CN111954678A

CN111954678A - 厄瑞努单抗组合物及其用途

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Publication number: CN111954678A
Application number: CN201980024813.5A
Authority: CN
Inventors: K·劳森; N·里德; S·哈普亚拉奇基; J·G·拉米雷斯
Original assignee: American Amgen
Current assignee: American Amgen; Amgen Inc
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2020-11-17
Also published as: JP2021519790A; CA3095899A1; SG11202009629YA; MA52202A; AR114722A1; EP3774881A1; WO2019195185A1; KR20200139720A; PH12020551618A1; CL2023000491A1; MX2020010320A; AU2019246983A1; US11407838B2; BR112020019882A2; US20190300617A1; JP2023103323A; IL277663A; EA202092335A1; CL2020002519A1; TW202003572A

Abstract

本发明涉及包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的组合物，该一种或多种变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、和HMW种类。还描述了包含厄瑞努单抗组合物的药物配制品以及使用和表征这些组合物的方法。

Description

厄瑞努单抗组合物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月2日提交的美国临时申请号62/651,651的权益，将其通过引用以其全文并入本文。

电子提交的文本文件的说明

本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且将其通过引用以其整体特此结合。2019年3月1日创建的序列表的计算机可读格式副本命名为A-2190-WO-PCT_SeqList_ST25，并且大小为15千字节。

技术领域

本发明涉及生物药剂学领域。特别地，本发明涉及厄瑞努单抗(erenumab)的变体的鉴定和表征，这些厄瑞努单抗的变体影响厄瑞努单抗的功能活性。本发明还涉及包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的组合物、包含这些组合物的药物配制品、以及使用和表征这些组合物的方法。

背景技术

厄瑞努单抗是特异性结合人降钙素基因相关肽(CGRP)受体并防止该CGRP配体结合且激活该受体的全人单克隆抗体。CGRP与偏头痛发病机制有关(Durham,New EnglandJournal of Medicine[新英格兰医学杂志],第350卷:1073-1075,2004；Edvinsson等人,Neurotherapeutics[神经治疗学],第7卷:164-175,2010)。在2期和3期临床试验中，与接受安慰剂的患者相比，使用厄瑞努单抗治疗的患有慢性或阵发性偏头痛的患者每月偏头痛天数减少(Tepper等人,Lancet Neurol.[柳叶刀神经病学],第16卷:425-434,2017；Goadsby等人,New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志],第377卷:2123-2132,2017)。

复杂的治疗性生物制剂，例如单克隆抗体，可以具有许多可影响生物制剂的安全性和/或效力的产品质量属性。通常需要对分子进行全面的结构和功能评估以鉴定这些属性并理解它们对分子特性的影响。了解分子的属性对于确保生产一致的产品非常重要。

生物制剂的变体可以在制造过程中或在储存条件下产生。这些产品变体可以归类为产品相关的物质或产品相关的杂质。产品相关的物质是在产品的制造或储存期间形成的所需产品的那些分子变体，这些变体具有与所需产品相当的性质，并且不被认为是杂质。相反，产品相关的杂质是所需产品的分子变体，其在产品效力和患者安全性方面不具有与所需产物相当的特性。因此，特别是对产品相关的杂质的鉴定和表征可用于生物药物产品的制造和质量控制。

发明内容

本发明部分基于对厄瑞努单抗的产品相关杂质的鉴定和表征，特别是具有降低的功能活性的厄瑞努单抗的变体。对治疗性厄瑞努单抗组合物中这些变体的量的控制和监测确保了厄瑞努单抗组合物具有必需的效力以产生所需的临床效果。因此，在一些实施例中，本发明提供了包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的厄瑞努单抗组合物，其中这些厄瑞努单抗变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、二硫化物同种型变体、高分子量(HMW)种类、或其组合，其中该组合物中厄瑞努单抗变体的量被控制住具体的范围内。

在某些实施例中，本发明提供了包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的组合物，其中该一种或多种厄瑞努单抗变体包括异构化变体和脱酰胺变体。在一些实施例中，该异构化变体在厄瑞努单抗的其中一条或两条重链(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)中的氨基酸位置105处具有异天冬氨酸残基或琥珀酰亚胺。在这些和其他实施例中，该脱酰胺变体在厄瑞努单抗的其中一条或两条重链(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)中的氨基酸位置102处具有的天冬酰胺残基转变为天冬氨酸残基、琥珀酰亚胺、或异天冬氨酸残基。例如，如通过疏水性相互作用色谱-高效液相色谱(HIC-HPLC)测定的该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量可以少于约30％、少于约15％、少于约8％、或少于约4％。

本发明还提供了厄瑞努单抗与厄瑞努单抗的一种或多种酸性变体的组合物。该组合物中酸性变体的量可以少于约40％，例如，从约25％至约38％或从约26％至约34％。在一些实施例中，通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)测定厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量。厄瑞努单抗的酸性变体包括二硫化物同种型变体、脱酰胺变体、片段化变体、非共有糖基化变体、HMW种类、及其组合。在某些实施例中，这些酸性变体包括二硫化物同种型变体、片段化变体、或其组合。

在一些实施例中，本发明提供了厄瑞努单抗与厄瑞努单抗的二硫化物同种型变体的组合物。厄瑞努单抗的二硫化物同种型变体可以包括IgG2-B同种型和/或IgG2-A/B同种型。该组合物中IgG2-B同种型的量可以少于约20％，例如，少于约10％、或少于约8％，例如从约4％至约6％。该组合物中IgG2-A/B同种型的量可以是从约20％至约40％、从约26％至约38％、或从约34％至约37％。在某些实施例中，通过非还原反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定二硫化物同种型的量。

本发明还包括包含厄瑞努单抗和厄瑞努单抗的一种或多种尺寸变体的组合物，例如低分子量(LMW)种类、中等分子量(MMW)种类、和高分子量(HMW)种类。在某些实施例中，该组合物中HMW种类的量少于约3.0％，例如，约2.5％或更少、约2.1％或更少、约1.8％或更少、约1.4％或更少、或约1.2％或更少。在一个具体的实施例中，厄瑞努单抗的HMW种类主要由共价连接的厄瑞努单抗的二聚体组成。厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量可以通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)测定。

在一些实施例中，本发明还提供了评价或评估厄瑞努单抗组合物的质量的方法。在一个实施例中，这些方法包括获得厄瑞努单抗组合物，该组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体；测量该组合物中一种或多种厄瑞努单抗变体的量；将该一种或多种厄瑞努单抗变体的所测量与预定参考标准进行比较；并且如果该比较表明满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。这些方法可以包括以下的一个、两个、或三个：(1)测量该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量(例如，通过HIC-HPLC中前峰的峰面积百分比)，(2)测量该组合物中酸性变体的量(例如，通过CEX-HPLC中酸性峰的峰面积百分比)，和/或(3)测量该组合物中HMW种类的量(例如，通过SE-UHPLC中前峰的峰面积百分比)。在某些实施例中，全部的三个测量对厄瑞努单抗组合物进行。

包含本文所述的厄瑞努单抗组合物的药物配制品还包括在本发明中。在一些实施例中，这些药物配制品包含本文所述的厄瑞努单抗组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂(例如，缓冲剂、糖、和表面活性剂)。可以将这些药物配制品掺入注入装置(例如，预填充式注射器或自动注射器)。在这样的实施例中，预填充式注射器或自动注射器的注射体积少于约2mL，例如，约1mL。

本发明还包括使用本发明的厄瑞努单抗组合物和药物配制品在对其有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的方法。在一个实施例中，这些方法包括向患者施用包含本文所述的厄瑞努单抗组合物的药物配制品。头痛可以是偏头痛、丛集性头痛、或其他类型的头痛障碍(例如，紧张型头痛、偏瘫性偏头痛、经期偏头痛、和视网膜性偏头痛)。在某些实施例中，待根据本发明的方法和用途治疗的患者具有或被诊断为偏头痛(例如，阵发性偏头痛或慢性偏头痛)。

特别考虑了这些厄瑞努单抗组合物在本文披露的任何方法中或在根据本文披露的任何方法施用的药物的制备中的用途。例如，本发明用于在对其有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的方法中使用的本文所述的厄瑞努单抗组合物或药物配制品。本发明还涵盖了本文所述的厄瑞努单抗组合物或药物配制品在制备用于在对其有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的药物中的用途。

附图说明

图1A和1B示出了针对厄瑞努单抗的重链(图1A；SEQ ID NO:1)和轻链(图1B；SEQID NO:2)的氨基酸序列。每条链上的互补决定区(CDR)以加粗和加下划线示出。该重链包含位置306处的天冬酰胺残基上的N-联糖基化位点。

图1C和1D示出了针对厄瑞努单抗，在N-末端和C-末端处具有常见翻译后修饰的重链(图1C；SEQ ID NO:3)和轻链(图1D；SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在每条链中CDR以加粗和加下划线示出。pE代表焦谷氨酸。

