CN110343624B - 一种重组菌及其在提高纤维素酶产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组菌及其在提高纤维素酶产量中的应用。本发明保护的重组菌是将特异DNA分子导入里氏木霉得到的。所述特异DNA分子中具有里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因。本发明首次鉴定了里氏木霉血红蛋白结构域，并且首次在里氏木霉菌株中成功表达该血红蛋白结构域，提高了菌株发酵效率，且明显提高了胞外蛋白总产量和主要纤维素酶活性。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于降低成本提高产量具有重要意义。

Description

一种重组菌及其在提高纤维素酶产量中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组菌及其在提高纤维素酶产量中的应用。

背景技术

木质纤维素生物质是地球上最为丰富的可再生资源，其主要多糖成分——纤维素和半纤维素——能在纤维素酶和半纤维素酶作用下被高效降解成寡糖和单糖，进而被用于食品、饲料、生物能源等多行业的生产。纤维素酶在这一过程中起着关键性作用，其产量和活性高低直接关系着食品、饲料、生物能源等相关产品的成本及应用。

丝状真菌里氏木霉是生产纤维素酶的主要工业菌株，具有较强的纤维素酶和半纤维素酶分泌能力，全球大约90％以上的纤维素酶产品是通过里氏木霉生成的。目前工业上主要是应用丝状真菌深层发酵技术来生产纤维素酶。已有研究表明，氧气是里氏木霉生产纤维素酶的关键因素。深层发酵过程中发酵液非常粘稠，容易导致局部供氧不足，使得细胞生长减慢、甚至死亡，同时纤维素酶产量显著降低。传统解决方法，提高搅拌转速或者增加通气量，能耗大、成本高且不能有效解决供氧不足的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组菌及其在提高纤维素酶产量中的应用。

本发明提供了一种促进里氏木霉生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而促进里氏木霉生产纤维素酶；所述特异DNA分子中具有里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因。

本发明还保护一种提高里氏木霉生产纤维素酶的产量方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而促进里氏木霉生产纤维素酶；所述特异DNA分子中具有里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因。

所述里氏木霉血红蛋白结构域为如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列1自5′末端第2311至2775位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码里氏木霉血红蛋白结构域的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码里氏木霉血红蛋白结构域的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

以上任一所述特异DNA分子具有gpdA启动子和里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因的表达。

以上任一所述gpdA启动子具体可为序列表的序列1自5′末端第1至2310位核苷酸所示的DNA分子。

以上任一所述特异DNA分子还包括TrpC终止子。

所述TrpC终止子具体可为序列表的序列1自5′末端第2776至3545位核苷酸所示的DNA分子。

以上任一所述特异DNA分子具体可如序列表的序列1所示。

本发明还保护以上任一所述特异DNA分子。

本发明还保护以上任一所述特异DNA分子或含有所述特异DNA分子的重组表达载体的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)促进里氏木霉生产纤维素酶；

(c2)提高里氏木霉生产纤维素酶的产量。

所述重组表达载体具体可为通过重组克隆的方法将所述里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因与带有gpdA启动子的表达载体进行重组得到的重组表达载体。

所述重组表达载体具体可为通过重组克隆的方法将所述里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因与pNOM102质粒进行重组得到的重组表达载体。

本发明还保护一种重组菌，是将以上任一所述的特异DNA分子导入里氏木霉得到的。

所述重组菌的制备方法包括如下步骤：

(d1)将所述特异DNA分子加至里氏木霉原生质体溶液中，再加入PEG 4000溶液，室温静置20min；

(d2)向步骤(d1)得到的混合溶液中加入PEG 4000溶液；

(d3)将步骤(d2)得到的混合溶液与山梨醇水溶液混合后接种至含有山梨醇的MM固体培养基培养，得到转化子；

(d4)将步骤(d3)得到的转化子接种至PDA固体培养基培养，用无菌水洗脱得到孢子悬液；

(d5)将步骤(d4)得到的孢子悬液接种至含Triton X-100的MM固体培养基培养，得到重组菌。

所述(d1)具体可为将pyr4标记基因片段与特异DNA分子一起加至里氏木霉原生质体溶液中再加入PEG 4000溶液，室温静置20min。

所述pyr4标记基因片段与特异DNA分子的摩尔比具体可为1:4。

所述pyr4标记基因片段具体可如序列表的序列3所示。

所述pyr4标记基因片段、特异DNA分子和里氏木霉原生质体溶液的配比具体可为1摩尔：4摩尔：0.2mL。所述里氏木霉原生质体溶液中原生质体的浓度具体可为4×10⁷-8×10⁷个/mL。

