CN111983076B - 一种检测化妆品中依克多因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测化妆品中依克多因的方法，所述方法包括以下步骤：对化妆品进行前处理，以制备依克多因供试品溶液；使用高效液相色谱法对所述依克多因供试品溶液进行检测；其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。与现有技术相比，本发明提供的检测化妆品中依克多因的方法操作简单、检测时间短、分离效果好、精密度和准确度高、节省溶剂、样品制备便捷、能够广泛的用于含有依克多因的化妆品的检测。
Description
技术领域
本发明涉及高效液相色谱检测领域，且更为具体地涉及一种检测化妆品中依克多因的方法
背景技术
依克多因(Ectoine)，又称四氢嘧啶(化学名为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文名为1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid)，是一种环状氨基酸衍生物，它能在高盐、热变性、干燥、冰冻等极端环境下，被用作酶、核酸、膜及细胞的保护剂及稳定剂，因此在酶剂生产、医学、保健食品以及化妆品工业等领域具有广泛的应用前景。
目前，依克多因的检测方法主要是采用高效液相色谱法，但是它一种强烈的亲水性物质，在常规的色谱条件或常规反相色谱柱上的保留很弱，其应用范围主要在原料或水质中，对于基质比较复杂的化妆品领域还未有报道。其中，李耀东、龙启福、李文军等的高效液相色谱检测青海湖嗜盐菌胞内积聚的相溶物质四氢嘧啶一文采用乙腈/甲醇(V/V，95:5)EClipse XDB-C18柱(150×4.6mm)，柱温20℃，流速1.0mL/min，检测波长204nm等色谱条件分析Ectoine，文献中指出该色谱条件下Ectoine的保留时间为1.400-1.429min，从文献结果及色谱柱特性可知被分析物在该色谱条件及色谱柱上并未保留。贺冰,陶萍,陈爱连等的亲水相互作用色谱法测定中度嗜盐菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶一文中采用亲水性色谱柱Merck-SeQuant ZIC-HILIC(150×4.6mm，5μm)，流动相乙腈:0.3％磷酸二氢钠缓冲液(pH5)＝80：20(V/V)，流速1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃条件下分析，其四氢嘧啶保留时间在12分钟以上，时间较长，且分析成本较高。专利CN108120792A也公开了一种四氢嘧啶的高效液相检测及含量测定方法，该专利中采用Shiseido CAPCELL PAK ADME(250×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇/20mM磷酸二氢钾水溶液(磷酸调pH至3.0)＝5/95(V/V)，柱温为30℃，流速为1mL/min，检测波长为204nm等色谱条件对四氢嘧啶进行检测，该专利中四氢嘧啶的保留时间为3.739min，从其结果可知，被分析物在色谱柱上的保留也不是很理想，且该专利中的色谱柱为非常规分析色谱柱，成本较高。
发明内容
针对现有技术存在的化妆品中依克多因检测方法的不足。本发明通过选择合适的方法和溶剂对化妆品进行前处理，并进一步选择合适的色谱条件，提供一种一种检测化妆品中依克多因的方法。
具体来说，本发明涉及如下的技术方案：
1、一种检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
对化妆品进行前处理，以制备依克多因供试品溶液；
使用高效液相色谱法对所述依克多因供试品溶液进行检测；
其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。
2、根据项1所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述化妆品为水包油型和油包水型化妆品时，所述前处理包括以下步骤：
使用甲醇对所述化妆品中的依克多因进行萃取；
对萃取液超声、离心、过滤得到所述依克多因供试品溶液。
3、根据项2所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述水包油型化妆品包括化妆水、乳液、日霜，所述油包水型化妆品包括晚霜、BB霜和粉底液。
4、根据项1所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述化妆品为蜡基化妆品时，所述前处理包括以下步骤：
使用有机溶剂溶解所述化妆品；
使用甲醇对溶解的所述化妆品中的依克多因进行萃取；
对萃取液超声、离心、过滤得到所述依克多因供试品溶液。
5、根据项4所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿、四氢呋喃和正己烷中的一种或两种以上。
