CN112034182A - 一种结肠癌转移预测方法和*** - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种结肠癌转移预测方法和***，通过蛋白质质谱检测技术，获取结直肠癌组织学石蜡切片的蛋白质信息，根据具体的蛋白信息纳入预测模型中，预测术后结肠癌的转移发生。

Description

一种结肠癌转移预测方法和***
技术领域
本发明涉及蛋白质质谱检测应用于癌症预测技术领域，具体涉及一种结肠癌转移预测方法和***。
背景技术
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。在西方发达国家，其发病率和死亡率位居肿瘤第3位，全球每年大约110万新发病例，53万死亡病例，其中我国每年新发病人数约40万人，发病数和死亡率已经超过美国。肝转移是结肠癌治疗失败、影响预后和长期生存的主要原因。结直肠癌具有显著的肝脏转移特异性，肝脏是结直肠癌最主要的转移部位，初次确诊的肠癌患者中，20％～40％存在肝转移，根治性切除术后5年内50％患者发生异时性肝转移，尸检报告见35％～81％发生肝转移。肝转移是结肠癌治疗失败、影响预后和长期生存的主要原因。
随着组学技术的发展，肿瘤转移发生、异质性成瘤等相关的基因、蛋白的信号转导途径和其内在分子群谱改变机制不断得到越来越详细的阐述，蛋白质组学研究已广泛应用于肿瘤生物学标记物的筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗及肿瘤发生机制等方面。然而，目前临床尚缺少客观的分子标志物预测结直肠癌异时性肝转移的发生以及指导后续的治疗。
蛋白质标记物可以在常规术后的组织标本(例如石蜡切片标本)上轻易地测量，由此减少了对新鲜或冷冻组织活检的依赖。尽管有证据证明CRC组织蛋白质组相较正常结直肠组织发生明显变化，但到目前为止，并没有特异性预测CRC异时性肝转移以及术后复发的组学生物标志物被验证用于临床使用。在这种情况下，蛋白质组学作为一种理想的，高度可解析的研究工具，可用于寻找新的癌症生物标志物。
发明内容
本发明的目的是提供一种结肠癌转移预测方法及***，用以提供针对结直肠癌患者肝脏异时性转移事件的预测。
为了达到上述目的，本发明一方面提供一种结肠癌转移预测方法，包括：
S1蛋白质提取，获取患者术中肿瘤组织的石蜡切片标本，进行脱蜡和再水化处理提取蛋白质样品；
S2酶解脱盐，将蛋白质样品进行胰酶消化和脱盐处理；
S3质谱分析，将经过步骤S2处理后的蛋白质样品进行质谱分析获得多肽质谱数据；
S4蛋白质信息定量分析与模型验证，将所述多肽质谱数据进行定量分析，挑选出蛋白标志物，将蛋白质标志物作为数据集构建结肠癌转移预测模型，基于所述模型的输出结果判断是否出现术后转移。
进一步的，在所述步骤S1中，还包括：
S101，剔除肿瘤周围间质组织；
S102，分别采用浓度为100％、67％和33％的二甲苯处理组织切片，并用浓度为100％、75％和50％的乙醇进行再水化处理；
S103，在99℃下温育30分钟加热变性，静置冷却至室温；
进一步的，在所述步骤S2中，还包括：
S201，将步骤S103中获取的蛋白质样品中加入typsin胰酶5ul(1ug/ul)，37℃恒温箱酶解过夜；
S202，将消化的肽脱盐、浓缩，然后重悬于含有0.1％FA的25％ACN中，然后通过使用高pH液相色谱分离消化的蛋白质样品。
进一步的，在步骤S3中，还包括：
S301，将经过步骤S205消化处理的蛋白质样品装载到质谱仪的捕获柱上进行洗脱肽处理；
S302，在高分辨率模式下以350至1500m/z测量扫描，然后以100至1250m/z在高灵敏度模式下进行质谱扫描；
S303，在每个周期内分别选择20-40个最密集的前体进行碎裂，获得多肽的一级(MS)和二级质谱(MS/MS)数据。
进一步的，在步骤S4中，还包括：
