CN112023062A - 一个用可溶性IgE受体抑制过敏反应的方法 - Google Patents

一个用可溶性IgE受体抑制过敏反应的方法 Download PDF

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Abstract

IgE与肥大细胞等细胞表面的IgE受体结合，是诱发鼻粘膜等组织过敏反应的关键环节。本发明提供了一个通过抑制IgE与肥大细胞IgE受体结合而抑制过敏反应的方法。主要步骤是：在体外制备编码FCERI‑ECD的mRNA，其中包括终止密码子、5末端和3末端的翻译区序列；将FCERI‑ECD‑mRNA用脂质体等进行包装；将包装的FCERI‑ECD‑mRNA通过人体局部(如鼻粘膜，皮肤等)或全身(如静脉)进行使用。FCERI‑ECD mRNA在体内表达FCERI‑ECD蛋白质，结合和抑制IgE,使IgE不能结合肥大细胞等细胞表面的IgE受体，从而抑制过敏反应。

Description

一个用可溶性IgE受体抑制过敏反应的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，提出了一个用大分子RNA抑制过敏反应的新方法。
背景技术
正常的情况下，当外来物质进入人体后大都面临两种命运，如果被机体识别为有用或无害物质，则这些物质将与人体和谐相处，最终将被吸收、利用或被自然排出。如这些物质被识别为有害物质时，机体的免疫***则立即做出反应，将其驱除或消灭，这就是免疫应答发挥的保护作用。免疫应答是人的防卫体系重要的功能之一，但是如果这种应答超出了正常范围，即免疫***对无害物质进行攻击时，这种情况称为***反应。***反应是一种疾病，因为无端的攻击也会损害正常的身体组织，甚至免疫***居然有时对机体本身的组织进行攻击和破坏，对人体的健康非常不利。
***反应分为I型(速发型)、Ⅱ型(细胞毒型)、Ⅲ型(免疫复合物型)、Ⅳ型(迟发型)。过敏反应是I型***反应的代表。常见的过敏性疾病有过敏性哮喘、过敏性鼻炎、花粉病、某些皮炎等。如过敏性鼻炎多为吸入性变应原与患者鼻黏膜相互作用的结果，患者多为过敏体质，且具有遗传性。
过敏性鼻炎:临床大致可分为季节性鼻炎和常年性鼻炎两种，前者多因为吸入花粉而引起，后者多为吸入屋内尘土、螨、霉菌及动物的毛、皮屑及禽类的羽毛等造成。临床表现：突发鼻痒、连续打喷嚏(多超过5个)和大量清水样浆液性鼻分泌物，每次发作症状多持续1小时以上，常反复发作。
过敏性哮喘:该病是支气管哮喘的主要类型，是因致敏原或其他过敏因素引起的广泛性气道超敏状态，造成以气道可逆性、痉挛性狭窄为特征的呼吸道阻塞综合征，病变主要累及支气管。导致该病发作的主要原因有吸入性变应原(室内尘土、屋尘螨和粉尘螨，还有真菌孢子、各种植物花粉、动物皮屑、羽毛、蚕丝、陈旧的织物、昆虫的肢体、残屑、粪便、蜕皮、虫卵等)、食物(如某些蛋类等)、药物(阿司匹林等)。
现在常用抗过敏反应的药物有抗组胺药和***类激素，均有很大的副作用。抗组胺类药物可能带来的副作用有头痛、口干、嗜睡，严重的话可能会诱发青光眼，导致少见的、严重的心脏毒性，会引起致命性心律失常。***类激素长期使用可引起以下副作用：医源性库欣综合征面容和体态、体重增加、下肢浮肿、紫纹、易出血倾向、创口愈合不良、痤疮、***、肱或股骨头缺血性坏死、骨质疏松及骨折(包括脊椎压缩性骨折、长骨病理性骨折)、肌无力、肌萎缩、低血钾综合征、胃肠道刺激(恶心、呕吐)、胰腺炎、消化性溃疡或穿孔，儿童生长受到抑制、青光眼、白内障、良性颅内压升高综合征、糖耐量减退和糖尿病加重。
综上，开发新的抑制过敏反应的方法有迫切的必要性。
肥大细胞主要存在于粘膜和***中，借助其表面表达的IgE的高亲和力受体FCERI与抗变应原的特异性抗体IgE的交联，形成IgE/FCERI复合物，进而引发I型***反应(图1)。肥大细胞浆中存在大量颗粒，其内储存组胺等生物介质，活化的肥大细胞也可新合成细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-13等生物介质。正是借助于这些生物活性介质，肥大细胞在***反应性疾病过程中发挥其生物学作用。因此，肥大细胞表面受体FcεRI表达以及其生物学功能调控机制的为***反应的防治提供了理论基础。在急性过敏反应中，特异性IgE结合于组织肥大细胞的表面，产生抗原依赖性的肥大细胞激活是过敏反应的中心事件和关键环节。IgE是血液循环中浓度最低的免疫球蛋白亚型。在一些患有过敏性疾病或寄生虫感染的个体中，它的血浆浓度可以显著升高。结合抗原的IgE同时与肥大细胞表面的FCERI等结合后，会激活FCERI让肥大细胞和其他效应细胞释放介质,引起过敏和炎症反应。