6、根据项4所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述蜡基化妆品包括口红和唇膏。
7、根据项1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱。
8、根据项1-7任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为50-250mm，优选为100-250mm。
9、根据项1-8任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液还包含1-庚烷磺酸钠，其中所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为5-100mM，优选为10-50mM，所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，优选为5-15mM。
10、根据项1-9任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液的pH为2.5-3.5。
11、根据项1-10任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：以所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20):(95-80)洗脱0～4min，再以所述流动相A与所述流动相B的体积比为70:30洗脱4.5～10min。
12、根据项1-11任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.2-2.0mL/min，优选为0.5-1.0mL/min。
13、根据项1-12任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20-50℃，优选为25-40℃。
14、根据项1-13任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
15、根据项14所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，检测波长为200-220nm，优选为210nm。
16、根据项1-15任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为0.5-20μL，优选为1-2μL。
本发明提供的检测化妆品中依克多因的方法操作简单、检测时间短、分离效果好、精密度和准确度高、节省溶剂、样品制备便捷、能够广泛的用于含有依克多因的化妆品的检测。
附图说明
图1为实施例1中依克多因的色谱图。
图2为实施例2中依克多因的色谱图
图3为对比例1中依克多因的色谱图。
图4为对比例2中依克多因的色谱图。
图5为依克多因浓度-峰面积的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
依克多因(Ectoine)，又称四氢嘧啶(化学名为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文名为1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid)，是一种环状氨基酸衍生物。依克多因在化妆品中有着非常广泛的应用。对于化妆品中依克多因的检测方法主要是采用高效液相色谱法，但是它一种强烈的亲水性物质，在常规的色谱条件或常规反相色谱柱上的保留很弱。虽然已有使用亲水性色谱柱Merck-SeQuant ZIC-HILIC(150ck-SeQ，5μm)，流动相乙腈:0.3％磷酸二氢钠缓冲液，Shiseido CAPCELL PAK ADME(250seido，5μm)色谱柱，流动相为甲醇/20mM磷酸二氢钾水溶液检测依克多因的报道，但是依克多因的保留时间不理想，其分析成本较高。因此，目前还没有使用常规色谱柱有效检测依克多因的方法。另外，对于基质比较复杂的化妆品中依克多因的含量检测，除了对依克多因本身含量的检测，如何有效的将依克多因从化妆品中提取出来也非常关键。
本发明提供一种检测化妆品中依克多因的方法，所述方法包括以下步骤：
对化妆品进行前处理，以制备依克多因供试品溶液；
使用高效液相色谱法对所述依克多因供试品溶液进行检测；
其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。
针对不同类型的化妆品，对化妆品所采用的前处理工艺不同。化妆品主要可以分为水包油型化妆品、油包水型化妆品和蜡基化妆品。水包油型化妆品是指将油分散在水中的乳化体系，油为内相，水为连续的外相的化妆品，包括化妆水、乳液、日霜。油包水化妆品是指将水分散在油中的乳化体系，水为内相，油为连续的外相的化妆品，包括晚霜、BB霜和粉底液。蜡基化妆品是指由油、脂、蜡、色素等主要成分复配而成的无水配方化妆品，包括口红和唇膏等。
