CN113214386B - 一种糖尿病早期诊断多肽标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多肽标志物及其应用,属于生物技术领域。所述多肽标志物的氨基酸序列为氨基酸序列表中的SEQ ID No.1,还提供了一种氨基酸序列为氨基酸序列表中的SEQ ID No.2的多肽标志物。所述应用是指所述多肽标志物在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。本发明提出了定量肽类生物标志物作为临床糖尿病早期诊断的策略,获得了预防和监测糖尿病的相关指标,采用以敏感肽和内标肽段液相色谱质谱得到的肽段的峰面积或峰强度之比作为糖基化修饰程度指标,巧妙地解决了临床样品中存在较大个体差异,相对定量存在较大困难的问题,对于糖尿病的早期诊断和有效干预具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽标志物及其应用,具体地说,涉及一种用于检测早期糖尿病的多肽标志物,属于生物技术领域。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由多种病因和发病机制引起的,体内胰岛素相对或绝对不足,进而导致体内糖、蛋白质和脂肪代谢紊乱,并以高血糖为主要临床表现的代谢性疾病。全世界90%的糖尿病患者患有2型糖尿病(Type 2Diabetes,T2D),这是一种慢性的进行性代谢疾病。在2型糖尿病发病早期,机体通过增加胰岛素的分泌以维持血糖的正常水平,β-胰岛细胞处于超负荷的工作状态,长此以往将导致胰岛细胞的受损,形成“高血糖浓度-胰岛细胞受损-血糖升高”的恶性循环。多年后,当机体的补偿机制耗尽、胰岛细胞受到严重的不可逆损伤时,糖尿病的各种临床症状才会显现出来,而这时已经错过了合适的治疗时机。如何有效地诊断和防治糖尿病已经成为一个全球性的难题。
目前,糖尿病的诊断一直沿用1999年世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)规定的血糖水平升高标准。基于血糖浓度的诊断标准简单易行、容易推广,但血糖容易随着饮食、情绪等的影响而上下波动,并不能客观地反映体内葡萄糖的真正水平。
血液中的蛋白质可能与血糖发生糖基化反应,这些糖基化蛋白可能是潜在的糖尿病诊断生物标志物。2010年,美国糖尿病学会(ADA)批准糖化血红蛋白(HbA1c)作为糖尿病新的诊断指标,能够反映出糖尿病患者2~3个月内的血糖水平,其结果更加稳定可靠,能够作为评价糖尿病患者长期血糖控制状况的金标准。糖化血清白蛋白(GA)水平可以反映患者近2~3周的平均血糖水平,不受临时血糖浓度波动的影响,具有一定的稳定性。然而,上述生物标志物也存在着一定的问题。在一些地中海贫血患病率较高的地区,当地人血红蛋白含量普遍偏低,HbA1c的诊断价值有限。而HbA1c和GA的检测结果也可能出现不一致的情况。目前,科学家正积极寻找其他更加可靠的糖尿病诊断标志物。1,5- 脱水葡萄糖醇(1,5-AG)是一种六碳链单糖,在血清中的浓度通常为 12μg/mL~40μg/mL,它能够反映患者1~2周的血糖情况,目前已经逐渐应用于临床。高敏感性C-反应蛋白(hs-CRP)被用于监测急性和慢性炎症反应状况,反映了多种糖尿病并发症的严重程度。在过去的研究中,丙氨酸转氨酶(ALT),胱抑素(Cys-c),甘油三酸酯和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)都被认为是反映糖尿病病情的生物指标。
高浓度的葡萄糖可以与血液中的蛋白质发生非酶催化的糖基化反应(Nonenzymatic Glycosylation,NEG),也称为美拉德反应(Maillard reaction),其总的反应历程由Hodge提出。美拉德反应可分为三个反应阶段:
第一阶段较为迅速,还原糖的羰基与赖氨酸的ε氨基、精氨酸的胍基或蛋白质游离氮端的自由氨基缩合形成可逆的早期产物希夫碱(Schiff bases),随后热不稳定的Schiffbases发生阿玛多利(Amadori)重排反应,生成较为稳定的 Amadori产物1-氨基-1-脱氧-2-酮糖,为早期糖基化产物,其产量与葡萄糖浓度有关,是反应中的限速步骤;
第二阶段,由于pH值的不同,Amadori产物发生不同程度的降解;
第三阶段,活泼的中间体与氨基发生缩合、脱氢、重排和异构化等一系列反应,生成各种异质性的不可逆的晚期糖基化产物(Advances glycation end products,AGEs)。