所述(d1)中，所述PEG 4000溶液具体可为50％(体积百分比)PEG 4000溶液。所述PEG 4000溶液和所述原生质体溶液的配比关系具体可为为0.2mL：50μL。

所述(d2)中，所述PEG 4000溶液具体可为50％(体积百分比)PEG 4000溶液。所述PEG 4000溶液和所述原生质体溶液的配比关系具体可为0.2mL：1mL。

所述(d3)中，所述山梨醇水溶液中山梨醇的浓度具体可为1.0M。所述含有山梨醇的MM固体培养基中的山梨醇的终浓度具体可为1.0M。所述培养温度具体可为30℃。所述培养时间具体可为5天。

所述(d4)中，所述培养温度具体可为30℃。所述培养时间为4-7天。所述孢子悬液的浓度具体可为10⁷个/mL。

所述(d5)具体可为将(d4)得到的孢子悬液稀释10³-10⁶倍后接种至含Triton X-100的MM固体培养基培养，得到重组菌。所述含有Triton X-100的MM固体培养基中TritonX-100的体积百分含量具体可为0.1％。所述培养度具体可为30℃。所述培养时间具体可为5天。

所述里氏木霉原生质体溶液的制备方法包括如下步骤：

(e1)将里氏木霉接种至产孢培养基中培养，得到孢子悬液；

(e2)将步骤(e2)得到的孢子悬液接种至MM液体培养基中培养，离心收集菌体沉淀；

(e3)将步骤(e2)得到的菌体沉淀用无菌水洗涤3次，用硫酸镁水溶液洗涤1次。

(e4)采用裂解液将步骤(e3)处理后的菌体沉淀重悬进行裂解反应，反应结束后收集原生质体沉淀；

(e5)将步骤(e4)得到的原生质体沉淀用山梨醇水溶液重悬，得到原生质体溶液。

所述(e1)中，所述产孢培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在产孢培养基中的浓度为马铃薯200g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉20g/L；所述溶剂为水。

所述(e1)中，所述孢子悬液的浓度为10⁷-10⁸个/mL。

所述(e2)中，所述孢子悬液和MM液体培养基的体积比为1:20。所述培养的条件具体可为200rpm、28℃。所述培养的时间具体可为14小时。

所述(e3)中，所述硫酸镁水溶液中硫酸镁的浓度为1.2M。

所述(e4)中，所述裂解液由溶壁酶、纤维素酶的硫酸镁水溶液组成。所述硫酸镁水溶液中硫酸镁的浓度为1.2M。所述溶壁酶、纤维素酶和硫酸镁水溶液的配比关系具体可为150mg：15mg：15mL。

所述(e4)中，所述裂解反应的反应温度具体可为30℃。所述裂解反应的反应时间具体可为1.5小时。所述裂解反应结束时采用山梨醇水溶液终止反应。所述山梨醇水溶液中山梨醇的浓度为0.6M。

所述(e4)中，收集原生质体沉淀的方法为取反应体系，用200目筛子过滤除去残余的菌丝，将滤液室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。

所述(e5)中，所述山梨醇水溶液中山梨醇的浓度为1.0M。

本发明还保护以上任一所述重组菌在制备纤维素酶中的应用。

本发明还保护一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：培养以上任一所述的重组菌，得到纤维素酶。

以上任一所述里氏木霉具体可为里氏木霉Tu6。

本发明首次鉴定了里氏木霉血红蛋白结构域，并且首次在里氏木霉菌株中成功表达该血红蛋白结构域，提高了菌株发酵效率，且明显提高了胞外蛋白总产量和主要纤维素酶活性。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于降低成本提高产量具有重要意义。