FCERI是肥大细胞表面的受体,属于跨膜蛋白质。FCERI的胞外段(FCERI-ECD)是结合IgE的部位(图2)，而胞内段具有向细胞内传递信号，诱发肥大细胞活化和脱颗粒的功能。我们的策略是让体内的组织合成FCERI的胞外段(FCERI-ECD)FCERI-ECD与体内的IgE结合后阻止IgE与内源性的跨膜FCERI结合，阻止FCERI的细胞内信号转导,从而抑制肥大细胞活化和过敏反应(图3)。
发明内容
本发明提供了一个通过抑制IgE与肥大细胞IgE受体的结合，而抑制过敏反应的方法。主要步骤是：在体外制备编码FCERI-ECD的mRNA，其中包括在FCERI-ECD的ORF(开放阅读框)添加终止密码子、5’UTR(非翻译区)和3’UTR序列；将FCERI-ECDmRNA用脂质体等进行包装；将包装的mRNA通过人体局部(如鼻粘膜，皮肤等)或全身(如静脉)进行使用。
我们注意到公开号CN1922197A(公开日：2007-2-28)的专利公开了一种用于治疗IgE介导的失调的RNA干涉分子的靶向递送方法，其中包括制备靶向IgE的siRNA的基因构建体，靶基因选自IgE、FcεRI等。我们的发明和该专利不同。该专利是用DNA载体进行治疗，而我们的发明是使用mRNA；该专利是用DNA表达载体表达siRNA，siRNA是国际上公认的小分子RNA，我们使用的是大分子RNA；该专利的目标是敲减IgE和IgE受体的表达，我们的发明主要是用mRNA在体内高表达IgE受体的胞外段，使其结合IgE,从而阻止IgE和体内的IgE受体结合。
本发明在常用的抗组胺和激素类等化合物之外，提供了一种新的抑制过敏反应的方法。
附图说明
图1 IgE参与过敏反应产生的机制。
图2 IgE受体FCERI的结构。圈内的胞外段(FCERI-ECD)是IgE结合区域。
图3 FCERI胞外段(FCERI-ECD)mRNA的使用策略。
图4空白对照组和过敏性鼻炎模型组小鼠抓鼻次数的比较。
图5 FCERI-ECD mRNA通过粘膜进入。荧光标记的mRNA经鼻腔局部喷雾后，小鼠鼻粘膜的组织荧光值变化。对照均值是0.94±0.15，FCERI-ECD mRNA组均值是30.6±6。
具体实施方式
一、空白脂质体的制备：
1.实验材料：
大豆卵磷脂，胆固醇(阿拉丁)；DOTAP(Toronto Research Chemicals,Canada)；
二氯甲烷(现代东方)；0.22um聚碳酸纤维膜(Ireland)
2.主要仪器：
旋转蒸发仪(中国长城仪器)；电热恒温水浴锅(上海精宏)；Misonix XL-2000S细胞超声粉碎仪(美国Misonix公司)；电子天平(德国Sartorius)；微量加样器(德国Ependorf)。
3.脂质体制备
(1)精密称取6mg大豆磷脂、6mgDOTAP和3mg胆固醇，混合溶于5mL二氯甲烷中，28℃水浴旋转蒸发除去溶剂；
(2)在50℃水浴中加入3mL预热至相同温度的蒸馏水，水化15min，得到脂质体混悬液；
(3)以超声波细胞粉碎仪对脂质体混悬液探头超声(100w，1min)，滤过0.22μm的聚碳酸酯膜整合脂质体微粒，即得所需的脂质体。
二、mRNA制备
首先合成了带有T7启动子的双链DNA模板，分别编码小鼠、人FCERI-ECD和GFP。我们在添加了编码FCERI-ECD的开放阅读框架(ORF)后添加了UAG作为蛋白质翻译的终止密码子。我们将pcDNA3的5’UTR区添加到了ORF的前面，将bPA的3‘UTR和多聚腺苷酸区加到了ORF的后面。这些处理的目的是使mRNA能在体内有效翻译成蛋白质。我们利用T7聚合酶介导的DNA依赖的RNA转录，在体外制备了mRNA。
1.在试管中，在室温一次加入下列试剂：
5x转录缓冲液100ul
DTT(100mM)100ul
RNase inhibitor 500单位
rNTP capping mix(see Section II)100μl
Ribo m 7G Cap Analog,5mM 25μl
DNA模板(10ug)10ul
T7 RNA聚合酶200单位
加入ddH2O至500ul
室温培养，3h。
2.RNA纯化：
(1)在180μl反应产物中添加20μl 3M醋酸钠,pH 5.2，彻底混合。
(2)加等量苯酚/氯仿混合物，然后用氯仿萃取两次。收集水相并转移到新的管中。
(3)通过加入2体积的乙醇沉淀RNA。-20℃孵育至少30分钟，离心收集沉淀。
(4)移除上清液，用500μl冷却的70％乙醇冲洗沉淀。
(5)将沉淀干燥后加入乙酸缓冲液进行冷冻保存。
三、mRNA-脂质体复合物的制备
(1)将250μl的mRNA(1μM)逐滴滴加至250μl的空白阳离子脂质体混悬液中，得到质量比[以脂质体中DOTAP记，即m(DOTAP):(mRNA)]为10：1的混悬液。
(2)涡旋10min，室温孵育30min形成mRNA-脂质体复合物。
四、过敏性鼻炎的模型建立
1.动物：