作为高浓度血糖与蛋白质的代谢产物,AGEs被认为是一种毒性物质,在糖尿病及其并发症的产生和发展中发挥着重要的作用,其与氧化应激损伤,染色体DNA损伤和高血压等均有关。1984年Vlassara团队首次发现糖尿病患者组织中AGEs含量显著增加,揭示了AGEs与糖尿病的相关性(Vlassara,H.; Brownlee,M.;Cerami,A.,NonenzymaticGlycosylation-Role in the Pathogenesis of Diabetic Complications.Clin Chem1986,32(10b),B37-B41.)。Monnier等人研究发现,衰老和血糖升高均能导致AGEs含量升高,引起组织细胞蛋白质结构异常和功能障碍,AGEs的含量与糖尿病并发症的发生和严重程度正相关 (Monnier,V.M.;Sell,D.R.;Strauch,C.;Sun,W.J.;Lachin,J.M.; Cleary,P.A.;Genuth,S.;Grp,D.R.,The association between skin collagen glucosepane andpast progression of microvascular and neuropathic complications in type1diabetes.J Diabetes Complicat 2013,27(2),141-149.)。分析体内AGEs的水平可以了解糖尿病的进程和严重程度,然而由于美拉德反应途径复杂,中间产物多样,最终会生成不同化学结构的AGEs,直接进行研究难度极大,迄今为止人类明确结构的AGEs不过二十多种。
过去研究已经表明,在血糖控制较差的1型糖尿病患者体内,其血清白蛋白的分子量不同程度地增加了439Da~2403Da,即每个蛋白质形成了3~15个 Amadori分子,说明在高浓度的血糖环境下体内蛋白的确会发生美拉德反应,而在正常人的血糖浓度下则几乎不会发生反应。然而比较蛋白质分子量的变化只能反映蛋白整体的修饰情况,由于营养程度和疾病的影响,蛋白质水平也会有所波动,仅依靠糖基化蛋白质难以完成对糖尿病的精确诊断。2011年 Priego-Capote等人应用基于质谱的分析方法,在人血浆中鉴定到113个不同的糖基化位点(Priego-Capote,F.;Scherl,A.;Muller,M.;Waridel,P.;Lisacek, F.;Sanchez,J.C.,Glycation Isotopic Labeling with C-13-Reducing Sugars forQuantitative Analysis of Glycated Proteins in Human Plasma.Mol CellProteomics 2010,9(3),579-592.),因此若从肽段层面分析,比较对葡萄糖敏感和不敏感肽段的相对定量情况,有可能为糖尿病的诊断提供新的生物标志物。
基于这个思路,Zhang Mei等人以血清白蛋白为研究对象,发现了3条对葡萄糖敏感的肽段(Zhang,M.;Xu,W.;Deng,Y.L.,A New Strategy for Early Diagnosis of Type2Diabetes by Standard-Free,Label-Free LC-MS/MS Quantification of GlycatedPeptides.Diabetes 2013,62(11),3936-3942.),但是血清白蛋白在人体中的半衰期较短,仅有20天左右,难以反映。
通过将血红蛋白与葡萄糖在37℃共同孵育,在体外建立模拟体内血红细胞中糖基化的模型,以研究葡萄糖对血红蛋白的修饰。蛋白被糖基修饰仅会发生在固定的位点上:赖氨酸、精氨酸以及N-末端的氨基。上述这些位点都有可能成为糖基化修饰的敏感位点,但并不排除由于蛋白三级结构、葡萄糖浓度较低等原因使得有些理论上可发生糖基化的位点实际上未被糖基修饰,在此称这样的位点为非敏感糖基化位点。若肽段上带有敏感糖基化位点,则该肽段就有可能成为葡萄糖敏感肽段;反之带有非敏感糖基化位点的肽段则十分可能成为葡萄糖不敏感肽段。
在给予足够量葡萄糖的条件下,随着葡萄糖孵育时间的延长,血红蛋白糖基化程度逐渐加剧,酶切后可能出现三种不同类型的肽段:1)葡萄糖不敏感肽段,即存在糖基化位点,但不易被葡糖糖修饰;2)葡萄糖敏感肽段,即存在糖基化位点,且位点已被葡萄糖修饰;3)未被葡萄糖修饰的葡萄糖敏感肽段,即存在糖基化位点,但位点由于葡萄糖浓度或者时间原因尚未被葡萄糖修饰。