其中，所述化妆品为水包油型和油包水型化妆品时化妆品时，所述前处理包括以下步骤：使用甲醇对所述化妆品中的依克多因进行萃取；对萃取液超声、离心、过滤得到所述依克多因供试品溶液。具体的，超声、离心、过滤等操作都可以采用任何现有相关技术，而所使用的甲醇为分析纯。
所述化妆品为蜡基化妆品时，所述前处理包括以下步骤：使用有机溶剂溶解所述化妆品；使用甲醇对溶解的所述化妆品中的依克多因进行萃取；对萃取液超声、离心、过滤得到所述依克多因供试品溶液。即与低油脂化妆品相比，在使用甲醇对溶解的所述化妆品中的依克多因进行萃取的步骤之前，增加了使用有机溶剂溶解所述化妆品的步骤。这是由于对于蜡基化妆品，直接使用甲醇不能溶解蜡基基质，对依克多因难以完全的萃取，而使用有机溶剂可以破坏化妆品的蜡基，以使其中的依克多因更好的释放出来，以便于后续甲醇的萃取。在一个优选的实施方案中，所述有机溶剂为氯仿、四氢呋喃和正己烷中的一种或两种以上。
本发明检测化妆品中依克多因的方法采用高效液相色谱法对所述依克多因供试品溶液进行检测，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。
十八烷基硅烷键合硅胶柱是一种常规色谱柱，目前大多数色谱厂家，如waters、岛津、phenomenex、Agilent、迪马等公司都有十八烷基硅烷键合硅胶柱。在一个优选的实施方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱，为美国Agilent公司生产。
所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的柱长为50-250mm，优选为100-250mm。在仪器压力条件允许的情况下，比如使用超高效液相色谱仪时，更优选所使用的十八烷基硅烷键合硅胶柱的柱长为100mm。色谱柱为色谱厂家提供的规格，柱长的选择要根据测定的物质和具体的色谱条件综合考虑。目前十八烷基硅烷键合硅胶柱主要有50mm、100mm、150mm、250mm四个规格，其中50mm、100mm的色谱柱的内径会小一点，3mm左右，通常为超高效液相色谱(UPLC)的优选项，优点是溶剂节省、分析时间短。
在一个具体的实施方案中，所述流动相B，即磷酸二氢钠溶液还包含1-庚烷磺酸钠。其中，在所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为5-100mM，优选为10-50mM，例如可以为5mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM。所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，优选为5-15mM，例如可以为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，10mM，15mM，20mM。所述磷酸二氢钠溶液的pH使用磷酸进行调节至2.5-3.5，例如可以为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5。
对于所述高效液相色谱法的洗脱方式，当测定单纯基质的依克多因(除了依克多因和溶剂没有别的杂质)时采用等度洗脱，等度洗脱是指在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。当测定复杂基质的依克多因(除了依克多因和溶剂外，还有其它杂质)时，比如化妆品中的依克多因时，采用梯度洗脱的方式。等度洗脱的具体条件为：所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20)：(95-80)，优选为(5-10):(95-90)，例如可以为5:95，6:94，7:93，8:92，9:91，10:90，12:88，15:85，18:82，20:80。具体的梯度洗脱的条件为：以所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20):(95-80)洗脱0～4min，再以所述流动相A与所述流动相B的体积比为70:30洗脱4.5～10min。
在一个具体的实施方案中，所述流动相的流速为0.2-2.0mL/min，例如可以为0.2mL/min，0.5mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min，1.2mL/min，1.5mL/min，1.8mL/min，2.0mL/min。优选为0.5-1.0mL/min。流动相的流速可以根据选用的具体色谱柱的类型，柱长等因素进行调整。例如当使用100mm长的色谱柱时，流动相的流速优选为0.5-1.0mL/min，当使用250mm长的色谱柱时，流速优选为1.0-1.5mL/min。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20-50℃，例如可以为20℃，22℃，25℃，28℃，30℃，32℃，35℃，40℃，45℃,50℃。优选为25-40℃。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器(UV检测器)或二极管阵列检测器(DAD检测器)。检测波长为200-220nm，优选为210nm。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中进样量为0.5-20μL，例如可以为0.5μL，1μL，2μL，5μL，8μL，10μL，12μL，15μL，20μL。优选为1～2μL。具体的在使用时，可根据选用的色谱柱和流动相等条件的不同进行调整。比如为了避免待测样溶剂效应，100mm长色谱柱优选1-2μL，250mm长色谱柱优选5-10μL。