步骤S401，基于步骤S303所获取的蛋白质质谱数据，通过Firmiana平台进行数据挖掘和分析确定蛋白质标记物；
步骤S402，将步骤401中获取的蛋白质标记物作为训练集和验证集，采用随机森林算法构建预测模型。
进一步的，在步骤S4中，所述蛋白质标记物包括：KRT222 S100A6
PSMB10 CLC OSTF1 ADRM1 ATG3 CEACAM3 LYPLA2 DNAJC8
RPF2 PDE12 BROX SMARCD2 TRIOBP PFDN5 HTRA1 PSMG1
ADPGK NDUFB1 DHX8 THOC2 PSMD10 SH3KBP1 WDR18 GPHNUBE2G1 VKORC1L1NDEL1 PRKAB1 NDUFAF4 SLC27A2 SCAF8
PSMD9 SCAF4 DDX56 ARHGAP18 SLAIN2 AKT2 SGCD
ABCB8 ENGASE C1orf123 SDC4 TMEM30B HIP1R DNTTIP2
ATAD1 TMEM30A UBXN6 MFN1 STAG2 ITM2B MTMR14
PADI3 ERLEC1 KIAA0226ANKRD10 RXRA OLFML1 MEST。
进一步的，所述随机森林模型将每项蛋白质标记物作为每个决策树的节点，以癌转移预后结果作为分类标签确定蛋白质标记物的分类归属。
另一方面，本发明还提供一种结肠癌转移预测***，包括：
蛋白质提取装置，用以获取患者术中肿瘤组织的石蜡切片标本，进行脱蜡和再水化处理提取蛋白质样品；
色谱分离装置，用以将蛋白质样品进行高温裂解和色谱分离消化；
质谱分析装置，用以将经过处理后的蛋白质样品进行分析获得多肽质谱数据；
蛋白质信息定量分析与模型验证模块，用以将所述多肽质谱数据进行定量分析，挑选出蛋白标志物，将蛋白质标志物作为数据集构建结肠癌转移预测模型，基于所述模型的输出结果判断是否出现术后转移。
本发明提供一种结肠癌转移预测方法和***，通过蛋白质质谱检测技术，获取结直肠癌组织学石蜡切片的蛋白质信息，根据具体的蛋白信息纳入预测模型中，预测术后结肠癌的转移发生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一种结肠癌转移预测方法的方法流程图。
图2为本发明实施例的一种结肠癌转移预测***的***架构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。、在以下的描述中，涉及到“一些实施例”，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。
本发明的一种结肠癌转移预测方法和***，通过蛋白质质谱检测技术，获取结直肠癌组织学石蜡切片的蛋白质信息，根据具体的蛋白信息纳入预测模型中，预测术后结肠癌的转移发生。
图1为本发明实施例一种结肠癌转移预测方法的方法流程图。如图1所示，本发明的一种结肠癌转移预测方法，包括以下步骤：
S1蛋白质提取，获取患者术中肿瘤组织的石蜡切片标本，进行脱蜡和再水化处理提取蛋白质样品。
具体的，在蛋白质提取过程中，首先选取结直肠癌患者手术石蜡切片标本，在显微镜下剔除肿瘤周围间质组织，随后在室温下用不同浓度的二甲苯(100％，67％和33％)处理组织切片各2分钟，然后组织切片继续用不同浓度的乙醇(100％，75％和50％)进行再水化。再水化完成后在样本试管中加入裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl，pH8.0)，然后在99℃下温育30分钟，并在60℃下振荡2小时。将液体组织提取物在4℃以14000g离心10分钟。将提取的蛋白质等量混合，然后用丙酮沉淀过夜，重悬蛋白，完成蛋白定量。
S2色谱分离，将蛋白质样品进行高温裂解和色谱分离消化。