因此,本领域技术人员正致力于筛选获得更多的葡萄糖敏感和不敏感的肽段,通过比较对葡萄糖敏感和不敏感肽段的相对定量情况,为糖尿病的诊断提供更多的生物标志物。
发明内容
为克服现有技术存在的缺陷,本发明的目的之一在于提供一种多肽标志物,所述多肽标志物为人源血红蛋白酶解后的葡萄糖不敏感的肽段(简称为不敏感肽)或对葡萄糖敏感的肽段(简称为敏感肽)。
本发明的目的之二在于提供一种多肽标志物的应用,通过从人源血红蛋白酶解后的肽段入手,通过研究高丰度蛋白发生反应肽段的减少量来实现敏感肽的检测,与蛋白相比,肽段能更灵敏的反应体内的变化,并且高丰度肽段易于质谱检测,稳定性较好,更适用于临床检验。
为实现本发明的目的,提供以下技术方案。
一种多肽标志物,所述多肽标志物的氨基酸序列为氨基酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1所述的氨基酸序列,即氨基酸序列表中的SEQ ID No.1(以下简称SEQ ID No.1),具体氨基酸序列为:Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg,m/z=637.87。所述多肽标志物为人源血红蛋白酶解后的葡萄糖不敏感肽段(简称为不敏感肽)。
一种与本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽标志物联合使用的多肽标志物,所述多肽标志物的氨基酸序列为氨基酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符2所述的氨基酸序列,即氨基酸序列表中的SEQ ID No.2(以下简称SEQ ID No.2),具体氨基酸序列为:Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys Tyr His,m/z=483.94。所述多肽标志物为人源血红蛋白酶解后的葡萄糖敏感肽段(简称为敏感肽)。
一种本发明所述多肽标志物的应用,所述应用是在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用;具体地说,所述应用如下:
本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽标志物不敏感肽,与本领域现有技术中的敏感肽或本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.2的多肽标志物敏感肽联合使用;优选与本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.2的多肽标志物联合使用;
本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.2的多肽标志物敏感肽,与本领域现有技术中的不敏感肽或本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽标志物不敏感肽联合使用;优选与本发明所述氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽标志物不敏感肽联合使用;
使用时,所述不敏感肽作为内标肽,当敏感肽含量与内标肽的含量比值大于0.02时,结果为健康,当敏感肽含量与内标肽含量的比值小于0.02时,结果为糖尿病。所述含量为液相色谱质谱得到的肽段的峰面积或峰强度。
有益效果
1.本发明提供了一种多肽标志物及其应用,通过选择人源血红蛋白制备体外模拟糖基化样品,并进一步采用临床样本进行液相色谱质谱检测;通过对血红蛋白肽段的定量分析,筛选出易被葡萄糖修饰的肽段,即含量易发生变化的敏感肽,和不容易被葡萄糖修饰的肽段,即含量稳定不易变化的不敏感肽(内标肽);通过糖尿病体外模型的鉴定,得到了4条对不敏感肽和14条对敏感肽,通过40例临床样本进行筛选验证,最终确定了1条不敏感肽和1条敏感肽段,作为Ⅱ型糖尿病临床早期诊断的肽类生物标志物。
2.本发明提供了一种多肽标志物及其应用,选择了高丰度蛋白作为研究对象,研究发现,糖基化反应属于非酶催化的化学反应,不具有选择性,因此外周血高丰度蛋白有更高的概率被葡萄糖所修饰,而修饰的程度则反映体内尚未代谢掉的葡萄糖的水平,且血糖的改变也会在蛋白上得到体现,因而可以比测量血糖水平更敏锐的发现罹患糖尿病的趋势,同时规避了低丰度蛋白在检测上的困难,包括难以达到准确定量等不利因素。