本发明的检测方法能用于水包油型化妆品、油包水型化妆品和蜡质化妆品中的依克多因的检测。首选通过对化妆品进行前处理，进一步使用传统的十八烷基硅烷键合硅胶柱，通过采用由流动相A甲醇和流动相B含有磷酸二氢钠和1-庚烷磺酸钠的溶液组成的流动相，并精确控制流动相流速(0.5-1.0mL/min)、以流动相A和流动相B的体积比(5-20)：(95-80)洗脱0-4min，再以流动相A和流动相B的体积比为70:30洗脱4.5～10min、流动相B的磷酸盐和1-庚烷磺酸钠、pH(磷酸二氢钠的浓度为5-100mM、1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，pH为2.5-3.5)等条件使得依克多因在色谱柱上能有效的保留，并保持良好的峰形。本发明的检测方法检测化妆品中依克多因的含量能广泛用于多种化妆品，方法的回收率高达99.75％，平行性和重现性好，并且精度高。。
本发明所使用的仪器和材料如下：
仪器与试剂：超高效液相色谱仪Agilent 1260Prime(美国Agilent公司)，配DAD检测器；色谱柱：Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7μm，美国Agilent公司)；甲醇，HPLC级，Merck；乙腈，HPLC级，Merck；依克多因(华熙生物科技股份有限公司)；超纯水机Milli-Q，Merck；磷酸二氢钠〃二水，HPLC级，上海安谱公司；磷酸二氢钾，HPLC级，上海安谱公司；1-庚烷磺酸钠，HPLC级，Fisher公司；磷酸，HPLC级，上海安谱公司。
实施例
实施例1
配制供试品溶液：取适量依克多因对照品用50％甲醇水溶解，并制成浓度为100μg/mL的溶液，该供试品溶液为单纯基质的依克多因供试品溶液，即除了依克多因和溶剂以外，没有其它组分。
色谱条件为：
色谱柱：Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7μm)
流动相：流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝5:95，其中流动相B中，磷酸二氢钠的浓度为40mM，1-庚烷磺酸钠浓度为10mM，pH为3.0。具体的操作步骤为，取适量的二水合磷酸二氢钠和1-庚烷磺酸钠溶于1000mL水中，用磷酸调节pH至3.0。
流速：0.5ml/min
进样量：1μL
柱温：25℃
检测波长：210nm
洗脱方式：等度洗脱
按照上述色谱条件对供试品溶液进行检测，得到的依克多因供试品的色谱图如图1所示。由图1可以看出依克多因具有良好的峰形，保留时间为2.894min，拖尾因子(T)为1.02，拖尾因子(T)是用于评价色谱峰对称性的参数，一般理想的T值应在0.95～1.05之间。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为1.0min，因也依克多因在色谱柱上得到很大的保留，满足检测的需要。
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处在于，流速采用0.8ml/min，其他条件与实施例1相同。得到的依克多因供试品的色谱图如图2所示。由图2可以看出依克多因具有良好的峰形，保留时间为1.92min，拖尾因子(T)为1.04。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为0.6min。与实施例1相比，该色谱条件下依克多因在色谱柱上同样保留优秀，且本实施例中依克多因的峰形更窄更好，能满足检测的要求。
实施例3
实施例3与实施例2的不同之处在于，柱温采用45℃，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因峰的保留时间为1.56min，拖尾因子(T)为1.02。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为0.6min，因此1.56min的保留时间能满足检测的要求。
实施例4
实施例4与实施例2的不同之处在于，流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝6:94，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为10mM，1-庚烷磺酸钠的浓度为5mM，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为1.699min，色谱峰的拖尾因子为1.06，色谱峰形良好，1.699min的保留时间能满足检测的要求。
