CN111944706B - 一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用，属于基因工程领域。为了提高衣康酸的产量，本发明提供了一种产衣康酸的重组土曲霉菌株，是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的；出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)；所述反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株，其中产量最高的菌株在摇瓶水平上比出发菌株提高了约50％，具有很强的应用价值。

Description

一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用。

背景技术

衣康酸(itaconic acid)是目前在聚合物工业中用作单体或共聚单体，主要用于合成腈纶化纤、树脂、塑料、橡胶、涂料、表面活性剂、高分子螯合剂、造纸、医药、农药、轻工、食品、丝绸等领域,也被鉴定为哺乳动物体内产生的具有抗菌活性的代谢物。

在土曲霉中，衣康酸的代谢途径是由三羧酸循环分流出来的，三羧酸循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的催化作用下脱羧形成衣康酸。玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis是另外一种能天然合成衣康酸的微生物，2016年研究人员发现玉蜀黍黑粉菌的衣康酸合成途径与土曲霉有差异，它是利用反式乌头酸作为前体，在反式乌头酸脱羧酶(trans-aconitate decarboxylase，Tad1)的催化作用下脱羧形成衣康酸(Elena Geiser,Sandra K Przybilla,Alexandra Friedrich et al,Ustilagomaydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans-aconitate.Microbial Biotechnology,2016,9,116–126)。

近几十年来提高衣康酸产量的尝试集中在进行传统诱变筛选高产菌株和发酵工艺优化等方面，但都没有使得衣康酸的发酵产量得到重大突破。

发明内容

为了提高衣康酸的产量，本发明提供了一种产衣康酸的重组土曲霉菌株，所述重组土曲霉菌株是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的；所述出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)。

在本发明的一个实施例中，所述出发菌株为土曲霉CICC40205、土曲霉NRRL1960、土曲霉DSM23081、土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

在本发明的一个实施例中，所述反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施例中，编码所述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

在本发明的一个实施例中，所述重组土曲霉菌株中含有反式乌头酸脱羧酶的表达盒，所述表达盒由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt、反式乌头酸脱羧酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC组成。

在本发明的一个实施例中，所述反式乌头酸脱羧酶的表达盒核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明还提供了上述产衣康酸的重组土曲霉菌株的构建方法，是在土曲霉菌株中导入编码所述反式乌头酸脱羧酶的基因构建获得重组土曲霉菌株。

在本发明的一个实施例中，所述重组土曲霉菌株的构建方法，步骤如下：

1)反式乌头酸脱羧酶表达盒的制备：将反式乌头酸脱羧酶tad1基因针对土曲霉表达进行密码子优化，优化后的反式乌头酸脱羧酶tad1基因的5’端与构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt相连，3’端与构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC相连，连接后获得反式乌头酸脱羧酶表达盒；

2)转化：将所述反式乌头酸脱羧酶表达盒导入土曲霉，获得重组土曲霉菌株。

本发明还提供了上述产衣康酸的重组土曲霉菌株在制备衣康酸中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述应用是指将所述重组土曲霉菌株培养于液体发酵培养基经发酵生产衣康酸。

在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基每升配方为：140gL^-1葡萄糖，2gL^{- 1}NH₄NO₃，0.2gL^-1(NH₄)₂HPO₄，20mgL^-1FeSO₄，0.4gL^-1MgSO₄，40mgL^-1ZnSO₄，40mgL^-1CuSO₄，余量为水，PH为3.5。

有益效果

申请人发现顺乌头酸能够自发转化成反式乌头酸，因此在土曲霉中也会有反式乌头酸的存在，据此提出在土曲霉中引入玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶，在顺乌头酸脱羧合成衣康酸的基础上再增加一条衣康酸合成途径，从而强化衣康酸的合成。

本发明所具有的优点：本发明提供的基因工程改造土曲霉以提高衣康酸发酵产量的方法，相较于传统的物理、化学等诱变方式，本发明方法目的明确，可操作性强，便于筛选。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株，其中产量最高的菌株在摇瓶水平上比出发菌株提高了约50％，具有很强的应用价值。

附图说明

图1为本发明中提到的土曲霉改造产衣康酸代谢途径图；

图2为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒构建在pUC57-Kan载体上；

图3为本发明实施例提供的吡啶硫胺素抗性筛选标记的载体；

图4为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒与吡啶硫胺素抗性筛选标记表达盒构建在pEasy-Blunt载体上；

图5为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒和潮霉素抗性元件进行共转化的示意图；

图6为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒和吡啶硫胺素抗性元件进行共转化的示意图；

图7为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达元件和潮霉素抗性元件构建成一个表达盒进行土曲霉转化的示意图；

图8为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达元件和吡啶硫胺素抗性元件构建成一个表达盒进行土曲霉转化的示意图；

图9为本发明实施例提供的HPLC分析菌株发酵液中衣康酸的纯度及含量；

图10为本发明实施例提供的反式乌头酸脱羧酶表达盒与潮霉素B抗性基因hph共转化获得的重组土曲霉菌株摇瓶发酵产衣康酸能力的比较图；

图11为本发明实施例提供的反式乌头酸脱羧酶基因表达盒与ptrA构建成一个表达盒转化获得的重组土曲霉菌株摇瓶发酵产衣康酸能力的比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司PlasmidMini KitI试剂盒(D6943-02),DNA片段回收采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-02),凝胶回收采用OMEGA公司GelExtraction Kit试剂盒(D2500-01)。