附图说明

图1为重组菌TrHb1的PCR鉴定结果。图1A为PCR鉴定示意图，图1B为PCR产物电泳结果，泳道1为以里氏木霉TU-6基因组DNA为模板扩增结果，泳道2为以重组菌TrHb1基因组DNA为模板扩增结果，泳道3为以重组表达载体pNOM102-TrHb1为模板扩增结果。

图2为western blot实验检测转化菌株中血红蛋白结构域TrHb1的表达情况。泳道1为里氏木霉TU-6胞内蛋白western结果，泳道2为重组菌TrHb1胞内蛋白western结果。

图3为重组菌TrHb1和里氏木霉TU-6CO差光谱分析结果。

图4为重组菌TrHb1和里氏木霉TU-6发酵不同时间点SDS-PAGE分析。C表示里氏木霉TU-6，T表示重组菌TrHb1。

图5为里氏木霉TU-6和重组菌TrHb1纤维素诱导培养基发酵胞外蛋白浓度测定情况。

图6为里氏木霉TU-6和重组菌TrHb1纤维素诱导培养基发酵滤纸酶活测定情况。

图7为里氏木霉TU-6和重组菌TrHb1纤维素诱导培养基发酵CMC-Na酶活测定情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pNOM102质粒：参考文献：Punt P J,Dingemanse M A,Kuyvenhoven A,etal.Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulansgpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.[J].Gene,1990,93(1):101-9.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。

pSK-pyr4质粒：在发明专利：一种高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用中公开(申请号：201510684461.X)；参考文献Qin L N,Cai F R,Dong XR,et al.Improved production of heterologous lipase in Trichoderma reesei byRNAi mediated gene silencing of an endogenic highly expressed gene[J].Bioresource technology,2012,109:116-122.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。

里氏木霉TU-6：ATCC，编号：MYA-256。

溶壁酶：SIGMA公司，货号：L1412-5G。

纤维素酶(CELLULASE“ONOZUKA”R-10)：日本Yakult公司，货号：130918-01。

产孢培养基：马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min。

MM液体培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.06g、CaCl₂ 0.06g、FeSO₄·7H₂O 0.5mg、MnSO₄·H₂O 0.16mg、ZnSO₄·7H₂O 0.14mg、CoCl₂ 0.2mg，蒸馏水定容至100mL，调pH值为5.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。

MM固体培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.06g、CaCl₂ 0.06g、FeSO₄·7H₂O 0.5mg、MnSO₄·H₂O 0.16mg、ZnSO₄·7H₂O 0.14mg、CoCl₂ 0.2mg，蒸馏水定容至100mL，调pH值为5.0，琼脂粉2g，115℃高压蒸汽灭菌20min。

发酵培养基：MM液体培养基中加入1％(质量百分比)微晶纤维素。

重组克隆试剂盒：

MultiS重组试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司。

以下实施例中用到的引物信息如表1所示。

表1引物信息

实施例1、重组菌的获得

一、重组表达载体pNOM102-TrHb1的构建

1、以里氏木霉TU-6的基因组DNA为模板，采用引物Trhb1-F和引物Trhb1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(Trhb1基因片段)。

2、以pNOM102质粒为模板，采用引物trpC-F和引物gpd-R组成的引物对进行PCR扩增，得到含有gpdA启动子和TrpC终止子的约5728bp的表达载体。

3、采用重组克隆试剂盒对步骤1得到的PCR扩增产物(Trhb1基因片段)和步骤2得到的表达载体进行重组，得到重组表达载体pNOM102-TrHb1(已经测序验证)。

二、里氏木霉原生质体制备

1、将里氏木霉TU-6接种至产孢培养基中培养，去离子水洗脱孢子得到孢子悬液(浓度为10⁷-10⁸个/mL)。

2、将5mL步骤1得到的孢子悬液接种至100mL MM液体培养基中，200rpm、28℃培养14小时，离心收集菌体沉淀。

3、将步骤2得到的菌体沉淀用无菌水洗涤3次，用1.2M硫酸镁水溶液洗涤1次。

4、取步骤3得到的菌体，加入15ml裂解液(在15mL 1.2M硫酸镁水溶液中加入150mg溶壁酶和15mg纤维素酶)，30℃裂解反应1.5小时，然后加入15mL 0.6M山梨醇水溶液终止反应。

