CN102027373B - 发现用于***癌诊断和治疗之生物标志物和药物靶标的方法及其确立的生物标志物测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确立癌症诊断/治疗用生物标志物测定和药物靶标的方法，其包括下列步骤：(a)基于对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的组织样品蛋白质组以及血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身样品蛋白质组中的蛋白质/肽成分浓度的测量，并定性地选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示明显差异行为的那些作为潜在的候选蛋白质/肽生物标志物，从而鉴定潜在的候选蛋白质/肽生物标志物和药物靶标；(b)任选地，通过对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身样品蛋白质组中潜在的候选蛋白质生物标志物进行定量质谱测量，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的定量差异行为的那些作为候选蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出的潜在候选蛋白质/肽生物标志物进行验证；(c)通过对来自健康人个体以及来自患癌人个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身样品蛋白质组中的候选蛋白质生物标志物进行质谱测量和/或基于抗体的测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA))，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的和/或基于抗体之测定可测得的差异行为的那些作为蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出或者任选地步骤(b)中验证的候选蛋白质/肽生物标志物进行确认；(d)应用统计学方法找出经步骤(c)确认的单个或成组蛋白质/肽生物标志物作为用于检测癌症患者之特征标记。本发明还涉及使用人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身对癌症(特别是局限性或非局限性***癌)进行高度可靠之诊断的特异性生物标志物测定。

Description

发现用于***癌诊断和治疗之生物标志物和药物靶标的方 法及其确立的生物标志物测定
技术领域
本发明涉及用于确立诊断癌症(特别是***癌，无论是局限性或非局限性***癌)及其治疗和/或预后之生物标志物测定和/或药物靶标的方法的领域。本发明的另一目的是提出针对这些诊断目的和/或患者分级的特异性生物标志物测定，以及使用这些特异性生物标志物测定进行诊断的方法。
背景技术
尽管经过十年的研究努力，但***癌的诊断和治疗仍是临床中的主要挑战。由于***癌的完全消退与治愈仅在其早期阶段才可能发生，因此令人遗憾地该疾病的发展是“静默(silent)”的，所以对较快发展和潜在危险病变的早期检测对于患者健康来说至关重要。
可用于***癌的最佳的非侵入性诊断测试是检测血液中的***特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)连同直肠指检(digital rectalexamination，DRE)。PSA是***上皮细胞产生的蛋白质。PSA也称为激肽释放酶III(kallikrein III)、***素(seminin)、semenogelase、γ-***蛋白以及P-30抗原，其为34kD糖蛋白，在正常男性血清中少量存在，在***癌和其它***疾病中常有所升高。测量PSA的血液测试连同DRE是***癌早期检测的现有最有效的测试。高于正常水平的PSA与局限性(loc)和转移性(met)***癌(CaP)均有关。
单独使用PSA的诊断准确性仅约为60％，并且该方法在特异性方面有明显缺点(太多的假阳性病例接受不必要的***活检或手术)。事实上，***感染、刺激(irritation)、良性***肥大(增大)或增生(BPH)以及最近***也可导致PSA水平升高，产生假阳性结果。
因此，即使出现基于同时对多种参数(例如游离的和总的PSA)进行测量的新方法作为增加总体诊断准确性的工具，但是仍缺乏可靠的、非侵入性的诊断/预后方法。血液中的大多数PSA与血清蛋白结合。少量未与蛋白质结合，称为游离的PSA。在患***癌的男性中，游离(非结合)PSA与总PSA的比值降低。如果游离PSA与总PSA的比值低于25％，则癌症风险增加。比值越低，则发生***癌的可能性越高。但是，在***后，总PSA和游离PSA均立刻增加，在24小时内缓慢恢复到基线水平，并且与CaP无关的其它机制也能够影响游离PSA与总PSA的比值。
与诊断类似地，由于***癌的异质性，对该疾病的治疗和/或预后仍是巨大的挑战。尽管已提出***癌症的多种机制，但是缺少合适的能够对患者分级的特征标记(signature)，并且用于治疗性干预治疗的关键靶标蛋白仍未有找到。
发明内容
因此，本发明的目的是提供确立用于对癌症(特别是***癌，无论是局限性或非局限性的***癌)进行诊断、预后、治疗以及监测治疗和/或用于患者分级的生物标志物测定和/或药物靶标的经改进方法。应当指出，从原理的角度来看，本发明所提出的方法不限于癌症，而是可以应用到任何类型的人或动物疾病或功能失调。从实践的角度来看，仅有的限制有时在于，应当存在可用于下述转换方法(translational approach)的模型***。
应当指出，不仅来自小鼠(或一般的动物，例如非人模型)的候选物是本发明的一部分。潜在的候选标志物可从多种来源确定，还包括人组织、近端液(proximal fluid)、动物模式细胞系、数据挖掘等。
然而，在***生物学方法更加一般化的背景下，动物模型对于发现生物标志物具有非常独特的优势。假定在不同癌症(其影响不同的组织)中细胞网络被干扰。进一步假定，不同表现的癌症可具有相同或重叠的干扰(perturbation)，动物(如小鼠)模型允许特异性地应用一个孤立的干扰或限定的干扰组合来确定靶组织对该干扰如何响应。如果进一步假定，构成该响应(干扰的直接作用，例如，如果激酶缺失或发生突变，则磷酸肽缺失)的某些蛋白质或补偿性作用在靶组织中留下特异性指纹，则使用我们本文所述的方法可在血清中检测这些指纹中的一些。遗传限定小鼠模型的明显特点在于允许限定与特定基因突变(在本申请中，如PTEN)有关的变化，所述突变是我们已知的在人类癌症中也存在的突变，并因而直接提示应当关注和治疗的患者亚类(个体化医疗)。在规划临床试验时，对于患病人群中分子标志物种类的普遍程度和频率具有扎实的了解常常是重要的。可选择那些很可能良好响应的患者用于所谓“患者分级”方法中。基于此信息，可以针对给定的严格的标志物谱来估计可用人群的规模。对经保存组织进行的回顾性研究例如允许在临床阶段设计必须确定之前快速并较早地测定那些参数。
