CN112029792B - 一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用，以I型鸭肝炎病毒及鸭脾脏为模板，通过RT‑PCR分别获得VP1和IL‑6基因，连接至PMD18‑T载体后保存备用；利用重叠延伸PCR技术得到VP1‑IL6融合基因，融合基因经双酶切后连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转座子，获得pPIC9‑VP1‑IL6阳性菌株；将表达产物添加LPS后与白油佐剂乳化后制作疫苗后免疫蛋鸡，制备卵黄抗体；本发明成功克隆DHV‑I的VP1及鸭IL‑6基因，并将两种基因构建成融合表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，融合蛋白制备的卵黄抗体保护效果好，具有抗病毒和消炎双重作用。

Description

一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及家禽疫病免疫控制领域，涉及一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法和应用，更为具体的涉及一种pPIC9-VP1-IL6重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用。
背景技术
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种高度致死性传染病。临床上以具有明显神经症状和肝脏肿大、表面呈斑点样出血为特征，其主要侵害6周龄以内雏鸭，尤以2日至3周的雏鸭最为易感，成年鸭有抵抗力。随着近几年中国养鸭业快速发展，该病已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭肝炎病毒包含小核糖核酸病毒科、星状病毒科、嗜肝病毒科3个病毒科的4种病毒，其中小核糖核酸病毒科的I型鸭肝炎病毒(DHV-I)呈世界性分布，毒力最强，感染率最高，危害也最严重。I型鸭肝炎病毒的发生和传播很快，雏鸭感染主要表现为精神萎靡、缩颈、翅下垂、厌食。患病鸭出现神经症状，角弓反张。大量死亡常在3-5d内发生。剖检病变主要集中在肝脏，表现为肝脏肿大、质脆易碎等现象，肝脏颜色暗淡或发黄，表面呈斑驳状；另外，胆囊、脾脏、胰腺等脏器也出现病变。
由于该病主要危害雏鸭，而20日龄以内的雏鸭的免疫***还未发育完全，对雏鸭进行疫苗免疫效果通常不理想，所以对本病最常用的防制方法是用疫苗免疫种鸭，使后代雏鸭获得高水平的母源抗体，从而预防该病。然而，由于种鸭免疫不及时、不规范，或者病毒变异造成雏鸭母源抗体水平不高或者中和效果变差等原因造成了临床发病率居高不下。目前商品代肉鸭普遍在3-4日龄时接种卵黄抗体以预防该病，或者在发病早期紧急接种卵黄抗体进行治疗。然而，临床反应注***制卵黄抗体治疗时常常出现效果不理想的案例。研究发现，鸭肝炎病毒感染急、发病快，感染0.5-1d即可诱导大量的炎性细胞因子表达，造成“细胞因子风暴”，这是雏鸭大批死亡的重要原因。然而，目前的卵黄抗体成份主要为针对鸭肝炎病毒的特异性抗体，即使可以中和病毒，但是并没有消除炎症，对于发病高峰期鸭群中的重症雏鸭依然会快速死亡，这是临床上治疗鸭病毒性肝炎失败的主要原因。因此，如何有效降低雏鸭体内的炎症反应是提高抗体治疗效果的有效解决方法。
炎性细胞因子是一类主要由免疫***细胞生成的具有许多强大生物学效应的内源性多肽，可介导多种免疫反应。炎性细胞在体内过度表达可引起多器官衰竭的症状。研究发现，鸭肝炎病毒感染雏鸭后会诱导多种细胞因子表达量升高，包括IFN-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α等，其中IL-1β、IL-2、IL-6为促炎细胞因子，可以诱导严重的炎症反应。是否抑制这些细胞因子的活性就能够降低鸭体内的炎症反应的强度尚无相关研究，通过何种方式抑制，且抑制哪一种细胞因子活性的治疗效果最佳并不清楚。
因此能否提供一种解决上述鸭肝炎病毒抗体水平不高，同时能够有效降低雏鸭体内的炎症反应的技术方案，成为本领域的技术难题。
发明内容
本发明的主要目的就在于克服上述现有技术的不足，提供一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法和应用，特别提供了一种pPIC9-VP1-IL6重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用，以I型鸭肝炎病毒(DHV-I)及鸭脾脏为模板，通过RT-PCR分别获得VP1和IL-6基因，连接至PMD18-T载体后保存备用；重新设计扩增VP1和IL-6基因的引物，并在引物中加入linker序列及酶切位点，利用重叠延伸PCR技术得到VP1-Linker-IL-6(缩写为VP1-IL6)融合基因。融合基因经双酶切后连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转座子，获得pPIC9-VP1-IL6阳性菌株；将表达产物添加LPS后与白油佐剂乳化后制作疫苗后免疫蛋鸡，制备卵黄抗体。本发明成功克隆DHV-I的VP1及鸭IL-6基因，并将两种基因构建成融合表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，融合蛋白制备的卵黄抗体保护效果好，具有抗病毒和消炎双重作用。
本发明的具体技术方案如下：
(1)以I型鸭肝炎病毒标准株(菌种保藏编号：CVCC AV1540，从保藏机构直接获得)为模板，设计扩增VP1基因的引物，具体为引物Primer 1和2(如SEQ ID NO：6和7所示)；根据NCBI公布的鸭IL-6的预测序列(序列号：XM_027450925.1)设计特异性引物，引物Primer 5和6(如SEQ ID NO：10和11所示)，扩增全长鸭IL-6基因。将VP1和IL-6的序列与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定双酶切位点XhoⅠ和NotⅠ；
(2)重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建，包括以下步骤：
①I型鸭肝炎病毒VP1基因的PCR扩增：
提取I型鸭肝炎病毒标准株(菌种保藏编号：CVCC AV1540，从保藏机构直接获得)RNA反转录为cDNA，将其作为模板，以引物Primer 1和2(如SEQ ID NO：6和7所示)，进行PCR扩增VP1基因，PCR产物胶回收，VP1基因序列如SEQ ID NO：1所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-VP1，保存备用；
②以①中构建的质粒为模板，设计引物Primer 3和4(如SEQ ID NO：8和9所示)，上游引物Primer 3引入Xho I酶切位点序列和HIS标签序列，下游引物Primer 4中引入linker序列，PCR扩增得到VP1-Linker，如SEQ ID NO：2所示；
③鸭IL-6基因的PCR扩增：提取鸭脾脏RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增鸭IL-6基因，所用引物为Primer 5和6(如SEQ ID NO：10和11所示)；PCR反应扩增鸭IL-6基因并胶回收后，连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-IL6重组质粒，保存备用；根据测序结果截取的鸭IL-6基因的编码区(CDs)序列如SEQ ID NO：3所示；
以③中构建的质粒为模板，设计引物Primer 7和8(如SEQ ID NO：12和13所示)，上游引物Primer 7的起点为去除信号肽的IL-6序列，并在引物中引入linker，下游引物Primer 8中引入Not I酶切位点序列，PCR扩增得到鸭IL-6-linker基因，如SEQ ID NO：4所示；