5、完成步骤4后，取反应体系，用200目筛子过滤除去残余的菌丝，将滤液室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。

6、将步骤5得到的原生质体沉淀用10mL 1.0M山梨醇水溶液重悬，室温3000rpm离心10分钟，收集原生质体沉淀。

7、重复步骤6。

8、将步骤7得到的原生质体沉淀用200μL 1.0M山梨醇水溶液重悬，得到原生质体溶液(4×10⁷-8×10⁷个/mL)。

三、重组菌的制备

1、以步骤一制备的重组表达载体pNOM102-TrHb1为模板，采用引物M13F和引物M13R进行扩增，得到PCR产物(TrHb1表达片段)。TrHb1表达片段如序列表的序列1所示。TrHb1表达片段如序列表的序列1所示。

序列序列1中，自5’端第1-2310位核苷酸为gpdA启动子区段，第2311-2775位核苷酸为Trhb1基因区段，第2776-3545位核苷酸为TrpC终止子区段。序列表的序列1自5’端第2311-2772位核苷酸编码序列2所示的蛋白质。

2、以pSK-pyr4质粒为模板，采用引物M13F和引物M13R进行扩增，得到PCR产物，将PCR产物(pyr4标记基因片段)，pyr4标记基因片段如序列表的序列3所示。

3、将步骤1得到4摩尔的TrHb1表达片段和1摩尔的步骤2得到的pyr4标记基因片段混合后加入至0.2mL步骤二得到的原生质体溶液中，再加入50μL 50％(体积百分比)PEG4000溶液，冰浴30min。

4、向步骤3得到的混合溶液中加入1mL 50％(体积百分比)PEG 4000溶液，室温放置20min。

5、向步骤4得到的混合溶液中加入1mL 1.0M山梨醇水溶液。

6、取0.5mL步骤5得到混合溶液，与4mL1.0M山梨醇水溶液混合后铺于含1.0M山梨醇的MM固体培养基上，30℃恒温培养箱培养5天，得到转化子。

7、将步骤6得到的转化子接种至PDA固体培养基上，30℃恒温培养箱培养4-7天，待长出菌丝后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，得到孢子悬液(浓度为10⁷个/mL)，将梯度稀释10³-10⁶倍的孢子悬液涂布与含0.1％(体积百分比)Triton X-100的MM固体培养基上，30℃恒温培养箱培养5天，挑取单个菌落，得到重组菌TrHb1。

8、取里氏木霉TU-6和步骤7得到的重组菌TrHb1，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物TF和引物TR进行PCR鉴定，设置采用重组表达载体pNOM102-TrHb1作为模板的阳性对照。PCR鉴定示意图见图1A。结果如图1B所示。结果表明，重组菌TrHb1扩增出特异的约2.2kb条带，与以重组表达载体pNOM102-TrHb1为模板扩增结果相同，而里氏木霉TU-6没有扩增出特异条带。将泳道2和3中的约2.2kb的条带回收并测序，测序结果如序列表序列1自5’端第996-3222位所示。结果表明，重组菌TrHb1构建成功。

9、以pNOM102质粒为模板，采用引物M13F和引物M13R进行扩增，得到PCR产物。

10、采用步骤9得到的PCR产物替代TrHb1表达片段，按照步骤3-7进行操作，得到对照重组菌。

四、重组菌的TrHb1蛋白表达鉴定

待测菌株为：里氏木霉TU-6、重组菌TrHb1和对照重组菌。

1、将待测菌株接种至产孢培养基中培养，去离子水洗脱孢子得到孢子悬液(浓度为约10⁷个/mL)。

2、将1mL孢子悬液接种至50mL含有2％(质量百分比)葡萄糖的MM液体培养基中，200rpm、28℃培养48小时，无菌纱布过滤收集菌丝体。

3、将步骤2得到的菌丝体沉淀加液氮研磨，然后使用30mL 50mM、pH7.0的磷酸钾缓冲液重悬菌体，8000rpm离心40min，取上清(即为胞内蛋白提取液)。

