CN112029668A - 一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食药用菌领域，具体涉及一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法。本发明的纵条纹炭角菌菌核中富含药典中衡量炭角菌药用价值的重要成分(甘露醇、腺苷)，并且含量高于目前报道的很多食药用菌。

Description

一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法
技术领域
本发明属于食药用菌领域，具体涉及一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法。
背景技术
纵条纹炭角菌(xylaria striata)隶属炭角菌科(Xylariaceae)，炭角菌属(Xylaria)真菌[1]-[3]，西南科技大学黄毅、雷传文、袁小红等2015年申请专利“一种纵条纹炭角菌的应用”，表明：纵条纹炭角菌子实体或醇提取物具有显著的镇静催眠作用，可用于治疗失眠、焦虑或者惊厥等神经***疾病，效果良好。西南科技大学袁诗俊、贺新生、袁小红等2019年申请专利“一种利用液体培养基生产纵条纹炭角菌子实体的方法”，发明了一种直接用液体培养基生产纵条纹炭角菌子实体的方法，此法工艺简单、易实施、产菌效率高。
炭角菌属真菌种类很多，但是该属真菌研究起步较晚，目前已报道有61种。大多数炭角菌属真菌都有较好的医疗保健功效，特别是菌核是传统中药组分，主要化学成分为多糖类、核苷类、环肽和羧酸类等活性物质，以及萜类、甾醇类、生物碱和聚酮类化合物等次级代谢产物。其中，黑柄炭角菌是目前研究最多，也是最著名的炭角菌属真菌，具有药用和食用价值，目前有“护龄神”胶囊、“乌灵参”胶囊等上市药品。黑柄炭角菌菌核被称为乌灵参，是极为昂贵的中药[4]。
发明概述
本发明提供一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法，该菌株的菌核可以作为中药“乌灵参”入药。
本发明的菌株纵条纹炭角菌(xylaria striata)是通过野外分离得到，采自于云南省昆明西山区碧鸡镇小七十郎社区的林下。对其进行了形态学分析、ITS分子鉴定和菌核培育的研究，该菌株命名为纵条纹炭角菌(xylaria striata)YK-4，属于炭角菌科(Xylariaceae)，炭角菌属(Xylaria)真菌。于2020年6月11日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.19660。
本发明提供一种纵条纹炭角菌(xylaria striata)，其主要形态特征和生物学特性为:
该菌株在加富PDA培养基上，25℃暗培养，菌丝洁白、气生菌丝多；
其子座幼嫩时期为黄白色，随着生长颜色不断加深，经黄色后变为黑色，子座顶端呈黄白色，棒状，密集成丛，有1-2级分枝，第1级分枝成叉状，第2级分枝从一个顶端同时分出2-11个小分枝，成总状分枝(参见图1)；
子座有明显灰白相间的纵条纹，尖端尖细，顶端***；
菌核条状或滴水状，表面黑色，内部菌肉白色，紧实。
根据本发明，纵条纹炭角菌菌株采自林下的纵条纹炭角菌子实体，经组织分离得到的纯培养菌丝体。
根据本发明，纵条纹炭角菌可在多种母种培养基上生长，其中以加富PDA培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、磷酸二氢钾3g/L、蛋白胨3g/L，pH为6.5)为最佳培养基。
根据本发明，本发明的纵条纹炭角菌采自林下的纵条纹炭角菌子实体，经组织分离得到的纯培养菌丝体。
本发明提供一种纵条纹炭角菌菌株，其包含ITS序列SEQ ID NO:3，或与SEQ IDNO:3具有97.0％以上(例如97.0％，97.1％，97.2％，97.3％，97.4％，97.5％，97.6％，97.7％，97.8％，97.9％，98.0％，98.1％，98.2％，98.3％，98.4％，98.5％，98.6％，98.7％，98.8％，98.9％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％)的同一性。
本发明提供一种纵条纹炭角菌，基于菌核干重，其菌核中甘露醇的含量为9.0％-11.7％，是野生鸡枞的2倍，明显高于野生松茸、黑牛肝菌等；同样基于菌核干重，菌核中腺苷的含量为0.028％-0.034％，高于野生冬虫夏草幼虫时期中腺苷的含量0.023％。
本发明还提供一种纵条纹炭角菌(xylaria striata)YK-4的菌核培育配方(wt％)：杂木屑78％、土10％、大米5％、麦麸5％、糖1％、石膏1％，以及采用该配方培育菌核的方法，其生物学效率达12.15％，为目前报道的最高水平。
发明效果
本发明的纵条纹炭角菌菌核中富含药典中衡量炭角菌药用价值的重要成分(甘露醇、腺苷)，并且含量高于目前报道的很多食药用菌。
附图及其简要说明
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于下列附图：
图1示出人工栽培的纵条纹碳角菌子座。
实施例
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。
实施例1
菌株的分离和保藏
在超净工作台内，将采集到的野生纵条纹炭角菌菌株，通过组织分离法接种到加富PDA培养基中，于25℃恒温暗培养，培养6天，每天观察记录，剔除污染的培养皿，挑选长势优良的培养皿作为母种。切去长宽为0.8cm的菌丝方块，至于装有无菌蒸馏水的离心管中，4℃保存。
菌株YK-4的分子鉴定