3.本发明提供了一种多肽标志物及其应用,筛选并验证得到了一条有效、典型的不敏感肽和一条有效、典型的敏感肽,这既弥补了单一生物标志物特异性不高、准确性欠佳等问题,又创新性的提出了用血红蛋白自身酶切,得到不敏感肽作为内标肽,以敏感肽和内标肽段液相色谱质谱得到的肽段的峰面积或峰强度之比作为糖基化修饰程度指标,这一新思路巧妙地解决了临床样品中存在较大个体差异,而使得相对定量存在较大困难的问题。本发明提出了定量肽类生物标志物作为临床糖尿病早期诊断的新策略,获得了预防和监测糖尿病的相关指标。这对于糖尿病的早期诊断和有效干预有重大意义和光明的前景。
附图说明
图1为实施例1中体外孵育过程中选出的4个不敏感肽在20天、40天和 60天孵育过程中含量变化的折线统计图。
图2为实施例1中体外孵育过程中选出的5个敏感肽在20天、40天和60 天孵育过程中含量变化的折线统计图。
图3为实施例2中对于正常人和糖尿病病人血样的敏感肽/内标肽t检验结果绘制的箱线图。
图4为实施例2中内标肽和敏感肽绘制的ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的生物化学试剂均为常规市售试剂,实施例中所用的仪器耗材均为市售,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所使用到的主要仪器如下表1所示。
表1主要仪器列表
实施例中所使用到的主要试剂如下表2所示。
表2主要试剂列表
试剂名称 | 生产厂家 |
人血红蛋白 | SIGMA-ALDRICH.Inc |
牛血清白蛋白 | Beijing Biodee Biotechnology Co.ttd |
D-葡萄糖 | 北京北化精细化学品责任有限公司 |
叠氮钠 | DIKMA |
尿素(分析纯) | SIGMA-ALDRICH.Inc |
二硫苏糖醇(DTT) | Inalco S.P.A. |
碘乙酰胺(IAA) | 北京拜尔迪生物公司 |
NH<sub>4</sub>HCO<sub>3</sub>(分析纯) | SIGMA-ALDRICH.Inc |
乙腈(色谱纯) | Fisher Scientific.Inc |
甲酸(色谱纯) | Fisher Scientific.Inc |
考马斯亮蓝G-250 | AerescoInc |
胰蛋白酶(测序级) | Promega Corporation |
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(化学纯) | 北京化工厂 |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(化学纯) | 北京化工厂 |
NaCl(化学纯) | 北京化工厂 |
KCl(化学纯) | 北京化工厂 |
超纯水 | Millipore.Inc |
实施例中所使用到的主要试剂溶液及其配制方法如下表3所示。
表3主要试剂溶液及其配制方法列表
实施例中所使用到的主要软件如下表4所示。
表4主要软件列表
软件名称 | 来源 |
Spectrum Mill | Agilent Technologies.USA |
Skyline | 互联网网站下载 |
Masshunter | Agilent Technologies.USA |
实施例1体外孵育糖尿病模型的建立及检测分析
1.体外糖基化样品的制备
(1)体外糖基化样品的制备参考了文献的方法(唐晓君,卢仙娥,李革,等. 2型糖尿病危险因素分析[J].中国公共卫生,2004,1(5):11-15),取30mg人血红蛋白标准品,加入10ml浓度为10mM的PBS缓冲液配制成人血红蛋白标准品溶液,由于血红蛋白有58个理论糖基化位点,根据D-葡萄糖及人血红蛋白的生理浓度换算成摩尔比,将葡萄糖和人血红蛋白的摩尔比例按照葡萄糖5倍过量而设计。
(2)将0.5ml浓度为3mg/ml的人血红蛋白标准品溶液与0.5ml浓度为 15mg/ml的D-葡萄糖溶液混合制成糖尿病体外孵育样本,加入10μl浓度为 0.02mg/ml的叠氮钠作为防腐剂;对每个糖尿病体外孵育样本按照20天、40天和60天设置三个不同孵育时间,进行37℃恒温箱共同孵育,并且在每个孵育时间下分别制备三个平行样品,因此一个糖尿病体外孵育样本会获得9个样品作为体外糖基化样品实验组;
将0.5ml浓度为3mg/ml的人血红蛋白标准品溶液作为空白对照孵育样本,加入10μl浓度为0.02mg/ml的叠氮钠作为防腐剂;对每个空白对照孵育样本按照20天、40天和60天设置三个不同孵育时间,进行37℃恒温箱共同孵育,并且在每个孵育时间下分别制备三个平行样品,因此一个空白孵育样本会获得9 个样品作为空白对照组。
