CN107271592B - 一种盐酸替吡拉西与其相关杂质完全分离的液相色谱纯度检测方法 - Google Patents
一种盐酸替吡拉西与其相关杂质完全分离的液相色谱纯度检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了盐酸替吡拉西与其相关杂质完全分离的液相色谱纯度检测方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐‑离子对‑有机相为流动相，以梯度洗脱的方式定量测定盐酸替吡拉西及其有关物质的含量，从而有效控制盐酸替吡拉西的质量。本发明方法具有专属性强、准确度高、操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种药物的分析检测，特别是一种盐酸替吡拉西与其相关杂质完全分离的液相色谱纯度检测方法。
背景技术
盐酸替吡拉西用于是作为复方片曲氟尿苷盐酸替吡拉西片中的一个主要成分，用于治疗不可切除型或复发型晚期结直肠癌，曲氟尿苷盐酸替吡拉西片由曲氟尿苷和盐酸替吡拉西组成，曲氟尿苷单磷酸代谢物能掺入DNA，通过抑制胸苷酸合成酶的活性发挥其抗肿瘤疗效，经口服给药后吸收良好，但易被肝脏的胸苷酸磷酸化酶降解；盐酸替吡拉西是曲氟尿苷降解酶的竞争性抑制剂，可以减少曲氟尿苷的降解，增强其活性。
盐酸替吡拉西，英文名称为tipiracil hydrochloride，化学名称为5-氯-6-((2-亚胺吡咯-1-基)甲基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮盐酸盐，分子式为C9H12Cl2N4O2，CAS号:183204-72-0，化学结构式如下：
药品在临床使用中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系。为保证临床用药的安全性,需要严格控制药品中的杂质。经检索，目前未见盐酸替吡拉西及其有关物质分析方法的相关专利或公开文献报道。根据其工艺、化合物的性质、破坏性试验等条件来建立一种盐酸替吡拉西及其有关物质的分析方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种盐酸替吡拉西与其相关杂质完全分离的液相色谱纯度检测方法，该方法应专属性好,能将可能的降解杂质、可能残留的起始原料及中间体与主成分有效分开，且灵敏度高,可应用于盐酸替吡拉西的杂质控制。
主流制备盐酸替吡拉西合成工艺如下：
工艺路线：
本发明人针对上述盐酸替吡拉西合成工艺以及降解情况，优先鉴定了6个杂质，分别为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6化学结构及来源见表1：
表1杂质结构及来源
本发明对色谱条件进行了筛选,能够将6个杂质有效分离,建立了有关物质分析方法,主成分与各有关物质之间，各有关物质之间均能达到基线分离,达到了上述发明的目的。
本发明采用的技术方案如下：一种盐酸替吡拉西及其有关物质的分析方法，其主要步骤包括：
(1)配置***适应性溶液：取盐酸替吡拉西样品及各杂质对照品适量，分别用甲醇或流动相溶解样品，配制成每lmL含盐酸替吡拉西及各杂质对照品0.01～1.5mg的***适应性溶液；
(1)取盐酸替吡拉西样品适量，分别用甲醇或流动相溶解样品，配制成每lmL含盐酸替吡拉西0.1～1.5mg的样品溶液；
(2)分别取各杂质对照品适量，分别用甲醇或流动相溶解样品，配制成每lmL含各杂质0.01～0.1mg的对照品溶液；
(3)采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件为：流动相为缓冲盐-离子对-有机相，梯度洗脱方法如下：
(4)设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为180～250nm，色谱柱柱温箱温度为20～40℃，进样量为5～30μL。
(5)用杂质对照品外标法计算盐酸替吡拉西及其有关物质的含量。
3).流动相A为磷酸盐缓冲液(pH2.0)和0.1％戊烷磺酸钠，流动相B为甲醇；流动相的洗脱梯度设置如下:
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0.00 | 95.0 | 5.0 |
| 5.00 | 95.0 | 5.0 |
| 30.00 | 90.0 | 10.0 |
| 55.00 | 85.0 | 15.0 |
| 65.00 | 40.0 | 60.0 |
| 80.00 | 40.0 | 60.0 |
| 80.10 | 95.0 | 5.0 |
| 105.00 | 95.0 | 5.0 |
如步骤(3)中所述，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，采用二极管阵列检测器，采用梯度洗脱程序；
]如步骤(3)中所述，色谱柱选岛津Intersil ODS-3C18
优选的，步骤(3)中，色谱柱的型号为250mm*4.6mm*5μm
