.1376
3 0.1362 0.1356 0.1375
4 0.1326 0.1398 0.1356
5 0.1362 0.1357 0.1368
6 0.1347 0.1365 0.1375
7 0.1364 0.1385 0.1367
8 0.1345 0.1365 0.1364
9 0.1348 0.1362 0.1362
10 0.1352 0.1385 0.1367
AVE 0.1350 0.1376 0.1370
SD 0.0011 0.0016 0.0008
(2)线性范围验证
将低值校准品4.3％(L)与15％(H)的高浓度HbA1c标准品，分别制成(5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H)共6个不同的稀释浓度样本。使用实施例1中制备的试剂分别对这些样本进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值。测量结果以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(r)。线性相关曲线如图4所示，线性回归方程为y＝1.0148x+0.2037，R2＝0.9898，说明线性关系良好。
(3)试剂盒的重复性验证
用实施例1中制备的试剂测试HbA1c浓度为5％的正常值水平的控制物质和HbA1c浓度为9.5％异常值水平的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值和标准差(SD)，按式(1)计算变异系数(CV)，测试结果见表2所示。根据测量结果，计算出变异系数CV＝0.96％和0.88％，符合试剂CV≤3％的技术要求。
表2为试剂盒的重复性验证结果
序号 水平一 水平二
1 5 9.5
2 5 9.4
3 5.1 9.4
4 5 9.4
5 5.1 9.2
6 5 9.3
7 5.1 9.3
8 5 9.4
9 5 9.4
10 5 9.4
M 5.03 9.37
SD 0.048 0.082
CV 0.96％ 0.88％
(4)临床相关性验证
通过收集了64个临床样本，采用实施例1中的试剂设备进行检测，检测结果与市场上的进口试剂盒的检测结果进行了相关性分析。分析结果如图5所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y＝0.9751x+0.1493，其中Y轴截距0.1493，斜率为0.9751，相关系数R＝0.9855。这个结果表明本发明中的试剂盒和进口上市试剂盒相关性高，准确性非常一致。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂R1中不添加抗冻融剂。
抗冻融性能检测：用实施例1中制备的试剂R1和对比例1中制备的R1试剂在-40℃冰箱反复冻融5次，并搭配实施例1中的R2试剂，分别测试5次冻融前后的数据，测试HbA1c浓度为5％的正常值水平的控制物质和HbA1c浓度为9.5％异常值水平的控制物质。测试结果见图6和图7：添加抗冻融剂后反复冻融R1测试值明显趋于稳定，在对比例1中无抗冻融剂，在冻融后有明显的下降。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure FDA0002669822850000011
试剂R2：
Figure FDA0002669822850000012
2.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述甘氨酸缓冲液的pH＝8.0。
3.根据权利要求2所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述MES缓冲液的pH＝7.5。
4.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂包括NP40、曲拉通X-100、十二烷基硫酸钠中的一种、两种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述盐包括氯化钠或氯化钾。
6.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述防腐剂包括叠氮化钠或Proclin-300。
7.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述抗冻融剂包括甜菜碱、甘油中的一种或是两种组合。
8.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述稳定剂包括牛血清白蛋白、蔗糖或海藻糖。
9.根据权利要求1所述的一种基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于：所述胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球；所述胶乳微球直径为100-400nm。
10.一种制备如权利要求1-9任一项所述的基于生物素-链霉亲和素放大的糖化血红蛋白试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
将胶乳微球在甘氨酸缓冲液中稀释至浓度为0.15％，室温下搅拌，搅拌2小时后37℃老化12h，再按照上述配比将表面活性剂、盐、防腐剂和抗冻融剂溶于其中，即制得试剂R1液；
(2)配制试剂R2
先将生物素和HbA1c抗体按照上述配比混合，将生物素标记到抗体上，再按照比例加入链霉亲和素，室温下反应2h后放入均质机中进行分散10min，制得生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物；将生物素-链霉亲和素-HbA1c抗体复合物溶于MES缓冲液中，搅拌均匀；再按照上述配比将表面活性剂、盐、防腐剂溶于其中，即制得试剂R2液。
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