(3)孵育结束后,将体外糖基化样品实验组和空白对照组的样品冷冻于 -80℃冰箱备用。
2.胰蛋白酶消化
(1)取步骤1制得的体外糖基化样品实验组和空白对照组的样本各5μl,加入200μl含8M尿素和10mM DTT的50mM NH4HCO3裂解液,37℃水浴孵育 2h进行变性和还原。
(2)再按照IAA与DTT摩尔之比为5:1,加入200μl 50mM IAA的50mM NH4HCO3溶液,震荡混匀后避光反应1h,以封闭氨基酸侧链活性基团,得到烷基化变性血红蛋白混合溶液体系。
(3)再按照步骤(2)中的烷基化变性血红蛋白混合溶液体系的8倍体积量加入50mMNH4HCO3水溶液进行稀释,漩涡震荡混匀,得到混合溶液。
(4)向步骤(3)得到的混合溶液中,加入用50mM NH4HCO3水溶液溶解的胰蛋白酶进行酶解,混合溶液中的烷基化变性血红蛋白和胰蛋白酶的质量之比为50:1,在37℃水浴孵育16h,得到酶解后的肽段。
3.液相色谱串联质谱及数据分析
(1)采用数据依赖模式在HPLC-QTOF-MS/MS上分析步骤2得到的肽段,生成.d文件。
(2)利用安捷伦公司的Spectrum Mill软件,对(1)生成的.d文件进行检索,采用Swiss-Prot数据库,设置参数如下:种属为人;固定修饰为 carbamidomethyl;酶为胰蛋白酶;前体离子设置20ppm;MS/MS限制50ppm;最大漏切位点为2;并用软件MRM Selector创建具有保留时间的DMRM离子对列表(表8)。
(3)将MRM列表导入到Masshunter软件中,建立DMRM方法,采用液相色谱三重四极杆串联质谱(HPLC-QQQ-MS/MS)用DMRM方法对步骤2.中血红蛋白酶解的肽段进行测定,生成.d文件。
(4)利用液相色谱三重四极杆串联质谱自带的Agilent MasshunterQuantitative Analysis软件对步骤(3)生成的.d文件进行峰面积积分,设置离子对信息、保留时间、定性离子参数,设置完成后对(3)中得到的数据文件进行分析,观测20天、40天和60天的面积,并利用软件把每个离子对的峰面积信息导出Excel中。
(5)根据每个离子对的峰面积的变异系数(CV值)小于10%为候选不敏感肽,CV值大于等于10%为候选敏感肽。
在体外孵育实验中,血红蛋白与500mM的葡萄糖孵育20天、40天和60 天,并同时设置平行的无葡萄糖对照组。发现4个肽段,具体氨基酸序列如下: Leu Leu Val Val TyrPro Trp Thr Gln Arg(LLVVYPWTQR,SEQ ID No.1)、Val Asn Val Asp Glu Val Gly GlyGlu Ala Leu Gly Arg(VNVDEVGGEALGR)、Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly LysK(SAVTALWG)和Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys(TYFPHFDLSHGSAQVK);这4个肽段在 20天,40天和60天的峰面积具有较小的变异系数(CV<10%),因此作为候选不敏感肽。参考文献1(Li,W.;Lin,L.;Yan,D.;Jin,Y.;Xu,Y.;Li,Y.;Ma,M.;Wu,Z.,Application of a Pseudotargeted MS Method for the Quantificationof Glycated Hemoglobin for the Improved Diagnosis of Diabetes Mellitus.AnalChem 2020,92(4),3237-3245.)通过体内和体外实验对血红蛋白糖基化进行了***全面的分析,未发现氨基酸序列为SEQ ID No.1的肽段有糖基化修饰。因此,确定所述肽段即作为本发明申请的不敏感肽,即氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽标志物;所述不敏感肽后续在糖尿病诊断试剂盒中作为内标肽使用。根据实施例1的3.液相色谱串联质谱及数据分析结果,将所述肽段的质谱峰强度/与对照组所述肽段峰强度作比,得到所述肽段相对强度随孵育时间变化的情况,绘制折线图如图1所示。所述内标肽变异系数为6.54%,说明随孵育时间增加,该肽段含量保持相对稳定,不易与葡萄糖发生美拉德反应。
