CN112014508A - 一种护肝片的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种护肝片的质量检测方法，涉及制药技术领域。护肝片的质量检测方法采用液相色谱法检测护肝片制成的待测试样中的绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素共八种组分的含量，包括：以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，测定检测图谱并计算所述八种组分的含量；通过控制流动相A和流动相B的组成，使各组分均能够形成检测谱图，有效检测出以上八种组分的含量，具有高效性、***性、特征性、稳定性等特点。

Description

一种护肝片的质量检测方法
技术领域
本发明涉及制药技术领域，且特别涉及一种护肝片的质量检测方法。
背景技术
护肝片是以柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉和绿豆粉六味药材为主要原料，其功能主治为疏肝理气，健脾消食，具有降低转氨酶作用，用于慢性肝炎及早期肝硬化。护肝片已在临床上应用多年，也已经被广大患者所接受，现市售护肝片种类繁多，但产品质量参差不齐。这主要是由于质量检测方法对护肝片质量控制不够全面，目前有许多关于护肝片检测方法研究，基本都是单一的指纹图谱研究或者是单一成分含量测定、多成分含量测定。
其中，单一的指纹图谱能整体的评估药品质量但很难控制单味药材的优劣，成分含量测定能够很好的控制主要成分但难以控制除药材外其他质量。此外，现有方法检测周期普遍较长，同时采用两种质量检测方法不太现实，很难应用到实际生产当中。
鉴于此，提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种护肝片的质量检测方法，旨在更***、高效地进行护肝片质量的检测，且检测方法具备较好的特征性和稳定性。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了一种护肝片的质量检测方法，采用液相色谱法检测护肝片制成的待测试样中的绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素共八种组分的含量，包括：
以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，测定检测图谱并计算所述八种组分的含量；
其中，流动相A为体积分数为0.03-0.1％的磷酸溶液，流动相B选自乙腈和甲醇中的至少一种。
本发明实施例提供一种护肝片的质量检测方法的有益效果是：其通过将护肝片制成待测试样，利用液相色谱法检测其中的绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素共八种组分的含量，通过控制流动相A和流动相B的组成，使各组分均能够形成检测谱图，有效检测出以上八种组分的含量，具有高效性、***性、特征性、稳定性等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中检测方法的专属性测试的对照品定位图；
图2为本发明实施例中检测方法的专属性特征峰归属图；
图3为特征峰光谱吸收图；
图4为特征峰光谱吸收图；
图5为八种组分的对照图谱；
图6为各批次指纹图谱的叠加图；
图7为不同流动相色谱图对比图；
图8为不同提取方式所得供试品色谱图；
图9为不同检测波长所得供试品色谱图；
图10为不同流速色谱结果对比图；
图11为不同柱温色谱结果对比图；
图12为不同色谱柱的测试对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的护肝片的质量检测方法进行具体说明。
本发明实施例提供了一种护肝片的质量检测方法，采用液相色谱法检测护肝片制成的待测试样中的绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素共八种组分的含量，包括：以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，测定检测图谱并计算八种组分的含量；其中，流动相A为体积分数为0.03-0.1％的磷酸溶液，流动相B选自乙腈和甲醇中的至少一种。
需要说明的是，发明人通过优化流动相的组成，使八种组分均形成有效的检测图谱，精确地检测各组分的含量。若流动相A替换为其他成分均不能形成有效的检测图谱，如采用甲酸会导致基线“塌陷”。
为进一步增加检测的精度，发明人对流动相的组成做了进一步优化，流动相A为体积分数为0.04-0.06％的磷酸溶液，流动相B为乙腈。
在梯度洗脱过程中，控制流速为0.7-0.9mL/min，0.75-0.85mL/min；柱温为 28-32℃；色谱柱为C18色谱柱，如Cortecs T3(4.6×150mm，2.7μm)色谱柱。通过控制流速和柱温使各组分得到有效的分离，提升检测的精确度。
在梯度洗脱过程中，以体积比计，控制洗脱条件为表1：
表1梯度洗脱条件
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
70 32 68
75 95 5
85 95 5