实施例5
实施例5与实施例2的不同之处在于，流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝7:93，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为50mM，流动相B中1-庚烷磺酸钠的浓度为15mMpH为3.5，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为2.21min，色谱峰的拖尾因子为1.00，色谱峰形良好，2.21min的保留时间能满足检测的要求。
实施例6
实施例6与实施例2的不同之处在于，流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝20:80，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为20mM，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为20mM，1-庚烷磺酸钠的浓度为20mM，pH为2.5，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为2.436min，色谱峰的拖尾因子为0.96，色谱峰形良好，2.436min的保留时间能满足检测的要求。
实施例7
实施例7与实施例2的不同之处在于流动相：流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝10:90，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为100mM，1-庚烷磺酸钠浓度为1mM，流速为0.9ml/min，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因峰的保留时间为0.91min，拖尾因子(T)为1.04。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为0.47min，因此0.91min的保留时间能满足检测的要求。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，所使用的流动相不同。对比例1中使用乙腈作为A相，以5mM的磷酸二氢钾溶液作为B相。其他反应条件同实施例1相同。得到的依克多因供试品的色谱图如图3所示。由图3可以看出依克多因的保留时间为0.956min。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为1.0min，因也依克多因在色谱柱的死时间出峰，所以基本无保留，不能满足检测的需要。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，所使用的流动相不同。对比例1中使用甲醇作为A相，以5mM的磷酸二氢钾溶液作为B相。其他反应条件同实施例1相同。得到的依克多因供试品的色谱图如图4所示。由图4可以看出依克多因的保留时间为1.032min。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为1.0min，因也依克多因在色谱柱的死时间出峰，所以基本无保留，不能满足检测的需要。
对比例3
对比例3与实施例2的不同之处在于，流动相B中不含1-庚烷磺酸钠，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为0.825min，色谱峰的拖尾因子为0.60，在该条件下依克多因基本无保留，且峰形差，不能满足检测的需要。
对比例4
对比例4与实施例2的不同之处在于，流动相A:B为25:75，其他条件与实施例2相同。依克多因的保留时间早于该色谱条件下的死时间0.6min，因此不能满足检测的需要。
对比例5
对比例5与实施例2的不同之处在于，流动相B中磷酸盐的浓度为4mM，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为2.936min，色谱峰的拖尾因子为1.64，在该条件下依克多因的色谱峰拖尾严重，流动相的洗脱能力弱，不能满足检测的需要。
对比例6
对比例6与实施例2的不同之处在于，流动相B中磷酸盐的浓度为120mM，其他条件与实施例2相同。在该条件下依克多因出峰早、拖尾严重，而且磷酸盐的浓度太高，由于容易析出，易造成***压力偏高，对仪器和色谱柱不利，不能满足检测的需要。
对比例7
对比例7与实施例2的不同之处在于，B中1-庚烷磺酸钠浓度为25mM，其他条件与实施例2相同。该条件中由于1-庚烷磺酸钠属于阳离子表面活性剂，其浓度高，会产生大量的泡沫，易污染仪器***，难冲洗，***平衡时间长，不能满足检测的需要。