分别胶回收VP1-linker及IL-6-linker基因PCR扩增产物作为模板，以Primer 3(如SEQ ID NO：8所示)和Primer 8(如SEQ ID NO：13所示)为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到VP1-IL6融合基因(如SEQ ID NO：5所示)；
由于VP1-linker及IL-6-linker中均嵌入了linker连接子，可以在后续的扩增中融合在一起；
④将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接至PMD18-T载体质粒，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-VP1-IL6重组质粒；
⑤将重组质粒PMD18-T-VP1-IL6用上述Xho I和Not I限制性内切酶酶切，将切下的VP1-IL6融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化和酶切验证已连接，然后经质粒测序验证***的外源基因序列正确，质粒命名为：pPIC9-VP1-IL6。
其中，扩增鸭IL-6基因时所用引物Primer 5和6(如SEQ ID NO：10和11所示)，是根据NCBI公布的鸭IL-6基因预测序列，从预测序列的5’非编码区和3’非编码区设计引物，在本领域首次扩增出鸭IL-6基因，并获得完整的编码区(CDs)序列信息，将扩增出鸭IL-6基因与NCBI公布的鸭IL-6基因预测序列进行比对，二者序列完全一致，表明本发明首次从活体动物中获得了该序列。
上述I型鸭肝炎病毒VP1的PCR扩增的组分为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2 +)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、cDNA模板1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积为25μL；
其PCR反应条件为：95.0℃5min的预变性；35个循环的变性、退火和延伸I，其中，变性条件为95.0℃30s，退火条件为56.0℃45s，延伸I条件72.0℃1min 30s；72.0℃10min的延伸II；
PMD18-T-VP1重组质粒的连接反应体系：VP1基因4.5μL，PMD18-T质粒0.5μL，Solution I溶液5.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2h。
其中，I型鸭肝炎病毒VP1-linker的PCR扩增的组分为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、PMD18-T-VP1重组质粒1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积为25μL；
其PCR反应条件为：95.0℃和时间5min的预变性；35个循环的变性、退火和延伸I，其中，变性条件为95.0℃30s，退火条件为56.0℃45s，延伸I条件72.0℃1min 30s；72.0℃10min的延伸II。
其中，鸭IL-6基因的PCR扩增的组分为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、cDNA模板1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；
PCR反应条件为：95.0℃5min的预变性；35个循环的变性、退火和延伸I，其中，变性条件为95.0℃30s，退火条件为58.0℃45s，延伸I条件72.0℃90s；72.0℃10min的延伸II；
PMD18-T-IL-6重组质粒的连接反应体系：IL-6基因4.5μL，PMD18-T质粒0.5μL，Solution I溶液5.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2h。
其中，鸭IL-6-linker的PCR扩增的组分为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、PMD18-T-IL-6重组质粒1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；
其PCR反应条件为：95.0℃5min的预变性；35个循环的变性、退火和延伸I，其中，变性条件为95.0℃30s，退火条件为58.0℃45s，延伸I条件72.0℃90s；72.0℃10min的延伸II；
上述采用的Linker连接子为柔性Linker肽段连接子，所述连接子为10个氨基酸，其氨基酸序为：GGGGSGGGGS。
其中，融合基因的PCR扩增的组分为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、IL-6-linker模板0.5μL、VP1-linker模板0.5μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；、
其PCR反应条件为：95.0℃5min的预变性；35个循环的变性、退火和延伸I，其中，变性条件为95.0℃30s，退火条件为58.0℃45s，延伸I条件72.0℃90s；72.0℃10min的延伸II。
其中，PMD18-T-VP1-IL6重组质粒的连接反应体系：VP1-IL6基因4.5μL，PMD18-T质粒0.5μL，Solution I溶液5.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2h；
双酶切PMD18-T-VP1-IL6反应体系：PMD18-T-VP1-IL6重组质粒1.0μg，Xho I内切酶0.5μL，Not I内切酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到一条2692bp及一条1373bp大小的条带，说明成功构建克隆质粒。
pPIC9-VP1-IL6重组质粒的连接反应体系：10×buffer1.0μL，VP1-IL6 2.0μL，酶切后pPIC9 6.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；
双酶切pPIC9-VP1-IL6反应体系如下：pPIC9-VP1-IL6重组质粒1.0μg，Xhol I内切酶0.5μL，Not I内切酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，酶切得到一条8000bp及一条1373bp大小的条带，说明该融合基因成功连接到表达质粒中。
本发明还提供了所述的pPIC9-VP1-IL6重组质粒在毕赤酵母的表达的方法，具体步骤如下：
(1)VP1-IL6融合蛋白在毕赤酵母中的表达：
①将构建的重组质粒用Sal I内切酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；同时将pPIC9空载体质粒以相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中，作为阴性对照；
用LiCl法将两种质粒分别转化GS115感受态细胞，涂布RDB平板，获得重组质粒阳性转化子和空质粒阴性转化子；
②提取两种转化子的基因组作为模板，PCR扩增其Aox1基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴性转化子出现一条2200bp及493bp条带，阳性转化子出现一条2200bp及1816bp条带，表明pPIC9-VP1-IL6重组质粒转化成功；
③将筛选出的阳性转化子和阴性转化子接种至20mL BMGY培养基中，30℃，250rpm震荡培养至OD600＝2-6，离心收集菌体；随后，阳性转化子再加入等体积的BMMY培养基重悬，阴性转化子则加入1/5体积的BMMY培养基重悬；阴阳性转化子于30℃，250rpm震荡培养96h，每隔24h补加甲醇至1％，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96h时取1.0mL培养基分析外源基因表达水平，阴性转化子作为对照，最终确定的最佳收菌时间为96h；