本发明的另一目的是提出用于这些诊断/治疗/监测/预后/患者分级目的的特异性生物标志物测定，以及使用这些特异性生物标志物测定进行诊断/治疗/监测/预后/患者分级的方法。
因此，根据第一方面，本发明涉及用于确立对癌症(或一般而言的疾病/功能失调)进行诊断/治疗/监测/预后/患者分级之生物标志物测定的方法，其包括下列步骤：
(a)基于对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的组织样品蛋白质组以及血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中蛋白质/肽成分浓度(丰度)的测量，并定性地选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示明显差异行为的那些作为潜在的候选蛋白质/肽生物标志物，从而鉴定出潜在的候选蛋白质/肽生物标志物。如上指出地，在此步骤中，使用非人样品不是必需的，此步骤也可以使用人来源的样品，如人组织、近端液等。
任选地，此步骤之后可以进行步骤(b)：通过对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中潜在的候选蛋白质生物标志物进行定量质谱测量，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的定量差异行为的那些作为候选蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出的潜在的候选蛋白质/肽生物标志物进行验证。当然，在此验证步骤中，质谱仅是一种测量方式并且也是优选的测量方式。也可以使用与最终用于诊断/预后/治疗之方法类似或相同的不同方法(例如使用亲和试剂)。
然后进行步骤(c)：通过对来自健康人个体以及来自患癌人个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中的候选蛋白质生物标志物进行质谱测量和/或基于抗体的测定，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的和/或基于亲和试剂之测定(优选基于抗体之测定)可测得的差异行为的那些作为蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出或者任选地步骤(b)中经验证的候选蛋白质/肽生物标志物进行确认；
(d)应用统计学方法找出经步骤(c)确认的单个或成组蛋白质/肽生物标志物作为用于检测癌症患者之特征标记。
优选地，基于亲和试剂的测定是如上所述的基于抗体的测定方法/方式，并且例如选用酶联免疫吸附测定(ELISA)或多重微珠阵列测定(Multiplex Bead Array Assay)或其它用于测量特定蛋白质浓度的方法。
如上所述，所述方法不仅可用于测定癌症生物标志物***，还可用于测定针对生物体之其它疾病或功能失调类型的生物标志物***。在上述方法(以及下文讨论中)的这些情形中，表述“癌症”(例如，针对样品来说)实质上可以被表述“患病”或“功能失调”所替代。
因此，本发明的一个主旨是提高针对检测(***)癌症之非侵入性诊断方法的准确性，另一方面是鉴定出用于临床实践的新的治疗性/成像用靶标。我们已建立了针对(***)癌症生物标志物和/或药物靶标鉴定的方案，其总结在图1中，在下文中将进行详细论述。该方法基于三个主要方面：
(I)基于使用遗传限定小鼠模型在体内最初鉴定出候选生物标志物和/或药物靶标、而后在人临床样品中进行验证的转换方法。
(II)我们实验室建立的用于分离、鉴定和定量N-连接糖蛋白的领先的基于质谱之方法和生物信息学方法，以及
(III)找出用于检测***癌症患者的特定特征标记的多变量统计学方法。
根据所提出方法的第一优选实施方案，其应用于***癌的诊断。为此目的，所述癌症样品蛋白质组选用患***癌个体的样品蛋白质组。此外，组织样品为***组织样品，其中这些可以是局限性或非局限性***癌的样品。相应地，选择衍生的蛋白质/肽生物标志物用于诊断***癌，可用于治疗***癌或监测***癌之治疗。
根据所提出方法的另一实施方案，在步骤(a)中，来自样品蛋白质组的蛋白质均选用糖蛋白(优选N-连接糖蛋白)，因为这些蛋白质构成了与癌症药物靶标和生物标志物发现高度相关的蛋白质组亚类。
优选地，在所述步骤(a)的第一步中，对相应样品的蛋白质组进行消化(优选通过使用胰蛋白酶和/或Lys C(然而，其它消化***也是可使用的)来实现)，随后使用固相提取进行提取(优选使用SPEG法，其在下文中将更详细地论述)。相应地，所测定的生物标志物优选为N-连接糖蛋白和/或其肽片段。
理论上，至少对于步骤(a)以及特别地针对其组织样品时可使用细胞培养***。但是，为了更真实地模拟人疾病或功能失调的复杂性，优选地选择来自体内来源的样品，并且最优选地，所述非人哺乳动物个体选用小鼠，优选地，在分析和/或进一步处理蛋白质组之前，对步骤(a)中样品的鼠***组织进行灌流以完全去除***组织中的血液(在其它疾病或功能失调的情形中，可以对相应的组织或器官作类似处理)。
如上文已指出地，由于几个原因，因此动物模型是优选的。该优选方式的三个主要原因如下所述：
-样品是同质的，即样品来源的个体在遗传上相同并具有相同的病变
-病变对应于在人癌症中观察到的病变，因此准确地模拟肿瘤发展
-重现性：可以一再制备非常类似的样品，而这对于人来说是不可能的
-限定的干扰：在人中，我们无法控制导致癌症的干扰。在动物模型中，可以组织特异性和时间特异性的方式施加单个或组合的干扰。
在步骤(a)中仅鉴定出蛋白质/其片段之后，优选地，仅选择在健康和癌症样品来源之间显示非常明显之差异行为的蛋白质/其片段。为此目的，观察所测量信号的差异行为(丰度差异)，仅选择那些显示足够差异行为的信号(对应于特定蛋白质/其片段)用于下一步的进一步评估。
差异行为可以是这样的情形，即当比较健康与癌症样品信号时，特定信号充分地增加/降低；然而，也可以是另一种情形，即在癌症或健康样品信号中没有信号，但分别在健康或癌症样品信号中有清晰可测的信号。因此，根据一个优选的实施方案，确定步骤(a)中存在充分之差异行为的选择标准选自以下的组：