对比例8
对比例8与实施例2的不同之处在于，B中用磷酸调节pH至2.0其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为3.684min，色谱峰的拖尾因子为1.39，在该条件下依克多因的色谱峰拖尾，不能满足检测的需要。
对比例9
对比例9与实施例2的不同之处在于，B中用磷酸调节pH至4.0其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为0.995min，色谱峰的拖尾因子为1.38，在该条件下依克多因出峰早且拖尾，可知，pH值对依克多因的分析影响较大，不能满足检测的需要。
综上所述，实施例1-7和对比例1-89的色谱条件如表1所示。
表1各实施例和对比例的色谱条件
实施例8绘制依克多因标准工作曲线
通过上述实施例中的色谱检测条件，可进一步制作该条件下依克多因浓度和峰面积的标准曲线。具体的操作步骤为：精密称取依克多因对照品0.1g(精确至0.0001g)，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成4mg/mL的标准储备液。并分别取一定体积的标准储备液，用50％甲醇水溶液稀释至一系列不同溶度的标准溶液。按选定的色谱条件测定，对系列标准溶液进行测定，以依克多因的浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线，计算回归方程。以实施例2中的色谱条件获得依克多因的线性方程为y＝3.2204x-2.6644，相关系数r2＝0.9999，如图5所示。图5的结果表明依克多因在8～800μg/mL范围内线性关系良好。通过得到的线性方程，根据色谱的峰面积计算可得待测样品依克多因的含量。
实施例9BB霜中依克多因的检测
(1)采用一款依克多因含量为0.1％wt的自制BB霜。BB霜的配方组分表见表2。称取1g(精确至0.0001g)供试品置于10mL具塞比色管中，甲醇(分析纯)作为萃取试剂，涡旋混合后。将涡旋混合后的比色管置于超声波清洗器中超声提取20min，以10000rpm转速离心10min，然后取上清液用0.22μm滤膜过滤得化妆品供试品溶液。
其中，在使用甲醇作为萃取剂之前，同时对于采用50％甲醇水溶液和50％甲醇饱和氯化钠溶液作为萃取试剂进行了试验，发现使用50％甲醇水溶液和50％甲醇饱和氯化钠溶液作为萃取试剂时，比色管中的样品不能完全处理，有油脂附着在比色管壁上，而用甲醇处理的比色管中，样品处理完全破乳且呈絮状。所以最终在本实施例中最终选择甲醇(分析纯)作为萃取试剂。
表2 BB霜的配方组分表
(2)供试品溶液检测
将(1)中制备的化妆品供试品溶液，使用高效液相色谱法进行检测。其中采用的色谱条件为：
色谱条件为：
色谱柱：Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7μm)
流动相：流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝5:95，其中流动相B中，磷酸二氢钠的浓度为40mM，1-庚烷磺酸钠浓度为10mM，pH为3.0。具体的操作步骤为，取适量的二水合磷酸二氢钠和1-庚烷磺酸钠溶于1000mL水中，用磷酸调节pH至3.0。
流速：0.8ml/min
进样量：1μL
柱温：25℃
检测波长：210nm
洗脱方式：梯度洗脱，以所述流动相A与所述流动相B的体积比为5:95洗脱0～4min，再以所述流动相A与所述流动相B的体积比为70:30洗脱4.5～10min。
使用上述检测条件检测的结果如表3所示，其中，计算时根据实施例8中的依克多因的线性方程y＝3.2204x-2.6644进行计算，x为依克多因的浓度(μ依/mL)，y为峰面积。
表3 BB霜供试品中依克多因含量检测结果
从表3结果可知，使用上述方法检测化妆品供试品中依克多因的含量平均值为997.5μg/g，与供试品中实际添加量0.1％wt(即1000μg/g)相比，回收率为99.75％，而且两个平行样平行性良好。
实施例10膏霜中依克多因的加标回收实验
(1)实验室自制一款化妆品膏霜空白基质，配方组分表见表4所示，由华熙生物科技有限公司上海研发中心配方实验室提供。精密称取1g(精确至0.0001g)样品，置于10mL具塞比色管中，分别加入2、4、6mg依克多因对照品，每组加标实验做三个平行样，甲醇(分析纯)作为萃取试剂，涡旋混合后。将涡旋混合后的比色管置于超声波清洗器中超声提取20min，以10000rpm转速离心10min，然后取上清液用0.22μm滤膜过滤得供试品溶液。
表4化妆品膏霜空白基质配方组分表
| 组分名称 | 添加量/wt％ |
| 水 | 70.05 |
| 甘油 | 10 |
| 羟苯甲酯 | 0.2 |
| 黄原胶 | 0.15 |
| 山嵛醇聚醚-25 | 1.4 |
| 甘油硬脂酸酯 | 1.6 |
| 鲸蜡硬脂醇 | 2 |
| 二十二醇 | 2 |
| 矿油 | 8 |
| 聚二甲基硅氧烷 | 2 |
| 矿脂 | 2 |