图1E和1F示出了针对厄瑞努单抗的重链可变区(图1E；SEQ ID NO:5)和轻链可变区(图1F；SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。在每个可变区中CDR以加粗和加下划线示出。

图2A和2B描绘了按全比例(图2A)和扩展比例(图2B)表示的厄瑞努单抗原料药的代表性HIC-HPLC图谱。通过HIC-HPLC，使用乙酸钠(pH 5.5)流动相，用硫酸铵的线性递减梯度进行洗脱并且在280nm处检测吸光度来分析厄瑞努单抗原料药。

图3显示HIC-HPLC收集的级分和通过HIC-HPLC分析的厄瑞努单抗原料药的叠加。通过HIC-HPLC，使用乙酸钠(pH 5.5)流动相，用硫酸铵的线性递减梯度进行洗脱并且在280nm处检测吸光度来分析厄瑞努单抗原料药和从半制备型HIC-HPLC(F1-F7)收集的级分。每个小图是在280nm处的吸光度相对按分钟表示的洗脱时间的图。将全部七种HIC-HPLC级分与厄瑞努单抗原料药的叠加示出在小图8中。

图4是针对富集的HIC-HPLC级分(F2-F6)和未分级的厄瑞努单抗原料药(DS)的厄瑞努单抗重链CDR3内肽的洗脱区的还原胰蛋白酶肽图叠加。TH12H13肽对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基99至113，并且TH13对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基101至113。

图5是暴露于热应激的厄瑞努单抗原料药的HIC-HPLC图谱。通过HIC-HPLC，使用乙酸钠(pH 5.5)流动相，用硫酸铵的线性梯度进行洗脱并且在280nm处检测吸光度来分析在50℃下孵育14天的厄瑞努单抗原料药。顶部迹线对应于第14天时间点。

图6描绘了针对在50℃下应激14天的厄瑞努单抗原料药以扩展比例的还原的胰蛋白酶肽图谱。TH12H13肽对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基99至113，并且TH13对应于SEQ IDNO:1的氨基酸残基101至113。TH26肽对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基311至326，并且检测的片段是由于L³¹⁵和T³¹⁶之间的非特异性切割。

图7是在pH 7.4和37℃应激的厄瑞努单抗原料药的HIC-HPLC图谱。将用PBS(pH7.4)稀释至10mg/mL并在37℃下孵育14天的厄瑞努单抗原料药通过HIC-HPLC，使用乙酸钠(pH 5.5)流动相，用硫酸铵的线性梯度进行洗脱并且在280nm处检测吸光度来进行分析。将对照样品连同生理pH应激状态的样品稀释于配制品缓冲液(pH5.2)中，并且在37℃下孵育14天。

图8是在pH 8.0和25℃应激的厄瑞努单抗原料药的HIC-HPLC图谱。将用Tris碱(pH8.0)稀释至10mg/mL并在25℃下孵育14天的厄瑞努单抗原料药通过HIC-HPLC，使用乙酸钠(pH 5.5)流动相，用硫酸铵的线性梯度进行洗脱并且在280nm处检测吸光度来进行分析。将对照样品连同高pH应激状态的样品稀释于配制品缓冲液(pH 5.2)中，并且在25℃下孵育14天。

图9是厄瑞努单抗批次的相对效力百分比作为在四种不同的储存条件下相同批次的HIC-HPLC分析中前峰的峰面积百分比的函数的图。针对每个温度显示来自数据线性回归分析的拟合回归线。对于40℃条件，回归线的斜率在统计上不同于零，并显示相对效力百分比如何随着HIC-HPLC前峰面积百分比的增加而降低。

图10显示了来自图9中40℃储存条件的数据的图和拟合回归线，其中拟合线延伸以跨70％相对效力阈值。70％相对效力阈值线跨回归线约28.85％的HIC-HPLC前峰面积。

图11描绘了厄瑞努单抗原料药的代表性CEX-HPLC图谱。通过CEX-HPLC，使用磷酸钠(pH 6.6)流动相，用氯化钠的线性梯度洗脱并在280nm处检测吸光度来分析厄瑞努单抗原料药。

图12显示CEX-HPLC收集的级分和通过CEX-HPLC分析的厄瑞努单抗原料药的叠加。通过CEX-HPLC，使用磷酸钠(pH 6.6)流动相，用氯化钠的线性梯度进行洗脱并在280nm处检测吸光度来分析厄瑞努单抗原料药和从半制备型CEX-HPLC(F1-F9)收集的级分。每个小图是在280nm处的吸光度相对按分钟表示的洗脱时间的图。

图13A和13B显示CEX-HPLC酸性和主峰级分(图13A)以及CEX-HPLC碱性峰级分(图13B)的RP-HPLC图谱。通过RP-HPLC，使用Waters BEH300 C4柱(1.7μm粒度，2.1mmx50mm)并且使用含有0.1％TFA的流动相和1-丙醇的梯度在75℃下进行洗脱在215nm下检测来分析厄瑞努单抗原料药(DS)和CEX-HPLC级分(F1-F9)。IgG2-A、IgG2-A/B和IgG2-B对应于厄瑞努单抗的不同二硫化物同种型。不同二硫化物同种型的结构示意性地显示在图15A-15C中。

图14说明了非还原的(顶部迹线)和还原的(底部迹线)厄瑞努单抗的Lys-C肽图谱。使厄瑞努单抗原料药变性并用内切蛋白酶Lys-C消化。还原图中经标记的峰鉴定存在于还原的Lys-C肽图中但在非还原的Lys-C肽图中不存在的肽。对于每种经标记的肽的描述列于表18和19中。

图15A是由非还原和还原的Lys-C肽图谱鉴定的厄瑞努单抗二硫化物同种型IgG2-A结构的图解。

图15B是由非还原和还原的Lys-C肽图谱鉴定的厄瑞努单抗二硫化物同种型IgG2-A/B结构的图解。

图15C是由非还原和还原的Lys-C肽图谱鉴定的厄瑞努单抗二硫化物同种型IgG2-B结构的图解。

图16A是以扩展比例的厄瑞努单抗原料药的非还原RP-HPLC图谱。通过RP-HPLC，使用Waters BEH300 C4柱(1.7μm粒度，2.1mm x 50mm)并且使用含有0.1％TFA的流动相和1-丙醇的梯度在75℃下进行洗脱在215nm下检测来分析厄瑞努单抗原料药。IgG2-A、IgG2-A/B和IgG2-B对应于厄瑞努单抗的不同二硫化物同种型。不同二硫化物同种型的结构示意性地显示在图15A-15C中。

图16B是相对于厄瑞努单抗原料药，富集二硫化物同种型变体的CEX-HPLC级分的RP-HPLC图谱的叠加。通过RP-HPLC，使用Waters BEH300 C4柱(1.7μm粒度，2.1mmx50mm)并且使用含有0.1％TFA的流动相和1-丙醇的梯度在75℃下进行洗脱在215nm下检测来分析厄瑞努单抗原料药和CEX-HPLC级分。

图17A和17B描绘了按全比例(图17A)和扩展比例(图17B)表示的厄瑞努单抗原料药的代表性SE-UHPLC图谱。通过SE-UHPLC，使用100mM磷酸钠、250mM氯化钠、pH 6.8流动相并在280nm处检测吸光度来分析厄瑞努单抗原料药。缓冲峰用星号(*)表示。

图18显示SE-UHPLC收集的级分和通过SE-UHPLC分析的厄瑞努单抗原料药的叠加。通过SE-UHPLC，使用100mM磷酸钠、250mM氯化钠、pH 6.8流动相并在280nm处检测吸光度来分析厄瑞努单抗原料药和从半制备型SE-HPLC收集的级分。每个小图是针对厄瑞努单抗原料药在SE-UHPLC图谱上叠加的每种级分的280nm处的吸光度对以分钟表示的洗脱时间的图。将全部三种SE-UHPLC级分与厄瑞努单抗原料药的叠加示出在小图4中。

图19是以扩展比例表示的SE-UHPLC收集的级分和厄瑞努单抗原料药的rCE-SDS图谱。使厄瑞努单抗原料药(DS)和SE-UHPLC级分(主级分、HMW1、HMW2)变性并还原，然后在25℃下电动注入用SDS胶缓冲液填充的裸熔融二氧化硅毛细管中。在220nm处监测吸光度。***峰用星号(*)表示。LMW＝低分子量种类；MMW＝中等分子量种类；HMW＝高分子量种类；LC＝轻链；HC＝重链；NGHC＝非糖基化的重链；post-HC＝后重链。

图20是暴露于热应激的厄瑞努单抗原料药的SE-UHPLC图谱。通过SE-UHPLC，使用100mM磷酸钠、250mM氯化钠、pH 6.8流动相来分析在50℃下孵育长达14天的厄瑞努单抗原料药，并在280nm处检测吸光度。顶部迹线对应于第14天时间点。