土曲霉CICC40205购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

土曲霉NRRL1960购买自美国农业菌种保藏中心(ARS Culture Collection)。

土曲霉DSM23081购买自德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)。

土曲霉TN484，记载在Yahiro,K.,Takahama,T.,Park,Y.S.,Okabe,M.,Breedingof Aspergillus-Terreus Mutant Tn-484 for Itaconic Acid Production with High-Yield,Journal of Fermentation andBioengineering,1995,79(5):506-508。

土曲霉TN484-M1，记载在Dwiarti,L.,Yamane,K.,Yamatani,H.,Kahar,P.,Okabe,M.,Purification and characterization of cis-aconitic acid decarboxylase fromAspergillus terreus TN484-M1,J Biosci Bioeng,2002,94(1):29-33。

质粒pSGF957,由Seoul National university得到，质粒记载在Kim,J.G.,Choi,Y.D.,Chang,Y.J.,Kim,S.U.,Genetic transformation of Monascus purpureusDSM1379，Biotechnology Letters,2003,25,1509–1514。

IPM液体培养基：60g L^-1葡萄糖，2g L^-1 NH₄NO₃，20mg L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^-1FeSO₄，0.4g L^-1 MgSO₄，4.4mg L^-1 ZnSO₄，0.5g/L玉米浆，余量为水，pH 2.5-5.5。

再生筛选培养基平板PDA-SH：3.9g L^-1马铃薯右旋糖琼脂培养基(Difco^TM PotatoDextrose Agar,BD,LOT:1165825)，和1.2M山梨醇，余量为水，灭菌后冷却至约55℃时加入潮霉素B(Solarbio，CatalogNo.：M419099)至终浓度为100μg/mL，制备平板。

再生筛选培养基平板CD-SPt：10g L^-1葡萄糖，3g L^-1 NaNO₃，2g L^-1 KCl，1g L^-1KH₂PO₄，0.5g L^-1 MgSO₄，20mg L^-1 FeSO₄，1.5g L^-1琼脂，和1.2M山梨醇，余量为水，灭菌后冷却至约55℃时加入吡啶硫胺素(Sigma，CatalogNo.：P0256)至终浓度为100μg/L，制备平板。

筛选培养基平板PDA-H：3.9g L^-1马铃薯右旋糖琼脂培养基(Difco^TM PotatoDextrose Agar,BD,LOT:1165825)，余量为水，灭菌后冷却至约55℃时加入潮霉素B(Solarbio，CatalogNo.：M419099)至终浓度为100μg/mL，制备平板。

筛选培养基平板CD-Pt：10g L^-1葡萄糖，3g L^-1 NaNO₃，2g L^-1 KCl，1g L^-1 KH₂PO₄，0.5g L^-1 MgSO₄，20mg L^-1 FeSO₄，1.5g L^-1琼脂，余量为水，灭菌后冷却至约55℃时加入吡啶硫胺素(Sigma，CatalogNo.：P0256)至终浓度为100μg/L，制备平板。

土曲霉产孢培养基：10gL^-1葡萄糖，2gL^-1 NaNO₃，0.2gL^-1 KH₂PO₄，5gL^-1MgSO₄，0.02mg L^-1FeSO₄，0.5gL^-1NaCl，0.04gL^-1ZnSO₄，0.04gL^-1CuSO₄，0.5％麸皮，1.5％琼脂粉，余量为水，115℃灭菌25min，制备平板。

土曲霉发酵培养基：140g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，0.2g L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^{- 1}FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，40mg L^-1ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，余量为水，用硫酸调节pH2.5-5.5。

本发明以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌株，通过基因工程改造在出发菌株基因组中***反式乌头酸脱羧酶基因表达盒得到重组土曲霉菌株，实现衣康酸产量的提高，其中出发菌株为目前已知的产衣康酸的土曲霉，如土曲霉CICC40205、土曲霉NRRL1960、土曲霉DSM23081、土曲霉TN484、土曲霉TN484-M1或其他能够生产衣康酸的基因工程菌或者野生菌株等，下面以土曲霉CICC40205为例，具体描述本发明所述重组土曲霉菌株的构建方法。

实施例1.构建表达反式乌头酸脱羧酶重组土曲霉菌株

1.土曲霉反式乌头酸脱羧酶表达盒的构建：本发明所述的反式乌头酸脱羧酶tad1基因为玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶基因tad1，编码的反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

人工合成反式乌头酸脱羧酶tad1基因，并针对土曲霉表达进行密码子优化，优化后的序列如SEQ ID No.2所示，将其连接构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC后，克隆在pUC57-Kan载体上，构建获得质粒pmWM22(图2)。

以PgpdAt-743(5’-ttacactctgggaggatccaggtact-3’)和TtrpC-R(5’-gtcgtgccagtcgactctaga-3’)为引物对，以质粒pcWM22为模板进行PCR扩增PgpdAt-tad1-TtrpC片段，产物纯化回收后得到反式乌头酸脱羧酶表达盒PgpdAt-tad1-TtrpC，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.反式乌头酸脱羧酶表达盒与潮霉素B抗性hph基因表达盒共转化土曲霉原生质体，获得重组土曲霉菌株，具体方法如下：