(2)VP1-IL6融合蛋白的鉴定：
抽提诱导后酵母菌体的DNA，以Primer 3其基因序列如如SEQ ID NO：8所示，和Primer 8其基因序列如如SEQ ID NO：13所示，为引物进行PCR反应；
重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳；
以Western-blotting鉴定I型鸭肝炎病毒VP1及鸭IL-6融合蛋白在酵母重组子中的表达。
除此之外，为了方便应用本发明还提供了具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法，具体的是pPIC9-VP1-IL6毕赤酵母表达产物制作卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)疫苗的制备：将pPIC9-VP1-IL6重组毕赤酵母大量诱导表达，培养96h后收获培养基上清；采用分光光度计测定VP1-IL6蛋白浓度，-20℃保存；用无菌水调整VP1-IL6最终的蛋白浓度为100μg/mL，并向溶液中加入5.0μg/mL的LPS作为多克隆抗体激活剂，将上述配制好的蛋白溶液作为水相，与等体积的白油佐剂混合，然后用均质机充分乳化20min，制备而成疫苗；
(2)用制备的疫苗分4次对开产前1个月左右的蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0mL/只；
(3)第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积比3-5:1混合稀释蛋黄液，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于30℃-37℃条件下预温1h；
(4)向蛋黄稀释液中加入PEG6000，混合后PEG6000的质量分数为3-4％，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6h，充分反应；
(5)将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤，其中先用100目，再用200目过滤；
(6)将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48h；
(7)将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛灭活未知病毒并作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗I型鸭病毒性肝炎病毒和鸭IL-6抗体的琼扩试验效价应不低于1:64；
(8)在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，即获得卵黄抗体成品，保存备用，保存温度为4-8℃。
优选的，上述步骤(1)中前期4次免疫完后，后续每隔1.5个月免疫一次；
步骤(2)中的稀释体积比为3.5:1，温度为35℃；
步骤(3)中的PEG6000添加量为3.5％；其中PEG6000可预先用少量温水溶解
与现有技术相比，本发明带来的有益效果是：
本发明在本领域首次成功克隆包含了其完整的CDs序列的鸭IL-6基因，填补了本领域的空白，同时成功克隆I型鸭肝炎病毒VP1基因，并将两种基因构建成融合表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，构建的表达质粒以甲醇为诱导剂，成本低廉，操作方便；
制备的精制卵黄抗体保护效果好，尤其是还具有抗炎、消炎的效果，总体效果优于市售的常规鸭病毒性肝炎卵黄抗体，为雏鸭I型鸭肝炎病毒治疗提供了新的治疗思路，能够显著推动养禽业的发展。
本发明提供了相关序列的序列表，序列表中各序列信息如下：
SEQ ID NO：1：I型鸭肝炎病毒VP1基因序列；
SEQ ID NO：2：I型鸭肝炎病毒VP1-linker基因序列；
SEQ ID NO：3：鸭IL-6基因编码区(CDs)基因序列；
SEQ ID NO：4：鸭IL-6-linker基因序列；
SEQ ID NO：5：融合VP1-IL6基因序列；
SEQ ID NO：6：I型鸭肝炎病毒VP1基因上游引物Primer 1；
SEQ ID NO：7：I型鸭肝炎病毒VP1基因下游引物Primer 2；
SEQ ID NO：8：I型鸭肝炎病毒VP1-linker基因上游引物Primer 3；
SEQ ID NO：9：I型鸭肝炎病毒VP1-linker基因下游引物Primer 4；
SEQ ID NO：10：鸭IL-6基因上游引物Primer 5；
SEQ ID NO：11：鸭IL-6基因下游引物Primer 6；
SEQ ID NO：12：鸭IL-6-linker基因上游引物Primer 7；
SEQ ID NO：13：鸭IL-6-linker基因下游引物Primer 8。
附图说明
图1为I型鸭肝炎病毒VP1基因PCR扩增结果显示图：
图中M为DL2000 Marker，1-2泳道为鸭I型鸭肝炎病毒VP1基因DNA。bp为碱基对单位。
图2为I型鸭肝炎病毒VP1-linker基因PCR扩增结果显示图。
图3为鸭IL-6基因PCR扩增结果显示图：
图中M为DL2000 Marker，1-2泳道为鸭IL-6基因的DNA。bp为碱基对单位。
图4为鸭IL-6-linker基因(去除信号肽)PCR扩增结果显示图。
图5为I型鸭肝炎病毒VP1-IL6融合基因PCR扩增结果显示图：
图中M为DL5000 Marker，1-4泳道为I型鸭肝炎病毒VP1-IL6 DNA。bp为碱基对单位。
图6为PMD-18-T-VP1-IL6质粒酶切显示图：
图中M为DL2000 Marker，1-2泳道为酶切后重组克隆质粒
PMD-18-T-VP1-IL6。bp为碱基对单位。
图7为pPIC9-VP1-IL6质粒酶切显示图：
图中M为DL8000 Marker，1为酶切后的重组表达质粒pPIC9-VP1-IL6。bp为碱基对单位。
图8为毕赤酵母阳性转座子PCR扩增结果显示图：
图中M为DL10000 Marker，1-2泳道为阳性显示图，3为阴性显示图。bp为碱基对单位。
图9为SWISS-MODEL软件分析预测融合蛋白空间折叠状态显示图。
图10为SDS-PAGE显示图：
图中M为Blue Plus Protein Marker，1-4泳道分别为第96h、72h、48h、24h诱导后上清样，5泳道为空质粒阴性对照。KDa为蛋白质分子质量单位。
图11为蛋白纯化图：
图中M为Blue Plus Protein Marker，1泳道阴性对照，2泳道为纯化蛋白样品。KDa为蛋白质分子质量单位。
图12为Western-blotting反应图：
图中M为Blue Plus Protein Marker，1泳道为阴性对照，2泳道为蛋白样品。KDa为蛋白质分子质量单位。
图13为通过ELISA方法检测鸭肝炎病毒感染后鸭血清中IL-6的表达量。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定：
实施例1重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建
包括以下步骤：
(1)确定酶切位点
根据从NCBI中查找I型鸭肝炎病毒标准株VP1基因序列(SEQ ID NO:1)以及PCR扩增获得的鸭IL-6基因序列(SEQ ID NO:3)的测序结果，与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定双酶切位点Xho I和Not I。
(2)重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建
①I型鸭肝炎病毒VP1基因的PCR扩增：
根据GenBank公布的I型鸭肝炎病毒VP1设计如下引物：
Primer 1:5′-GGTGATTCTAACCAGTTAGG-3′，如序列表SEQ ID NO：6所示；
Primer 2:5′-TTCAATTTCCAGATTGAGTT-3′，如序列表SEQ ID NO：7所示。