进一步地，在0-25min内，检测波长为320-340nm；在25-42min内，检测波长为200-210nm；在42-85min，检测波长为240-260nm；优选地，在0-25min 内，检测波长为330nm；在25-42min内，检测波长为205nm；在42-85min，检测波长为250nm。通过进一步控制检测波长，使各组分均能够检测出峰，若不采用上述波长的技术方案则很可能出现有些组分检测不到的情况。
在一些优选的实施例中，待测试样的制备是采用乙醇提取，采用甲醇复溶的方法。具体地，待测试样的制备过程包括：将护肝片去包衣并粉碎之后，采用乙醇提取液进行超声提取，经过滤之后将滤液蒸干得到残渣，采用甲醇溶液将残渣复溶，再过滤得到滤液作为待测试样；甲醇溶液的体积分数为40-60％，采用乙醇提取液进行超声提取过程中，所用乙醇提取液的体积分数为90-98％；超声功率为300-400W，超声频率为30-45kHz，超声时间为20-30min。采用此种提取方法能够有效提取试样中的有效成分，提升检测的准确性。
在一些优选的实施例中，采用八种组分制成对照品溶液，并形成对照图谱，按照中药指纹图谱相似度评价***计算，待测试样指纹图谱和对照图谱的相似度大于或等于0.90。对照品溶液的制备包括：将八种组分和溶剂混合，并控制绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素的浓度依次为28-32μg/mL、3-5μg/mL、 0.5-0.7mg/mL、13-17μg/mL、90-110μg/mL、4-6μg/mL、18-22μg/mL、38-42μg/mL；所用的溶剂为甲醇。
进一步地，根据检测图谱计算各组分的含量，绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素的最低含量依次为：0.26mg/g、0.03mg/g、10.0mg/g、0.11mg/g、0.80mg/g、0.13mg/g、 0.07mg/g、0.03mg/g，若八种组分的含量大于或等于对应的最低含量则为合格。通过进一步控制八种组分的最低含量，形成一个质量评价标准，以评价试样是否合格。
在一些优选的实施例中，取多批次的护肝片按上述质量检测方法进行试验，将多批次护肝片的实验数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价***软件，利用中位数法，以随机一批护肝片的色谱图为参照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成对照指纹图谱。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种护肝片的质量检测方法，即对护肝片的指纹图谱及多成分含量检测，护肝片指纹图谱测定的具体步骤如下：
仪器：Waters e2695(PDA检测器)；Thermo U3000(PDA检测器)；Agilent 1260(VWD检测器)；Thermo U3000-QE高分辨质谱仪；电子天平(十万分之一)，XSE105DU，梅特勒-托利多；电子天平(万分之一)，MS204TS/02，梅特勒-托利多；超声仪，P120H，德国ElmaSchmidbauer GmbH；超纯水制备仪，Elix Advantage 15，默克密理博。
材料：护肝片(批号：201705024、201903092、201903034、201902044、 201902037、201902021、201902020、201812170、201812052、201710026、 201707026)，缺五味子、缺柴胡、缺茵陈、缺板蓝根、缺绿豆、缺猪胆粉阴性制剂，黑龙江葵花药业有限公司。
对照品：五味子醇甲，纯度99.7％，中检院；绿原酸，纯度96.8％，中检院；牡荆苷，纯度94.9％，中检院；甘氨猪去氧胆酸，98.7％，源叶生物；柴胡皂苷b2，98.2％，源叶生物；五味子甲素，99.5％，中检院；五味子乙素，99.1％，中检院。
乙腈(色谱纯，Honey-well)，甲酸(质谱纯，Honey-well)，磷酸(色谱纯，Fisher)，超纯水(实验室制备)。
色谱条件与***适用性试验用Cortecs T3(4.6×150mm，2.7μm)色谱柱；以0.05％磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8mL；柱温为30℃；检测波长为：0～25min，330nm，25～42min， 205nm；42～85min，250nm，理论板数按五味子醇甲峰计不得低于3000。
对照品溶液的制备：取绿原酸、牡荆苷、柴胡皂苷b2、甘氨猪去氧、胆酸、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含绿原酸30μg、牡荆苷4μg、甘氨猪去氧胆酸0.6mg、柴胡皂苷B2 15μg、五味子醇甲100μg、柴胡皂苷B1 5μg、五味子甲素20μg、五味子乙素40μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品10片，除去包衣，研细，取约1.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇20mL，密塞，称定重量，超声处理 (功率330W，频率37kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣用50％甲醇溶解并转移至10mL量瓶，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为护肝片供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。