1)土曲霉原生质体的制备

将土曲霉CICC40205的孢子悬液接种至50mL液体培养基IPM中，孢子浓度约为10⁷个/mL，在200rmp、37℃培养12-18h。用无菌单层100目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取1g菌丝，加入10mL酶解液，在30℃、120rpm处理1-2h。酶解液成分为：1％纤维素酶(Sigma，CatalogNo.：C1184)、1％裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、1％蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO₄，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。

将上述酶解后的混合液用300目尼龙布过滤，收集滤液。4℃离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH8.0，50mMCaCl₂)洗涤一次，最后把原生质体重悬于150μl预冷的STC，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。

2)潮霉素B筛选标记基因hph表达盒的构建

以hph-F(5’-ttcgggatcgcaagcgtaaag-3’)和hph-R(5’-caattatctttgcgaacccagg-3’)为引物对，以质粒pSGF957为模板进行PCR扩增PtrpC-hph-TtrpC片段，PtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶基因启动子，hph为潮霉素磷酸转移酶基因，TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；扩增产物纯化回收后，得到潮霉素B抗性hph基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC。

3)反式乌头酸脱羧酶表达盒与抗性基因hph共转化土曲霉原生质体(图5)：

在上述原生质体悬液中加入约5μg(体积不超过10μL)的反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒DNA和1μg潮霉素B抗性hph基因表达盒DNA，再加入50μL PSTC(40％PEG4000，50Mm Tris-HCl pH8.0，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1.5mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板PDA-SH，在30℃、黑暗条件下培养3-4天。

从平板上将转化子转接至筛选平板PDA-H上(称取4g马铃薯右旋糖琼脂培养基溶解于100ml蒸馏水中，灭菌，冷却至约55℃时加入潮霉素至终浓度为100μg/mL，制备平板)，在30℃培养3-5天，得到转化子。

上述含有PgpdAt-tad1-TtrpC表达盒的重组土曲霉菌株的制备过程中，也可以将反式乌头酸脱羧酶表达盒与潮霉素B抗性hph基因表达盒连接为一个表达盒，然后转化原生质体(图7)不影响阳性转化子的筛选以及基因型的鉴定。

4)反式乌头酸脱羧酶表达盒与抗性基因hph共转化重组土曲霉菌株基因型的验证：

挑取上述获得的重组土曲霉转化子接种于PDA-H平板上培养孢子，然后分别将孢子接种于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，以PgpdAt-F743(5’-ttacactctgggaggatccaggtact-3’)和TtrpC-R(5’-gtcgtgccagtcgactctaga-3’)为引物对进行PCR，扩增***基因组中的PgpdAt-tad1-Ttrp元件；以hph-F(5’-ttcgggatcgcaagcgtaaag-3’)和hph-R(5’-caattatctttgcgaacccagg-3’)为引物对，扩增***重组菌中的PtrpC-hph-TtrpC片段，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子中PgpdAt-tad1-TtrpC元件的整合情况。电泳结果显示挑选的转化子中都能扩增到PtrpC-hph-TtrpC条带。部分转化子中可以扩增到PgpdAt-tad1-Ttrp，以出发菌株CICC40205基因组DNA模板作为阴性对照，没有扩增到DNA片段。因此，证明这些转化子中都成功整合了PgpdAt-tad1-Ttrp表达盒。

将转化子转接到PDA-H平板上进行传代培养，传代3次。然后再分别收集孢子用生理盐水进行适当的梯度稀释，取100μL涂布于PDA-H平板上，使其长出独立的单菌落，即为单孢分离。再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离，共进行4次单孢分离传代培养。单孢分离后的重组菌株再次进行基因型鉴定进行验证。挑取部分验证正确的重组菌株进行摇瓶发酵筛选。

实施例2.以ptrA作为筛选标记构建表达反式乌头酸脱羧酶重组土曲霉菌株

重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中所述重组土曲霉菌株中使用的筛选标记基因为吡啶硫胺素筛选标记ptrA基因，具体方法描述如下：

1.土曲霉反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒的构建，参照实施例1。

2.用吡啶硫胺素抗性基因ptrA作为筛选标记构建表达tad1土曲霉菌株

1)反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒与ptrA共转化土曲霉

以ptrA-F(5’-gggcaattgattacgggatc-3’)和ptrA-R(5’-atggggtgacgatgagccgc-3’)为引物对，以质粒pPTR II(Takara)为模板进行PCR扩增吡啶硫胺素抗性基因ptrA，经纯化回收后得到ptrA片段。将该表达盒克隆至Peasy-Blunt载体(TransGen Biotech)上，得到质粒pmWM24(图3)。

参照实施例1中的制备方法制备土曲霉CICC40205原生质体。在原生质体悬液中加入约5μg(体积不超过10μL)的反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒DNA和1μg筛选标记ptrA片段，(图6所示共转化)再加入50μL PSTC(40％PEG4000，50Mm Tris-HCl pH8.0，50mMCaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1.5mLPSTC，混匀后室温放置20min；然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板CD-SPt，在30℃、黑暗条件下培养3－4天。从平板上将转化子转接至筛选平板CD-Pt上，在30℃培养3-5天，得到转化子。

挑取制备的重组土曲霉转化子接种于CD-Pt平板上培养孢子，然后分别将孢子接种于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，以PgpdAt-F743(5’-ttacactctgggaggatccaggtact-3’)和TtrpC-R(5’-gtcgtgccagtcgactctaga-3’)为引物对进行PCR，扩增***基因组中的tad1表达元件PgpdAt-tad1-TtrpC，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子中PgpdAt-tad1-TtrpC元件的整合情况。电泳结果显示部分转化子中能扩增到PgpdAt-tad1-TtrpC条带。