具体实施方式

本发明涉及对表现出降低的功能活性的厄瑞努单抗的变体进行鉴定和表征。特别地，具有某些结构修饰的厄瑞努单抗的变体在阻断由CGRP配体引起的CGRP受体激活方面比厄瑞努单抗弱得多。在本文中详细描述的此类变体包括异构化变体、脱酰胺变体、二硫化物同种型变体、酸性变体、和HMW种类。通过限制厄瑞努单抗原料药和厄瑞努单抗药物产品中这些变体的量，厄瑞努单抗组合物的总体效力可以维持或与临床试验中采用的厄瑞努单抗组合物匹配，并观察到具有临床效力。因此，本发明提供了包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的组合物，其中该组合物中厄瑞努单抗变体的量被控制在如本文所述的具体范围或限制内。

术语厄瑞努单抗是指IgG2抗体，该抗体包含SEQ ID NO:5的重链可变区序列和SEQID NO:6的轻链可变区序列。在一个实施例中，厄瑞努单抗包含含有SEQ ID NO:1的序列的重链和含有SEQ ID NO:2的序列的轻链。在这样的实施例中，厄瑞努单抗是包含两条重链和两条轻链的抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:1的序列，并且每条轻链包含SEQ ID NO:2的序列。当重组产生时，厄瑞努单抗可以在重链和轻链的末端经历一般的翻译后修饰，例如从重链去除位置456处的C-末端赖氨酸残基并且以及轻链和重链中的N-末端谷氨酰胺残基环化为焦谷氨酸。因此，术语厄瑞努单抗还可以指IgG2抗体，该抗体在一条或两条重链中缺少C-末端赖氨酸残基和/或在一条或两条轻链和/或一条或两条重链中包含焦谷氨酸残基代替谷氨酰胺残基作为N-末端残基。例如，在一些实施例中，厄瑞努单抗是包含两条重链和两条轻链的抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:3的序列，并且每条轻链包含SEQ ID NO:4的序列。在其他实施例中，厄瑞努单抗是包含两条重链和两条轻链的抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列，并且每条轻链包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的序列。

在某些实施例中，在本发明的组合物中存在的厄瑞努单抗变体是电荷变体。电荷变体是指具有不同电荷特征的厄瑞努单抗的变体，该电荷特征尤其是由直接改变抗体的净电荷，诱导构象变化或影响局部电荷分布的翻译后修饰引起的。此类翻译后修饰可以包括去酰胺化(deamidiation)、异构化、糖基化、氧化、和唾液酸化的糖基化。可以将电荷变体与厄瑞努单抗分离，并且使用离子交换色谱、反相色谱、或疏水性相互作用色谱进行检测。厄瑞努单抗的电荷变体可以包括，但不限于异构化变体、脱酰胺变体、二硫化物同种型变体、酸性变体、和糖基化变体。

在一些实施例中，厄瑞努单抗的电荷变体是异构化变体。厄瑞努单抗的异构化变体是指其中在重链多肽或轻链多肽中的一个或多个天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸或琥珀酰亚胺的厄瑞努单抗的变体。在一个实施例中，厄瑞努单抗的异构化变体在厄瑞努单抗的一条或两条重链(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)中的氨基酸位置105处具有异天冬氨酸残基或琥珀酰亚胺。如实例1中的描述，重链可变区的CDR3中位置105处的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸显著降低厄瑞努单抗的抑制效力。

在其他实施例中，厄瑞努单抗的电荷变体是脱酰胺变体。厄瑞努单抗的脱酰胺变体是指其中重链多肽或轻链多肽中一个或多个天冬酰胺残基转变为天冬氨酸的厄瑞努单抗的变体，该天冬氨酸反过来可以转变为琥珀酰亚胺或异天冬氨酸。在一个实施例中，该脱酰胺变体在厄瑞努单抗的其中一条或两条重链(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)中的氨基酸位置102处具有的天冬酰胺残基转变为天冬氨酸、琥珀酰亚胺、或异天冬氨酸。如实例1中的描述，重链可变区的CDR3中位置102处的天冬酰胺残基的脱酰胺作用显著降低了厄瑞努单抗的抑制效力。在另一个实施例中，该脱酰胺变体在厄瑞努单抗的其中一条或两条重链中的氨基酸位置393和/或398处具有的天冬酰胺残基转变为天冬氨酸、琥珀酰亚胺、或异天冬氨酸。

测定和定量厄瑞努单抗的异构化变体和脱酰胺变体的方法包括疏水性相互作用色谱，例如在实例1中描述的疏水性相互作用色谱-高效液相色谱(HIC-HPLC)方法；肽作图，例如在实例1中描述的ESI-MS/MS肽作图方法；离子交换色谱，例如在实例3中描述的阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)方法；反相高效液相色谱(RP-HPLC)，以及对于本领域技术人员已知的其他方法，例如在以下文献中描述的那些：Kameoka等人,Journal ofBiochemistry[生物化学杂志],第134卷:129-135,2003；Zhang等人,Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis[药物与生物医学分析杂志],第30卷:1479-1490,2003；Yang等人,Electrophoresis[电泳],第31卷:1764-1772,2010；Faseri等人,Journal of Chromatography A[色谱A杂志],第1498卷:215-223,2017；和Leblanc等人,Journal of Chromatography B[色谱B杂志],第1048卷:130-139,2017中。

本发明的组合物包含受控量的厄瑞努单抗的异构化变体和脱酰胺变体，使得厄瑞努单抗组合物的总体效力维持在观察到具有临床效力的水平。参见实例1和2。例如，在某些实施例中，本发明提供了包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的组合物，其中该一种或多种厄瑞努单抗变体包括异构化变体和脱酰胺变体，并且其中该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量少于约30％。该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量可以少于约25％、少于约20％、少于约17％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、或少于约4％。在一个实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量少于约15％。在另一个实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量少于约8％。在又另一个实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量少于约4％。在一些实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量可以是从约0.5％至约30％、从约1％至约20％、从约1％至约17％、从约1％至约15％、从约1％至约12％、从约1％至约10％、从约0.5％至约8％、从约0.5％至约6％、从约1％至约4％、从约0.5％至约3.5％、从约1.5％至约2.5％、或从约1.7％至约2.1％。在一个实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是从约1％至约10％。在另一个实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是从约1％至约4％。在又另一个实施例中，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是从约0.5％至约3.5％。

可以通过上述用于检测和定量这些变体的任何方法来确定本发明的组合物中的厄瑞努单抗异构化变体和脱酰胺变体的量。在某些实施例中，通过HIC-HPLC测定该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量。这些异构化变体(例如，重链中Asp105的异构化)和脱酰胺变体(例如，重链中Asn102的脱酰胺)是HIC-HPLC的前峰级分中的优势种类。参见实例1和2。因此，可以由HIC-HPLC色谱图中前峰的峰面积百分比确定厄瑞努单抗组合物中这些变体的量。HIC-HPLC色谱图中的前峰是指峰高高于检测限的峰，该峰具有的保留时间短于主峰的保留时间，该主峰通常是色谱图中具有最大峰高的峰。参见图2A、2B、5、7、和8。该主峰对应于厄瑞努单抗(例如，包含具有SEQ ID NO:1或3的序列的两条重链以及具有SEQ ID NO:2或4的序列的两条轻链的抗体)，该厄瑞努单抗是组合物中抗体分子的主要形式。根据以下公式可以计算前峰的峰面积百分比：

其中总积分的峰面积是色谱图中具有高于检测限的峰高的所有峰的经合并的面积。类似地，可以根据以下公式计算主峰的峰面积百分比：

其中总积分的峰面积是色谱图中具有高于检测限的峰高的所有峰的经合并的面积。在一些实施例中，如实例1中所述进行HIC-HPLC方法。

在某些实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，本发明的组合物中异构化变体(例如，重链中Asp105的异构化)和脱酰胺变体(例如，重链中Asn102的脱酰胺)的量是约15％或更少。在一个实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约10％或更少。在另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约8％或更少。在另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约6％或更少。在又另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约4％或更少。在仍另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约3.2％或更少。在另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约2.7％或更少。在一些实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是从约1％至约10％。在其他实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是从约1％至约4％。在仍其他的实施例中，如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是从约0.5％至约3.5％。

在一些实施例中，本发明的组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体，其中这些厄瑞努单抗变体包含异构化变体和脱酰胺变体，并且其中：

(i)如通过HIC-HPLC中主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约90％或更多、约92％或更多、约93.9％或更多、约94.4％或更多、约96.2％或更多、约96.8％或更多、或约97.3％或更多；以及

(ii)如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约10％或更少、约8％或更少、约6.1％或更少、约5.6％或更少、约3.8％或更少、约3.2％或更少、或约2.7％或更少。

在一个实施例中，如通过HIC-HPLC中主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约92％或更多，并且如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约8％或更少。在另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约96.8％或更多，并且如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约3.2％或更少。在又另一个实施例中，如通过HIC-HPLC中主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约97.3％或更多，并且如通过HIC-HPLC中前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约2.7％或更少。在这些和其他实施例中，如实例1所述进行HIC-HPLC，并且由主峰和前峰的峰面积百分比确定量。