具体的，将经过步骤S1处理的蛋白质样品在56℃下被5mM DTT还原30分钟，并通过10mM MMTS在室温下烷基化30分钟。然后用50mM碳酸氢铵稀释样品直至尿素浓度低于1M。将Lys-C以1:50(酶：蛋白质)的质量比在37℃下加入蛋白质中3小时。胰蛋白酶以1:50(酶：蛋白质)的质量比加入样品12小时。将消化的肽脱盐、浓缩，然后重悬于含有0.1％FA的2％ACN中。通过使用高pH液相色谱分离消化的蛋白质样品。
S3质谱分析，将经过步骤S2处理后的蛋白质样品进行分析获得多肽质谱数据。
具体的，本实施例采用Fusion-Lumos质谱仪进行UHPLC-MS/MS质谱分析。首先将分离消化的蛋白质样品自动装载捕获柱上。在90分钟梯度条件下以300nL/min的恒定流速从15cm柱洗脱肽。在高分辨率模式下从350至1500m/z采集测量扫描，而在高灵敏度模式下MS/MS扫描从100至1250m/z。每个周期分别选择20-40个最密集的前体进行碎裂，从而获得多肽的一级(MS)和二级质谱(MS/MS)数据。
S4蛋白质信息定量分析与模型验证，将所述多肽质谱数据进行定量分析，挑选出蛋白标志物，将蛋白质标志物作为数据集构建结肠癌转移预测模型，基于所述模型的输出结果判断是否出现术后转移。
具体的，本实施例采用一站式分子表型组数据分析和知识挖掘云平台Firmiana进行搜库与数据分析。将多肽质谱数据进行分析后进行数据合并，根据US-peptite数目(n＝1)，选取可靠蛋白数据，补齐空值和取Log10后，分别挑选预测模型中对应的61个蛋白质标记物，将该信息投入到预测模型中。
具体的，蛋白质标记物包括：KRT222 S100A6 PSMB10 CLC
OSTF1 ADRM1 ATG3 CEACAM3 LYPLA2 DNAJC8 RPF2 PDE12
BROX SMARCD2 TRIOBP PFDN5 HTRA1 PSMG1 ADPGK
NDUFB1 DHX8 THOC2 PSMD10 SH3KBP1 WDR18 GPHN UBE2G1
VKORC1L1 NDEL1 PRKAB1 NDUFAF4 SLC27A2 SCAF8 PSMD9
SCAF4 DDX56 ARHGAP18 SLAIN2 AKT2 SGCD ABCB8
ENGASE C1orf123 SDC4 TMEM30B HIP1R DNTTIP2 ATAD1
TMEM30A UBXN6 MFN1 STAG2 ITM2B MTMR14 PADI3
ERLEC1 KIAA0226ANKRD10 RXRA OLFML1 MEST。
在一个实施例中，本发明将获取的蛋白质标记物作为训练集和验证集，采用随机森林算法构建预测模型。
具体的，预测模型应用R语言中RandomForest包进行构建，将每项蛋白质标记物作为每个决策树的节点，以癌转移预后结果作为分类标签确定蛋白质标记物的分类归属，通过预测模型的分类结果判断是否会出现术后转移。
图2为本发明实施例的一种结肠癌转移预测***的***架构图，如图2所示，本发明的一种结肠癌转移预测***，包括：
蛋白质提取装置1，用以获取患者术中肿瘤组织的石蜡切片标本，进行脱蜡和再水化处理提取蛋白质样品。
酶解脱盐装置2，将蛋白质样品进行胰酶消化和脱盐处理。
质谱分析装置3，用以将经过处理后的蛋白质样品进行分析获得多肽质谱数据。
蛋白质信息定量分析与模型验证模块4，用以将所述多肽质谱数据进行定量分析，挑选出蛋白标志物，将蛋白质标志物作为数据集构建结肠癌转移预测模型，基于所述模型的输出结果判断是否出现术后转移。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，包括：
S1蛋白质提取，获取患者术中肿瘤组织的石蜡切片标本，进行脱蜡和再水化处理提取蛋白质样品；
S2酶解脱盐，将蛋白质样品进行胰酶消化和脱盐处理；
S3质谱分析，将经过步骤S2处理后的蛋白质样品进行质谱分析获得多肽质谱数据；
S4蛋白质信息定量分析与模型验证，将所述多肽质谱数据进行定量分析，挑选出蛋白标志物，将蛋白质标志物作为数据集构建结肠癌转移预测模型，基于所述模型的输出结果判断是否出现术后转移。