2)反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达元件与筛选标记基因ptrA串联整合至土曲霉基因组

反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达元件与筛选标记基因ptrA串联的DNA元件构建方法如下：将pmWM24质粒采用限制性内切酶XhoI和NotI酶切，回收酶切后的片段作为载体骨架；将pWM22质粒采用限制性内切酶XhoI、NotI和DraI酶切，回收2.9kb的tad1表达盒PgpdAt-tad1-TtrpC；将以上回收的两个片段使用T₄DNA ligase相连，得到质粒pWM23(图4)。以PgpdAt-743(5’-ttacactctgggaggatccaggtact-3’)和ptrA-R(5’-atggggtgacgatgagccgc-3’)为引物对，以质粒pmWM23为模板进行PCR扩增，产物纯化回收后得到反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达元件和吡啶硫胺素筛选标记基因ptrA融合在一起的表达盒PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette(图8)。

或者：参照实施例1中的制备方法制备土曲霉CICC40205原生质体。在原生质体悬液中加入约5μg PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette表达盒DNA，再加入50μLPSTC(40％PEG4000，50Mm Tris-HCl pH8.0，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1.5mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板CD-SPt，在30℃、黑暗条件下培养3－4天。从平板上将转化子转接至筛选平板CD-Pt上，在30℃培养3-5天，得到转化子。

挑取制备的重组土曲霉转化子接种于CD-Pt平板上培养孢子，然后分别将孢子接种于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，以PgpdAt-F743(5’-ttacactctgggaggatccaggtact-3’)和ptrA-R(5’-atggggtgacgatgagccgc-3’)为引物对进行PCR，扩增***基因组中的PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrAcassette元件，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子中PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette元件的整合情况。电泳结果显示部分转化子中能扩增到PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette条带。以出发菌株CICC40205基因组DNA模板作为阴性对照，没有扩增到DNA片段。因此，证明这些转化子中都成功整合了PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette表达盒。

3.阳性转化子的验证及分离纯化

将基因型验证正确的阳性转化子转接到CD-Pt平板上进行传代培养，传代3次。然后再分别收集孢子用生理盐水进行适当的梯度稀释，取100μL涂布于CD-Pt平板上，使其长出独立的单菌落，即为单孢分离。再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离，共进行4次单孢分离传代培养。单孢分离后的重组菌株再次进行基因型鉴定进行验证。挑取部分验证正确的重组菌株进行摇瓶发酵筛选。

实施例3.重组土曲霉发酵产衣康酸

1.重组土曲霉菌株产衣康酸的摇瓶筛选

将实施例1和实施例2所得重组菌株传代后稳定的重组土曲霉菌株分别接种至土曲霉产孢培养基，32℃培养6天获得成熟的孢子。再分别将各个培养至成熟的孢子接种至衣康酸发酵培养基中(500ml三角瓶中装有55ml衣康酸发酵培养基)，每株菌做三瓶平行，37℃，220rpm发酵72h。过滤除去发酵液中的菌丝，发酵上清液进行适度稀释后进行高效液相色谱分析(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)。

2.发酵液中衣康酸的含量及纯度分析

选取重组菌株和出发菌株CICC40205的发酵上清液稀释后进行高效液相色谱分析，以不同浓度的衣康酸的标准品作为标准曲线，分析比较发酵液中衣康酸的含量及纯度。色谱条件如下：色谱柱:AminexHPX-87H Organic Acid Analysis Column,300mm×7.8mm(Bio-rad,Cat No.1250140)；流动相：5mmol/L硫酸；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；检测温度：30℃；紫外检测器(210nm)。结果如图9所示，保留时间在15.581min的峰为衣康酸，分析结果表明，在摇瓶发酵水平上重组菌株发酵液中的衣康酸纯度与出发菌株CICC40205相比没有显著变化，都在99％以上。以hph作为筛选标记的重组菌株发酵液中的衣康酸产量与出发菌株CICC40205相比有显著提高，提高约10％～50％(图10)。以ptrA作为筛选标记的重组菌株发酵液中的衣康酸产量与出发菌株CICC40205相比也有显著提高，最高可以提高40％(图11)。本发明所涉及的氨基酸或核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：

MAPALNANPTTKRDELSAPSASHKLGMSSMASRAAGGGLKLTGLPDLSDSAGTLSDIFGTPQMREIWSDQNRVACYLEIEAALAIVQADLGIIPKNAAHEIVEHCRVQEIDWALYKQKTELIGYPVLGIVQQLVANCKDGLGEYCHWGATTQDITDTATVMQIRQSLTLVKQRLDSIVSSLEHLAEQHRNVPMAARSNLKQAVPITFGFKMARFLATFRRHQQRLVELEKRVYTLEFGGAAGNLSSLGDQGIATHDALAKMLDLAPAEIAWHTEHDRFAEVGTFLGLLTGTLAKLATDIKLMSQTEVGEVGEPFISNRGSSSTMPQKNNPISCVYIHACAANVRQGAAALLDAMQSDHERGTGPWEIIWVQLPLMMNWTSAALNNADFVLRGLQVFPDAMQHNLDLSKGLIVSEAVMMGLGNTLGRQYAHDAVYECCRTAFVQDRPLLDVLLENHEIASKLDRTELEKLCDPANYLGQCSQWIDRVLSRPSSA