| 羟苯丙酯 | 0.1 |
| 苯氧乙醇 | 0.4 |
(2)化妆品供试品溶液检测
将(1)中制备的供试品溶液，使用高效液相色谱法进行检测。其中采用的色谱条件与实施例9中的色谱条件相同。
检测的结果如表5所示，其中，计算时根据实施例8中的依克多因的线性方程y＝3.2204x-2.6644进行计算，x为依克多因的浓度(μg/mL)，y为峰面积。
表5膏霜供试品中依克多因含量检测结果
实施例11 BB霜中依克多因检测的精密度和重现性实验
(1)同实施例9中BB霜样品。精密称取1g(精确至0.0001g)样品，置于10mL具塞比色管中，甲醇(分析纯)作为萃取试剂，涡旋混合后。将涡旋混合后的比色管置于超声波清洗器中超声提取20min，以10000rpm转速离心10min，然后取上清液用0.22μm滤膜过滤得供试品溶液。其中，做6个平行样品。
(2)化妆品供试品溶液检测
将(1)中制备的供试品溶液，使用高效液相色谱法进行检测。其中采用的色谱条件与实施例9中的色谱条件相同。
检测的结果如表6所示，其中，计算时根据实施例8中的依克多因的线性方程y＝3.2204x-2.6644进行计算，x为依克多因的浓度(μg/mL)，y为峰面积。
表6化妆品BB霜6个平行样中依克多因含量检测结果
| 样品名称 | BB霜-1 | BB霜-2 | BB霜-3 | BB霜-4 | BB霜-5 | BB霜-6 | RSD/％ |
| 保留时间t<sub>r</sub>/min | 1.868 | 1.865 | 1.862 | 1.872 | 1.875 | 1.874 | 0.278 |
| 含量/μg/g | 1034.77 | 1017.26 | 1057.76 | 1018.21 | 985.47 | 898.33 | 5.593 |
从表6可看知，6个平行样的保留时间和含量测试值的RSD分别为0.278％和5.593，该方法的重现性和精密度都良好。
实施例12化妆水中依克多因的检测
(1)实验室自制一款化妆水，化妆水的配方组分表见表7，由华熙生物科技有限公司上海研发中心配方实验室提供。精密称取1g(精确至0.0001g)样品，置于10mL具塞比色管中，分别加入2、4、6mg依克多因对照品，每组加标实验做三个平行样，甲醇(分析纯)作为萃取试剂，涡旋混合后。将涡旋混合后的比色管置于超声波清洗器中超声提取20min，以10000rpm转速离心10min，然后取上清液用0.22μm滤膜过滤得供试品溶液。
表7化妆水的配方组分表
| 组分名称 | 添加量/wt％ |
| 水 | 85.9 |
| 甘油 | 5 |
| 丙二醇 | 5 |
| 透明质酸钠 | 0.3 |
| 依克多因 | 0.05 |
| 防腐剂K350 | 0.4 |
| 甘油聚醚-26 | 2 |
| 甘草酸二钾 | 0.1 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 0.1 |
| 甘草酸二钾 | 0.1 |
| 甜菜碱 | 1 |
(2)化妆品供试品溶液检测
将(1)中制备的供试品溶液，使用高效液相色谱法进行检测。其中采用的色谱条件与实施例9中的色谱条件相同。
检测的结果如表8所示，其中，计算时根据实施例8中的依克多因的线性方程y＝3.2204x-2.6644进行计算，x为依克多因的浓度(μg/mL)，y为峰面积。
表8化妆水中依克多因的含量测定结果
实施例13护肤面霜中依克多因的检测
(1)实验室自制一款护肤面霜，护肤面霜的配方组分见表9所示，由华熙生物科技有限公司上海研发中心配方实验室提供。精密称取1g(精确至0.0001g)样品，置于10mL具塞比色管中，甲醇(分析纯)作为萃取试剂，涡旋混合后。将涡旋混合后的比色管置于超声波清洗器中超声提取20min，以10000rpm转速离心10min，然后取上清液用0.22μm滤膜过滤得供试品溶液。
表9护肤面霜的配方组分表
(2)化妆品供试品溶液检测
将(1)中制备的供试品溶液，使用高效液相色谱法进行检测。其中采用的色谱条件与实施例9中的色谱条件相同。
检测的结果如表10所示，其中，计算时根据实施例8中的依克多因的线性方程y＝3.2204x-2.6644进行计算，x为依克多因的浓度(μg/mL)，y为峰面积。
表10护肤面霜中依克多因的含量测定结果
实施例14唇膏中依克多因的检测(1)实验室自制一款唇膏，唇膏的配方组分见表11所示，由华熙生物科技有限公司上海研发中心配方实验室提供。精密称取1g(精确至0.0001g)样品，置于25mL具塞比色管中，先加入5mL四氢呋喃(分析纯)，涡旋，将唇膏样品分散，然后用甲醇(分析纯)补足至刻度，涡旋混合均匀。将涡旋混合后的比色管置于超声波清洗器中超声提取20min，以10000rpm转速离心10min，然后取上清液用0.22μm滤膜过滤得供试品溶液。
表11唇膏的配方组分表
(2)唇膏供试品溶液检测
将(1)中制备的供试品溶液，使用高效液相色谱法进行检测。其中采用的色谱条件与实施例9中的色谱条件相同。
检测的结果如表12所示，其中，计算时根据实施例8中的依克多因的线性方程y＝3.2204x-2.6644进行计算，x为依克多因的浓度(μg/mL)，y为峰面积。