在体外孵育实验中,血红蛋白与500mM的葡萄糖孵育20天、40天和60 天,并同时设置平行的无葡萄糖对照组。结果发现14个肽段在20天,40天和 60天的峰面积具有较大的变异系数(CV值大于等于10%),因此作为候选敏感肽,如表5所示,其中,倍数变化指葡萄糖的实验组与无葡萄糖对照组的肽段峰值面积比。
表5候选敏感肽列表
进一步研究,发现其中5个肽段,具体氨基酸序列如下:
Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His Leu Pro Ala GluPhe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys (LLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDK)、Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys Tyr His(VVAGVANALAHKYH,SEQ IDNo.2)、Leu Arg Val Asp Pro Val Asn Phe Lys(LRVDPVNFK)、Leu Leu Gly Asn Val LeuVal Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys(LLGNVLVCVLAHHFGK)和Lys Val Leu GlyAla Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn Leu Lys(KVLGAFSDGLAHLDNLK);这5个肽段在20天,40天和60天的峰面积具有较大的变异系数(CV值大于等于10%)。
更进一步研究,由实施例1中3液相色谱串联质谱及数据分析结果得到血红蛋白酶解肽段葡萄糖的实验组与无葡萄糖对照组相比肽段含量的变化,如图2 所示,在随孵育时间的增加,氨基酸序列为SEQ ID No.2的肽段的含量减少最为显著,选择作为敏感肽,变异系数为26.95%。因此,确定所述肽段即作为本发明申请的敏感肽,即氨基酸序列为SEQ IDNo.2的多肽标志物;在后续在糖尿病诊断试剂盒中作为敏感肽使用。
以上步骤中所用到的仪器分析参数如下:
液相参数:
(1)色谱柱:DIKMA C18 3.5μm,2.1×150mm
(2)流动相A:质量分数0.1%甲酸;流动相B:质量分数0.1%乙腈。流速:0.2ml/min,停止运行时间50min,后运行时间15min。
(3)液相梯度设定见表6。
表6梯度表
时间/min | 流动相B/%(质量分数) |
0 | 5 |
5 | 5 |
30 | 40 |
35 | 85 |
40 | 85 |
45 | 5 |
50 | 5 |
HPLC-QTOF-MS/MS分析参数:
扫描模式:ESI Positive,雾化气Nebulizer:15psi,干燥气Dry Gas:7L/min,干燥气温度:350℃,扫描类型:Auto MS/MS;质量扫描范围MS: 290m/z~1500m/z,MS/MS:100m/z~3000m/z;毛细管电压Vcap:3500V;离子传输电压Fragmentor:175V;时间段设置Time:0min~5min to waste,5min~50min to MS。
碰撞能量(Collision Energy,CE)设置按照表7设置。
表7碰撞能量设置
Charge | Slope | Offset |
2 | 3.7 | 2.5 |
2 | 3.6 | -4.8 |
>3 | 3.6 | -4.8 |
HPLC-QQQ-MS/MS分析参数:
梯度同表6
质谱参数:
Gas Temp:300℃;
Gas Flow:7L/min;
Sheath Gas Temp:250℃;
Sheath Gas Flow:11L/min;
Capillary:3500V
时间段设置Time:0min~5min to waste,5min~50min to MS;
扫描模式:DMRM,具体信息如表8所示。
表8 DMRM离子对列表
实施例2临床样品的验证
1.临床样品的收集
糖尿病是以慢性高血糖为主要特征的一组内分泌代谢性疾病,临床主要分为3种类型:1型、2型及妊娠糖尿病,其中2型糖尿病最为常见。目前对于各型糖尿病的具体发病机制尚无统一定论,但研究显示,糖尿病是遗传因素、自身免疫***因素及环境因素共同作用的结果。其中1型糖尿病(T1DM)主要与遗传有关,由于胰岛细胞自免疫缺陷使得胰岛素分泌缺乏。患者主要依靠注射胰岛素来补偿胰岛素分泌的不足。2型糖尿病(T2DM)是一种慢性进行性代谢疾病。T2DM发病率高,并发症危害大。T2DM如控制不当,会导致多种并发症的发生,诸如肾功能衰竭、失明、心血管疾病及神经***疾病等,造成严重的后果。本实施例中研究的临床样品均为T2DM患者。