(a)序列特征：

长度：493Aa

类型：蛋白序列

(b)分子类型：氨基酸

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)

(f)特异性名称：反式乌头酸脱羧酶Tad1

SEQ ID NO.2：反式乌头酸脱羧酶tad1基因

atggcacctgcacttaacgcaaaccctacaacaaagagagacgaacttagcgcacctagcgcaagccataaacttggaatgagcagcatggcaagccgcgcagcaggaggaggacttaaacttacaggacttcctgatcttagcgatagcgcaggaacacttagcgatatctttggaacacctcagatgcgcgaaatctggagcgatcagaaccgcgtggcatgctatcttgaaatcgaagcagcacttgcaatcgtgcaggcagatcttggaatcatccctaagaatgcggcacatgaaatcgtggaacattgccgcgtgcaggaaatcgattgggcactttataaacagaaaacagaacttatcggatatcctgtgcttggaatcgtgcagcagcttgtggcaaactgcaaagatggacttggagaatattgccattggggagccaccacacaggatatcacagatacagcaacagtgatgcagatccgccagagccttacacttgtgaaacagcgccttgatagcatcgtgagcagccttgaacatcttgcagaacagcatcgcaacgtgcctatggcagcacgcagcaaccttaaacaggcagtgcctatcacatttggatttaagatggcccgctttcttgcaacatttcgccgccatcagcagcgccttgtggagctcgagaagcgggtttatacacttgaatttggaggagcagcaggaaaccttagcagccttggagatcagggaatcgcaacacatgatgcacttgcaaagatgttagatcttgcacctgcagaaatcgcatggcatacagaacatgatcgctttgcagaagtgggaacatttcttggacttcttacaggaacacttgcaaagctggcgacagatatcaaacttatgagccagacagaggtcggagaggtaggtgagccctttataagtaaccgcggaagcagcagcacaatgcctcagaagaataatcctatcagctgcgtgtatatccatgcatgcgcagcaaacgtgcgccagggagcagcagcacttcttgacgccatgcaatcagaccatgaacgcggaacaggaccttgggaaatcatctgggtgcagcttcctcttatgatgaactggacaagcgcagcacttaacaacgcagatttcgtattgcgcggacttcaggtgtttcctgacgcgatgcaacacaatcttgatcttagcaaaggacttatcgtgagcgaagcagtgatgatgggacttggaaacacacttggacgccagtatgcacatgatgcagtgtatgaatgctgccgcacagcatttgtgcaggatcgccctcttcttgatgtgcttcttgagaatcacgaaatcgcaagcaaacttgatcgcacagagctggagaagctatgtgatcctgcaaactatcttggacagtgcagccagtggatcgatcgcgtgcttagccgccctagcagcgcatga

SEQ ID NO.3：

ctcgagttacactctgggaggatccaggtacttccattcttactaggaagtatttcggcctagactaatacaacgaaagaaactgttcgattctacgggaaaagtactccaattccattacatcatcgcattctccctctcgtaaggtacctaccacaaacccccactatcgttcatccgtccccggttacaacgggaagaaaaagcccggggagagggggaagaagaaaatcccaagggacgggaatagccgtgcggaagagaagacgattagcctaggtagaagcctcatggccgaccatttgattccgaaaagctggcaaaacattcacgagatagacacagtgaggacccggacgatgccctatgcggcgcgctgattggccaggccgggcagtgccgaagcagcaaatatcgtgagtctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaagggttgctggggagctggtcagcggcgcaagccgggagggcgactgagctctgtagcttttgccccgtctgtccgtccggtgtagagtggcagaccaccgcctgctgcgcctcccattgggtcttccccaacgtgactgggtcgttgcgtcagtccatgtcgctgcctttttcttcctccccctcccccgctgtccttcttcttcttcttcttctctctttctcccatcatcctctcatcctctgcctttcccatcgaactcacttcttctaccaacaactcatcaatcatcacaacatggcacctgcacttaacgcaaaccctacaacaaagagagacgaacttagcgcacctagcgcaagccataaacttggaatgagcagcatggcaagccgcgcagcaggaggaggacttaaacttacaggacttcctgatcttagcgatagcgcaggaacacttagcgatatctttggaacacctcagatgcgcgaaatctggagcgatcagaaccgcgtggcatgctatcttgaaatcgaagcagcacttgcaatcgtgcaggcagatcttggaatcatccctaagaatgcggcacatgaaatcgtggaacattgccgcgtgcaggaaatcgattgggcactttataaacagaaaacagaacttatcggatatcctgtgcttggaatcgtgcagcagcttgtggcaaactgcaaagatggacttggagaatattgccattggggagccaccacacaggatatcacagatacagcaacagtgatgcagatccgccagagccttacacttgtgaaacagcgccttgatagcatcgtgagcagccttgaacatcttgcagaacagcatcgcaacgtgcctatggcagcacgcagcaaccttaaacaggcagtgcctatcacatttggatttaagatggcccgctttcttgcaacatttcgccgccatcagcagcgccttgtggagctggagaagcgggtttatacacttgaatttggaggagcagcaggaaaccttagcagccttggagatcagggaatcgcaacacatgatgcacttgcaaagatgttagatcttgcacctgcagaaatcgcatggcatacagaacatgatcgctttgcagaagtgggaacatttcttggacttcttacaggaacacttgcaaagctggcgacagatatcaaacttatgagccagacagaggtcggagaggtaggtgagccctttataagtaaccgcggaagcagcagcacaatgcctcagaagaataatcctatcagctgcgtgtatatccatgcatgcgcagcaaacgtgcgccagggagcagcagcacttcttgacgccatgcaatcagaccatgaacgcggaacaggaccttgggaaatcatctgggtgcagcttcctcttatgatgaactggacaagcgcagcacttaacaacgcagatttcgtattgcgcggacttcaggtgtttcctgacgcgatgcaacacaatcttgatcttagcaaaggacttatcgtgagcgaagcagtgatgatgggacttggaaacacacttggacgccagtatgcacatgatgcagtgtatgaatgctgccgcacagcatttgtgcaggatcgccctcttcttgatgtgcttcttgagaatcacgaaatcgcaagcaaacttgatcgcacagagctggagaagctatgtgatcctgcaaactatcttggacagtgcagccagtggatcgatcgcgtgcttagccgccctagcagcgcatgaccacttaacgttactgaaatcatcaaacagcttgacgaatctggatataagatcgttggtgtcgatgtcagctccggagttgagacaaatggtgttcaggatctcgataagatacgttcatttgtccaagcagcaaagagtgccttctagtgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacgcgtttcgggtttacctcttccagatacagctcatctgcaatgcattaatgcattggacctcgcaaccctagtacgcccttcaggctccggcgaagcagaagaatagcttagcagagtctattttcattttcgggagacgagatcaagcagatcaacggtcgtcaagagacctacgagactgaggaatccgctcttggctccacgcgactatatatttgtctctaattgtactttgacatgctcctcttctttactctgatagcttgactatgaaaattccgtcaccagcccctgggttcgcaaagataattgcactgtttcttccttgaactctcaagcctacaggacacacattcatcgtaggtataaacctcgaaaatcattcctactaagatgggtatacaatagtaaccatggttgcctagtgaatgctccgtaacacccaatacgccggccgaaacttttttacaactctcctatgagtcgtttacccagaatgcacaggtacacttgtttagaggtaagcggccgc