提取I型鸭肝炎病毒标准株(菌种保藏编号：CVCC AV1540，从保藏机构直接获得)的RNA，反转录为cDNA并作为模板，用Primer 1和Primer 2作为引物对VP1基因进行PCR扩增：
Figure GDA0002723795880000071
Figure GDA0002723795880000081
PCR反应条件为：
Figure GDA0002723795880000082
扩增产物回收结果如图1所示:对回收的VP1基因琼脂糖凝胶电泳得到一条714bp的条带，与预期结果一致。将目的条带克隆至PMD18-T载体后，测序结果显示，与GenBank公布的VP1序列一致。表明VP1基因成功克隆，将测序正确的重组质粒命名为PMD18-T-VP1，并保存备用。
②I型鸭肝炎病毒VP1-linker基因的PCR扩增：
基于将来要把VP1和IL-6基因进行融合，以及需要将融合基因克隆至pPIC9质粒这两个方面的目的，需要在扩增产物中***连接序列linker，因此引物设计如下：
Primer 3:
5′-CCGCTCGAGATGCATCATCATCATCATCATGGTGATTCTAACCAGTTAGG-3′，短划线部分为Xho I酶切位点，长划线部分为His标签。如序列表SEQ ID NO：8所示。
Primer 4:
5′-TGAACCTCCACCTCCTGATCCACCTCCACCTTCAATTTCCAGATTGAGTT-3′，划线部分为linker序列。如序列表SEQ ID NO：9所示。
以重组质粒PMD18-T-VP1为模板，用Primer 3和Primer 4作为引物对VP1-linker基因进行PCR扩增：
Figure GDA0002723795880000083
PCR反应条件为：
Figure GDA0002723795880000084
Figure GDA0002723795880000091
结果如图2所示:对回收的VP1-linker基因琼脂糖凝胶电泳得到一条774bp的条带(含有linker连接子基因、His标签、酶切位点和保护性碱基序列)，与预期结果一致。
③鸭IL-6基因的PCR扩增：
根据GenBank公布的鸭IL-6基因的预测序列，设计如下引物：
Primer 5:
5′-ATGAGCTCTCCCGACGGCTG-3′，如序列表SEQ ID NO：10所示；
Primer 6:
5′-TCAGACACTGACACTCCTGG-3′，如序列表SEQ ID NO：11所示。
提取鸭脾脏RNA，反转录为cDNA作为模板，用Primer 5和Primer 6作为引物对鸭IL-6基因进行PCR扩增：
Figure GDA0002723795880000092
PCR反应条件为：
Figure GDA0002723795880000093
结果如图3所示:对回收的IL-6基因琼脂糖凝胶电泳得到一条961bp的条带，与预期结果一致。将目的条带克隆至PMD18-T载体后，测序结果显示，该基因序列包含的编码区(CDs)部分与GenBank公布的鸭IL-6基因预测序列一致。表明鸭IL-6基因CDs区的全长序列成功克隆，截取鸭IL-6基因编码区(CDs)基因序列，如序列表SEQ ID NO：3所示，该序列填补了本领域的空白，将测序正确的重组质粒命名为PMD18-T-IL6，并保存备用。
④鸭IL-6-linker基因的PCR扩增：
基于要将IL-6和VP1基因融合，融合基因中需要去掉鸭IL-6的信号肽序列以及需要将融合表达产物克隆至pPIC9这三个方面的目的，设计如下引物：
Primer 7
5′-GGTGGAGGTGGATCAGGAGGTGGAGGTTCAGCGCCGCTGCCCCTGGCCGC-3′，划线部分为linker序列。如序列表SEQ ID NO：12所示。
Primer 8:
5′-TATGCGGCCGCTCAGACACTGACACTCCTGG-3′，划线部分为NotI酶切位点。如序列表SEQ ID NO：13所示。
以重组质粒PMD18-T-IL-6为模板，用Primer 7和Primer 8作为引物对IL-6-linker基因进行PCR扩增：
Figure GDA0002723795880000101
PCR反应条件为：
Figure GDA0002723795880000102
结果如图4所示：对IL-6-linker基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条633bp大小的条带，与预期结果一致。
⑤融合基因的PCR扩增：
分别胶回收扩增的VP1-linker及IL-6-linker基因，以Primer 3(SEQ ID NO：8)和Primer 8(SEQ ID NO：13)作为特异性引物进行SOE-PCR扩增得到VP1-IL6融合基因；
Figure GDA0002723795880000103
Figure GDA0002723795880000111
PCR反应条件为：
Figure GDA0002723795880000112
结果如图5所示：对融合基因的SOE-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条为1379bp大小的条带，与预期结果一致。
⑥将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接，经转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑单菌落摇菌提质粒，酶切及测序得到PMD18-T-VP1-IL6重组质粒；具体操作如下：
连接反应体系：VP1-IL6基因4.5μL，PMD18-T质粒0.5μL，SolutionⅠ5.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2h；
双酶切PMD18-T-VP1-IL6反应体系如下：PMD18-T-VP1-IL6重组质粒1.0μg，Xho I内切酶0.5μL，NotⅠ内切酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；
结果如图6所示：对PMD18-T-VP1-IL6重组质粒酶切得到一条2692bp及一条1373bp大小(去掉了两端的各3个保护性碱基)的条带，说明成功构建克隆质粒。
⑦将重组质粒PMD18-T-VP1-IL6用上述Xho I和Not I限制性内切酶酶切，将切下的VP1-IL6融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化和酶切验证已连接，然后经质粒测序验证***的外源基因序列正确，质粒命名为：pPIC9-VP1-IL6；
具体操作如下：
连接反应体系：10×buffer1.0μL，VP1-IL6基因2.0μL，酶切后pPIC96.0μL，T4 DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；
双酶切pPIC9-VP1-IL6反应体系如下：pPIC9-VP1-IL6重组质粒1.0μg，NotⅠ内切酶0.5μL，XhoⅠ内切酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h。
结果如图7所示：对重组pPIC9-VP1-IL6酶切得到一条8000bp及一条1373bp(去掉了两端的各3个保护性碱基)大小的条带，说明该融合基因成功连接到表达质粒中。
实施例2 pPIC9-VP1-IL6质粒毕赤酵母表达及纯化
(1)VP1-IL6融合蛋白在毕赤酵母的表达及鉴定
①将构建的重组质粒用Sal I内切酶切线性化并胶回收，同时将空载体以相同酶切线性化并胶回收，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；用常规LiCl法将重组质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布RDB平板，挑选阳性转化子。
其中酶切反应体系如下：pPIC9-VP1-IL6重组质粒1.0μg，Sal I内切酶1.0μL，10×buffer 2.5μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；