如步骤(3)中所述，有机相选自以下化合物中的一种：甲醇、乙睛、丙醇、异丙醇；
优选的，步骤(3)中，有机相为甲醇。
如步骤(3)中所述，缓冲盐溶液选自以下缓冲盐中的一种：磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、高氯酸盐；
优选的，步骤(3)中，缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲液
优选的，步骤(3)中，磷酸盐缓冲液的pH为2.0；
如步骤(3)中所述，离子对试剂选自以下离子对试剂中的一种：辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠、戊烷磺酸钠等；
优选的，步骤(3)中，离子对试剂为戊烷磺酸钠；
优选的，步骤(3)中，戊烷磺酸钠的溶度为0.1％；
优选的，步骤(4)中，检测波长优选为200～220nm，
优选的，步骤(4)中，检测波长优选为210nm，
优选的，步骤(4)中，流速优选为0.8～1.2ml/min，
优选的，步骤(4)中，流速优选为1.0ml/min，
优选的，步骤(4)中，色谱柱柱温优选为30～40℃，
优选的，步骤(4)中，色谱柱柱温优选为35℃，
优选的，步骤(4)中，进样量优选为10～20μL。
优选的，步骤(4)中，进样量优选为10μL。
本发明的优点是：本发明的盐酸替吡拉西与其相关杂质完全分离的液相色谱纯度检测方法，专属性好,能将可能的降解杂质、可能残留的起始原料及中间体与主成分有效分开，且灵敏度高,可应用于盐酸替吡拉西的杂质控制。
附图说明
图1：杂质1定位图谱；
图2：杂质2定位图谱；
图3：杂质3定位图谱；
图4：杂质4定位图谱；
图5：杂质5定位图谱；
图6：杂质6定位图谱；
图7：盐酸替吡拉西定位图谱；
图8：***适用性图谱；
图9：定量限图谱；
图10：检测限图谱；
图11：流速0.8ml/min图谱；
图12：流速1.2ml/min图谱；
图13：柱温33℃图谱；
图14：柱温37℃图谱。
具体实施方式
本发明中具体实施方式中使用的供试品、设备均为已知产品。
实例1：
验证用盐酸替吡拉西样品、各杂质对照品信息(经过检测确证其结构)。
| 名称 | 批号 | 来源 | 纯度(HPLC法) |
| 盐酸替吡拉西 | 160820-2 | 自制 | / |
| 杂质1 | 20151101 | 深圳卓越生物科技有限公司 | 97.6％ |
| 杂质2 | 20150809 | 深圳卓越生物科技有限公司 | 99.5％ |
| 杂质3 | 20150809 | 深圳卓越生物科技有限公司 | 98.2％ |
| 杂质4(起始物料Ⅰ) | BH-B62078-150729 | 上海瀚鸿化工科技有限公司 | 99.3％ |
| 杂质5(起始物料Ⅱ) | BH-B45026-151217 | 上海瀚鸿化工科技有限公司 | 99.9％ |
| 杂质6(中间体) | 20160823 | 自制 | 99.8％ |
验证用各杂质贮备液、杂质对照品溶液、***适用性溶液、供试品溶液的配制方法
检测方法：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器
色谱柱：岛津Intersil ODS-3C18型号为250mm*4.6mm*5μm
流动相A：磷酸盐缓冲液(pH 2.0)+0.1％戊烷磺酸钠(称取19.7g十二水合磷酸氢二钠和移取12ml磷酸至1L水中，用磷酸氢二钠调节pH至2.0，再加入1g的戊烷磺酸钠)
流动相B：甲醇
洗脱梯度：
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0.00 | 95.0 | 5.0 |
| 5.00 | 95.0 | 5.0 |
| 30.00 | 90.0 | 10.0 |
| 55.00 | 85.0 | 15.0 |
| 65.00 | 40.0 | 60.0 |
| 80.00 | 40.0 | 60.0 |
| 80.10 | 95.0 | 5.0 |
| 105.00 | 95.0 | 5.0 |
检测波长：210nm
柱温：35℃
流速1.0ml/min
进样量：10μl
按照上述检测条件，精密量取***适用性溶液10μl注入液相色谱仪进行检测，结果符合要求，精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，按外标法计算供溶液中盐酸替吡拉西及其杂质的含量，结果数据见下表
计算公式：
杂质含量＝(A样×V×Z平)/M样
式中：A样为供试品中被测物的峰面积，
M样为供试品的称样量
V为供试品的稀释倍数
Z平为被测物对照品的浓度与峰面积的比值
表1盐酸替吡拉西有关物质检验结果：
从上述结果中可以看出，样品测定结果符合要求，保留时间、分离度、理论塔板数等均符合要求，检测数据可靠，说明该方法可以用于检测盐酸替吡拉西及其杂质。
方法学验证
专属性实验
检测方法：同上。
分别配制盐酸替吡拉西供试品溶液及各有关物质对照品溶液，盐酸替吡拉西与各有关物质的混合溶液以及空白溶剂溶液，分别取10μl注入液相色谱仪进行检测。盐酸替吡拉西与各杂质分离度结果见表2，图谱见图1-8。