(a)序列特征：

长度：2950bp

类型：剪辑序列

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工合成

(f)特异性名称：反式乌头酸脱羧酶tad1基因表达盒

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换均应属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所、浙江国光生化股份有限公司

<120> 一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 493

<212> PRT

<213> 反式乌头酸脱羧酶Tad1

<400> 1

Met Ala Pro Ala Leu Asn Ala Asn Pro Thr Thr Lys Arg Asp Glu Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ser Ala Ser His Lys Leu Gly Met Ser Ser Met Ala Ser

20 25 30

Arg Ala Ala Gly Gly Gly Leu Lys Leu Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser

35 40 45

Asp Ser Ala Gly Thr Leu Ser Asp Ile Phe Gly Thr Pro Gln Met Arg

50 55 60

Glu Ile Trp Ser Asp Gln Asn Arg Val Ala Cys Tyr Leu Glu Ile Glu

65 70 75 80

Ala Ala Leu Ala Ile Val Gln Ala Asp Leu Gly Ile Ile Pro Lys Asn

85 90 95

Ala Ala His Glu Ile Val Glu His Cys Arg Val Gln Glu Ile Asp Trp

100 105 110

Ala Leu Tyr Lys Gln Lys Thr Glu Leu Ile Gly Tyr Pro Val Leu Gly

115 120 125

Ile Val Gln Gln Leu Val Ala Asn Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr

130 135 140

Cys His Trp Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ile Thr Asp Thr Ala Thr Val

145 150 155 160

Met Gln Ile Arg Gln Ser Leu Thr Leu Val Lys Gln Arg Leu Asp Ser

165 170 175

Ile Val Ser Ser Leu Glu His Leu Ala Glu Gln His Arg Asn Val Pro

180 185 190

Met Ala Ala Arg Ser Asn Leu Lys Gln Ala Val Pro Ile Thr Phe Gly

195 200 205

Phe Lys Met Ala Arg Phe Leu Ala Thr Phe Arg Arg His Gln Gln Arg

210 215 220

Leu Val Glu Leu Glu Lys Arg Val Tyr Thr Leu Glu Phe Gly Gly Ala

225 230 235 240

Ala Gly Asn Leu Ser Ser Leu Gly Asp Gln Gly Ile Ala Thr His Asp

245 250 255

Ala Leu Ala Lys Met Leu Asp Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ala Trp His

260 265 270

Thr Glu His Asp Arg Phe Ala Glu Val Gly Thr Phe Leu Gly Leu Leu

275 280 285

Thr Gly Thr Leu Ala Lys Leu Ala Thr Asp Ile Lys Leu Met Ser Gln

290 295 300

Thr Glu Val Gly Glu Val Gly Glu Pro Phe Ile Ser Asn Arg Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ser Thr Met Pro Gln Lys Asn Asn Pro Ile Ser Cys Val Tyr Ile