在***组织和血清中受调节的生物标志物；在***组织中受调节并在血清中检出的潜在生物标志物；在***组织中受调节并分泌的潜在生物标志物；仅在癌症小鼠之***组织和血清中检出的潜在生物标志物；***特异性的并在癌组织或血清中受调节的潜在生物标志物；***特异性的并且分泌的潜在生物标志物；在***组织或血清中高度受调节的潜在生物标志物，优选地差异倍数大于4；基于现有知识选择的潜在生物标志物，优选地特征在于已知其在癌症发展中的生物学功能；或者其组合，优选地使用这些标准中至少五个或最优选地使用所有的组合。在这些优选的具体标准中，以下标准的组合能得到可最终用于人诊断/治疗的生物标志物***：在***组织和血清中受调节的生物标志物；在***组织中受调节并在血清中检出的潜在生物标志物；在***组织中受调节并分泌的潜在生物标志物；在***组织或血清中高度受调节的潜在生物标志物，优选地差异倍数大于4；基于现有知识选择的潜在生物标志物，优选地特征在于已知其在癌症发展中的生物学功能。
优选地，如果健康样品信号与癌症样品信号之间的差异倍数大于1.5或小于0.75，则进行选择(选择意味着相应的蛋白质/其片段(意指蛋白质或该蛋白质的片段)将进入下一步骤)。这特别适用于上述选择标准中的前三项。
典型地，在步骤(a)中，第一步通过使用(鸟枪法)质谱技术来鉴定样品中蛋白质/经消化蛋白质的肽，第二步使用液相色谱/质谱联用技术(优选无标记的定量技术)用于鉴定健康和癌症样品之间的性质差异(通常为丰度差异)。优选地，在步骤(a)中，通过使用将质谱信号对应于特定蛋白质/蛋白质片段的数据库信息，将质谱测得的蛋白质/蛋白质片段信号归于相应的蛋白质。
根据另一优选的实施方案，在步骤(b)中，通过使用定量内部标准(优选为专门合成的内部标准)进行绝对定量。
还优选在步骤(b)和/或步骤(c)中使用串联质谱技术，优选为选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)，优选与液相色谱联用，作为质谱方法。关于使本说明书内容在合理范围内的这些技术及其定义和参数，参考出版物B.Domon和R.Aebersold，Mass Spectrometry andProtein Analysis(Science 312，121(2006))以及其中引用的相应参考文献。关于用于分析蛋白质组的这些分析工具，这些文献的公开内容明确包括在本说明书内。
本发明还涉及可使用上述方法确立的或使用此类方法特别确立的癌症诊断生物标志物测定和/或治疗性靶标。特别地，这样的生物标志物测定和/或治疗靶标可以在对相应方法之说明的背景下由下文进一步列举的集合组成，所以例如针对局限性***癌的癌症诊断/治疗生物标志物测定(用于监测局限性***癌，特别是用于与良性***增生相区分)可以基于对人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中选自从以下衍生的蛋白质和/或蛋白质片段中至少两种、优选至少三种之浓度的联合测量：ASPN、VTN、AOC3、LOX、PGCP、PSAP、THBS1、CFH、CLU、KIT、TFRC、LGALS3BP、GOLPH2、HYOU1、CTSD、OLFM4、AKAP13、CP、CPE、CPM、ICAM1、MSMB、TM9SF3、GALNTL4。整个说明书中一般使用的基因名称(此处给出的)、条目名称、蛋白质名称(缩写)和登录号根据UniProt Consortium(www.uniprot.org)定义，其包括欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)、瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics，SIB)和蛋白质序列数据库资源(ProteinInformation Institute，PIR)。优选地，使用串联质谱技术进行测量，优选地使用选择反应监测(SRM)，更优选与液相色谱和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)联用，以检测这些蛋白质/其片段。
本发明还涉及使用上述方法可确立的或使用此类方法特别确立的癌症诊断生物标志物测定和/或治疗性靶标。特别地，这样的生物标志物测定和/或治疗靶标可以在相应方法之说明的背景下由下文进一步列举的集合组成，所以例如对局限性***癌的癌症诊断/治疗生物标志物测定可以基于ASPN和任选地VTN与以下之一种的组合：AOC3、LOX、PGCP、PSAP、THBS1、CFH、CLU、KIT、TFRC、LGALS3BP、GOLPH2、HYOU1、CTSD、OLFM4衍生的蛋白质/其片段。
此外，本发明涉及用于诊断、治疗和/或治疗性监测(人体)疾病或功能失调(优选癌症，最优选***癌(局限性的或非局限性的))的癌症诊断/治疗生物标志物测定，其包括对人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中至少两种、优选至少三种或至少5种蛋白质/肽生物标志物(例如根据上述方法进行测定)。所述测定可以例如是基于抗体的测定，如酶联免疫吸附测定，但也可以是LC-SRM测定。
为了提高这种癌症诊断生物标志物测定的可靠性，可以将其与基于亲和试剂的测定(例如用于检测另外***(如***特异性抗原(PSA)的基于抗体的测定(如酶联免疫吸附分析(ELISA))联用)。另外，此时也可使用例如利用微珠技术的针对一系列抗体的多重测定技术。
本发明还涉及通过测量(优选联合测量)人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中的ASPN衍生之蛋白质/其片段以及VTN衍生之蛋白质/其片段的浓度来诊断局限性***癌的方法。为了提高准确性，优选进行另一种(或甚至几种)测量，即测量选自从以下衍生的蛋白质/其片段：AOC3、LOX、PGCP、PSAP、THBS1。如果与PSA测量联用，则另外的蛋白质/其片段可额外选自：CFH、CLU、KIT、TFRC、LGALS3BP、GOLPH2。
优选地，在这样的方法中，所述测量使用通常与在前的液相色谱技术联用的串联质谱技术(优选地使用选择反应监测(SRM))来进行。作为替代或另外地，可以使用基于抗体的测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))来检测这些蛋白质/其片段。可以使用组合的方法，因此例如一个***(或一组***)可以使用SRM(如果例如ELISA不可用时)来测定，而其余的***可以使用基于抗体的技术(例如ELISA技术)来测定。