取10批不同厂家的护肝片按上述方法进行试验，将上述10 个不同厂家的实验数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价***软件利用中位数法，以随机一批护肝片的色谱图为参照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成对照指纹图谱，并采取外标法计算绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素、五味子乙素的含量。
供试品色谱中应呈现以下8个特征峰，以五味子醇甲为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间，其结果应在规定值的±5％之内。规定值：0.25(峰1)， 0.42(峰2)，0.88(峰3)，0.97(峰4)，1.00(峰5/S峰)，1.02(峰6)， 1.51(峰7)，1.61(峰8)。按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
测试结果：供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价***计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不低于0.90，并且本品绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素、五味子乙素含量应不低于0.09mg/片、0.012mg/片、3.50mg/片、0.04mg/片、0.28mg/片、0.045mg/ 片、0.024mg/片、0.012mg/片、0.024mg/片。
试验例1
测试实施例1中方法的专属性，结果见图1和图2，图1为对照品定位(从上至下依次为：空白溶液，五味子醇甲、绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、五味子甲素、五味子乙素、护肝片201705024)，图2为特征峰归属(从上至下依次为：缺茵陈阴性制剂、缺绿豆阴性制剂、缺猪胆粉阴性制剂、缺柴胡阴性制剂、缺五味子阴性制剂、缺板蓝根阴性制剂、护肝片201705024)。
从图1-2中可知，空白溶液对护肝片指纹图谱测定无干扰，8个特征峰中，绿原酸归属于茵陈，牡荆苷归属于绿豆，甘氨猪去氧胆酸归属于猪胆粉，柴胡皂苷B2与柴胡皂苷B1归属于柴胡，五味子醇甲、五味子甲素与五味子乙素归属于五味子。由图3-4可知，护肝片供试品中8个特征峰的光谱吸收(190nm～400 nm)与相应对照品光谱吸收一致，表明此方法专属性良好。
试验例2
测试实施例1中方法的精密度，按照供试品溶液制备方法，平行制备护肝片供试品溶液6份，以五味子醇甲峰作为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，并运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算其相似度，结果见表2-4。
表2精密度实验结果(相对保留时间)
Figure RE-GDA0002697644040000061
表3精密度实验结果(峰面积)
Figure RE-GDA0002697644040000062
表4精密度实验结果(相似度)
Figure RE-GDA0002697644040000071
从表2-4可知，6份供试品色谱中，各特征峰的相对保留时间RSD％在 0.01～0.11之间，符合要求(RSD％值≤1％)；各特征峰的相对峰面积RSD％值在1.57～12.59之间，符合要求(RSD％值≤15％)；6份供试品的相似度均大于 0.997，符合要求(不得低于0.95)，可见此方法精密度良好。
试验例3
测试实施例1中方法的准确度，按照高、中、低三个浓度(高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测成分量之比为1.5:1，1:1，0.5:1左右)，制备护肝片加标回收率样品，每个浓度平行制备三份，进行液相分析并计算其回收率，结果见表5。
从表5可知，护肝片中绿原酸的回收率在98.9％～107.4％之间，平均值为103.5％，RSD％值为3.09，符合规定(85％≤回收率≤110％；RSD％≤4)；护肝片中牡荆苷的回收率在98.8％～109.7％之间，平均值为103.4％，RSD％值为3.4，符合规定(80％≤回收率≤115％；RSD％≤6)；护肝片中甘氨猪去氧胆酸的回收率在97.9％～103.6％之间，平均值为101.8％，RSD％值为1.4，符合规定(90％≤回收率≤108％；RSD％≤3)护肝片中柴胡皂苷b2的回收率在98.0％～106.6％之间，平均值为107.7％，RSD％值为1.3，符合规定(85％≤回收率≤110％；RSD％≤4)；护肝片中五味子醇甲的回收率在97.1％～101.7％之间，平均值为99.2％，RSD％值为1.3，符合规定(90％≤回收率≤108％；RSD％≤3)，护肝片中柴胡皂苷b1 的回收率在98.2％～109.3％之间，平均值为105.2％，RSD％值为3.1，符合规定(85％≤回收率≤110％；RSD％≤4)。