将YK-4的菌丝加入到离心管并加入适量液氮研磨菌丝；提取方法参照真菌DNA提取试剂盒步骤(新型快速植物基因组DNA提取试剂盒，Bio Take Corporation)；PCR扩增：以YK-4的基因组DNA为模板，利用正向引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，SEQ ID NO:1)和反向引物ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，SEQ ID NO:2)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR反应体系
Figure BDA0002677820400000041
反应程序
95℃变性5min，进入循环，循环条件是94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
琼脂糖凝胶电泳方法
①称lg琼脂糖粉末，加入用于制胶的锥形瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液置于微波炉中加热熔化；
②冷却至65℃左右时加入核酸染料，混匀，倒入提前用梳子插好的制胶板中；
③待胶冷却凝固后，拔起梳子；
④在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，点样，在220V/180A的电压和电流下进行电泳30min左右；
⑤利用凝胶成像***对PCR产物进行观察。
YK-4菌株的ITS序列测序
将有清晰目的条带的PCR产物进行割胶纯化后送往上海生工科技有限公司进行测序，利用DNAMAN软件、MEGA6.0软件及NCBI数据库在线软件(https://blast.ncbi.nih.gov/Blast.cgi)对YK-4菌株的ITS序列进行比对分析。
测序
所得的测序结果经过人工校正后获得一段591bp的序列：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTAAAGAGTTATCATAACTCCCAAACCCATGTGAACCTACCTTTGTTGCCTCGGCAGGTCTGCAGCTTACCCTGTGAGACCCTACCCTGTAGGGACCTTACCTGGTAGTTGCGGGTAAAGCCTGCCGGTGGTCTACTAAACTCTGTTTACTATGTTATTCTGAATAATATAACTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCCTTGTTGCTTAGCGTTGGGAGCTTACAGAAACCCTCTGTAGTTCCTTAAAGTTAGTGGCAGAGTTGGTTTCACACTCTAGACGTAGTAAATTTTATCTCGCCTATAGATGAACCGGCCCCTTGCCGTAAAACCCCTTAATTTTTAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAAGGAA(SEQ IDNO:3)
对比分析
将YK-4菌株的ITS序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现YK-4菌株的ITS序列与登录号为GU300089.1的纵条纹炭角菌(Xylaria striata)总评分、覆盖率、相似度最高，分别为989、99％、96.95％，该菌株鉴定为Xylaria striata。
实施例2
菌核的培育配方筛选
配方1：杂木屑78％、土20％、糖1％、石膏1％
配方2：杂木屑78％、土10％、大米5％、麦麸5％、糖1％、石膏1％
配方3：米粒培养基98％、石膏1％、糖1％
配方4：玉米芯78％、土20％、糖1％、石膏1％。
将4个配方的培养料分别分装瓶中，每瓶料高6cm、平均每瓶湿重100g。在121℃下，高压灭菌2小时，冷却后接种，接种量保持一致。培养条件放置在培养箱中培养：温度为25℃、黑暗培养，培养料含水量65％、室内培养湿度60％。结果表明，配方2生物学效率最高，生长成熟时间最短(参见下表1)。
表1：
Figure BDA0002677820400000061
备注：生物学效率为培养料干重与所生产的金耳鲜重的比率。
菌株活性物质的测定
甘露醇的测定
参照2015版药典中乌灵胶囊甘露醇的测定[5]，称取样品0.4g，加入水20ml，称量，在水浴锅中加热回流2小时，取出冷却，补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液作为供试品贮备液并量取供试品贮备液2ml，放在碘瓶中，精密加入高碘酸钠(钾)溶液50ml，在水浴锅中加热15分钟，取出冷却，加碘化钾试液10ml，密塞，放置5分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失，将滴定的结果用空白试验来校正。
结果表明，纵条纹炭角菌(Xylaria striata)YK-4菌株菌核甘露醇含量达11.7％，是野生鸡枞的2倍，明显高于野生松茸、黑牛肝菌等菌类[6]。
腺苷的测定
参照2015版药典乌灵胶囊腺苷的测定方法[5]，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.04mol/L磷酸二氢钾溶液(10：90)为流动相；检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备，取腺苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含腺苷20μg的溶液。测定法，分别精密吸取对照品溶液与甘露醇类物质项下的供试品贮备液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果表明，纵条纹炭角菌(Xylaria striata)YK-4菌株菌核中腺苷的含量0.034％，高于野生冬虫夏草幼虫时期中腺苷的含量0.023％[7]。