7周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠40只，在动物部屏障层饲养实验，室温20-24℃，照明时间12h/d，自由取食(在屏障环境中饲养1周，排除环境因素影响实验结果)。
2.主要试剂：
卵清蛋白(北京博然一新)；明矾(虹湖化工)；PBS缓冲液(中杉金桥)；氯化钠(北京化工厂)。
3.OVA溶液的配制和过敏性鼻炎动物模型的制备
鼻痒和喷嚏是过敏性鼻炎的特征性外在临床表现，过敏性鼻炎是以肥大细胞浸润为特点的Ⅰ型***反应。卵清蛋白呈粉末状，具有很强的免疫原性，故选取卵清蛋白溶液作为本实验的过敏原。
我们试了6种不同的小鼠鼻炎模型制备方法，发现了用卵清蛋白进行致敏、强化和激化三阶段处理能够在30天内成功制备出动物模型。动物的抓鼻次数，鼻部粘膜下的肥大细胞浸润等都证明了动物模型是成功的。
致敏阶段：
(1)用电子天平分别称取10μg卵清蛋白和2mg的明矾；
(2)根据PBS缓冲液的配制方法配制pH 7.3的PBS溶液；
(3)将称量好的卵清蛋白和明矾溶于0.5mL的PBS中,配成每毫升20μg卵清蛋白和4mg明矾的溶液；
(4)腹腔注射10μg卵清蛋白和2mg明矾溶于0.5mL的PBS溶液所制成的试剂，隔一天一次，一共7次，共13天。然后进入强化阶段。
强化阶段：
(1)用电子天平准确称取0.5g卵清蛋白；
(2)将称取好的卵清蛋白溶于50mL的PBS中，配成10mg/mL的卵清蛋白的溶液，为小鼠强化阶段所用的溶液；
(3)从第14天起，将含1％卵清蛋白(10mg/mL in PBS)的液体，以喷雾形式，每天30min进行实验，连续5天；
激化阶段：
(1)用电子天平称取40mg的卵清蛋白溶于1mL的0.9％的NaCl溶液中，配成浓度为4％的卵清蛋白溶液，为小鼠激化所用的溶液；
(2)间歇3天后，将2％卵清蛋白用微量加样器滴入双侧鼻腔，每侧20μl，一天一次，连续7次。给药后30min内，观察小鼠的行为学变化，并且记录；
(3)2日后，记录小鼠每30min的抓鼻次数并收集小鼠样品。
小鼠过敏性鼻炎模型制备成功的确认：
(1)抓鼻次数：
鼻痒和喷嚏是过敏性鼻炎的特征性外在临床表现。测定每30min的小鼠抓鼻次数。模型组小鼠的抓鼻次数明显增多(图4)。
(2)用甲苯胺蓝测定肥大细胞：
过敏性鼻炎是以肥大细胞浸润为特点的Ⅰ型***反应。甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为碱性染料,甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性***，因此，甲苯胺蓝可用于肥大细胞的检测。
甲苯胺蓝为肥大细胞特异性染色。染色结果：肥大细胞颗粒呈***，胞核呈蓝色。空白对照组中的肥大细胞细胞近似圆形，数量较少；实验组中的肥大细胞呈现不规则的形状，且可以看到***的颗粒，为肥大细胞在致敏的情况的脱颗粒现象。更加进一步的确定了肥大细胞在过敏性鼻炎造模成功后数量及其形态的变化。
(3)用免疫组化法测定鼻粘膜下肥大细胞的浸润：
肥大细胞主要存在于粘膜和***中，借助其表面表达的IgE的高亲和力受体FcεRI与抗变应原的特异性抗体IgE的交联，形成IgE/FcεRI复合物，进而引发I型***反应。我们用抗FcεRI抗体进行免疫组化染色，确认了模型组表达大量的肥大细胞。
4.实验分组
将40只小鼠随机分成4个组，每组10只。
(1)空白对照组：
①用PBS代替含卵清蛋白的PBS溶液对小鼠进行致敏、强化和激化阶段的处理。从第16天起连续14天每天记录小鼠的抓鼻次数；在第30天的时候记录小鼠每30min的抓鼻次数和收集所有的小鼠样品。小鼠没有出现过敏性鼻炎样症状。
(2)模型组：
①用卵清蛋白进行小鼠过敏性鼻炎模型制作；
②从第16天起，每天对鼻腔喷雾一次PBS；
③每天记录小鼠的抓鼻次数；在第30天的时候收集所有的小鼠样品。
(3)模型阴性对照组：
①用卵清蛋白进行小鼠过敏性鼻炎模型制作；
②从第16天起，每天对鼻腔喷雾一次脂质体包裹的对照mRNA(GFP mRNA)；
③每天记录小鼠的抓鼻次数；在第30天的时候收集所有的小鼠样品。
(4)模型实验治疗组：
①用卵清蛋白进行小鼠过敏性鼻炎模型制作；
②从第16天起，每天对鼻腔喷雾一次脂质体包裹的治疗用mRNA(FCERI-ECD mRNA)(含2ug mRNA)；
③每天记录小鼠的抓鼻次数；在第30天的时候收集所有的小鼠样品。
五、实验结果
1.mRNA局部用药确认：
用荧光标记的mRNA对动物的鼻部进行局部喷雾处理，对鼻部组织进行切片处理后，荧光值测定显示mRNA能够进入鼻部组织内(图5)。
2.抓鼻次数：
空白对照组的小鼠每30min的抓鼻次数为平均大约1次；而用卵清蛋白制作的动物鼻过敏反应模型组的动物其抓鼻次数可达每30min 40次。用阴性对照组的GFP mRNA进行处理后抓鼻次数无明显改进，但用FCERI-ECD mRNA处理后的动物，其抓鼻次数显著减少(表1)。提示FCERI-ECD mRNA具有抑制过敏反应作用。