4、取步骤3得到的胞内蛋白提取液进行Western blot检测。

结果如图2所示。结果表明，重组菌TrHb1在17kDa左右有明显特异条带而里氏木霉TU-6没有特异条带，说明TrHb1蛋白在重组菌中成功表达。对照重组菌也没有特异条带产生。

5、取2mL步骤3得到的胞内蛋白提取液，加入20mg连二亚硫酸钠，通CO气体5min，通过分光光度计光谱扫描测定TrHb1活性。

结果如图3所示。结果表明，重组菌TrHb1胞内蛋白提取液在420nm波长处有特征吸收峰而里氏木霉TU-6没有，说明TrHb1基因在里氏木霉中成功表达且能在胞内行使正常功能。对照重组菌在420nm波长处没有特征吸收峰。

实施例2、重组菌的发酵应用

待测菌株：里氏木霉TU-6、重组菌TrHb1和对照重组菌。

1、用去离子水悬浮待测菌株的孢子，得到孢子悬液(浓度为10⁷个/mL)。

2、将4mL步骤1得到的孢子悬液接种至400mL含有2％(质量百分比)葡萄糖的MM液体培养基中，200rpm、28℃培养48h，将发酵液离心收集菌丝体。

3、将步骤2得到的菌丝体用无菌水冲洗后接种至100mL含1％(质量百分比)结晶纤维素Avicel的发酵培养基中，28℃、200rpm培养，在第48h、72h、96h、120h和144h进行如下测定：

(1)将发酵体系离心取上清，测定上清液中的蛋白浓度(胞外蛋白浓度)并进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE电泳分析结果如图4所示。胞外蛋白浓度测定结果如图5所示。结果表明，胞外蛋白分泌有明显差异，重组菌TrHb1胞外蛋白浓度比里氏木霉TU-6明显提高，蛋白浓度测定结果也显示重组菌TrHb1胞外蛋白比里氏木霉TU-6明显提高，第120小时重组菌TrHb1胞外蛋白浓度比里氏木霉TU-6提高了81％。对照重组菌与里氏木霉TU-6的统计结果无显著性差异。

(2)将发酵体系离心取上清，测定上清液的滤纸酶活和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)酶活，测定方法参照IUPAC(INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY)标准方法，参考文献：Ghose T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure&AppliedChemistry,1987,59(2):257-268.。

滤纸酶活统计结果见图6，羧甲基纤维素钠酶活统计结果见图7。

结果表明，重组菌TrHb1发酵液中纤维素酶活也有显著提高，第120小时重组菌TrHb1发酵液滤纸酶活比里氏木霉TU-6提高了约36％，CMC-Na酶活却没有明显的提高。对照重组菌与里氏木霉TU-6的统计结果无显著性差异。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种重组菌及其在提高纤维素酶产量中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattccctt gtatctctac acacaggctc aaatcaataa gaagaacggt tcgtcttttt 60