在这样的方法中，通常对于局限性***癌的阳性诊断来说，ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于55ng/ml，优选地高于60ng/ml，任选地，与此同时，VTN衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于3500ng/ml，优选地低于3300ng/ml。
如果(根据优选地)测量另一种上述额外***，
则AOC3衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于250ng/ml，优选地低于220ng/ml，
和/或LOX衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于580ng/ml，优选地低于550ng/ml，
和/或PGCP衍生之蛋白质/片段的浓度须高于550ng/ml，优选地高于570ng/ml，
和/或PSAP衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于33000ng/ml，优选地低于32500ng/ml，更优选地低于32250ng/ml，
和/或THBS1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于12500ng/ml，优选地高于13000ng/ml，更优选地高于13500ng/ml，
和/或LGALS3BP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于390ng/ml，优选地高于400ng/ml，
和/或GOLPH2衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于80ng/ml，优选地高于90ng/ml，
和/或HYOU1衍生之蛋白质/其片段的浓度必须高于35ng/ml，优选地高于40ng/ml，
和/或CTSD衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于32ng/ml，优选地低于25ng/ml，
和/或OLFM4衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于20ng/ml，优选地低于15ng/ml，
优选地，在这样的方法中，使用联合测量人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中选自从以下衍生的至少3种蛋白质和/或蛋白质片段的浓度：ASPN、HYOU1、CTSD、OLFM4来进行测量，用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测局限性***癌以与良性***增生相区别。对于诊断/监测来说，优选地使用基于亲和试剂的测定(优选基于抗体的测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA))额外地对人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中的***特异性抗原(PSA)的浓度进行测量。对于阳性诊断来说更优选地，***特异性抗原(PSA)的浓度须高于2ng/ml，优选地高于4ng/ml。
在此背景下，对于局限性***癌的阳性诊断或监测来说优选地，ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度因而须高于55ng/ml，优选地高于60ng/ml；和/或HYOUI衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于40ng/ml；和/或CTSD衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于32ng/ml，优选地低于25ng/ml；和/或OLFM4衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于20ng/ml，优选地低于15ng/ml。
应指出，针对上文给出的阈值浓度以及下文的详述，这些可取决于特定的测量技术，例如本文所用的方法(即SRM)将测量所有种类(如游离的和结合的种类)，而例如基于抗体的测定(如ELISA)则可能能够区分这两种形式，导致如果使用后一种方法的话则出现不同的阈值浓度。因而本文给出的数值特别地涉及使用SRM方法的测量值，如果使用不同的方法，则可能需要类推转换。但这种转换是在本领域技术人员技能范畴之内的。
本发明还涉及通过测量(优选联合测量)人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中的ASPN和CTSD和THBS1和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白质/其片段的浓度并优选地与测量选自从PSAP、GSPT1、CEACAM1、HYOU1、EFNA5、KIT衍生之另一种蛋白质/其片段联用的极高准确性方法，用于诊断转移性***癌。
优选地，如上述用于诊断局限性***癌的方法所述，使用串联质谱技术(优选地使用选择反应监测(SRM))进行测量，更优选地与液相色谱和/或基于抗体的方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA))联用以用于检测这些蛋白质/其片段。
对于非局限性(转移性)***癌的阳性诊断来说，
ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于60ng/ml，优选地高于65ng/ml，最优选地高于68ng/ml，并且同时
CTSD衍生之蛋白质/片段的浓度须高于120ng/ml，优选地高于130ng/ml，最优选地高于133ng/ml，并且同时
THBS1衍生之蛋白质/片段的浓度须低于12000ng/ml，优选地低于11500ng/ml，最优选地低于10750ng/ml，并且同时
GALNTL4衍生之蛋白质/片段的浓度须高于1400ng/ml，优选地高于1600ng/ml，最优选地高于1650ng/ml，并且同时
VTN衍生之蛋白质/片段的浓度须高于3000ng/ml，优选地高于3150ng/ml，最优选地高于3300ng/ml。