如实例2所述，在重链CDR3中Asp105的异构化对强制热应激条件高度敏感，并且当暴露于升高的pH(例如，pH7.4或更高)时重链CDR3(Asn102)和Fc区(Asn393和Asn398)中的脱酰胺化都增加。因此，通过限制厄瑞努单抗组合物的暴露于高于室温的温度和碱性溶液(例如，pH大于7.0的溶液)的时间，可以在制造过程和储存过程中控制厄瑞努单抗的异构化和脱酰胺变体的产生。例如，在一些实施例中，将过程池保持或将厄瑞努单抗组合物的储存物在室温下保持不超过14天。在其他实施例中，在低于15℃，例如在2℃至8℃之间的温度下进行厄瑞努单抗组合物的长期储存。还可以通过纯化过程，例如疏水性相互作用色谱或离子交换色谱，从厄瑞努单抗组合物中去除厄瑞努单抗的异构化变体和脱酰胺变体。厄瑞努单抗的异构化和脱酰胺变体两者在HIC中比厄瑞努单抗更早洗脱，并因此可以通过收集和丢弃这些早期洗脱的级分从厄瑞努单抗组合物中去除这些变体。厄瑞努单抗的脱酰胺变体通常比厄瑞努单抗具有更多的负电荷，并且因此，在阳离子交换色谱中比厄瑞努单抗更早洗脱，或在阴离子交换色谱中将比厄瑞努单抗洗脱更晚。因此，通过适当地定时收集从阳离子交换树脂或阴离子交换树脂中洗脱的级分，可以从厄瑞努单抗组合物中去除更酸性的脱酰胺变体。

在某些实施例中，本发明组合物中厄瑞努单抗的电荷变体是酸性变体。酸性变体是指已经获得负电荷或失去正电荷的厄瑞努单抗的变体，或由于构象变化而具有改变的表面电荷特征，因此相对于厄瑞努单抗具有更多的酸性特征。与厄瑞努单抗相比，厄瑞努单抗的酸性变体展示出降低的抑制效力。参见实例3和表14。使用基于电荷特征分离蛋白质的任何方法，例如等电点聚焦电泳、毛细管等电点聚焦电泳、阳离子交换色谱(CEX)和离子交换色谱(AEX)可以将酸性变体与厄瑞努单抗分离、检测和定量。当通过离子交换色谱分析时，可以通过酸性变体相对于主峰的保留时间来鉴定酸性变体，该主峰对应于厄瑞努单抗。例如，酸性变体比CEX的主峰更早洗脱-即，酸性变体的保留时间比CEX中主峰的保留时间更短。当使用AEX时，酸性变体比主峰更晚洗脱，并因此具有比AEX中主峰的保留时间更长的保留时间。

在一些实施例中，本发明提供了包含受控量的厄瑞努单抗酸性变体的组合物，使得该厄瑞努单抗组合物的总效力维持在观察到具有临床效力的水平。参见实例3。因此，在某些实施例中，本发明提供了包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗酸性变体的组合物，其中该组合物中酸性变体的量少于约40％。该组合物中酸性变体的量可以是少于约38％、少于约37％、少于约36％、少于约35％、少于约34％、少于约33％、少于约32％、少于约31％、少于约30％、少于约29％、少于约28％、少于约27％、或少于约26％。在一个实施例中，该组合物中酸性变体的量少于约38％。在另一个实施例中，该组合物中酸性变体的量少于约35％。在又另一个实施例中，该组合物中酸性变体的量少于约32％。在又另一个实施例中，该组合物中酸性变体的量少于约30％。在一些实施例中，该组合物中酸性变体的量可以从约20％至约40％、从约25％至约38％、从约24％至约35％、从约28.5％至约37.5％、从约26％至约34％、从约28％至约32％、从约32.5％至约37.5％、从约28.7％至约31.3％、或从约26.5％至约33.6％。在一个实施例中，该组合物中酸性变体的量是从约25％至约38％。在另一个实施例中，该组合物中酸性变体的量是从约26％至约34％。在又另一个实施例中，该组合物中酸性变体的量是从约28％至约32％。

可以通过上述用于检测和定量这些变体的任何方法来确定本发明的组合物中厄瑞努单抗酸性变体的量。在某些实施例中，通过离子交换色谱测定该组合物中酸性变体的量。在一个具体的实施例中，通过CEX-HPLC，例如实例3中所述的方法测定该组合物中酸性变体的量。当通过CEX分离时，厄瑞努单抗的酸性变体比厄瑞努单抗(主峰)洗脱更早，并且厄瑞努单抗的碱性变体比厄瑞努单抗(主峰)洗脱更晚。参见图11。根据CEX-HPLC色谱中酸性峰的峰面积百分比可以测定厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量。酸性峰是具有峰高高于检测限的那些峰，这些峰具有比主峰的保留时间更短的保留时间。碱性峰是具有峰高高于检测限的那些峰，这些峰具有比主峰的保留时间更长的保留时间。所需组分(例如，酸性峰、主峰、或碱性峰)的峰面积百分比可通过将所需组分(例如，酸性峰、主峰或碱性峰)的峰面积除以总积分峰面积并将结果乘以100来计算。在某些实施例中，如实例3中所述进行CEX-HPLC方法。

在一些实施例中，本发明的组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体，其中这些厄瑞努单抗变体包括酸性变体，并且如通过CEX-HPLC中酸性峰所测量的，该组合物中酸性变体的量是约40％或更少、约38％或更少、约36％或更少、约35％或更少、约34％或更少、或约32％或更少。在一个实施例中，如通过CEX-HPLC中酸性峰所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约25％至约38％。在另一个实施例中，如通过CEX-HPLC中酸性峰所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约26％至约34％。在又另一个实施例中，如通过CEX-HPLC中酸性峰所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约26.5％至约33.6％。在仍另一个实施例中，如通过CEX-HPLC中酸性峰所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约28.7％至约31.3％。在另一个实施例中，如通过CEX-HPLC中酸性峰所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约32.5％至约37.5％。在这些和其他实施例中，如实例3所述进行CEX-HPLC，并且由酸性峰的峰面积百分比确定酸性变体的量。

这些酸性变体可以包括二硫化物同种型变体、脱酰胺变体、片段化变体、非共有糖基化变体、高分子量(HMW)种类、及其组合。在某些实施例中，这些酸性变体包括二硫化物同种型变体(本文中更详细的描述)、片段化变体、或其组合。如实例3所述，与厄瑞努单抗相比，富集片段化变体或二硫化物同种型变体(特别是IgG2-B二硫化物同种型)的酸性级分展示出降低的效力。

在一些实施例中，这些酸性变体包括片段化变体。片段化变体可以通过水解肽键形成，导致轻链多肽和/或重链多肽的切割。因此，厄瑞努单抗的片段化变体是指由比全长链更少的氨基酸组成的厄瑞努单抗轻链(SEQ ID NO:2或4)的片段或厄瑞努单抗重链(SEQID NO:1或3)的片段。可以使用具有十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)的还原毛细管电泳，例如在实例3中所述的rCE-SDS方法测量片段化变体，该方法将这些片段化的变体解析为低分子量(LMW)和中等分子量(MMW)种类。厄瑞努单抗的LMW种类是具有分子量低于完整厄瑞努单抗轻链的分子量的片段，该完整厄瑞努单抗轻链具有约22,790Da的分子量。厄瑞努单抗的MMW种类是具有分子量高于完整厄瑞努单抗轻链的分子量但小于完整厄瑞努单抗重链的分子量的片段，该完整厄瑞努单抗重链具有约50,165Da的分子量(去糖基化)。在用rCE-SDS分离后，厄瑞努单抗的LMW种类在厄瑞努单抗轻链峰之前迁移，并且厄瑞努单抗的MMW种类在厄瑞努单抗轻链峰和厄瑞努单抗重链峰之间迁移。参见，例如图19。

使用基于电荷特征分离蛋白质的色谱方法(例如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱或混合式色谱)可以降低厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量。参见，例如在美国专利号8,946,395；9,067,990；9,249,218；和9,346,879中描述的方法。如上所述，在通过阳离子交换色谱分离后，厄瑞努单抗的酸性变体比厄瑞努单抗(主峰)更早洗脱。因此，可以在洗脱厄瑞努单抗主峰之前收集和丢弃酸性变体，或可以在洗脱酸性变体后开始收集厄瑞努单抗级分。当通过阴离子交换色谱分离时，厄瑞努单抗的酸性变体比厄瑞努单抗(主峰)洗脱更晚，并因此通过在酸性变体洗脱之前停止收集厄瑞努单抗级分，可以减少或从厄瑞努单抗组合物中去除酸性变体。