表2盐酸替吡拉西与各杂质分离度结果
| 名称 | 杂质定位保留时间 | 混合样品保留时间 | 分离度 | 理论塔板数 |
| 杂质5 | 6.326 | 6.325 | - | 9763 |
| 盐酸替吡拉西 | 10.247 | 10.254 | 11.51 | 9294 |
| 杂质4 | 14.735 | 14.748 | 4.21 | 14665 |
| 杂质2 | 28.422 | 28.431 | 24.36 | 32125 |
| 杂质1 | 30.894 | 30.914 | 3.84 | 35416 |
| 杂质3 | 32.749 | 32.965 | 2.74 | 35957 |
| 杂质6 | 37.163 | 37.176 | 5.91 | 34661 |
结论：空白溶剂对主峰无干扰，各杂质峰分离度符合要求，对主峰无干扰。
进样精密度实验：
检测方法：同上
混合杂质对照品溶液连续进样6次，根据各杂质的峰面积计算RSD(RSD≤2.0％)，结果见表3
表3进样精密度实验结果
结论：该方法进样精密度符合要求。
定量限、检测限实验：
检测方法：同上。
(1)将杂质对照品溶液逐级稀释进样检测
定量限信噪比为10:1时的各杂质浓度检测结果见表4，图谱见图9。
表4定量限
| 杂质名称 | 定量限浓度 | 定量限/ng |
| 杂质5 | 0.02284 | 0.2284 |
| 杂质4 | 0.0501 | 0.501 |
| 杂质2 | 0.213 | 2.13 |
| 杂质1 | 0.1054 | 1.054 |
| 杂质3 | 0.1004 | 1.004 |
| 杂质6 | 0.05425 | 0.5425 |
检测限信噪比为3:1时的各杂质浓度检测结果见表5，图谱见图10
表5检测限
线性试验
精密称取各杂质对照品适量，用50％甲醇水溶液溶解并稀释，配制成不同浓度的溶液分别进样并记录色谱图，以各杂质的实际浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到各杂质的线性回归方程。
检测方法：同上。
杂质1线性试验结果见表6
表6：杂质1线性
杂质2线性试验结果见表7：
表7：杂质2线性
杂质3线性试验结果见表8：
表8：杂质3线性
杂质4线性试验结果见表9：
表9：杂质4线性
杂质5线性试验结果见表10：
表10：杂质5线性
杂质6线性试验结果见表11：
表11：杂质6线性
结论：杂质1在0.1054～11.76μg/ml浓度范围内，杂质2在0.213～12.75μg/ml浓度范围内，杂质3在0.1004～12.048μg/ml浓度范围内，杂质4在0.0501～12.024μg/ml浓度范围内，杂质5在0.02284～13.704μg/ml浓度范围内，杂质6在0.05425～13.02μg/ml浓度范围内，线性关系良好。
回收率实验
配制各浓度杂质对照品混合储备液，将杂质以(80％、100％、120％)浓度加入盐酸替吡拉西中共配制9份供试品溶液，计算回收率，结果见表12-17
检测方法：同上。
表12：杂质1回收率
表13：杂质2回收率
表14：杂质3回收率
表15：杂质4回收率
表16：杂质5回收率
表17杂质6回收率
耐用性实验
(1)检测方法：仅改变流速，其他同以上。
将流速改变为0.8ml/min、1.0ml/min及1.2ml/min，用专属性的混合溶液进样，考察各杂质的分离度，结果见表18，图谱见11-12。
(2)检测方法：仅改变柱温，其他同上。
将柱温改变为33℃、35℃、37℃，用专属性的混合溶液进样，考察各杂质的分离度，结果见表18，图谱见13-14。
表18杂质分离度结果
结论：各条件下分离度良好，说明本方法在流速和柱温上耐用性良好。
Claims (1)
1.一种盐酸替吡拉西有关物质的分析方法，其主要步骤包括：
1）***适应性溶液的配置：取盐酸替吡拉西样品及各杂质对照品适量
分别用甲醇或流动相溶解样品，配制成每1mL含盐酸替吡拉西及各杂质对照品0.01～1.5mg的***适应性溶液；
2）取盐酸替吡拉西样品适量，用甲醇或流动相溶解样品，配制成每1mL含盐酸替吡拉西0.1～1.5mg的样品溶液；
3）分别取各杂质对照品适量，分别用甲醇或流动相溶解样品，配制成每1mL含各杂质0.01～0.1mg的对照品溶液；
4）采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件为：流动相A为pH2.0的磷酸盐缓冲液和0.1%戊烷磺酸钠，流动相B为甲醇，梯度洗脱方法如下：
5）设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，色谱柱柱温箱温度为35℃，进样量为10µL，色谱柱岛津Intersil ODS-3 C18 250mm*4.6mm*5µm；
6）分别把步骤1）、2）、3）中的溶液加入到上述高效液相色谱中进行检测，最后用外标法计算盐酸替吡拉西及各杂质的含量。
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