糖化血红蛋白(HbA1c)实际上指的是被葡萄糖糖化了的血红蛋白,通过测定血液中糖化血红蛋白(HbA1c)的含量,可以反映一名糖尿病患者在以往几个月的时间内糖尿病控制状况的好坏。目前糖尿病的治疗中糖化血红蛋白是一个非常重要的血液检查指标。糖化血红蛋白就是人体内血红蛋白的糖化比例,正常人的值为质量分数3.9%~6.1%,糖尿病因为血糖升高,因此其血红蛋白的糖化比例也会明显升高。2015年美国糖尿病学会(ADA)发布了的糖尿病诊疗标准中明确HbA1c作为评价血糖控制的“金指标”。
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质,是使血液呈红色的蛋白。在哺乳动物中,血红蛋白占红细胞干重的97%,总重的35%。血红蛋白存在于红细胞中,不存在于血浆中,因此收集乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血样品进行分析。
2.临床样品的信息
血样是已经明确诊断T2DM患者和正常体检患者,均提供了糖化血红蛋白值。根据ADA发布糖尿病诊断标准,糖化血红蛋白质量分数低于6.1%为糖耐量正常组,反之为2型糖尿病组(T2DM)组。
本实验最终确定了两个分组:2型糖尿病(T2DM)组和糖耐量正常组 (Normal)各20例临床血样,为EDTA抗凝全血新鲜样品。为了更方便的验证敏感肽,T2DM组选取了HbA1c质量分数的百分值(糖化血红蛋白的质量分数) 由7.0~12.55%的宽范围样品,如表9所示。
表9临床样品信息一览表
3.临床样品的蛋白酶酶解
胰酶酶解方法同实施例1中2.胰蛋白酶消化。
4.液相色谱串联质谱及数据分析
临床样品的质谱分析方法参数同实施例1中3.(2)(3)(4)完全一样,步骤和结果完全一样。而后对得到的不敏感肽(内标肽)与敏感肽峰强度作比,对比值进行t检验、ROC分析等,并与患者的HbA1c含量进行比较。
为了验证敏感肽和内标肽诊断的准确性,利用MRM方法定量检测实施例2 中的临床样本中血红蛋白敏感肽和内标肽的含量。以MRM方法中计算得到的敏感肽和内标肽质谱峰面积,在软件Graphpad Prism 8上对健康人和糖尿病患者血红蛋白的敏感肽含量/内标肽含量进行t检验,计算数据之间的差异显著性,对于t检验的结果,绘制箱线图如图3所示,其中p值小于0.001,说明内标肽/ 敏感肽的比值在健康人和糖尿病病人血样中的确存在显著性差异。内标肽可视为不与葡萄糖发生反应,在健康人和糖尿病病人体内含量均保持稳定。结果表明,敏感肽在糖尿病患者体内的含量均发生了显著减少,能够反映出糖尿病患者体内血糖浓度的变化,进而实现对糖尿病的诊断。
受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标,是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系,它通过将连续变量设定出多个不同的临界值,从而计算出一系列敏感性和特异性,再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线,ROC曲线下与坐标轴围成的面积(Area UnderCurve,AUC)越大,建立的诊断方法准确性越高。在实施例2的临床样本的验证分析中,为了展示基于肽类生物标志物糖尿病诊断标准的准确性,以实施例1和2中得到的敏感肽和内标肽作比建立基于血红蛋白酶解肽段的糖尿病诊断标准,对18个健康人和19个糖尿病患者的MRM数据进行分析,绘制ROC曲线如图4所示,其ROC曲线各项参数如表10所示,得到AUC=1.00,说明基于上述肽段的糖尿病诊断标准具有较高的准确性,可在糖尿病诊断试剂盒中应用。
表10以为内标肽建立糖尿病诊断标准,对18位健康人和19位糖尿病患者的 ROC分析参数
生物标志肽 | 截止点<sup>a</sup> | 灵敏度(%) | 特异性(%) | 曲线下面积(AUC)<sup>b</sup> |
敏感肽 | 0.014 | 100.00 | 100.00 | 1.00 |
a:在每种临床病例中推定的敏感肽与内标肽的峰面积之比;
b:曲线下面积(AUC):0.5~0.7表示该种敏感肽的诊断准确性低;0.7~0.9表示该种敏感肽具有中等诊断准确性;>0.9表示该种敏感肽具有较高的诊断准确性。