在某些实施例中，这些酸性变体包括二硫化物同种型变体。基于铰链区中二硫键的排列，IgG2抗体可展示出不同的结构同种型。在经典的二硫化物同种型(被称为IgG2-A)中，Fab臂未通过二硫键与铰链区连接，并且一条重链中的铰链区中的四个半胱氨酸残基(例如，SEQ ID NO:1或3的C232、C233、C236、和C239)各自与其他重链的铰链区中对应于半胱氨酸残基形成二硫键。参见图15A。二硫化物同种型变体是指IgG2抗体的变体，该变体与经典IgG2-A同种型相比具有不同二硫键连接性。在一些实施例中，该二硫化物同种型变体是IgG2-B同种型。在IgG2-B同种型结构中，两个Fab臂通过铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基与重链恒定CH1区和/或轻链恒定CL区中的半胱氨酸残基形成二硫键而与铰链区连接。参见图15C。例如，在一个实施例中，该IgG2-B同种型包含在第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)、和第二轻链(LC2)之间的以下二硫键连接性，其中氨基酸位置相对于重链的SEQ ID NO:1或3和轻链SEQ ID NO:2或4：

·HC1的C232与HC2的C157

·HC1的C233与LC1的C215

·HC2的C232与HC1的C157

·HC2的C233与LC2的C215

·HC1的C236与HC2的C236

·HC1的C239与HC2的C239

在其他实施例中，该二硫化物同种型变体是IgG2-A/B同种型。在IgG2-A/B同种型结构中，仅一个Fab臂通过铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基与重链恒定CH1区和/或轻链恒定CL区中的半胱氨酸残基形成二硫键而与铰链区连接。参见图15B。在一个实施例中，该IgG2-A/B同种型包含在HC1、LC1、HC2、和LC2之间的以下二硫键连接性，其中氨基酸位置相对于重链的SEQ ID NO:1或3和轻链的SEQ ID NO:2或4：

·HC1的C232与HC2的C157

·HC2的C232与LC2的C215

·HC1的C233与HC2的C233

·HC1的C236与HC2的C236

·HC1的C239与HC2的C239

本发明包括包含厄瑞努单抗和其一种或多种二硫化物同种型变体的组合物。这些二硫化物同种型变体可以包括IgG2-B同种型、IgG2-A/B同种型、或这两种的组合。在一些实施例中，该组合物包含厄瑞努单抗和其一种或多种二硫化物同种型变体，其中该一种或多种二硫化物同种型变体包括IgG2-B同种型，并且其中该组合物中IgG2-B同种型的量少于约20％。该组合物中IgG2-B同种型的量可以是少于约18％、少于约16％、少于约14％、少于约12％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、或少于约6％。在一个实施例中，该组合物中IgG2-B同种型的量少于约10％。在另一个实施例中，该组合物中IgG2-B同种型的量少于约8％。在某些实施例中，该组合物中IgG2-B同种型的量可以是从约0.5％至约20％、从约1％至约16％、从约3％至约12％、从约0.5％至约8％、从约1％至约6％、从约4％至约6％、从约4.4％至约5.9％、或从约4.6％至约5.2％。在一个实施例中，该组合物中IgG2-B同种型的量是从约0.5％至约8％。在另一个实施例中，该组合物中IgG2-B同种型的量是从约4％至约6％。

在某些实施例中，本发明的这些组合物包含厄瑞努单抗和其一种或多种二硫化物同种型变体，其中该一种或多种二硫化物同种型变体包括IgG2-A/B同种型。该组合物中IgG2-A/B同种型的量可以是从约10％至约56％、从约20％至约40％、从约26％至约38％、从约27％至约32％、从约32％至约38％、从约34％至约37％、或从约34.2％至约35.5％。在一个实施例中，该组合物中IgG2-A/B同种型的量是从约32％至约38％。在另一个实施例中，该组合物中IgG2-A/B同种型的量是从约34％至约37％。

在一些实施例中，本发明的这些组合物包含厄瑞努单抗IgG2-A同种型、厄瑞努单抗IgG2-A/B同种型、和厄瑞努单抗IgG2-B同种型，其中：

(i)该组合物中IgG2-A同种型的量是从约50％至约70％、从约52％至约66％、从约56％至约60％、或从约57.4％至约59.3％；

(ii)该组合物中IgG2-A/B同种型的量是从约26％至约38％、从约32％至约38％、从约34％至约37％、或从约34.2％至35.5％；以及

(iii)该组合物中IgG2-B同种型的量是从约3％至约12％、从约1％至约10％、从约4％至约8％、或从约4.6％至约5.2％。

检测和定量硫化物同种型的方法包括非还原反相高效液相色谱(RP-HPLC)，例如在实例3和4中，和在Wypych等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16194-16205,2008所述的RP-HPLC方法；肽作图，例如在实例4中所述的Lys-C肽作图方法；和基于质谱法的方法，例如在Zhang等人,Anal Chem.[分析化学],第82卷(3):1090-1099,2010和Zhang等人,Biochemistry[生物化学],第54卷:1956-1962,2015中描述的那些。在某些实施例中，在本发明的组合物中二硫化物同种型(例如，IgG2-A、IgG2-A/B、和IgG2-B)的量通过非还原RP-HPLC，任选地通过使用RP-HPLC图谱上针对每种同种型的峰面积百分比来确定(参见，例如图16A)。

使用在Dillon等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16206-16215,2008,PCT公开号WO 2006/047340、或PCT公开号WO 2006/060083(所有这些文献通过引用并入本文中)中描述的方法，通过将包含不同同种型的组合物暴露于单独的还原-氧化(氧化还原)剂或与离液剂的组合，可以改变二硫化物同种型的比例。例如，通过将包含不同同种型的组合物暴露于氧化还原剂(例如，半胱氨酸/胱氨酸或谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)和离液剂(例如，盐酸胍)，可以增加IgG2-A同种型的比例。因此，在一些实施例中，通过将组合物暴露于氧化还原剂与离液剂的组合中，任选地根据在Dillon等人,2008；WO 2006/047340；或WO 2006/060083中所述的方法可以从组合物中减少或消除厄瑞努单抗的IgG2-B同种型的量，该IgG2-B同种型与IgG2-A/B和IgG2-A同种型相比效力显著更低。

在某些实施例中，本发明的组合物中存在的厄瑞努单抗变体是尺寸变体。厄瑞努单抗的尺寸变体是指具有比厄瑞努单抗单体更低分子量或具有比厄瑞努单抗单体更高分子量的变体。如本文使用的，术语厄瑞努单抗单体是指包含两条重链和两条轻链的完整抗体，并且当测量没有N-或C-末端修饰的去糖基化的重链和轻链时，该单体具有约146,194Da的分子量。尺寸变体包括片段化变体，例如以上所述的LMW种类和MMW种类，以及高分子量(HMW)种类。厄瑞努单抗的HMW种类是指具有高于厄瑞努单抗单体的分子量的种类。HMW种类可以包括通过共价和非共价自缔合形成的厄瑞努单抗的二聚体、多聚体和其他聚集形式。在一些实施例中，厄瑞努单抗的HMW种类包含共价连接的厄瑞努单抗的二聚体(即，两个共价连接的厄瑞努单抗单体)。在某些实施例中，在还原和变性条件下，共价连接的厄瑞努单抗二聚体是可还原性二聚体，其中该二聚体还原为单独的重链和轻链。

检测和定量厄瑞努单抗的尺寸变体的方法包括尺寸排阻色谱，例如在实例5中所述的尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)方法；在还原或非还原条件下进行的具有十二烷基硫酸钠(CE-SDS)的毛细管电泳，例如在实例3中所述的rCE-SDS和nrCE-SDS方法；沉降速度超速离心法；和具有静态光散射检测的SE-HPLC来测定摩尔质量。

富集HMW种类的级分在抑制配体诱导的CGRP受体激活方面效力更小。参见实例5和表26。因此，本发明提供了含有受控量的HMW种类的厄瑞努单抗组合物，使得厄瑞努单抗组合物的总效力维持在观察到具有临床效力的水平。在一些实施例中，本发明的组合物包含厄瑞努单抗和厄瑞努单抗的HMW种类，其中该组合物中HMW种类的量少于约3.0％。该组合物中HMW种类的量可以是约2.5％或更少、约2.4％或更少、约2.3％或更少、约2.2％或更少、约2.1％或更少、约2.0％或更少、约1.8％或更少、约1.6％或更少、约1.4％或更少、约1.2％或更少、约1.0％或更少、约0.8％或更少、约0.6％或更少、或约0.4％或更少。在一个实施例中，该组合物中HMW种类的量是约1.8％或更少。在另一个实施例中，该组合物中HMW种类的量是约1.4％或更少。在又另一个实施例中，该组合物中HMW种类的量是约1.2％或更少。在仍另一个实施例中，该组合物中HMW种类的量是约0.6％或更少。在一些实施例中，该组合物中HMW种类的量可以是从约0.3％至约2.4％、从约0.4％至约1.2％、从约0.6％至约2.1％、从约0.3％至约1.8％、从约1.0％至约1.6％、或从约0.6％至约1.4％。在一个实施例中，该组合物中HMW种类的量是从约0.4％至约1.2％。在另一个实施例中，该组合物中HMW种类的量是从约0.6％至约2.1％。