cgtttatatc ttgcatcgtc ccaaagctat tggcgggata ttctgtttgc agttggctga 120

cttgaagtaa tctctgcaga tctttcgaca ctgaaatacg tcgagcctgc tccgcttgga 180

agcggcgagg agcctcgtcc tgtcacaact accaacatgg agtacgataa gggccagttc 240

cgccagctca ttaagagcca gttcatgggc gttggcatga tggccgtcat gcatctgtac 300

ttcaagtaca ccaaccctct tctgatccag tcgatcatcc cgctgaaggg cgctttcgaa 360

tcgaatctgg ttaagatcca cgtcttcggg aagccagcga ctggtgacct ccagcgtccc 420

tttaaggctg ccaacagctt tctcagccag ggccagccca agaccgacaa ggcctccctc 480

cagaacgccg agaagaactg gaggggtggt gtcaaggagg agtaagctcc ttattgaagt 540

cggaggacgg agcggtgtca agaggatatt cttcgctctg tattatagat aagatgatga 600

ggaattggag gtagcatagc ttcatttgga tttgctttcc aggctgagac tctagcttgg 660

agcatagagg gtccctttgg ctttcaatat tctcaagtat ctcgagtttg aacttattcc 720

cgtgaacctt ttattcacca atgagcattg gaatgaacat gaatctgagg actgcaatcg 780

ccatgaggtt ttcgaaatac atccggatgt cgaaggcttg gggcacctgc gttggttgaa 840

tttagaacgt ggcactattg atcatccgat agctctgcaa agggcgttgc acaatgcaag 900

tcaaacgttg ctagcagttc caggtggaat gttatgatga gcattgtatt aaatcaggag 960

atatagcatg atctctagtt agctcaccac aaaagtcaga cggcgtaacc aaaagtcaca 1020

caacacaagc tgtaaggatt tcggcacggc tacggaagac ggagaagccc accttcagtg 1080

gactcgagta ccatttaatt ctatttgtgt ttgatcgaga cctaatacag cccctacaac 1140

gaccatcaaa gtcgtatagc taccagtgag gaagtggact caaatcgact tcagcaacat 1200

ctcctggata aactttaagc ctaaactata cagaataaga tggtggagag cttataccga 1260

gctcccaaat ctgtccagat catggttgac cggtgcctgg atcttcctat agaatcatcc 1320

ttattcgttg acctagctga ttctggagtg acccagaggg tcatgacttg agcctaaaat 1380

ccgccgcctc caccatttgt agaaaaatgt gacgaactcg tgagctctgt acagtgaccg 1440

gtgactcttt ctggcatgcg gagagacgga cggacgcaga gagaagggct gagtaataag 1500

cgccactgcg ccagacagct ctggcggctc tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg 1560

accggccgcc cctccgcccc gaagtggaaa ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc 1620

tattgcatca tcggagaata tggagcttca tcgaatcacc ggcagtaagc gaaggagaat 1680

gtgaagccag gggtgtatag ccgtcggcga aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag 1740

tccaattgct tccgatctgg taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag 1800

agcgagtacc cggcgcgtaa gctccctaat tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa 1860

atatcgtgcc tctcctgctt tgcccggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg 1920

ccagcggcgc agaccgggaa cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga 1980

cctgctgagg tccctcagtc cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt 2040

cggcggggtt gacaaggtcg ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct 2100

ccccaccagc tgctcttttc ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc 2160

catccaagaa cctttatttc ccctaagtaa gtactttgct acatccatac tccatccttc 2220

ccatccctta ttcctttgaa cctttcagtt cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact 2280

aacagctacc ccgcttgagc agacatcaca atggccaccc tcaccgcaga ccaaatcgcc 2340

atcatcaagt ccaccgtgcc catcatccgc gagcacggca ccaccgtcac aaccaccttc 2400

tacgcaaaca tgctcgccgc ccaccccgag ctcaagaact acttctccct ccgcaaccag 2460

caaacgggag cccagcaggc cgccctcgcc aactcggtcc tcgccgcggc aacctacatc 2520

gacaacctgg ccgtcatcgc cggcgccgtc gagcgcatcg cccagaagca cgcctcgctc 2580

ttcatcaagc ccgagcacta ccccatcgtc ggcaagtacc tcatcggcgc ctttgagcag 2640

atcctcggcg acgccttcac cccggagatc aaggacgcct gggtcaccgc ctacggcatc 2700

ctggccgaca tcttcatcaa gcgcgagcag cagctctacg ccgaggccgg ctggcatcat 2760

catcatcatc attaaggatc cacttaacgt tactgaaatc atcaaacagc ttgacgaatc 2820

tggatataag atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt gagacaaatg gtgttcagga 2880

tctcgataag atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt gccttctagt gatttaatag 2940