护肝片中五味子甲素的回收率在98.5％～106.7％之间，平均值为101.8％，RSD％值为1.5，符合规定(90％≤回收率≤108％；RSD％≤3)，护肝片中五味子醇甲的回收率在101.6％～105.4％之间，平均值为103.0％，RSD％值为1.3，符合规定(90％≤回收率≤108％；RSD％≤3)。
表5回收率实验结果
Figure RE-GDA0002697644040000081
试验例4
测试实施例1中方法的稳定性，取一份供试品溶液，分别于0h、4h、8h、 12h、24h与36h考察其稳定性，结果见表6-7。
表6稳定性实验结果(相对保留时间)
Figure RE-GDA0002697644040000082
Figure RE-GDA0002697644040000091
表7稳定性实验结果(峰面积)
Figure RE-GDA0002697644040000092
结果表明，各特征峰的相对保留时间RSD％值在0.008～0.73之间，均小于 1.0％；各特征峰的相对峰面积RSD％值在0.2～1.7之间，均小于2.0％；各时间点所得色谱图的相似度均为1.000。综上，表明护肝片供试品溶液在36h内稳定性良好。
试验例5
测试实施例1中的方法对于色谱柱的耐用性，分别用不同批号色谱柱 (LC04701与LC04702)对空白溶液、混合对照品溶液以及护肝片供试品溶液进行分析，结果见表8-9。
表8耐用性-色谱柱实验结果(相对保留时间)
Figure RE-GDA0002697644040000093
表9耐用性-色谱柱实验结果(峰面积)
Figure RE-GDA0002697644040000094
Figure RE-GDA0002697644040000101
结果表明：运用不同色谱柱，空白溶液对护肝片指纹图谱的测定均无干扰；运用不同色谱柱，各特征峰的相对保留时间RSD％值在0.002～1.04之间，均小于2.0％；各特征峰的相对峰面积RSD％值在0.04～1.04之间，均小于2.0％；两只色谱柱所得的色谱结果相似度为1.000，符合规定。综上，表明此方法在同型号不同批次色谱柱上运行时，方法耐用性良好。
试验例6
测试实施例1中的方法对于磷酸用量的耐用性，分别用不同磷酸添加量的流动相(水相)对空白溶液、混合对照品溶液以及护肝片供试品溶液进行分析，结果见表10-11。
表10耐用性-磷酸用量实验结果(相对保留时间)
Figure RE-GDA0002697644040000102
表11耐用性-磷酸用量实验结果(峰面积)
Figure RE-GDA0002697644040000103
结果表明：运用不同磷酸添加量，空白溶液对护肝片指纹图谱的测定均无干扰；运用不同磷酸添加量，各特征峰的相对保留时间RSD％值在0.02～0.52 之间，均小于1.0％；各特征峰的相对峰面积RSD％值在0.17～1.43之间，均小于2.0％；不同磷酸添加量所得的色谱结果相似度为1.000，符合规定。综上，表明此方法在流动相(水相)中磷酸添加量在0.04％～0.06％之间时，方法耐用性良好。
试验例7
运用护肝片指纹图谱方法对17批护肝片供试品进行液相分析，以五味子醇甲为参照峰，计算各峰相对保留时间与相对峰面积(表12～15)。使用《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012.13723版本)》软件对17批护肝片样品的色谱数据进行处理，采用“中位数”法，时间窗宽度为0.10，特征色谱峰多点校正，对17批护肝片样品指纹图谱色谱峰进行Marck峰匹配生成对照图谱(见图 5)，作为护肝片的指纹图谱，指纹图谱叠加图见图6，17批护肝片样品的相似度结果见表13。
图5中，1-绿原酸，2-牡荆苷，3-甘氨猪去氧胆酸，4-柴胡皂苷B2，5-五味子醇甲，6-柴胡皂苷B1，7-五味子甲素，8-五味子乙素。图6中，S1-201705024、 S2-201706019、S3-201707026、S4-201710026、S5-201711006、S6-201801009、 S7-201812052、S8-201812170、S9-201812179、S10-20191003、S11-201902020、 S12-201902021、S13-201902037、S14-201902044、S15-201903034、 S16-201903092、S17-201903099。
表12样品测定实验结果(相对保留时间)
Figure RE-GDA0002697644040000111
Figure RE-GDA0002697644040000121
表13样品测定实验结果(峰面积)
Figure RE-GDA0002697644040000122
表14样品测定实验结果(相似度)
Figure RE-GDA0002697644040000123
Figure RE-GDA0002697644040000131
(S1-201705024、S2-201706019、S3-201707026、S4-201710026、S5-201711006、S6-201801009、S7-201812052、 S8-201812170、S9-201812179、S10-20191003、S11-201902020、S12-201902021、S13-201902037、S14-201902044、 S15-201903034、S16-201903092、S17-201903099)