325 330 335

His Ala Cys Ala Ala Asn Val Arg Gln Gly Ala Ala Ala Leu Leu Asp

340 345 350

Ala Met Gln Ser Asp His Glu Arg Gly Thr Gly Pro Trp Glu Ile Ile

355 360 365

Trp Val Gln Leu Pro Leu Met Met Asn Trp Thr Ser Ala Ala Leu Asn

370 375 380

Asn Ala Asp Phe Val Leu Arg Gly Leu Gln Val Phe Pro Asp Ala Met

385 390 395 400

Gln His Asn Leu Asp Leu Ser Lys Gly Leu Ile Val Ser Glu Ala Val

405 410 415

Met Met Gly Leu Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gln Tyr Ala His Asp Ala

420 425 430

Val Tyr Glu Cys Cys Arg Thr Ala Phe Val Gln Asp Arg Pro Leu Leu

435 440 445

Asp Val Leu Leu Glu Asn His Glu Ile Ala Ser Lys Leu Asp Arg Thr

450 455 460

Glu Leu Glu Lys Leu Cys Asp Pro Ala Asn Tyr Leu Gly Gln Cys Ser

465 470 475 480

Gln Trp Ile Asp Arg Val Leu Ser Arg Pro Ser Ser Ala

485 490

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213> 反式乌头酸脱羧酶tad1基因

<400> 2

atggcacctg cacttaacgc aaaccctaca acaaagagag acgaacttag cgcacctagc 60

gcaagccata aacttggaat gagcagcatg gcaagccgcg cagcaggagg aggacttaaa 120

cttacaggac ttcctgatct tagcgatagc gcaggaacac ttagcgatat ctttggaaca 180

cctcagatgc gcgaaatctg gagcgatcag aaccgcgtgg catgctatct tgaaatcgaa 240

gcagcacttg caatcgtgca ggcagatctt ggaatcatcc ctaagaatgc ggcacatgaa 300

atcgtggaac attgccgcgt gcaggaaatc gattgggcac tttataaaca gaaaacagaa 360

cttatcggat atcctgtgct tggaatcgtg cagcagcttg tggcaaactg caaagatgga 420

cttggagaat attgccattg gggagccacc acacaggata tcacagatac agcaacagtg 480

atgcagatcc gccagagcct tacacttgtg aaacagcgcc ttgatagcat cgtgagcagc 540

cttgaacatc ttgcagaaca gcatcgcaac gtgcctatgg cagcacgcag caaccttaaa 600

caggcagtgc ctatcacatt tggatttaag atggcccgct ttcttgcaac atttcgccgc 660

catcagcagc gccttgtgga gctcgagaag cgggtttata cacttgaatt tggaggagca 720

gcaggaaacc ttagcagcct tggagatcag ggaatcgcaa cacatgatgc acttgcaaag 780

atgttagatc ttgcacctgc agaaatcgca tggcatacag aacatgatcg ctttgcagaa 840

gtgggaacat ttcttggact tcttacagga acacttgcaa agctggcgac agatatcaaa 900

cttatgagcc agacagaggt cggagaggta ggtgagccct ttataagtaa ccgcggaagc 960

agcagcacaa tgcctcagaa gaataatcct atcagctgcg tgtatatcca tgcatgcgca 1020

gcaaacgtgc gccagggagc agcagcactt cttgacgcca tgcaatcaga ccatgaacgc 1080

ggaacaggac cttgggaaat catctgggtg cagcttcctc ttatgatgaa ctggacaagc 1140

gcagcactta acaacgcaga tttcgtattg cgcggacttc aggtgtttcc tgacgcgatg 1200

caacacaatc ttgatcttag caaaggactt atcgtgagcg aagcagtgat gatgggactt 1260

ggaaacacac ttggacgcca gtatgcacat gatgcagtgt atgaatgctg ccgcacagca 1320

tttgtgcagg atcgccctct tcttgatgtg cttcttgaga atcacgaaat cgcaagcaaa 1380

cttgatcgca cagagctgga gaagctatgt gatcctgcaa actatcttgg acagtgcagc 1440

cagtggatcg atcgcgtgct tagccgccct agcagcgcat ga 1482

<210> 3

<211> 2950

<212> DNA

<213> 反式乌头酸脱羧酶tad1基因表达盒

<400> 3

ctcgagttac actctgggag gatccaggta cttccattct tactaggaag tatttcggcc 60

tagactaata caacgaaaga aactgttcga ttctacggga aaagtactcc aattccatta 120

catcatcgca ttctccctct cgtaaggtac ctaccacaaa cccccactat cgttcatccg 180

tccccggtta caacgggaag aaaaagcccg gggagagggg gaagaagaaa atcccaaggg 240

acgggaatag ccgtgcggaa gagaagacga ttagcctagg tagaagcctc atggccgacc 300

atttgattcc gaaaagctgg caaaacattc acgagataga cacagtgagg acccggacga 360

tgccctatgc ggcgcgctga ttggccaggc cgggcagtgc cgaagcagca aatatcgtga 420

gtctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaagggttg ctggggagct ggtcagcggc 480