ctccatgtca acaagaataa aacgcgtttt cgggtttacc tcttccagat acagctcatc 3000

tgcaatgcat taatgcattg actgcaacct agtaacgcct tncaggctcc ggcgaagaga 3060

agaatagctt agcagagcta ttttcatttt cgggagacga gatcaagcag atcaacggtc 3120

gtcaagagac ctacgagact gaggaatccg ctcttggctc cacgcgacta tatatttgtc 3180

tctaattgta ctttgacatg ctcctcttct ttactctgat agcttgacta tgaaaattcc 3240

gtcaccagcn cctgggttcg caaagataat tgcatgtttc ttccttgaac tctcaagcct 3300

acaggacaca cattcatcgt aggtataaac ctcgaaatca nttcctacta agatggtata 3360

caatagtaac catgcatggt tgcctagtga atgctccgta acacccaata cgccggccga 3420

aactttttta caactctcct atgagtcgtt tacccagaat gcacaggtac acttgtttag 3480

aggtaatcct tctttctaga agtcctcgtg tactgtgtaa gcgcccactc cacatctcca 3540

ctcga 3545

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ile Ala Ile Ile Lys Ser Thr Val

1 5 10 15

Pro Ile Ile Arg Glu His Gly Thr Thr Val Thr Thr Thr Phe Tyr Ala

20 25 30

Asn Met Leu Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Asn Tyr Phe Ser Leu Arg

35 40 45

Asn Gln Gln Thr Gly Ala Gln Gln Ala Ala Leu Ala Asn Ser Val Leu

50 55 60

Ala Ala Ala Thr Tyr Ile Asp Asn Leu Ala Val Ile Ala Gly Ala Val

65 70 75 80

Glu Arg Ile Ala Gln Lys His Ala Ser Leu Phe Ile Lys Pro Glu His

85 90 95

Tyr Pro Ile Val Gly Lys Tyr Leu Ile Gly Ala Phe Glu Gln Ile Leu

100 105 110

Gly Asp Ala Phe Thr Pro Glu Ile Lys Asp Ala Trp Val Thr Ala Tyr

115 120 125

Gly Ile Leu Ala Asp Ile Phe Ile Lys Arg Glu Gln Gln Leu Tyr Ala

130 135 140

Glu Ala Gly Trp His His His His His His

145 150

<210> 3

<211> 2908

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gactagactg acccccccgg ttgggcccct cgtcccgtct ccaacagagc accaccagac 60