可以通过上述用于检测和定量这些变体的任何方法来确定本发明的组合物中尺寸变体的量。在某些实施例中，通过SE-UHPLC确定尺寸变体(例如，HMW种类)的量。在SE-UHPLC中厄瑞努单抗的HMW种类比厄瑞努单抗单体(主峰)洗脱更早，并因此对应于SE-UHPLC色谱图中的前峰，然而LMW和MMW种类比厄瑞努单抗单体洗脱更晚，并因此对应于SE-UHPLC色谱图中的后峰。参见实例5和图17A和17B。因此，由SE-UHPLC色谱图中前峰(HMW种类)或后峰(LMW和MMW种类)的峰面积百分比可以确定厄瑞努单抗组合物中这些尺寸变体的量。在一些实施例中，如实例5所述进行SE-UHPLC方法。

在某些实施例中，本发明的组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗尺寸变体，其中这些厄瑞努单抗尺寸变体包含厄瑞努单抗的HMW种类，并且其中：

(i)如通过SE-UHPLC中的主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约97.5％或更多、约97.9％或更多、约98.2％或更多、约98.4％或更多、约98.6％或更多、约98.8％或更多、约99.2％或更多、或约99.4％或更多；以及

(ii)如通过SE-UHPLC的前峰所测量的，该组合物中HMW种类的量是约2.5％或更少、约2.1％或更少、约1.8％或更少、约1.6％或更少、约1.4％或更少、约1.2％或更少、约0.8％或更少、或约0.6％或更少。

在一个实施例中，如通过SE-UHPLC中的主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约97.9％或更多，并且如通过SE-UHPLC中的前峰所测量的，该组合物中HMW种类的量是约2.1％或更少。在另一个实施例中，如通过SE-UHPLC中的主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约98.2％或更多，并且如通过SE-UHPLC中的前峰所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.8％或更少。在又另一个实施例中，如通过SE-UHPLC中的主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约98.8％或更多，并且如通过SE-UHPLC中的前峰所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.2％或更少。在仍另一个实施例中，如通过SE-UHPLC中的主峰所测量的，该组合物中厄瑞努单抗的量是约98.6％或更多，并且如通过SE-UHPLC中的前峰所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.4％或更少。在这些和其他实施例中，如实例5所述进行SE-UHPLC，并由主峰和前峰的峰面积百分比确进行定量。

使用基于尺寸或流体力学体积分离蛋白质的方法(例如，尺寸排阻色谱和过滤步骤)可以减少厄瑞努单抗组合物中尺寸变体(例如，HMW种类)的量。另外，亲和色谱(例如，蛋白质A色谱)、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、和混合式色谱也可以有效减少HMW种类。参见，例如在Shukla等人,Journal of Chromatography B[色谱B杂志],第848卷:28-39,2007；Chen等人,Journal of Chromatography A[色谱A杂志],第1217卷:216-224,2010；美国专利号6,620,918；9,505,803；以及9,783,570中所述的方法。如上所述，通过尺寸排阻色谱分离后，厄瑞努单抗的HMW种类比厄瑞努单抗(主峰)洗脱更早。因此，可以在洗脱厄瑞努单抗主峰之前收集和丢弃HMW种类，或可以在洗脱HMW种类后开始收集厄瑞努单抗级分。

可以分析本发明的厄瑞努单抗组合物的本文所述的一种或多种厄瑞努单抗变体。例如，在一些实施例中，本发明包括包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的组合物，其中这些厄瑞努单抗变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、HMW种类、或其组合，并且其中这些组合物具有这些变体中的每一种的受控量。在一个实施例中，该组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体，其中这些厄瑞努单抗变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、HMW种类、或其组合，并且其中该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约25％至约38％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约2.1％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约8.0％或更少。在另一个实施例中，该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量少于约38％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约2.5％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约10％或更少。在另一个实施例中，该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约32.5％至约37.5％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.8％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约6.1％或更少。在又另一个实施例中，该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约26.5％至约33.6％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.2％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约3.2％或更少。在仍另一个实施例中，该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约26.5％至约33.6％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.2％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约2.7％或更少。在另一个实施例中，该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约26.5％至约33.6％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.4％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约3.2％或更少。在另一个实施例中，该组合物具有以下特征中的一种或多种或全部：(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约28.7％至约31.3％；(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约0.6％或更少；并且(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约2.1％或更少。

可以通过在宿主细胞中重组表达编码重链和轻链的核酸，部分纯化或纯化来自宿主细胞培养物或宿主细胞裂解物的厄瑞努单抗来制备本发明的厄瑞努单抗组合物，并根据下文详细描述的方法，针对在本文中详细描述的一种或多种厄瑞努单抗变体分析所得组合物。

对于厄瑞努单抗的重组产生，将编码重链(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽)和轻链(例如，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽)的一个或多个核酸***一个或多个表达载体中。可以将编码重链的核酸和编码轻链的核酸***单个表达载体中或可以将它们***分开的表达载体中。如本文使用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有所需编码序列和用于在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的适合的核酸控制序列的重组DNA分子。表达载体可包括影响或控制转录、翻译以及如果存在内含子则影响与其可操作连接的编码区的RNA剪接的序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子，任选地操纵序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、和终止子以及多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由表达载体编码，与目的编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可以由重组宿主细胞分泌，如果需要，以便更容易地从细胞中分离目的多肽。载体还可以包括一个或多个选择性标记基因以促进向其中引入载体的宿主细胞的选择。将编码厄瑞努单抗的重链和轻链的示例性核酸以及合适的信号肽序列和用于重组表达厄瑞努单抗的表达载体的其他组分描述于PCT公开号WO 2010/075238中，其通过引用以其全文并入本文中。

在表达载体已经被构建并且编码厄瑞努单抗的重链和轻链组分的一个或多个核酸分子已经被***一个或多个载体的一个或多个合适的位点后，可以将完成的一个或多个载体***适合的宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。可以通过以下熟知的方法完成将厄瑞努单抗的表达载体转化到所选的宿主细胞中，这些方法包括：转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知的技术。所选择的方法将与待使用的宿主细胞类型的部分有关。这些方法和其他适合的方法对于熟练的技术人员是熟知的，并列出，例如，在Sambrook,Fritsch和Maniatis(编),Molecular Cloning；ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor,N.Y.),(1989),Ausubel等人(编)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],格林出版联合公司(Greene Publishing Associates)(1989)中。

当在适当条件下培养时，宿主细胞合成厄瑞努单抗，该厄瑞努单抗随后可从培养基(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)中收集或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果是未分泌的)。合适的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及易于折叠成生物活性分子。

示例性宿主细胞包括原核生物细胞、酵母或高等真核细胞。原核宿主细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)像埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏杆菌(Shigella)、还有芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)。真核微生物(如丝状真菌或酵母)是用于重组多肽的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株在本文中通常可获得且是有用的，例如毕赤酵母属(Pichia)(例如，毕赤酵母(P.pastoris))粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如像脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)以及曲霉属(Aspergillus)宿主(例如，构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。

用于表达糖基化抗体的宿主细胞可以来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的相应的许可性昆虫宿主细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染此类细胞的多种病毒株是公开可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。

脊椎动物宿主细胞也可以是合适的宿主，并且来自这些细胞的抗体的重组产生已成为常规程序。可用作表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括但不限于可从美国种质保存中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216,1980)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞(Graham等人,J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1、ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.[纽约科学院年报]383:44-68,1982)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞，以及许多其他的细胞系。在一些实施例中，CHO细胞是用于表达厄瑞努单抗的优选宿主细胞。

用上述表达载体转化或转染宿主细胞以产生厄瑞努单抗，并在适当改进用于诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。用于产生厄瑞努单抗的宿主细胞可以在多种培养基中培养。以下可商购的培养基适用于培养宿主细胞：Ham's F10(西格玛公司(Sigma))、极限必需培养基(MEM，西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，西格玛公司)。另外，在Ham等人,Meth.Enz.[酶学方法]58:44,1979；Barnes等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]102:255,1980；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；或WO 87/00195中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)；盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)；缓冲液(如HEPES)；核苷酸(如腺苷和胸苷)；抗生素(如Gentamycin^TM药物)；微量元素(被定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必需的补充剂。培养条件(例如温度，pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员将是显而易见的。

在培养宿主细胞后，抗体可以在细胞内、周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，裂解宿主细胞(例如，通过机械剪切、渗透压休克、或酶促方法)，并且例如通过离心、微滤或超滤去除例如颗粒碎片(例如，宿主细胞和裂解的片段)。如果抗体分泌到培养基中，可以通过离心或微滤，并任选地随后通过超滤将抗体与宿主细胞分离。可以使用例如，一个或多个色谱步骤，例如亲和色谱(例如，蛋白质A或蛋白质G亲和色谱)、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、羟磷灰石色谱、疏水性相互作用色谱、或混合式色谱将厄瑞努单抗进一步纯化或部分纯化。