②阳性转化子的鉴定：提取转化子的基因组，以基因组为模板，PCR扩增其Aox1基因，PCR反应体系如下：
Figure GDA0002723795880000121
PCR反应条件为：
Figure GDA0002723795880000122
结果如图8所示：琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现一条2200bp及493bp条带者为空质粒转化子，出现一条2200bp及1816bp条带者为阳性转化子，其中1816bp长度表示质粒上493bp的基因片段与***的基因序列1323bp(***的序列为：酶切后的VP1-IL6融合基因长度1373bp减去pPIC9质粒上的两个酶切位点14bp及之间36bp的序列)的长度之和。
挑取阳性转化子进行后续蛋白表达。
阳性转化子成功构建完成后，对连接的基因利用SWISS-MODEL软件进行空间结构预测：
结果如图9所示：SWISS-MODEL软件分析结果中可以看出试验所连接的两段基因中间以一段肽段连接，并且肽段两段基因所表达的蛋白分别保持各自的空间结构，互不干扰。因此本试验所选用的表达***所表达的蛋白仍可分别保留两个基因的空间结构，并且保持其各自免疫原性。
(2)I型鸭肝炎病毒VP1及鸭IL-6融合蛋白在毕赤酵母的表达
①在毕赤酵母中诱导表达VP1-IL6融合蛋白：
将筛选出的阳性重组子接种至20mL BMGY培养基中，30℃，250rpm震荡培养至OD600＝2-6，离心收集菌体。若为阳性转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为阴性转化子，则加入1/5体积的BMMY培养基重悬；30℃，250rpm震荡培养96h，每隔24h补加甲醇至1％，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96h取1.0mL培养基分析表达水平，最终确定最佳收菌时间为96h。
结果如图10所示：与对照组相比，在不同时间段取样泳道中都得到一条49.98kDa大小的条带，与预期结果一致。并且随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加，这符合毕赤酵母表达规律，因此该重组表达质粒可以在毕赤酵母表达***中成功表达。
②VP1-IL6融合蛋白的鉴定及纯化。
取蛋白提取物，加入SDS上样缓冲液调整蛋白浓度，煮沸10min，进行SDS-PAGE，每孔上样量为40μL，并转移至NC膜，共3块重复膜。用0.5％的脱脂奶粉封闭3h，将已封闭的3块NC膜，分别浸入1：1000倍稀释的兔抗His标签一抗(购买，用0.05％PBST配制)、1:200(v/v)兔抗VP1一抗(免疫兔制备)、1:200(v/v)兔抗IL-6一抗(免疫兔制备)，37℃摇晃2.5h，取出漂洗3次，再浸入1:2000(v/v)稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购买，用PBST配制)结合1.5h，洗膜后作DEB化学显色。
结果如图11所示：对收获的蛋白进行纯化后SDS-PAGE电泳得到一条49.98kDa大小的条带，于上述结果一致，因此表明该融合蛋白经毕赤酵母成功表达后得到较好的纯化。
如图12所示：对纯化后的融合蛋白分别利用抗His标签抗体、兔抗VP1一抗、兔抗IL-6一抗和对应的二抗进行鉴定，分别在目的条带处得到49.98kDa大小的条带，表明经本表达***表达的蛋白分别保留了VP1及IL-6蛋白各自的免疫原性。
实施例3抗VP1-IL6卵黄抗体的制备
(1)疫苗的制备：将pPIC9-VP1-IL6重组毕赤酵母大量诱导表达，培养96h后收获培养基上清；采用分光光度计测定VP1-IL6蛋白浓度，-20℃保存；用无菌水调整VP1-IL6最终的蛋白浓度为100μg/mL，并向溶液中加入5.0μg/mL的LPS作为多克隆抗体激活剂，将上述配制好的蛋白溶液作为水相，与等体积的白油佐剂混合，然后用均质机充分乳化20min，制备而成疫苗；
(2)用制备的疫苗分4次对开产前1个月左右的蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0mL/只；
(3)第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积比3-5:1混合稀释蛋黄液，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于30℃-37℃条件下预温1h；
(4)向蛋黄稀释液中加入PEG6000，混合后PEG6000的质量分数为3-4％，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6h，充分反应；
(5)将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤，其中先用100目，再用200目过滤；
(6)将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48h；
(7)将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛灭活未知病毒并作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗I型鸭病毒性肝炎病毒和鸭IL-6抗体的琼扩试验效价应不低于1:64；
(8)在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，即获得卵黄抗体成品，保存备用，保存温度为4-8℃。
实施例4卵黄抗体的质量检验
(1)安全性检验
用1日龄樱桃谷雏鸭20只，肌肉多点注射本发明实施例3制备的卵黄抗体2.0mL，观察14日，易感雏鸭全部健康存活，说明本发明的卵黄抗体的安全性好。
(2)无菌检验
按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)执行，结果本发明的卵黄抗体无细菌、支原体和外源病毒污染。
(3)效力检验
3日龄易感雏鸭(DHV-I母源抗体<1:4)80只，随机分为A、B、C、D 4个组，每组20只。每只鸭感染10LD50剂量的DHV-I病毒。感染病毒后6h，A组肌肉注射实施例4制备的卵黄抗体，每只1.0mL；B组肌肉注射市售的I型鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体(1号厂家)，每只1.0mL；C组肌肉注射市售的I型鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体(2号厂家)，每只1.0mL；D组为对照组，肌肉注射生理盐水，每只1.0mL，隔离饲养。注射完8h，每组剖杀10只，检测肝脏中IL-6的含量；同时，采集肝脏组织制作病理组织切片，评价肝脏中的炎症得分情况。每组剩余10只，观察到20日龄，记录死亡率。
结果显示，A组(抗VP1-IL6卵黄抗体组)10只鸭肝脏中IL-6的含量均显著低于B组和C组(图13)；病理组织学观察发现，A组病理得分低于B、C、D组(表1)；此外，A组剩余10只鸭在观察期全部存活，B组死亡2只，C组死亡3只，D组全部死亡。结果表明，实施例4制备的抗VP1-IL6卵黄抗体保护效果优于2家市售的卵黄抗体，且明显降低了肝脏中的炎症反应。3日龄雏鸭注射1.0mL即可达到理想的治疗效果。
表1.鸭肝炎病毒感染后鸭肝脏病理变化得分(mean)
组别 A组 B组 C组 D组
得分 0.8 1.5 1.7 3.6
注：得分情况按如下标准，各组得分用平均数表示。
0：正常的肝脏组织学形态；
1：轻度局灶性的肝细胞变性；
2：中度多灶性肝细胞变性，少量出血，淋巴细胞、异嗜性粒细胞等少量炎性细胞浸润；
3：弥漫性的肝细胞变性坏死，有大量炎性细胞浸润，明显的出血灶；
4：广泛性的肝细胞严重坏死，严重出血灶，肝组织损伤严重，肝组织结构消失。
实施例5抗VP1-IL6卵黄抗体的效果比较