本发明基于现有技术构建了体外孵育的糖尿病模型,基于液相色谱四极杆飞行时间串联质谱和液相色谱三重四极杆串联质谱优化条件,寻找对葡萄糖不敏感的内标肽段和对葡萄糖敏感的肽段,共鉴定到14条对葡萄糖敏感和4条对葡萄糖不敏感的候选肽段,并从中筛选出了敏感肽序列为氨基酸序列为SEQ ID No.2的多肽标志物,不敏感肽(内标肽)序列为氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽标志物。
通过三重四极杆质谱测定敏感肽峰面积和内标肽峰面积,用敏感肽峰面积/ 内标肽峰面积作为2型糖尿病的诊断标准,当比值<0.02,可判断患有糖尿病。
然后使用实施例2中4.液相色谱串联质谱及数据分析的方法对健康血样和临床样本进行验证,结果表明,相比于健康人,糖尿病患者血液中血红蛋白的敏感肽/内标肽比值显著降低,这说明由于血糖浓度升高,病人血红蛋白中对敏感肽发生了糖基化修饰,进而导致未发生修饰的敏感肽含量降低,病人的糖化血红蛋白质量分数的检测结果也对此进行了印证。为了验证我们建立的基于血红蛋白酶解肽段的诊断标准的准确性,绘制了上述诊断方法的受试者工作特征曲线,分析得到AUC>0.9,具有较好的可信度。
综上所述,相比于传统的糖尿病诊断标准,所述特征肽含量稳定,丰度高。不会因为情绪、饮食或营养水平而受到影响,具有更好的可信度和准确性,基于敏感肽/内标肽比值的变化有望成为潜在的糖尿病诊断新标准。同时,高效液相色谱-质谱具有分析速度快、高通量的特点,有望投入临床,实现糖尿病的快速精确诊断。
实施例4多肽标志物在糖尿病诊断中的潜在应用
1.稳定同位素标记的标志肽段的合成(C13标记或N15标记都可以)
根据实施例1和实施例2中筛选验证得到的内标肽和敏感肽,基于固相合成法设计合成N15标记的内标肽以及N15标记的敏感肽,除相对分子质量外,N15标记内标肽与内标肽,N15标记的敏感肽与敏感肽的性质几乎无差异,在试剂盒中,将N15标记的内标肽和N15标记的敏感肽等物质的量进行混合得到N15标准肽,-80℃保存备用。
2.临床样本前处理
选取病人的全血样本用于糖尿病诊断检测,胰酶酶解方法同实施例1第2 步(以下简称临床样本)。
3.液相色谱串联质谱及数据分析
根据实际情况可采取标记定量和非标记定量两种方式对全血样本进行分析。
(1)标记定量:在临床样本中加入N15标准肽溶液。
(2)非标记定量:临床样本不与N15标准肽进行混合。
将实施例1第3步中得到的MRM列表导入到Masshunter软件中,建立 DMRM方法,采用液相色谱三重四极杆串联质谱(HPLC-QQQ-MS/MS)用 DMRM方法对步骤2.中临床样本进行测定,质谱参数同实施例1第3步。
三重四极杆质谱分析得到临床样本中内标肽和敏感肽中肽段的峰面积相对于N15标准肽段的含量差异,从而得到临床样本中敏感肽与内标肽含量的差异,通过与实施例2中前期临床验证得到的敏感肽/内标肽比值与糖化血红蛋白的关系,可以实现糖尿病的诊断。
氨基酸序列表
<110> 北京理工大学
<120> 一种多肽标志物及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽标志物(不敏感肽)
<400> 1
Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽标志物(敏感肽)
<400> 2
Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys Tyr His
1 5 10
Claims (2)
1.多肽标志物在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于:氨基酸序列为SEQID No.1的多肽标志物作为不敏感肽,与氨基酸序列为SEQ ID No.2的多肽标志物作为敏感肽联合使用,所述不敏感肽是指葡萄糖不敏感肽段,所述敏感肽是指葡萄糖敏感肽段。
2.根据权利要求1所述的多肽标志物在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于:使用时,所述不敏感肽作为内标肽,当敏感肽含量与内标肽的含量比值大于0.02时,结果为健康,当敏感肽含量与内标肽含量的比值小于0.02时,结果为糖尿病;所述含量为液相色谱质谱得到的肽段的峰面积或峰强度。
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