表12唇膏中依克多因的含量测定结果
Claims (19)
1.一种检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
对化妆品进行前处理，以制备依克多因供试品溶液；
使用高效液相色谱法对所述依克多因供试品溶液进行检测；
其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液；
其中，
所述磷酸二氢钠溶液还包含1-庚烷磺酸钠，在所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为5-100mM，在所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM；
所述磷酸二氢钠溶液的pH为2.5-3.5；
所述高效液相色谱法的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：以所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20):(95-80)洗脱0～4min，再以所述流动相A与所述流动相B的体积比为70:30洗脱4.5～10min。
2.根据权利要求1所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述化妆品为水包油型和油包水型化妆品时，所述前处理包括以下步骤：
使用甲醇对所述化妆品中的依克多因进行萃取；
对萃取液超声、离心、过滤得到所述依克多因供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，
所述水包油型化妆品包括化妆水、乳液、日霜；
所述油包水型化妆品包括晚霜、BB霜和粉底液。
4.根据权利要求1所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述化妆品为蜡基化妆品时，所述前处理包括以下步骤：
使用有机溶剂溶解所述化妆品；
使用甲醇对溶解的所述化妆品中的依克多因进行萃取；
对萃取液超声、离心、过滤得到所述依克多因供试品溶液。
5.根据权利要求4所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿、四氢呋喃和正己烷中的一种或两种以上。
6.根据权利要求4所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述蜡基化妆品包括口红和唇膏。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱。
8.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为50-250mm。
9.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为100-250mm。
10.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，在所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为10-50mM，
在所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为5-15mM。
11.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.2-2.0mL/min。
12.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5-1.0mL/min。
13.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20-50℃。
14.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为25-40℃。
15.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
16.根据权利要求15所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，检测波长为200-220nm。
17.根据权利要求15所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，检测波长为210nm。
18.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为0.5-20μL。
19.根据权利要求1-6任一项所述的检测化妆品中依克多因的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为1-2μL。
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