用本发明相同的技术，分别制备VP1-IL1β和VP1-IL2融合蛋白，并用相同的方法制备卵黄抗体，比较VP1-IL1β、VP1-IL2和VP1-IL6三种卵黄抗体的保护效果。
3日龄易感雏鸭(DHV-I母源抗体<1:4)80只，随机分为A、B、C、D 4个组，每组20只。每只鸭感染100EID50剂量的DHV-I病毒。感染病毒后6h，A组肌肉注射实施例4制备的抗VP1-IL6卵黄抗体，每只1.0mL；B组肌肉注射抗VP1-IL1β卵黄抗体，每只1.0mL；C组肌肉注射抗VP1-IL2卵黄抗体，每只1.0mL；D组为对照组，肌肉注射生理盐水，每只1.0mL，隔离饲养。注射完8h，每组剖杀10只，采集肝脏制作病理组织切片，评价肝脏中的炎症得分情况。每组剩余10只，观察到20日龄，记录死亡率。
结果显示，A组(抗VP1-IL6卵黄抗体组)剩余10只鸭在观察期全部存活，B组死亡1只，C组死亡2只，D组全部死亡；病理组织学观察发现，A组病理得分低于B、C、D组(表2)。结果表明，实施例4制备的抗VP1-IL6卵黄抗体抗炎效果和保护效果优于其他两种，即融合表达的IL-6的抗炎效果比融合IL-1β和IL-2这两种细胞因子的效果更好。
表2.鸭肝炎病毒感染后鸭肝脏病理变化得分(平均数，mean)
组别 A组 B组 C组 D组
得分 0.8 1.2 1.3 3.6
注：得分情况按如下标准，各组得分用平均数表示。
0：正常的肝脏组织学形态；
1：轻度局灶性的肝细胞变性；
2：中度多灶性肝细胞变性，少量出血，淋巴细胞、异嗜性粒细胞等少量炎性细胞浸润；
3：弥漫性的肝细胞变性坏死，有大量炎性细胞浸润，明显的出血灶；
4：广泛性的肝细胞严重坏死，严重出血灶，肝组织损伤严重，肝组织结构消失。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 山东百瑞凯来生物科技有限公司
<120> 一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggtgattcta accagttagg ggatgatggg ccagtttgct tcctgaattt tgagacagct 60
aatgtcccga tacaaggtga gtctcacact cttgttaaac atctgtttgg gaggcaatgg 120
ttggttagga ctgtgcaaca tgcttcaact gtgcaagagt tggacctcca agttccagat 180
agagggcatg cctctctcat ccggttcttt gcttattttt ctggagagat catccttacc 240
attgttaata atggcactac accagcaatg gtagcacact cttattctat ggatgatctc 300
agttcagagt atgctgttac agcaatgggg ggtgtaatga ttcctgctaa tagtgccaaa 360
aatatctctg tgccattcta ctctgagaca ccactcaggc caactcgacc aattcctggc 420
acagcagaag caacctttgg caggctattt atgtggactc aatcaggaag cctttcagtt 480
tttatgggtc tcaagaagcc agctcttttt tttccacttc ctgctcccac ttccacgaca 540
tcatcacaca aatccaatgg cgttattcct acattgaatc agtctgggga tgaagtggat 600
tgtcacttct gcgaaatttg ttctaaaatg aagaggatgt ggaaaccaag gggacacttt 660
agattttgcc ttagactcaa aacactagca tttggactca atctggaaat tgaa 714
<210> 2
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ccgctcgaga tgcatcatca tcatcatcat ggtgattcta accagttagg ggatgatggg 60
ccagtttgct tcctgaattt tgagacagct aatgtcccga tacaaggtga gtctcacact 120
cttgttaaac atctgtttgg gaggcaatgg ttggttagga ctgtgcaaca tgcttcaact 180
gtgcaagagt tggacctcca agttccagat agagggcatg cctctctcat ccggttcttt 240
gcttattttt ctggagagat catccttacc attgttaata atggcactac accagcaatg 300
gtagcacact cttattctat ggatgatctc agttcagagt atgctgttac agcaatgggg 360
ggtgtaatga ttcctgctaa tagtgccaaa aatatctctg tgccattcta ctctgagaca 420
ccactcaggc caactcgacc aattcctggc acagcagaag caacctttgg caggctattt 480
atgtggactc aatcaggaag cctttcagtt tttatgggtc tcaagaagcc agctcttttt 540
tttccacttc ctgctcccac ttccacgaca tcatcacaca aatccaatgg cgttattcct 600
acattgaatc agtctgggga tgaagtggat tgtcacttct gcgaaatttg ttctaaaatg 660
aagaggatgt ggaaaccaag gggacacttt agattttgcc ttagactcaa aacactagca 720
tttggactca atctggaaat tgaaggtgga ggtggatcag gaggtggagg ttca 774
<210> 3
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
atgagctctc ccgacggctg ccaggcggcg aggagccggg ggccgccctc cctccgctcc 60
gccgccgccc tgctgctgct gctgccgctg ctgcctccgc ccgccgccgc cgcgccgctg 120
cccctggccg ccggccccga ctcctccggg gaggccgagc cggaggaggc cggggcgagg 180
cgagcggcgc tgcccgactg cgaggccctg gcctggctgc tgcacgcccg ggcggcccga 240
ctgcaggagg agatgtgcga gaagttcacc gtctgcgaga acagcatgga gatgctggtc 300
cagaacaacc tcaacctccc caaggtgacg gaggaagacg ggtgtctcct ggctggcttc 360
gacgaggaga aatgcttgaa gaaactctcc agcgggcttt tcacctttca gacctacctt 420
gaatacgtac aagaaacttt taccagtgaa aagcaaaaag ttgagtcgct gtgctatagc 480
acaaagcatc tggcaacgac gataaggcag atggtgataa atcctgatga agtggtcatc 540
ccagattcag ctacccagaa atccctcctc acaaagctga aatcggataa gacctggata 600
gagaaaatca ccacacacct catcctccga gactttactt catttatgga gaaaaccgtg 660
agggctgttc gctatttgaa aaacaccagg agtgtcagtg tctga 705
<210> 4