如果(根据优选地)测量另一种上述额外***，
则PSAP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于33000ng/ml，优选地高于34000ng/ml，
和/或GSPT1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于450ng/ml，优选地高于500ng/ml，更优选地高于510ng/ml，
和/或CEACAM1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于38ng/ml(此阈值是唯一根据ELISA测定计算出的值)，
和/或HYOU1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于80ng/ml，优选地高于89ng/ml，
和/或EFNA5衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于60ng/ml，优选地高于65ng/ml，
和/或KIT衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于90ng/ml，优选地高于95ng/ml。
如上所述，无论对于局限性或非局限性***癌症诊断来说，将对上述***的测量与对血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中另一些参数(其并非上述生物标志物测定方法的结果)的测量联用可以是有利的。例如，对于诊断来说，可以使用基于抗体的测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))来额外地测量人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中的***特异性抗原(PSA)，其中对于阳性诊断来说，***特异性抗原(PSA)的浓度通常须高于2ng/ml，优选地高于4ng/ml。
本发明另外的实施方案列在后附的权利要求中。
附图说明
在附图中显示了本发明的一些优选实施方案：
图1是用于发现、验证和确认生物标志物之综合蛋白质组方法的总览。该图分为两个主要部分：第一部分是使用动物模型的发现和验证阶段，第二部分是使用人患者样品的确认阶段；斜体数字表示经鉴定并考虑用于下一步的糖蛋白数；其中a)：从来自健康和癌症小鼠的组织和血清中选择性地富集N-糖肽，使用来自CaP小鼠模型的***组织来体内发现CaP特异性的特征标记；这产生了一组785种糖蛋白作为后一步骤的来源；对于同样的鼠组织和血清样品进行基于质谱的无标记的定量；这得到352种糖蛋白在癌症和良性样品间比较的相对定量；然后选出164种符合标准的糖蛋白用于进一步的研究；其中b)：这些候选生物标志物中的41种可以在小鼠血清中得以确认，并且其中c)：通过基于质谱的选择反应监测(SRM)和ELISA在人患者中确认了43种候选物；通常，人与动物步骤间的界限是灵活的；例如，也可以在人样品中进行验证步骤，如果这样的收集确实有用的话；
图2显示了小鼠糖蛋白质组目录(Mouse Glycoproteome Catalog)的总览，其中在小鼠***组织和血清中鉴定出的蛋白质数目用文氏图(Venn diagram)显示；下方显示了可进行定量的蛋白质数；以及
图3显示所选候选物在多参数方法中的区分准确度；遵循通过统计学软件得到的规律对患者进行分类；正确预测的百分数定义为该模型的准确度；如上所示，基因名称根据UniProt Consortium(www.uniprot.org)来定义，其包括欧洲生物信息研究所(EBI)、瑞士生物信息研究所(SIB)和蛋白质序列数据库资源(PIR)；第一行中阴影表示的条目指示可在一个测定内互换的***。
对优选实施方案的详细描述
参考附图(其目的在于示意本发明的一些优选实施方案，而非限制本发明)，图1显示用于发现、验证和确认生物标志物之综合蛋白质组方法的总览。该图分为两个主要部分：第一部分是使用动物模型(小鼠)进行的发现和验证阶段(a)和(b)，第二部分是在人患者样品中的确认阶段(c)。
在以下实施例中，所述方法用于确定针对***癌的生物标志物。如上所述，这不应理解为本发明的实际要旨，因为本方法可以等同地应用于其它类型的癌症(例如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等)，并且它还可以等同地一般性应用于其它类型的疾病或功能失调(例如多尿症(diabetes)(糖尿病(mellitus)或其它类型)；神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病、克雅氏症；自身免疫病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎；感染性疾病，如疟疾、HIV；心血管疾病，例如高血压、动脉粥样硬化。如上所述，使用动物模型的主要优势在于可以施加特定的、限定的干扰，并测量这些干扰的结果。同样的干扰还可能与其它类型的癌症相关，这意味着可以将标志物视为所引发之干扰的合理结果，而不是像“疾病相关的”这样的一般性表述可表示的。
在最初的发现阶段，使用健康小鼠和***癌小鼠的***组织样品、血清样品或者两者，因此有四个不同系列的实验。对于差异行为的确定，仅对健康/癌症小鼠的组织样品进行比较，另一方面对健康/癌症小鼠的血清样品进行比较。
在第一步骤(a)中，使用胰蛋白酶对组织(如下详述进行制备)和血清样品进行消化，从相应蛋白质组的消化产物中选出N-连接的糖基化蛋白质，并使用SPEG技术进行提取(下文有详细描述)。
然后使用质谱(特别地“鸟枪法”)进行随后的糖蛋白鉴定，在该阶段无需确定差异行为。这样在***组织中总共检测到532种糖蛋白，在血清中检测到253种糖蛋白。总共检测到785种糖蛋白，这是因为有110种蛋白质同时在组织和血清中检测到(如图2所示)。
下一步使用无标记的定量测定，其目的在于检测蛋白质片段信号的差异行为。该实验是液相色谱/质谱联用的实验，其中质谱测量根据色谱的洗脱谱来进行。使用此实验，可以追踪健康/癌症样品间的差异行为。该无标记定量步骤中未显示差异行为的那些信号/蛋白质片段从上述785种糖蛋白中排除，得到352种经定量的蛋白质，其中279种来自组织样品，160种来自血清样品(如图2所示)。
对这352种经定量的蛋白质进行进一步地选择，仅保留那些显示明显差异行为并符合下表1中所列及讨论的8项依据中至少一项的蛋白质。使用这些依据进行筛选后，得到164种潜在的候选生物标志物***，其通过使用电子注解(electronic annotation)将信号对应于特定的糖蛋白。