一旦产生或获得厄瑞努单抗组合物，可以评估组合物中本文所述的一种或多种厄瑞努单抗变体(包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、和尺寸变体(例如，HMW种类))的存在和量。因此，本发明包括用于评估厄瑞努单抗组合物质量的方法，该方法包括获得包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的厄瑞努单抗组合物；测量该组合物中一种或多种厄瑞努单抗变体的量；将该一种或多种厄瑞努单抗变体的所测量与预定参考标准进行比较；并且如果该比较表明满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。在一些实施例中，这些方法包括以下中的一个、两个、三个：(1)测量该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量，(2)测量该组合物中酸性变体的量，和/或(3)测量该组合物中HMW种类的量。在某些实施例中，全部的三个测量对厄瑞努单抗组合物进行。

每种厄瑞努单抗变体的预定参考标准可以是变体的阈值量或量的范围，该变体不显著影响厄瑞努单抗组合物抑制配体诱导的CGRP受体激活的效力。例如，每种厄瑞努单抗变体的预定参考标准可以是本文公开的针对每种变体的任何限制或范围，因为具有变体的这些限制/范围的厄瑞努单抗组合物具有与在临床试验中评估的厄瑞努单抗组合物相当的效力并显示具有临床效力。

在这些方法的某些实施例中，如果组合物中所测量的厄瑞努单抗变体的量满足预定参考标准，则可以将该厄瑞努单抗组合物分类为可接受的并且进行到制造或分配过程中的下一步骤，例如像，通过制备组合物的药物配制品(例如，通过与一种或多种赋形剂或稀释剂组合)；通过制备组合物的药物产品(例如，通过填充到小瓶、注射器、自动注射器、或其他容器或递送装置中)；将组合物与使用说明、稀释剂和/或递送装置一起包装；或商业销售组合物或运送组合物给经销商。在这些方法的一些实施例中，如果组合物中厄瑞努单抗变体的所测量满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品。在这些方法的其他实施例中，如果组合物中厄瑞努单抗变体的所测量满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物产品。下文更详细地描述了制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品和药物产品的方法。如果组合物中厄瑞努单抗变体的所测量不满足预定参考标准，那么，在这些方法的一些实施例中，该厄瑞努单抗组合物可以被分类为不可接受并丢弃、破坏或经历另外的制造步骤，例如，另外的纯化以去除或减少组合物中的厄瑞努单抗变体的量，使得该量满足预定参考标准。

在一个实施例中，用于评估厄瑞努单抗组合物质量的方法包括获得包含厄瑞努单抗和厄瑞努单抗异构化变体和脱酰胺变体的厄瑞努单抗组合物；测量该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量；将异构化变体和脱酰胺变体的所测量与预定参考标准进行比较；并且如果该比较表明满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准可以少于约30％，例如约25％或更少、约20％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约6％或更少、或约4％或更少。在一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约15％或更少。在另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约10％或更少。在另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约8％或更少。在又另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约6％或更少。在仍另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约4％或更少。在某些实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约3.2％或更少。在其他实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准是约2.7％或更少。在一些实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量的预定参考标准可以在例如，厄瑞努单抗组合物的从约1％至约10％、厄瑞努单抗组合物的从约1％至约4％、或厄瑞努单抗组合物的从约0.5％至约3.5％的量范围内。在某些实施例中，通过HIC-HPLC，例如通过HIC-HPLC中前峰的峰面积百分比测量厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量。在这样的实施例中，如实例1所述可以进行HIC-HPLC方法。

在另一个实施例中，用于评估厄瑞努单抗组合物质量的方法包括获得包含厄瑞努单抗和厄瑞努单抗酸性变体的厄瑞努单抗组合物；测量组合物中酸性变体的量；将酸性变体的所测量与预定参考标准进行比较；并且如果该比较表明满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准可以是少于约40％，例如约38％或更少、约37％或更少、约36％或更少、约35％或更少、约34％或更少、约33％或更少、约32％或更少、约31％或更少、约30％或更少、约29％或更少、约28％或更少、约27％或更少、或约26％或更少。在一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是约38％或更少。在另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是约35％或更少。在又另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是约32％或更少。在仍另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是约30％或更少。在一些实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是在例如厄瑞努单抗组合物的约25％至约38％、厄瑞努单抗组合物的约32.5％至约37.5％、厄瑞努单抗组合物的约26％至约34％、或厄瑞努单抗组合物的约26.5％至约33.6％的量的范围内。在一个具体的实施例，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是约25％至约38％。在另一个具体的实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量的预定参考标准是约26.5％至约33.6％。在某些实施例中，通过CEX-HPLC(例如，通过CEX-HPLC中酸性峰的峰面积百分比)测量厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量。在这样的实施例中，可以如实例3所述进行CEX-HPLC方法。

在另一个实施例中，用于评估厄瑞努单抗组合种类量的方法包括获得包含厄瑞努单抗和厄瑞努单抗的HMW种类的厄瑞努单抗组合物；测量该组合物中HMW种类的量；将HMW种类的所测量与预定参考标准进行比较；并且如果该比较表明满足预定参考标准，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准可以少于约3.0％，例如约2.5％或更少、约2.4％或更少、约2.3％或更少、约2.2％或更少、约2.1％或更少、约2.0％或更少、约1.8％或更少、约1.6％或更少、约1.4％或更少、约1.2％或更少、约1.0％或更少、约0.8％或更少、约0.6％或更少、或约0.4％或更少。在一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准是约2.5％或更少。在另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准是约1.8％或更少。在另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准是约1.4％或更少。在又另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准是约1.2％或更少。在仍另一个实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准是约0.6％或更少。在一些实施例中，针对厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量的预定参考标准可以在例如厄瑞努单抗组合物的从约0.3％至约2.4％、厄瑞努单抗组合物的从约0.6％至约2.1％、厄瑞努单抗组合物的从约0.4％至约1.2％、或厄瑞努单抗组合物的从约0.6％至约1.4％的量的范围内。在某些实施例中，通过SE-UHPLC(例如，通过SE-UHPLC中前峰的峰面积百分比)测量厄瑞努单抗组合物中HMW种类的量。在此类实施例中，可以如实例5所述进行SE-UHPLC方法。

在本发明的方法的某些实施例中，这些方法包括：

(a)获得包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的厄瑞努单抗组合物，其中这些厄瑞努单抗变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、HMW种类、或其组合；

(b)通过进行以下的一个、两个、或全部三个来评价厄瑞努单抗组合物：

(i)通过HIC-HPLC中的前峰测量该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量，并将所测量与约10％或更少的预定参考标准进行比较；

(ii)通过CEX-HPLC中的酸性峰测量该组合物中酸性变体的量，并且将所测量与约25％至约38％的预定参考标准进行比较；和/或

(iii)通过SE-UHPLC中的前峰测量该组合物中HMW种类的量，并且将所测量与约2.5％或更少的预定参考标准进行比较；以及

(c)如果在步骤(b)中的一个或多个比较表明预定参考标准/标准被满足，则制备厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。在一些实施例中，进行全部的三个步骤(b)(i)、(b)(ii)、和(b)(iii)。在其他实施例中，仅进行步骤(b)(i)和(b)(ii)。在仍其他的实施例中，仅进行步骤(b)(ii)和(b)(iii)。在某些实施例中，仅进行步骤(b)(i)和(b)(iii)。

在本发明方法的某些其他的实施例中，这些方法包括：

(i)通过HIC-HPLC中的前峰测量该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量，并将所测量与约3.2％或更少的预定参考标准进行比较；

(ii)通过CEX-HPLC中的酸性峰测量该组合物中酸性变体的量，并且将所测量与约26.5％至约33.6％的预定参考标准进行比较；和/或

(iii)通过SE-UHPLC中的前峰测量该组合物中HMW种类的量，并且将所测量与约1.2％或更少的预定参考标准进行比较；以及

在本发明的方法的一些实施例中，这些方法包括：

(i)通过HIC-HPLC中的前峰测量该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量，并将所测量与约2.7％或更少的预定参考标准进行比较；

在本发明的方法的其他实施例中，这些方法包括：

(iii)通过SE-UHPLC中的前峰测量该组合物中HMW种类的量，并且将所测量与约1.4％或更少的预定参考标准进行比较；以及

可以将用于评估质量或评价上述厄瑞努单抗组合物的本发明方法用于各种上下文。例如，这些方法可以用作针对厄瑞努单抗的制造过程的不同步骤中的质量控制方法(例如，作为过程中的控制方法)。在一些实施例中，这些方法可以在大多数或所有制造过程完成时使用，例如，作为针对厄瑞努单抗原料药(例如，活性药物成分或API)或厄瑞努单抗药物产品(例如，用一种或多种人用赋形剂配制的API)的批次释放方法。这些方法还可用于评估已经储存不同时间段的厄瑞努单抗组合物，以便于确定药物有效期。这些方法还可用于重新评估厄瑞努单抗组合物，对于该组合物，最初未满足预定参考标准并已经被再处理(例如，进行另外的纯化操作)。