表1可溶性IgE受体mRNA对小鼠过敏性鼻炎抓鼻次数的影响
组别(n＝6) 抓鼻次数(每30min)
正常对照组 1.00±0.31
模型组 42.56±1.40
模型阴形治疗组 41.32±2.31
模型实验治疗组 12.65±2.23<sup>****</sup>
****P<0.0001,与阴性治疗对照组(GFP mRNA)比。
3.肥大细胞浸润：
我们用甲苯胺蓝进行了正常小鼠、过敏模型组、阴性治疗组合模型实验治疗组的鼻黏膜组织的肥大细胞染色，结果如表2。与模型组合阴性治疗组相比，FCERI-ECD mRNA治疗组的肥大细胞染色明显变少，提示FCERI-ECD mRNA的处理抑制了过敏反应。IgE抗体的受体在肥大细胞高表达，我们同时对上述组织用抗FCERI抗体(抗胞内段)进行了免疫组化染色，结果显示FCERI-ECD mRNA处理减少了肥大细胞的数量。
表2肥大细胞浸润测定
Figure BDA0002686065850000071
Figure BDA0002686065850000081
总之,动物模型证明,FCERI-ECD mRNA对过敏反应有显著的抑制作用。
序列表
<110>
<120> 一个用可溶性IgE受体抑制过敏反应的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1018
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus Musculus)
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guuaucgaaa uuaauacgac ucacuauagg gagacccaag cuggcuagcg uuuaaacuua 60
uggucacugg aaggucugcc cagcugugcc uagcacugcu guucaugucu cuugauguca 120
uucugacagc cacugagaaa ucuguacuga ccuuggaccc accauggauu agaauauuua 180
caggagagaa agugacccuu uccugcuaug ggaacaauca ccuucaaaug aacucuacua 240
cuaaauggau ccacaauggu accgucucug aggugaacuc uucacauuug gucauuguga 300
gugccaccgu ucaagacagu ggaaaauaca uaugucagaa gcaaggauug uuuaagagua 360
aaccugugua cuugaaugua acgcaagauu ggcugcuccu ucagacaucu gcugacaugg 420
ucuuagucca uggauccuuu gacaucagau gccauggcug gaagaacugg aauguccgca 480
aggugaucua cuacaggaau gaccaugcuu ucaacuacag uuaugagagc cccgucucca 540
uuagagaggc cacacugaau gacaguggca ccuaccacug caagggcuau cuuaggcagg 600
ugaaauauga aucugacaaa uucagaauug cuguaguaaa agcuuacaaa ugcaaguauu 660
auuggcuaca acgacugugc cuucuaguug ccagccaucu guuguuugcc ccucccccgu 720
gccuuccuug acccuggaag gugccacucc cacuguccuu uccuaauaaa augaggaaau 780
ugcaucgcau ugucugagua ggugucauuc uauucugggg gguggggugg ggcaggacag 840
caagggggag gauugggaag acaauagcag gcaugcuggg gaugcggugg gcucuaugga 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1018
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
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Ser Leu Ala Val Ile Leu Thr Ala Thr Gly Leu Ser Val Leu Thr Leu