表15样品含量测定实验结果(单位：mg/片)
Figure RE-GDA0002697644040000132
Figure RE-GDA0002697644040000141
结果表明，17批护肝片供试品的特征峰相对保留时间(以五味子醇甲为参照峰)RSD％值在0.01～0.36之间，小于1％；17批样品色谱的相似度均大于0.97。
对比试验
为证明本申请中色谱条件控制的优越性，增加了一下对比例。
对比例1
本对比例提供一种护肝片的质量检测方法，与实施例1不同之处仅在于：将流动相A0.05％的磷酸(体积分数)，替换为0.2％的甲酸(体积分数)。实施例1和对比例1的测试图谱对比如图7，当流动相添加甲酸造成的基线“塌陷”。发现乙腈-0.05％磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱时能够使调整波长的色谱图基线更加平稳，并且选择0.05％磷酸作为水相对于猪胆粉与板蓝根的吸收无影响，对特征峰无干扰。
对比例2
本对比例提供一种护肝片的质量检测方法，与实施例1不同之处仅在于：将实施例1中的供试品溶液的制备方法替换为水煎煮、水超声、乙醇超声、甲醇超声、50％甲醇超声、乙酸乙酯超声的方法，测试结果见图8。
具体步骤：取本品10片，除去包衣，研细，取约1.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率330 W，频率37kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣用50％甲醇溶解并转移至10mL 量瓶，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为护肝片供试品溶液。其中水超声、乙醇超声、甲醇超声、50％甲醇超声、乙酸乙酯超声，均为将95％乙醇替换为上述溶剂。
水煎煮制备方法：取本品10片，除去包衣，研细，取约1.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，称定重量，加热回流25分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣用50％甲醇溶解并转移至10mL量瓶，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为护肝片供试品溶液。
结果表明：乙醇、甲醇、50％甲醇超声所提取护肝片供试品色谱信息相近且最全面，其中，乙醇所制备供试品基线在波长切换时抬升最小，但25min前峰因受溶剂效应影响峰形较差。
需要说明的是，对比水煎煮、水超声、乙醇超声、甲醇超声、50％甲醇超声、乙酸乙酯超声，提取方式进行对比考察，采用乙醇提取-50％甲醇复溶的方法作为供试品制备方法，不但操作简单，而且省时高效，能够有效全面的提取护肝片中绿原酸、牡荆苷、柴胡皂苷b2、甘氨猪去氧、胆酸、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素、五味子乙素有效成分，排除其他成分的干扰，并且能够减小25min前因受制剂效应导致峰形差的问题。
对比例3
本对比例提供一种护肝片的质量检测方法，与实施例1不同之处仅在于：将实施例1中的波长控制调整为一直保持250nm，测试结果见图9。
结果表明：采用波长切换检测方法可以检测所有药材成分的特征峰，能够更好的全面控制护肝片质量，而采用单波长(250nm)只能检测到几个特征峰，检测不到绿原酸、牡荆苷、以及甘氨猪去氧胆酸。
需要补充的是，本发明色谱条件中波长的选择，根据各阴性制剂与成品色谱图对比分析，确定各单位药材特征峰信息，选择波长切换检测方法，更全面的控制护肝片质量，使得检测的各个色谱峰灵敏度与响应值均较好，同时排除其他成分的干扰，另根据文献检索得出目前检测甘氨猪去氧胆酸含量方法较为常用的为蒸发光检测器，但是该方法通过波长切换检测使得能够利用紫外检测器检测护肝片中甘氨猪去氧胆酸含量，减少了再次利用蒸发光检测甘氨猪去氧胆酸的麻烦，节约了检测成本。
对比例4
本对比例提供一种护肝片的质量检测方法，与实施例1不同之处仅在于：将实施例1中的流速调整为每分钟1mL，结果见图10。
结果表明：当流速为1.0mL/min时，柴胡皂苷b2与五味子甲素峰未完全分离。
对比例5
本对比例提供一种护肝片的质量检测方法，与实施例1不同之处仅在于：柱温由实施例1中的30℃调整为35℃。
如图11所示，实验结果表明：同样流速，温度升高，6号峰会出现分离的现象；而14号峰(柴胡皂苷b2)与15号峰(五味子醇甲)出现了完全重叠的现象。柱温30℃的选择，能够使图谱中的各个特征峰稳定性好、吸收较强的色谱峰之间具有良好的分离度，且使每个色谱峰的峰形良好。
对比例6
本对比例提供一种护肝片的质量检测方法，与实施例1不同之处仅在于：色谱柱由实施例1中Waters Cortecs T3替换为Agilent Poroshell 120 SB-C18和 Waters X-bridge C18，结果见图12。
由图12可知，同样色谱条件下，色谱柱Waters Cortecs T3(2.7μm，4.6×150 mm)表现最佳，因此选择该色谱柱作为护肝片指纹图谱优化用色谱柱。