<211> 695
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ggtgattcta accagttagg ggatgatggg ccagtttgct tcctgaattt tgagacagct 60
ggtggaggtg gatcaggagg tggaggttca gcgccgctgc ccctggccgc cggccccgac 120
tcctccgggg aggccgagcc ggaggaggcc ggggcgaggc gagcggcgct gcccgactgc 180
gaggccctgg cctggctgct gcacgcccgg gcggcccgac tgcaggagga gatgtgcgag 240
aagttcaccg tctgcgagaa cagcatggag atgctggtcc agaacaacct caacctcccc 300
aaggtgacgg aggaagacgg gtgtctcctg gctggcttcg acgaggagaa atgcttgaag 360
aaactctcca gcgggctttt cacctttcag acctaccttg aatacgtaca agaaactttt 420
accagtgaaa agcaaaaagt tgagtcgctg tgctatagca caaagcatct ggcaacgacg 480
ataaggcaga tggtgataaa tcctgatgaa gtggtcatcc cagattcagc tacccagaaa 540
tccctcctca caaagctgaa atcggataag acctggatag agaaaatcac cacacacctc 600
atcctccgag actttacttc atttatggag aaaaccgtga gggctgttcg ctatttgaaa 660
aacaccagga gtgtcagtgt ctgagcggcc gcata 695
<210> 5
<211> 1379
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ccgctcgaga tgcatcatca tcatcatcat ggtgattcta accagttagg ggatgatggg 60
ccagtttgct tcctgaattt tgagacagct aatgtcccga tacaaggtga gtctcacact 120
cttgttaaac atctgtttgg gaggcaatgg ttggttagga ctgtgcaaca tgcttcaact 180
gtgcaagagt tggacctcca agttccagat agagggcatg cctctctcat ccggttcttt 240
gcttattttt ctggagagat catccttacc attgttaata atggcactac accagcaatg 300
gtagcacact cttattctat ggatgatctc agttcagagt atgctgttac agcaatgggg 360
ggtgtaatga ttcctgctaa tagtgccaaa aatatctctg tgccattcta ctctgagaca 420
ccactcaggc caactcgacc aattcctggc acagcagaag caacctttgg caggctattt 480
atgtggactc aatcaggaag cctttcagtt tttatgggtc tcaagaagcc agctcttttt 540
tttccacttc ctgctcccac ttccacgaca tcatcacaca aatccaatgg cgttattcct 600
acattgaatc agtctgggga tgaagtggat tgtcacttct gcgaaatttg ttctaaaatg 660
aagaggatgt ggaaaccaag gggacacttt agattttgcc ttagactcaa aacactagca 720
tttggactca atctggaaat tgaaggtgga ggtggatcag gaggtggagg ttcagcgccg 780
ctgcccctgg ccgccggccc cgactcctcc ggggaggccg agccggagga ggccggggcg 840
aggcgagcgg cgctgcccga ctgcgaggcc ctggcctggc tgctgcacgc ccgggcggcc 900
cgactgcagg aggagatgtg cgagaagttc accgtctgcg agaacagcat ggagatgctg 960
gtccagaaca acctcaacct ccccaaggtg acggaggaag acgggtgtct cctggctggc 1020
ttcgacgagg agaaatgctt gaagaaactc tccagcgggc ttttcacctt tcagacctac 1080
cttgaatacg tacaagaaac ttttaccagt gaaaagcaaa aagttgagtc gctgtgctat 1140
agcacaaagc atctggcaac gacgataagg cagatggtga taaatcctga tgaagtggtc 1200
atcccagatt cagctaccca gaaatccctc ctcacaaagc tgaaatcgga taagacctgg 1260
atagagaaaa tcaccacaca cctcatcctc cgagacttta cttcatttat ggagaaaacc 1320
gtgagggctg ttcgctattt gaaaaacacc aggagtgtca gtgtctgagc ggccgcata 1379
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
ggtgattcta accagttagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
ttcaatttcc agattgagtt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
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ccgctcgaga tgcatcatca tcatcatcat ggtgattcta accagttagg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
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tgaacctcca cctcctgatc cacctccacc ttcaatttcc agattgagtt 50
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<212> DNA
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gccgtgaata atctcgaagc 20
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ggttcctaaa aggaaatgag ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
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ggtggaggtg gatcaggagg tggaggttca gcgccgctgc ccctggccgc 50
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
tatgcggccg ctcagacact gacactcctg g 31

Claims (5)