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Ala Pro Pro Thr Ile Ala Ile Pro Thr Gly Gly Leu Val Thr Leu Ser
35 40 45
Cys Thr Gly Ala Ala His Leu Gly Met Ala Ser Thr Thr Leu Thr Ile
50 55 60
His Ala Gly Thr Val Ser Gly Val Ala Ser Ser His Leu Val Ile Val
65 70 75 80
Ser Ala Thr Val Gly Ala Ser Gly Leu Thr Ile Cys Gly Leu Gly Gly
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Leu Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Ala Val Thr Gly Ala Thr Leu
100 105 110
Leu Leu Gly Thr Ser Ala Ala Met Val Leu Val His Gly Ser Pro Ala
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Thr Ala Ala Ala His Ala Pro Ala Thr Ser Thr Gly Ser Pro Val Ser
145 150 155 160
Ile Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Ser Gly Thr Thr His Cys Leu Gly
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<213> 人(Homo Sapiens)
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<211> 205
<212> PRT
<213> 人(Homo Sapiens)
<400> 4
Met Ala Pro Ala Met Gly Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Ala Pro Ala Gly Val Leu Ala Val Pro Gly Leu Pro Leu Val
20 25 30
Ser Leu Ala Pro Pro Thr Ala Ala Ile Pro Leu Gly Gly Ala Val Thr
35 40 45
Leu Thr Cys Ala Gly Ala Ala Pro Pro Gly Val Ser Ser Thr Leu Thr
50 55 60
Pro His Ala Gly Ser Leu Ser Gly Gly Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Ala Leu Pro Gly Ala Ser Gly Gly Thr Leu Cys Gly His Gly
85 90 95
Gly Val Ala Gly Ser Gly Pro Val Thr Leu Gly Val Pro Ser Ala Thr
100 105 110
Leu Leu Leu Gly Ala Ser Ala Gly Val Val Met Gly Gly Gly Pro Leu
115 120 125
Pro Leu Ala Cys His Gly Thr Ala Ala Thr Ala Val Thr Leu Val Ile
130 135 140
Thr Thr Leu Ala Gly Gly Ala Leu Leu Thr Thr Thr Gly Ala His Ala
145 150 155 160
Ile Ser Ile Thr Ala Ala Thr Val Gly Ala Ser Gly Thr Thr Thr Cys
165 170 175
Thr Gly Leu Val Thr Gly Leu Ala Thr Gly Ser Gly Pro Leu Ala Ile
180 185 190
Thr Val Ile Leu Ala Pro Ala Gly Leu Thr Thr Leu Gly
195 200 205

Claims (3)

1.一种抑制IgE活性的抗过敏剂，其特征是编码IgE受体胞外段的大分子RNA。
2.权利要求所属大分子RNA的制备，可通过以DNA为模板用RNA聚合酶进行转录来实现。
3.权利要求1所述的抗过敏剂针对的过敏性疾病，包括过敏性鼻炎、春季型黏膜炎、异位型皮肤炎、过敏性结膜炎、荨麻诊、支气管哮喘中至少一种。
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