在第二步骤(b)(其为任选的步骤)中，使用非人***进行验证或进一步定性，其中使用最终生物标志物测定方法将要使用的最终分析工具。在此步骤(b)中，相应地仅对健康/癌症小鼠的血清进行分析，再次对其进行消化并按照步骤(a)中所述提取糖蛋白，但是随后使用选择反应监测(SRM)(即液相色谱/串联质谱方法)对***进行绝对定量，其使用专门提供(合成)的内部标准进行绝对定量。
主要由于操作的原因，在进入步骤(b)的164个***中仅有41个可被绝对定量。相应的41个***列在表2中，并在下文有更详细的论述。
因此，对于下一步来说，使用来自步骤(a)的所有164个***进行最终的确认步骤(c)。步骤(b)的结果通过使用RT-PCR、免疫组化、Western印迹进行验证。
在步骤(c)中进行与步骤(b)中几乎相同的步骤，但此时使用人来源的健康/癌症个体的血清样品。根据SRM测定，得到37个候选物。可能时，使用现有的ELISA测定对进入步骤(c)的164个候选物进行进一步地验证，得到另外11个可能的候选物。
由于某些***来自SRM验证以及来自ELISA确认，因此最终得到43个候选生物标志物***。它们列在表3中。
理论上，可以将这些中任何一个以及可能地与一个或几个联用以用于检测***癌。
由于通过同时保持尽可能高的准确性来减少必需的测量数，因此对全部43个***应用统计学方法(更详细的讨论见下文)，这与患者的数据收集相关联，得到图3中给出的最终测定。
图3A)中给出了5个准确度特别高的测定，并注意到，在所有测定中都存在ASPN和VTN。因此，相应地，这些基因衍生的糖蛋白或这些糖蛋白的片段高度指示出良性***增生(BPH)和局限性***癌(locPCa)之间的差别。相应的准确度高于80％，因此约比现有技术中PSA方法的准确度高出20％。
额外引入使用ELISA的PSA测量，利用统计学还发现了区分BPH与locPCa的9个生物标志物测定，如图3B)所示。再次地，在所有这些***中均存在ASPN和VTN衍生的糖蛋白。这些联合测量的准确度比未采用PSA测量的方法又高出10％，最终得到针对***癌检测的迄今尚未到达过的极高准确度。
额外引入使用ELISA的PSA测量和更多数据，利用统计学还发现了区分BPH和locPCa的5个生物标志物测定，如图3C)所示。在这些***的每一个中，ASPN、OLFM4、HYOU1、CTSD衍生的糖蛋白中有三个存在于***中。相应的准确度仍高于80％，因此约比现有技术中PSA方法的准确度高出20％。
最后，图3D)中给出了区分locPCa与metCPa的生物标志物测定的统计学结果。在每个测定中使用六个***的联合测量，可达到100％的准确度。
上文表明，本发明所提出的方法不仅为靶向开发高准确度的生物标志物测定提供了强大的工具。此外，其还表明，针对***癌的具体情形，本发明确立的生物标志物测定显示出预料不到的高准确度，其超出了迄今文献中所报道的任何准确度。
实验细节：
(I)转换方法：该转换方法基于在***癌小鼠模型中对感兴趣的候选生物标志物进行最初鉴定，并将这些候选物在人临床样品中进行确认。为了鉴定将要用于临床中的候选生物标志物(称为“诊断或治疗靶标”)，我们开始分析来自患***癌的遗传限定小鼠(Pten条件性敲除(cKO)，例如见US 2006/0064768)以及具有完好的Pten等位基因并且未患这种肿瘤的对照小鼠的***组织和血液。
使用小鼠模型的依据：我们决定使用遗传限定的Pten条件性敲除模型是因为这些小鼠在肿瘤抑制基因Pten缺失后发生早期上皮***癌。其表型与人局限性***癌非常相关，因此成为鉴定能够区分人局限性***癌和良性增生病变(良性***增生或BPH)的新型生物标志物的理想起点。并且，使用Pten cKO小鼠模型允许鉴定将要特异性用于对具有PTEN突变或任何源自PTEN信号途径中突变之失衡的患者进行分级的治疗性/成像靶标和生物标志物。使用小鼠模型有利于对候选生物标志物进行最初鉴定，因为***组织非常同质性，并且主要变量(如环境条件和时间进程)可以被控制，其与高度异质性的人组织不同。令人感兴趣的是，与人相比，小鼠中***癌组织体积与血液总体积的比值要高出40～40000倍。这当然是内在的优势，因为预期该模型中血液蛋白质组中的变化比人患者样品中更容易发现。最后，只有鼠组织可以为了消除血液污染物而有效地进行灌注(见下文)。组织中的血液蛋白质污染物常常掩盖浓度特别低的蛋白质的鉴定。并且，灌注后的组织中没有血液使得可以进行没有任何潜在偏向性的比较蛋白质组学(血液-组织)(见表1，依据1、2、4、7)。
表1：选择感兴趣的蛋白质用于在人血清中进行验证。选择在小鼠血清和组织中检测出的165种糖蛋白通过靶向质谱进行验证，并且随后在人临床样品中进行确认。本说明书中一般性使用的基因名称、条目名称、蛋白质名称(缩写)和登录号根据UniProtConsortium(www.uniprot.org)来定义，包括欧洲生物信息研究所(EBI)、瑞士生物信息研究所(SIB)和蛋白质序列数据库资源(PIR)。所注解的或预测的细胞定位根据EmanuelssonO，Brunak S，von Heijne G，Nielsen H.(2007)Locatingproteins in the cell usingTargetP，SignalP and related tools，Nat Protoc，2，953-71。
使用小鼠和非细胞培养***的依据：蛋白质组技术容易应用于体外细胞系，而使用体内模型需要更复杂的操作和最初的故障排除(trouble-shooting)。但是，我们决定使用体内模型，原因是这比体外模型更接近地模拟人疾病的复杂程度。因此，本文所示的方法是独特的，因为目前几乎没有筛选方法应用于新近分离的器官。
组织和血液提取步骤：对小鼠进行麻醉，通过左心室穿刺取血。然后对小鼠进行心脏灌注。这使得***组织中的血液完全去除。然后将组织样品剪碎，将纯的***组织迅速进行速冻并在液氮存在下使用研钵和研杵进行研磨。从血液中提取血清并保存在-80℃备用。
(II)先进的质谱(MS)和生物信息学技术：关注于N-连接的糖蛋白质组的依据：为了找到候选的生物标志物，我们决定关注于特定的高度相关的蛋白质组亚类——N-连接的糖基化蛋白质。蛋白质糖基化很早就被认为是常见的翻译后修饰。典型地，聚糖连接至丝氨酸或苏氨酸残基(O-连接的糖基化)或连接至天冬酰胺残基(N-连接的糖基化)。N-连接的糖基化位点一般落入NxS/T序列基序中，其中x代表除脯氨酸以外的任意氨基酸。蛋白质的糖基化是定位于细胞外空间中蛋白质的特征性翻译后修饰。这意味着，绝大多数特异性分泌或由肿瘤脱落并释放到血流中(这使它们成为很有价值的候选生物标志物)的蛋白质被糖基化。此外，糖蛋白的富集使得能够发现那些特别低浓度存在的感兴趣的候选物，这是因为组织样品中的高丰度、非糖基化和非相关的蛋白质(如细胞骨架蛋白)以及血清样品中的白蛋白(以35～50mg/ml存在)被排除在测量之外。