gcaagccggg agggcgactg agctctgtag cttttgcccc gtctgtccgt ccggtgtaga 540

gtggcagacc accgcctgct gcgcctccca ttgggtcttc cccaacgtga ctgggtcgtt 600

gcgtcagtcc atgtcgctgc ctttttcttc ctccccctcc cccgctgtcc ttcttcttct 660

tcttcttctc tctttctccc atcatcctct catcctctgc ctttcccatc gaactcactt 720

cttctaccaa caactcatca atcatcacaa catggcacct gcacttaacg caaaccctac 780

aacaaagaga gacgaactta gcgcacctag cgcaagccat aaacttggaa tgagcagcat 840

ggcaagccgc gcagcaggag gaggacttaa acttacagga cttcctgatc ttagcgatag 900

cgcaggaaca cttagcgata tctttggaac acctcagatg cgcgaaatct ggagcgatca 960

gaaccgcgtg gcatgctatc ttgaaatcga agcagcactt gcaatcgtgc aggcagatct 1020

tggaatcatc cctaagaatg cggcacatga aatcgtggaa cattgccgcg tgcaggaaat 1080

cgattgggca ctttataaac agaaaacaga acttatcgga tatcctgtgc ttggaatcgt 1140

gcagcagctt gtggcaaact gcaaagatgg acttggagaa tattgccatt ggggagccac 1200

cacacaggat atcacagata cagcaacagt gatgcagatc cgccagagcc ttacacttgt 1260

gaaacagcgc cttgatagca tcgtgagcag ccttgaacat cttgcagaac agcatcgcaa 1320

cgtgcctatg gcagcacgca gcaaccttaa acaggcagtg cctatcacat ttggatttaa 1380

gatggcccgc tttcttgcaa catttcgccg ccatcagcag cgccttgtgg agctggagaa 1440

gcgggtttat acacttgaat ttggaggagc agcaggaaac cttagcagcc ttggagatca 1500

gggaatcgca acacatgatg cacttgcaaa gatgttagat cttgcacctg cagaaatcgc 1560

atggcataca gaacatgatc gctttgcaga agtgggaaca tttcttggac ttcttacagg 1620

aacacttgca aagctggcga cagatatcaa acttatgagc cagacagagg tcggagaggt 1680

aggtgagccc tttataagta accgcggaag cagcagcaca atgcctcaga agaataatcc 1740

tatcagctgc gtgtatatcc atgcatgcgc agcaaacgtg cgccagggag cagcagcact 1800

tcttgacgcc atgcaatcag accatgaacg cggaacagga ccttgggaaa tcatctgggt 1860

gcagcttcct cttatgatga actggacaag cgcagcactt aacaacgcag atttcgtatt 1920

gcgcggactt caggtgtttc ctgacgcgat gcaacacaat cttgatctta gcaaaggact 1980

tatcgtgagc gaagcagtga tgatgggact tggaaacaca cttggacgcc agtatgcaca 2040

tgatgcagtg tatgaatgct gccgcacagc atttgtgcag gatcgccctc ttcttgatgt 2100

gcttcttgag aatcacgaaa tcgcaagcaa acttgatcgc acagagctgg agaagctatg 2160

tgatcctgca aactatcttg gacagtgcag ccagtggatc gatcgcgtgc ttagccgccc 2220

tagcagcgca tgaccactta acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata 2280

taagatcgtt ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga 2340

taagatacgt tcatttgtcc aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat 2400

gtcaacaaga ataaaacgcg tttcgggttt acctcttcca gatacagctc atctgcaatg 2460

cattaatgca ttggacctcg caaccctagt acgcccttca ggctccggcg aagcagaaga 2520

atagcttagc agagtctatt ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt 2580

caagagacct acgagactga ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc 2640

taattgtact ttgacatgct cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt 2700

caccagcccc tgggttcgca aagataattg cactgtttct tccttgaact ctcaagccta 2760

caggacacac attcatcgta ggtataaacc tcgaaaatca ttcctactaa gatgggtata 2820

caatagtaac catggttgcc tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact 2880

tttttacaac tctcctatga gtcgtttacc cagaatgcac aggtacactt gtttagaggt 2940

aagcggccgc 2950

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> hph-F

<400> 4

ttcgggatcg caagcgtaaa g 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> hph-R

<400> 5

caattatctt tgcgaaccca gg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ptrA-F

<400> 6

gggcaattga ttacgggatc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> ptrA-R

<400> 7

atggggtgac gatgagccgc 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> PgpdAt-743

<400> 8

ttacactctg ggaggatcca ggtact 26

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> TtrpC-R

<400> 9

gtcgtgccag tcgactctag a 21

Claims (6)

1.一种产衣康酸的重组土曲霉菌株，其特征在于，所述重组土曲霉菌株是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的；所述出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)；所述反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述重组土曲霉菌株中含有反式乌头酸脱羧酶的表达盒，所述表达盒由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt、反式乌头酸脱羧酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC组成；所述反式乌头酸脱羧酶的表达盒核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述产衣康酸的重组土曲霉菌株，其特征在于，所述出发菌株为土曲霉CICC40205、土曲霉NRRL1960、土曲霉DSM23081、土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

3.一种权利要求1或2任意一项所述产衣康酸的重组土曲霉菌株的构建方法，其特征在于，是在土曲霉菌株中导入编码所述反式乌头酸脱羧酶的基因构建重组土曲霉菌株。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)反式乌头酸脱羧酶表达盒的制备：将反式乌头酸脱羧酶tad1基因针对土曲霉表达进行密码子优化，优化后的反式乌头酸脱羧酶tad1基因的5’端与构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt相连，3’端与构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC相连，连接后获得反式乌头酸脱羧酶表达盒；

2)转化：将所述反式乌头酸脱羧酶表达盒导入土曲霉，获得重组土曲霉菌株。

5.权利要求1或2任意一项所述产衣康酸的重组土曲霉菌株在制备衣康酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是指将所述重组土曲霉菌株培养于液体发酵培养基经发酵生产衣康酸。

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