aaagacccct gcccgcgcga atccagaccc ccccagcaat tccgggcctc gttgatcctc 120

ctctactgta gttgtacata catacctacc gactgcattg cattggtaca gctgcaggca 180

cttccaggca cggccaccaa attgcagcgg cccttgcttg cttgcttggt tcgagaacta 240

ggatctgtgt cttttgcctt gccttgtctt gtctgggttc ctgctcgtct gcggcaatcg 300

gaacgccgcc agtgcggtgc caagcaaacc agccaaggta ggtacctacc actaggcttc 360

ttttctcgtt gtctcactct ctcttttcct ctttgtcctc tcttatcccc atcttttctc 420

tctctctctg ctcctttcct aaccacttcc ctacctttct ctttttcctt ttcttgtcat 480

ctccatcttg gctgacgaaa aaggtctgac tgggtaggta ttatctggca gacttgtgtg 540

tatcattcac cctatttctg cttcatagta catgtactgt acctgaacgg ctcaaccgct 600

atttacgact cttatttttt tgtggcgttg gtcacgtttg ccagctgttg tccgtctttc 660

tagggctcct caaacttgac ctgaccgagc tccctttctg gacccggtgg gcttcacttc 720

cagctgctga gcgacctgag ccgaacatcc tcagtccttg tccagcgcaa ttcattttct 780

ttccttttct ttttttttat tcctttcttt acttttattc tctctttttc tcctcttcct 840

cttcttcttc tttctcctcc tcctccatat cctcactctc gtctccctca ttactaccct 900

ctcggctcct caggtccacc aaccctcccg cacccaaacc tctgccgctg aaacccattc 960

ggtggtcgcc gttttttttt tttttttttt ctcaccccca aagtcgcaat atcgggtatc 1020

gccgccggca ttgaatcgcc ttctccgcta gcatcgacta ctgctgctct gctctcgttg 1080

ccagcgctgc tccctagaat tttgaccagg ggacgagccc gacattaaag caactccctc 1140

gcctcgagac gactcggatc gcacgaaatt ctcccaatcg ccgacagttc ctactcctct 1200

tcctcccgca cggctgtcgc gcttccaacg tcattcgcac agcagaattg tgccatctct 1260

ctcttttttt tccccccctc taaaccgcca caacggcacc ctaagggtta aactatccaa 1320

ccagccgcag cctcagcctc tctcagcctc atcagccatg gcaccacacc cgacgctcaa 1380

ggccaccttc gcggccagga gcgagacggc gacgcacccg ctgacggctt acctgttcaa 1440

gctcatggac ctcaaggcgt ccaacctgtg cctgagcgcc gacgtgccga cagcgcgcga 1500

gctgctgtac ctggccgaca agattggccc gtcgattgtc gtgctcaaga cgcactacga 1560

catggtctcg ggctgggact tccacccgga gacgggcacg ggagcccagc tggcgtcgct 1620

ggcgcgcaag cacggcttcc tcatcttcga ggaccgcaag tttggcgaca ttggccacac 1680

cgtcgagctg cagtacacgg gcgggtcggc gcgcatcatc gactgggcgc acattgtcaa 1740

cgtcaacatg gtgcccggca aggcgtcggt ggcctcgctg gcccagggcg ccaagcgctg 1800

gctcgagcgc tacccctgcg aggtcaagac gtccgtcacc gtcggcacgc ccaccatgga 1860

ctcgtttgac gacgacgccg actccaggga cgccgagccc gccggcgccg tcaacggcat 1920

gggctccatt ggcgtcctgg acaagcccat ctactcgaac cggtccggcg acggccgcaa 1980

gggcagcatc gtctccatca ccaccgtcac ccagcagtac gagtccgtct cctcgccccg 2040

gttaacaaag gccatcgccg agggcgacga gtcgctcttc ccgggcatcg aggaggcgcc 2100

gctgagccgc ggcctcctga tcctcgccca aatgtccagc cagggcaact tcatgaacaa 2160

ggagtacacg caggcctgcg tcgaggccgc ccgggagcac aaggactttg tcatgggctt 2220

catctcgcag gagacgctca acaccgagcc cgacgatgcc tttatccaca tgacgcccgg 2280

ctgccagctg ccccccgaag acgaggacca gcagaccaac ggatcggtcg gtggagacgg 2340

ccagggccag cagtacaaca cgccgcacaa gctgattggc atcgccggca gcgacattgc 2400

cattgtgggc cggggcatcc tcaaggcctc agaccccgta gaggaggcag agcggtaccg 2460

atcagcagcg tggaaagcct acaccgagag gctgctgcga taggggaggg aagggaagaa 2520

agaagtaaag aaaggcattt agcaagaagg gggaaaaggg agggaggaca aacggagctg 2580

agaaagagct cttgtccaaa gcccggcatc atagaatgca gctgtattta ggcgacctct 2640

ttttccatct tgtcgatttt tgttatgacg taccagttgg gatgatggat gattgtaccc 2700

cagctgcgat tgatgtgtat ctttgcatgc aacaacacgc gatggcggag gcgaactgca 2760

cattggaagg ttcatatatg gtcctgacat atctggtgga tctggaagca tggaattgta 2820

tttttgattt ggcatttgct tttgcgcgtg gagggaacat atcaccctcg ggcatttttc 2880

atttggtagg atggtttgga tgcagttg 2908

Claims (7)

1.一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而促进里氏木霉生产纤维素酶；所述特异DNA分子中具有里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因；

所述特异DNA分子具有gpdA启动子和里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因的表达；

所述里氏木霉血红蛋白结构域为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述里氏木霉血红蛋白结构域的编码基因为序列表中序列1自5′末端第2311至2775位核苷酸所示的DNA分子。

3.序列表中序列1所示的特异DNA分子。

4.权利要求3所述的特异DNA分子或含有权利要求3所述的特异DNA分子的重组表达载体在提高里氏木霉生产纤维素酶产量中的应用。

5.一种重组菌，是将权利要求3所述的特异DNA分子导入里氏木霉得到的。

6.权利要求5所述的重组菌在生产纤维素酶中的应用。

7.一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：培养权利要求5所述的重组菌，得到纤维素酶。

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