N-连接的糖肽提取步骤和定量：为了鉴定N-连接的糖蛋白，我们使用从组织和血清中固相提取N-糖肽的方法(SPEG)，根据Zhang，H.，Li，X.J.，Martin，D.B.和Aebersold，R.(2003)Identification andquantification of N-linked glycoproteins usinghydrazide chemistry，stableisotope labeling and mass spectrometry；NatBiotechnol 2l，660-666，其涉及SPEG的公开内容明确地包括在本说明书中。通过糖肽的聚糖部分将其与固相支持物偶联。然后洗去非糖基化的肽，并可使用PNGase F酶特异性地释放N-糖肽。该方法同样可以应用于组织和血清。
所使用的质谱设备设置(LTQ-FT设备)的高质量准确性和保留时间重现性连同蛋白质组学分析软件包trans proteomic pipeline(TPP)和SuperHirn(见例如：Mueller等，An Assessment of Software Solutions forthe Analysis of Mass SpectrometryBased Quantitative Proteomics Data.JProteome Res(2008)卷7(1)51-61页)允许对普通的肽特征进行鉴定和直接的无标记定量。从而，对来自不同运行的肽洗脱谱进行比较，根据属于同一蛋白质的N-糖肽计算糖蛋白比例。验证和确认阶段：为了验证我们最初发现阶段的结果，通过选择反应监测(SRM，见例如Stahl-Zeng，J.，Lange，V.，Ossola，R.，Eckhardt，K.，Krek，W.，Aebersold，R.和Domon，B.(2007)High sensitivity detection ofplasma proteins by multiple reactionmonitoring of N-glycosites Mol CellProteomics 6，1809-1817)的靶向质谱在相应的鼠血清中对一系列根据各种标准选择的感兴趣蛋白质进行定量。
这种新方法允许同时检测并定量蛋白质，其灵敏度与经典的免疫检测方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))相当，但优点在于对每种候选生物标志物不需要繁冗的优化步骤以及产生新的抗体。SRM实验如下实现：指定MS/MS片段化之化合物的原始质量，然后特异性地监测单个片段离子。因此，SRM输出可以在非常复杂的基质中进行监测和定量的独特的片段离子。合成对应于靶标N-糖肽(N-glycosite，去糖基化形式的完整蛋白质被N-糖基化的肽)的稳定同位素标记的肽用作内部标准。这允许对小鼠血清中存在的内源性糖蛋白进行绝对定量(表2)
表2：在8周龄和18周龄的对照和患***癌症小鼠的鼠血清中，通过SRM测量41种血清糖蛋白。p值低于0.05表明相应的蛋白质在正常小鼠(n＝3)和患***癌小鼠(n＝3)之间具有统计学显著性的差异。利用8周龄和18周龄小鼠进行实验。基因名称、蛋白质名称(缩写)和登录号如表1中所定义。
通过监测对照小鼠(健康)和患***癌之小鼠(患癌)的血清中特异性针对每种目的肽的片段化通道，进行高度灵敏和选择性的分析。然后，使用标准ELISA技术以及再次使用靶向质谱在人血清中对在小鼠中检测出的潜在生物标志物的人旁系同源物进行验证。
(III)多变量统计学方法：使用多变量方法的依据和优势：与使用单个生物标志物检测相比，特征标记或生物标志物的联合检测可以提高诊断准确性。当同时使用总PSA和游离PSA进行***癌诊断时也可提高准确性。在我们的情形中，我们测量了一系列候选生物标志物，我们现在想知道哪些特征标记可以最佳地区分BPH与局限性***癌(locPCa)或者区分局限性***癌与非局限性***癌(即转移性***癌(metastatic prostatecancer，metPCa))。此外，我们可以找出在所有特征标记中共同具有的生物标志物，使其在知识产权方面具有很高价值。为了基于生物标志物特征来使患者分类，我们进行了二次判别分析(quadraticdiscriminance analysis)。所述判别分析的目的是确定一个规则，基于在个体中测量的独立变量(生物标志物)，通过所述规则将该个体划归到2个或更多组(例如BPH和locPCa)之一中。根据对所有类别已知的个体的变量分析，对描述此规则的参数进行计算。为了估计判别规则的偏向性，我们应用Jacknife留一法交叉验证(Jacknife leaveone-out crossvalidation)。使用统计学软件包SYSTAT 12和SPSS14.0进行分析。
结果：
最初，我们从对照和患癌小鼠经灌注的***组织和血清中提取N-糖肽。我们鉴定了来自***组织的总共642种糖蛋白和来自血清的253种糖蛋白。其中110种蛋白质被共同检测到。从而，我们可以得到包含总共785种糖蛋白的组。从最初的小鼠糖蛋白组中，我们可以对来自组织的279种糖蛋白和来自血清的160种糖蛋白进行定量，比较来自癌症小鼠及其各自对照的样品(图2)。在这些蛋白质中，认为满足表1中所列之至少一项依据的165种糖蛋白是潜在的生物标志物，因此选择用于进一步的验证。
使用SRM对鼠血清样品进行分析，我们可以从165种最初候选物中验证并定量41种(表2)。
利用52个人血清样品，对46种候选生物标志物(其已通过SRM在小鼠血清中进行了测试，或者在最初发现阶段中从鼠***组织中显示为有前景的候选物)进行进一步地确认。这通过应用ELISA和SRM进行。
表3：在人血清中测量的46种血清糖蛋白的列表。所选择的候选生物标志物通过SRM或ELISA进行分析。基因名称、蛋白质名称(缩写)和登录号如表1中所定义。
统计学分析
进行统计学分析后，我们可以鉴定“3-生物标志物”的特征标记，包含Asporin(ASPN)、玻连蛋白(VTN)和膜铜胺氧化酶(AOC3)。该特征标记在区分BPH(n＝15)和locPCa(n＝16)患者时的准确度为81％，这意味着使用我们的“3-生物标志物”的特征标记，所分析患者中有81％诊断正确。发现AOC3的贡献最弱。因此，我们用其它潜在生物标志物替换此蛋白质，并使其保持相似或更高的准确度(≥80％)。下列蛋白质可以该方式单独地加入：LOX、PGCP、PSAP、THBS1(图3A)。