参考文献
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[2]卯晓兰主编.2000.中国大型真菌[M].郑州:河南科学出版社,2000:570-575。
[3]Linnaeus C.Flora svecica exhibens plantas per regnum Sueciaecrescentes,1745,2.Salvii,Stockholm。
[4]闻绍锋,曹瑶,杨林雷,周忠发,李荣春.药用炭角菌的研究进展[J].食药用菌,2019,27(02):106-111。
[5]中国药典[S].一部.2015。
[6]胡淑琴,陈智毅,邹宇晓,施英,刘学铭.比色法测定15种食用菌中甘露醇的含量[J].现代食品科技,2010,26(08):901-903+912。
[7]陆巍杰,唐永范,高瑞栋.HPLC法测定北冬虫夏草和常见食用菌中腺苷和虫草素[J].现代药物与临床,2011,26(04):313-315。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南菌视界生物科技有限公司
<120> 一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法
<130> SPI203422-43
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 2
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 3
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta aagagttatc ataactccca aacccatgtg 60
aacctacctt tgttgcctcg gcaggtctgc agcttaccct gtgagaccct accctgtagg 120
gaccttacct ggtagttgcg ggtaaagcct gccggtggtc tactaaactc tgtttactat 180
gttattctga ataatataac taaataagtt aaaactttca acaacggatc tcttggttct 240
ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 300
tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc attagtattc tagtgggcat gcctgttcga 360
gcgtcatttc aacccttaag cccttgttgc ttagcgttgg gagcttacag aaaccctctg 420
tagttcctta aagttagtgg cagagttggt ttcacactct agacgtagta aattttatct 480
cgcctataga tgaaccggcc ccttgccgta aaacccctta atttttaaag gttgacctcg 540
gatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag catatcaaaa gccggaagga a 591

Claims (8)

1.一种纵条纹炭角菌(xylaria striata)菌株，其主要的形态特征和生物学特性包括如下：
该菌株在加富PDA培养基上，25℃暗培养，菌丝洁白、气生菌丝多；
其子座幼嫩时期为黄白色，随着生长颜色不断加深，经黄色后变为黑色，子座顶端呈黄白色，棒状，密集成丛，有1-2级分枝，第1级分枝成叉状，第2级分枝从一个顶端同时分出2-11个小分枝，成总状分枝；
子座有明显灰白相间的纵条纹，尖端尖细，顶端***；
菌核条状或滴水状，表面黑色，内部菌肉白色，紧实。
2.权利要求1所述的纵条纹炭角菌菌株，其采自林下的纵条纹炭角菌子实体，经组织分离得到的纯培养菌丝体。
3.权利要求1或2所述的纵条纹炭角菌菌株，其中加富PDA培养基包括马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、磷酸二氢钾3g/L、蛋白胨3g/L，pH为6.5。
4.一种纵条纹炭角菌菌株，其菌核中相对于菌核干重甘露醇的含量为9.0％-11.7％，而腺苷的含量为0.028-0.034％。
5.一种纵条纹炭角菌菌株，其中包含ITS序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有97.0％以上(优选97.5％，98.0％，98.5％，99.0％，99.5％，甚至99.9％)的同一性。
6.一种纵条纹炭角菌菌株YK-4，其保藏编号为CGMCC No.19660。
7.前述权利要求任一项所述的纵条纹炭角菌菌株的菌核培育方法，其包括在下列菌核培育配方中培育的步骤：杂木屑78％、土10％、大米5％、麦麸5％、糖1％、石膏1％。
8.权利要求7所述的菌核培育方法，其中生物学效率高达12.15％。
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