2.如权利要求1所述的一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，在所述步骤S1中，还包括：
S101，剔除肿瘤周围间质组织；
S102，分别采用浓度为100％、67％和33％的二甲苯处理组织切片，并用浓度为100％、75％和50％的乙醇进行再水化处理；
S103，在99℃下温育30分钟加热变性，静置冷却至室温。
3.如权利要求2所述的一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，在所述步骤S2中，还包括：
S201，将步骤S103中获取的蛋白质样品中加入typsin胰酶5ul(1ug/ul)，37℃恒温箱酶解过夜；
S202，将消化的肽脱盐、浓缩，然后重悬于含有0.1％FA的25％ACN中，然后通过使用高pH液相色谱分离消化的蛋白质样品。
4.如权利要求3所述的一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，在步骤S3中，还包括：
S301，将经过步骤S205消化处理的蛋白质样品装载到质谱仪的捕获柱上进行洗脱肽处理；
S302，在高分辨率模式下以350至1500m/z测量扫描，然后以100至1250m/z在高灵敏度模式下进行质谱扫描；
S303，在每个周期内分别选择20-40个最密集的前体进行碎裂，获得多肽的一级(MS)和二级质谱(MS/MS)数据。
5.如权利要求4所述的一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，在步骤S4中，还包括：
步骤S401，基于步骤S303所获取的蛋白质质谱数据，通过Firmiana平台进行数据挖掘和分析确定蛋白质标记物；
步骤S402，将步骤401中获取的蛋白质标记物作为训练集和验证集，采用随机森林算法构建预测模型。
6.如权利要求5所述的一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，在步骤S4中，所述蛋白质标记物包括：KRT222 S100A6 PSMB10 CLC OSTF1
ADRM1 ATG3 CEACAM3 LYPLA2 DNAJC8 RPF2 PDE12 BROX
SMARCD2 TRIOBP PFDN5 HTRA1 PSMG1 ADPGK NDUFB1DHX8 THOC2 PSMD10 SH3KBP1WDR18 GPHN UBE2G1
VKORC1L1 NDEL1 PRKAB1 NDUFAF4 SLC27A2 SCAF8 PSMD9
SCAF4 DDX56 ARHGAP18 SLAIN2 AKT2 SGCD ABCB8
ENGASE C1orf123 SDC4 TMEM30B HIP1R DNTTIP2 ATAD1
TMEM30A UBXN6 MFN1 STAG2 ITM2B MTMR14 PADI3
ERLEC1 KIAA0226ANKRD10 RXRA OLFML1 MEST。
7.如权利要求6所述的一种结肠癌转移预测方法，其特征在于，所述随机森林模型将每项蛋白质标记物作为每个决策树的节点，以癌转移预后结果作为分类标签确定蛋白质标记物的分类归属。
8.一种结肠癌转移预测***，其特征在于，包括：
蛋白质提取装置，用以获取患者术中肿瘤组织的石蜡切片标本，进行脱蜡和再水化处理提取蛋白质样品；
酶解脱盐装置，用以将蛋白质样品进行高温裂解和色谱分离消化；
质谱分析装置，用以将经过处理后的蛋白质样品进行分析获得多肽质谱数据；
蛋白质信息定量分析与模型验证模块，用以将所述多肽质谱数据进行定量分析，挑选出蛋白标志物，将蛋白质标志物作为数据集构建结肠癌转移预测模型，基于所述模型的输出结果判断是否出现术后转移。
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