1.pPIC9-VP1-IL6 重组质粒，其特征在于：该重组质粒中含有VP1-IL6融合基因，该基因的序列如SEQ ID NO：5所示。
2.重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
① I型鸭肝炎病毒VP1基因的PCR扩增：
提取I型鸭肝炎病毒标准株RNA反转录为cDNA，将其作为模板，以引物Primer 1和2，其基因序列如SEQ ID NO：6 和7所示，进行 PCR扩增VP1基因， PCR产物胶回收，VP1基因序列如SEQ ID NO：1所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-VP1，保存备用；
② 以①中构建的质粒为模板，设计引物Primer 3和4，其基因序列如SEQ ID NO：8和9所示，上游引物Primer 3引入Xho I酶切位点序列和HIS标签序列，下游引物Primer 4中引入linker序列，PCR扩增得到VP1-Linker，其基因序列如SEQ ID NO：2所示；
③ 鸭 IL-6基因的PCR扩增：提取鸭脾脏RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增鸭 IL-6基因，所用引物为Primer 5和6，其基因序列如SEQ ID NO：10 和11所示；PCR反应扩增鸭IL-6基因并胶回收后，鸭IL-6基因的CDS序列如SEQ ID NO：3 所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-IL6，保存备用；
以③中构建的质粒为模板，设计引物Primer 7和8，其基因序列如SEQ ID NO：12 和13所示，上游引物Primer 7的起点为去除信号肽的IL-6序列，并在引物中引入linker，下游引物Primer 8中引入Not I酶切位点序列，PCR扩增得到鸭 IL-6-linker基因，其基因序列如SEQ ID NO：4所示；
分别胶回收VP1-linker及IL-6-linker基因PCR扩增产物作为模板，以Primer 3 ，其基因序列如SEQ ID NO：8 所示和Primer 8，其基因序列如SEQ ID NO：13 所示为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到VP1-IL6融合基因其基因序列如SEQ ID NO：5 所示;
④将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接至PMD18-T载体质粒，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-VP1-IL6重组质粒;
⑤将重组质粒PMD18-T-VP1-IL6用上述Xho I和Not I限制性内切酶酶切，将切下的VP1-IL6融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化和酶切验证已连接，然后经质粒测序验证***的外源基因序列正确，质粒命名为：pPIC9-VP1-IL6。
3.权利要求1所述pPIC9-VP1-IL6重组质粒在毕赤酵母的表达的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）VP1-IL6融合蛋白在毕赤酵母中的表达：
① 将构建的重组质粒用Sal I内切酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；同时将pPIC9空载体质粒以相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中，作为阴性对照；
用LiCl法将两种质粒分别转化GS115感受态细胞，涂布RDB平板，获得重组质粒阳性转化子和空质粒阴性转化子；
②提取两种转化子的基因组作为模板，PCR扩增其Aox1基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴性转化子出现一条2200 bp及493 bp条带，阳性转化子出现一条2200 bp及1816 bp条带，表明pPIC9-VP1-IL6重组质粒转化成功；
③ 将筛选出的阳性转化子和阴性转化子接种至20 mL BMGY培养基中，30℃，250 rpm震荡培养至OD600=2-6，离心收集菌体；随后，阳性转化子再加入等体积的BMMY培养基重悬，阴性转化子则加入1/5体积的BMMY培养基重悬；阴阳性转化子于30℃，250 rpm震荡培养96h，每隔24 h补加甲醇至1%，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96h时取1.0 mL培养基分析外源基因表达水平，阴性转化子作为对照，最终确定的最佳收菌时间为96h；
（2） VP1-IL6融合蛋白的鉴定：
抽提诱导后酵母菌体的DNA，以Primer 3其基因序列如SEQ ID NO：8 所示，和Primer 8其基因序列如SEQ ID NO：13 所示，为引物进行PCR反应；
重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳；
以Western-blotting鉴定I型鸭肝炎病毒VP1及鸭IL-6融合蛋白在酵母重组子中的表达。
4.一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法，采用pPIC9-VP1-IL6 毕赤酵母表达产物制作卵黄抗体，其特征在于：具体步骤如下：
（1）疫苗的制备：将pPIC9-VP1-IL6重组毕赤酵母大量诱导表达，培养96h后收获培养基上清；采用分光光度计测定VP1-IL6蛋白浓度，-20℃保存；用无菌水调整VP1-IL6最终的蛋白浓度为 100 μg/mL，并向溶液中加入5.0 μg/mL的LPS作为多克隆抗体激活剂，将上述配制好的蛋白溶液作为水相，与等体积的白油佐剂混合，然后用均质机充分乳化20 min，制备而成疫苗，
其中VP1-IL6的基因序列如SEQ ID NO：5所示；
（2）用制备的疫苗分4次对开产前1个月的蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0 mL/只；
（3）第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积比3-5:1混合稀释蛋黄液，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于30℃-37℃条件下预温1 h；
（4）向蛋黄稀释液中加入PEG6000，混合后PEG6000的质量分数为3-4%，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6 h，充分反应；
（5）将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤，其中先用100目，再用200目过滤；
（6）将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48 h；
（7）将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛灭活未知病毒并作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗I型鸭病毒性肝炎病毒和鸭IL-6抗体的琼扩试验效价应不低于1:64；
（8）在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，即获得卵黄抗体成品，保存备用，保存温度为4-8℃。
5.根据权利要求4所述具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中前期4次免疫完后，后续每隔1.5个月免疫一次；
步骤（2）中的稀释体积比为3.5:1，温度为35℃；
步骤（3）中的PEG6000添加量为3.5%。
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