综上所述，本发明提供的一种护肝片的质量检测方法，其通过将护肝片制成待测试样，利用液相色谱法检测其中的绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素共八种组分的含量，通过控制流动相A和流动相B的组成，使各组分均能够形成检测谱图，有效检测出以上八种组分的含量，具有高效性、***性、特征性、稳定性等特点。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种护肝片的质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法检测护肝片制成的待测试样中的绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素共八种组分的含量，包括：
以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，测定检测图谱并计算所述八种组分的含量；
其中，流动相A为体积分数为0.03-0.1％的磷酸溶液，流动相B选自乙腈和甲醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，所述流动相A为体积分数为0.04-0.06％的磷酸溶液，流动相B为乙腈。
3.根据权利要求2所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，在所述梯度洗脱过程中，控制流速为0.7-0.9mL/min，优选为0.75-0.85mL/min；
优选地，柱温为28-32℃；优选地，色谱柱为C18色谱柱。
4.根据权利要求2所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，在0-25min内，检测波长为320-340nm；在25-42min内，检测波长为200-210nm；在42-85min，检测波长为240-260nm；
优选地，在0-25min内，检测波长为330nm；在25-42min内，检测波长为205nm；在42-85min，检测波长为250nm。
5.根据权利要求2所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，在所述梯度洗脱过程中，以体积比计，控制洗脱条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 95 5 70 32 68 75 95 5 85 95 5
6.根据权利要求1所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，所述待测试样的制备是采用乙醇提取，采用甲醇复溶的方法；
优选地，所述待测试样的制备过程包括：将所述护肝片去包衣并粉碎之后，采用乙醇提取液进行超声提取，经过滤之后将滤液蒸干得到残渣，采用甲醇溶液将所述残渣复溶，再过滤得到滤液作为所述待测试样；
优选地，所述甲醇溶液的体积分数为40-60％。
7.根据权利要求6所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，采用乙醇提取液进行超声提取过程中，所用乙醇提取液的体积分数为90-98％；
优选地，超声功率为300-400W，超声频率为30-45kHz，超声时间为20-30min。
8.根据权利要求1所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，采用所述八种组分制成对照品溶液，并形成对照图谱，按照中药指纹图谱相似度评价***计算，要求待测试样指纹图谱和对照图谱的相似度大于或等于0.90。
9.根据权利要求8所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备包括：将所述八种组分和溶剂混合，并控制绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素的浓度依次为28-32μg/mL、3-5μg/mL、0.5-0.7mg/mL、13-17μg/mL、90-110μg/mL、4-6μg/mL、18-22μg/mL、38-42μg/mL；
优选地，在制备所述对照品溶液过程中所用的溶剂为甲醇。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的护肝片的质量检测方法，其特征在于，根据检测图谱计算各组分的含量，若含量大于或等于所述八种组分各自对应的最低含量则为合格，绿原酸、牡荆苷、甘氨猪去氧胆酸、柴胡皂苷b2、五味子醇甲、柴胡皂苷b1、五味子甲素和五味子乙素的最低含量依次为：0.26mg/g、0.03mg/g、10.0mg/g、0.11mg/g、0.80mg/g、0.13mg/g、0.07mg/g、0.03mg/g；
优选地，取多批次的护肝片按权利要求1-9中任一项所述的质量检测方法进行试验，将多批次护肝片的实验数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价***软件，利用中位数法，以随机一批护肝片的色谱图为参照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成对照指纹图谱。
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