对PSA本身的区分作用也进行了测量，其在区分BPH(n＝15)和locPCa(n＝16)时得到71％的准确度。
此外，我们将PSA数据加入到ASPN和VTN的核心特征标记(coresignature)中。通过包括下列蛋白质中的一种实现了高达90％的准确度：AOC3、CFH、CLU、KIT、LOX、TFRC，THBS1、LGALS3BP、GOLPH2(图3B)。
使用更多的数据进行统计学分析后，我们可以进一步地鉴定“5-生物标志物”特征标记，其包含Asporin(ASPN)、组织蛋白酶D(CTSD)、缺氧上调蛋白1(HYOU1)和嗅介蛋白-4(OLFM4)。所述特征标记在区分BPH(n＝35)和locPCa(n＝41)患者时准确度为87％，这意味着使用我们的“5-生物标志物”特征标记，所分析患者中有87％诊断正确。对PSA本身的区分作用也进行了测量，其在区分BPH(n＝41)和locPCa(n＝64)时得到72％的准确度。
另外，通过在每种情形中仅移除这4种蛋白质中的一种，实现了高达83％的准确度(图3C)。
使用同样的数据集合，并且在从表3的***中选择时应用严格程度略低的标准，重新提炼了一组生物标志物，归纳在表4中。测定表4所给出***之至少3种的组连同测量PSA(ELISA)得到约为80％或甚至更高的准确性。选择表4所给出***之至少4种连同测量PSA(ELISA)得到约85％或更高的准确性。
表4所给出之每种***的阈值表示高于或低于(如所示)该阈值时可得出阳性诊断的浓度阈值。如果一个测定中所有标志物(例如，选自表4的3种生物标志物的组)的浓度都超出了这些浓度值，那么可以得出具有上述准确度的阳性诊断。
表4：经过统计学分析(BPH(n＝35)和locPCa(n＝41))后，人血清中测量到的15种血清糖蛋白的重新提炼列表。基因名称、蛋白质名称(缩写)和登录号按照表1中所定义。在第一列中给出了ng/ml为单位的基本浓度阈值，在第二列中给出了ng/ml为单位的优选浓度阈值。其中，OD值在405nm处测量，使用商品化的抗体给出相对数值(CPE：R&Dsystems，多克隆：Nr.AF3587和R&Dsystems，单克隆：MAB3587；MSMB：R&Dsystems，多克隆：Nr.AF3780和Abnova，单克隆：H00004477-M08)。
b)使用含有下列生物标志物的生物标志物特征标记，我们可以在100％的情形中正确地区分locPCa(n＝16)和metPCa(n＝21)的患者：Asporin(ASPN)、玻连蛋白(VTN)、组织蛋白酶D(CSTD)、多肽N-乙酰-氨基半乳糖基转移酶GALNTL4、激活肽前体(PSAP)和凝血酶敏感素-1(THBS-1)。发现PSAP的贡献最小。除去PSAP，判别分析仍然可以获得97％的准确度。因此，我们用其它潜在生物标志物替换此蛋白质，并且提高了准确度(＞97％)。下列蛋白质可以这样单独地加入：CEACAM1、EFNA5、GSPT1、HYOU1、KIT(所有均获得100％的准确度)(图3)。
应当指出，表3中给出的任何***(优选两种糖蛋白联合，最优选至少三种(或恰好3种)、至少4种(或恰好4种)或至少5种(或恰好5种)糖蛋白的联合)均可构成本发明涵盖的测定。上述特异性的经统计学评估的***在这些统计学测试中针对诊断方面可显示非常有效。对于不同的诊断/预后/治疗方面或使用不同统计学评价方法，还可能使用不同的组合，并且也应视为属于本发明。

Claims (11)

1.联合检测人血清、血浆或血液本身中选自具有其后括号中所示登录号的以下蛋白质中至少3种的浓度的试剂在制备用于诊断和/或用于监测局限性***癌的诊断工具中的用途：ASPN(Q9BXN1)、HYOU1(Q9Y4L1)、CTSD(P07339)、OLFM4(Q6UX06)；并且其中为了诊断/监测，使用基于亲和试剂的测定额外地检测人血清、血浆或血液本身中***特异性抗原(PSA)的浓度。
2.联合检测人血清、血浆或血液本身中具有其后括号中所示登录号的以下4种蛋白质的浓度的试剂在制备用于诊断和/或用于监测局限性***癌的诊断工具中的用途，CTSD(P07339)、ASPN(Q9BXN1)、HYOU1(Q9Y4L1)、OLFM4(Q6UX06)；并且其中为了诊断/监测，使用基于亲和试剂的测定额外地检测人血清、血浆或血液本身中***特异性抗原(PSA)的浓度。
3.根据权利要求1或2的用途，其是在制备用于诊断和/或用于监测局限性***癌、用于与良性***增生相区别的诊断工具中的用途。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述基于亲和试剂的测定为基于抗体的测定。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述基于抗体的测定为酶联免疫吸附测定。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中对于阳性诊断来说，***特异性抗原的浓度为高于2ng/ml。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中对于阳性诊断来说，***特异性抗原的浓度为高于4ng/ml。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述基于亲和试剂的测定为基于抗体的测定。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述基于抗体的测定为酶联免疫吸附测定。
10.根据权利要求1或2所述的用途，其中对于局限性***癌的阳性诊断或监测来说：
ASPN(Q9BXN1)蛋白质的浓度为高于55ng/ml，
和/或HYOU1(Q9Y4L1)蛋白质的浓度为高于35ng/ml，
和/或CTSD(P07339)蛋白质的浓度为低于32ng/ml，
和/或OLFM4(Q6UX06)蛋白质的浓度为低于20ng/ml。
11.根据权利要求1或2所述的用途，其中对于诊断和/或用于监测局限性***癌来说，所述***特异性抗原的浓度为高于8ng/ml。
CN200980117399.9A 2008-05-14 2009-05-12 发现用于***癌诊断和治疗之生物标志物和药物靶标的方法及其确立的生物标志物测定 Active CN102027373B (zh)

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