因此，这些方法中使用的厄瑞努单抗组合物可以是包含厄瑞努单抗和可能的一种或多种厄瑞努单抗变体的任何组合物。在一些实施例中，该厄瑞努单抗组合物获得自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，该细胞系表达编码SEQ ID NO:1的重链的核酸和编码SEQ ID NO:2的轻链的核酸。在此类实施例中，该厄瑞努单抗组合物是细胞培养物收获物(例如，澄清的细胞培养物上清液或澄清的细胞裂解物)。在其他此类实施例中，该厄瑞努单抗组合物是厄瑞努单抗的经部分纯化的制剂，该制剂已经历一种或多种纯化操作(例如，来自一个或多个色谱或过滤步骤的池或级分)。在一个实施例中，该厄瑞努单抗组合物是来自阳离子交换色谱材料的洗脱池。在另一个实施例中，该厄瑞努单抗组合物是厄瑞努单抗原料药(例如，活性药物成分或API)。在又另一个实施例中，该厄瑞努单抗组合物是厄瑞努单抗药物产品(例如，厄瑞努单抗原料药或用一种或多种人用赋形剂配制的API)。

作为上述质量评估方法的一部分，可以评估厄瑞努单抗组合物的生物活性。在一些实施例中，这些方法包括评估所述厄瑞努单抗组合物抑制CGRP配体诱导的人CGRP受体激活的能力。用于评估CGRP受体激活的各种测定法是本领域已知的并且包括测量CGRP配体诱导的钙动员和cAMP产生的基于细胞的测定法。示例性基于细胞的cAMP测定描述于实例1中。其他适合的CGRP受体激活测定描述于Aiyar等人,Molecular and Cellular Biochemistry[分子与细胞生物化学],第197卷:179-185,1999；Pin等人,European Journal ofPharmacology[欧洲药理学杂志],第577卷:7-16,2007；美国专利号8,168,592、和WO 2010/075238中，其全部均通过引用以其全部内容并入本文。

本发明包括药物配制品，这些药物配制品包含本文所述的厄瑞努单抗组合物中的任何一种和一种或多种药学上可接受的赋形剂。“药学上可接受的”是指在施用人时采用的剂量和浓度下对人类接受者无毒和/或在施用人时不产生过敏或不良反应的分子、化合物和组合物。在某些实施例中，药物配制品可含有用于改变、维持或保存厄瑞努单抗组合物的以下特性的材料：例如pH、渗量、黏度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在这样的实施例中，适合的材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(如乙酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克类(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、曲通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；稀释剂；赋形剂和/或药用佐剂。用于配制用于治疗用途的分子的方法和适合的材料在制药领域中是已知的，并进行了描述，例如，在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿的药物科学],第18版,(A.R.Genrmo,编辑),1990,马克出版公司(Mack Publishing Company)。

在一些实施例中，本发明的这些药物配制品包含本文所述的厄瑞努单抗组合物、使溶液的pH维持在约4.5至约6.5的范围内的缓冲液、稳定剂、和任选地表面活性剂。适合的缓冲液包括，但不限于谷氨酸盐、乙酸盐、Tris、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、和磷酸盐缓冲液。在某些实施例中，该药物配制品包含乙酸盐缓冲液。该乙酸盐缓冲液可以由乙酸或乙酸盐(例如，乙酸钠)制得。可以使用其他盐，例如像乙酸盐的钾盐、铵盐、钙盐或镁盐。包含乙酸盐缓冲液的药物配制品典型地具有约4.5至约5.5的pH或约4.8至约5.2的pH，包括约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、和约5.5的pH。

稳定剂是指稳定抗体的天然构象和/或防止或减少抗体的物理或化学降解的赋形剂。适合的稳定剂包括但不限于多元醇(例如，山梨糖醇、甘油、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇和苏糖醇)，糖(例如，果糖、葡萄糖、甘油醛、乳、***糖、甘露糖、木糖、核糖、鼠李糖，半乳糖麦芽糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、三氯蔗糖、松三糖和棉子糖)和氨基酸(例如，甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或谷氨酸)。在一些实施例中，该药物配制品包含糖作为稳定剂。在这些和其他实施例中，该糖是蔗糖。

在某些实施例中，该药物配制品包含表面活性剂。表面活性剂是用于降低溶解在其中的液体的表面张力的物质。出于各种目的(包括例如防止或控制液体配制品中的聚集、颗粒形成和/或表面吸附，或在冻干配制品的冻干和/或重构过程中防止或控制这些现象)可以将表面活性剂包括在药物配制品中。表面活性剂包括，例如，在有机溶剂和水溶液中均显示出部分溶解性的两亲性有机化合物。表面活性剂的一般特征包括它们降低水的表面张力、降低油和水之间的界面张力以及形成胶团的能力。可以被掺入本发明的药物配制品的表面活性剂包括非离子和离子表面活性剂。适合的非离子表面活性剂包括但不限于烷基聚(环氧乙烷)、烷基多葡糖苷(例如，辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如，鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA。非离子表面活性剂的具体的实例包括聚山梨醇酯，包括例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85等；泊洛沙姆包括例如泊洛沙姆188(也称为泊洛沙姆或聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷))、泊洛沙姆407或聚乙烯-聚丙二醇等，以及聚乙二醇(PEG)。适合的离子表面活性剂包括例如阴离子、阳离子和两性离子表面活性剂。阴离子表面活性剂包括但不限于磺酸盐基或羧酸盐基表面活性剂，例如肥皂、脂肪酸盐、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵和其他烷基硫酸盐。阳离子表面活性剂包括但不限于基于季铵基表面活性剂，例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、其他烷基三甲基铵盐、十六烷基吡啶氯化物、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)和苯扎氯铵。两性离子或两性表面活性剂包括，例如，十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、和椰油两性甘氨酸盐。在某些实施例中，该药物配制品包含非离子表面活性剂。在一个实施例中，该非离子表面活性剂是聚山梨醇酯20。在另一个实施例中，该非离子表面活性剂是聚山梨醇酯80。

在某些实施例中，这些药物配制品包含本文所述的厄瑞努单抗组合物中的任一种(例如，约70mg/mL至约140mg/mL厄瑞努单抗组合物)、约20mM至约40mM乙酸盐、约6％至约9％(w/v)蔗糖、和约0.008％至约0.012％(w/v)聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。这些配制品的pH是在约4.9至约5.5的范围中(例如，pH为约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、或约5.4)。在一个具体的实施例中，该药物配制品包含70mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约25mM乙酸盐、约7.3％(w/v)蔗糖、和约0.010％(w/v)聚山梨醇酯80，其中该药物配制品具有pH为约5.2±0.2。在另一个具体的实施例中，该药物配制品包含140mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约34mM乙酸盐、约6.5％(w/v)蔗糖、和约0.010％(w/v)聚山梨醇酯80，其中该药物配制品具有pH为约5.2±0.2。

药物配制品优选适用于肠胃外注射(例如静脉内或皮下注射)。适合于肠胃外注射的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。优选地，药物配制品是无菌的并且具有足够的流动性以允许通过注射器或其他注入装置递送(即，配制品不过分粘稠而有碍通过注射器或其他注入装置)。可以通过无菌过滤膜过滤来完成灭菌。当冻干组合物时，可以在冻干和重构之前或之后使用该过滤方法进行灭菌。用于肠胃外施用的药物配制品可以按冻干形式或溶液形式储存。可以将肠胃外配制品置于具有无菌进入口的容器中，例如，具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。肠胃外配制品还可以储存在注射器、自动注射器装置或笔型注入装置或适于与这种注入装置一起使用的药筒中。

可以将上述药物配制品填充到小瓶、注射器、自动注射器、或其他容器或递送装置中，并且任选地与使用说明一起包装(例如，包含用于使用药物配制品治疗、预防头痛、或减少头痛发生如偏头痛的说明的处方信息)制备药物产品。在某些实施例中，将本文所述的这些药物配制品掺入自我给药注入装置。此类装置是可商购并且包括，但不限于自动注射器、剂量给药笔、微量灌流泵、和预填充式注射器。其中可以掺入本发明的药物配制品的示例性装置包括自动注射器(例如，

和

)；笔型注入装置(例如，

笔型注射器、DCP^TM笔型注射器、BD Vystra^TM一次性笔、BD^TM重复使用笔)，和预填充式注射器(BD Sterifill^TM、BD Hypak^TM、来自Baxter的预填充式注射器)。在一些实施例中，将药物配制品掺入并储存在注射器中以产生预填充式注射器。在其他实施例中，将药物配制品掺入自动注射器中。预填充式注射器或自动注射器的注射体积可以是约2mL或更少、约1.5mL或更少、或约1mL或更少。在某些实施例中，将本文所述的这些药物配制品掺入注射器或自动注射器，其中注射体积为约1mL。

因此，在一些实施例中，本发明提供了包含以下的预填充式注射器：约70mg/mL至约140mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约20mM至约40mM乙酸盐、约6％至约9％(w/v)蔗糖、和约0.008％至约0.012％(w/v)聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，pH为约4.5至约5.5。在一个实施例中，该预填充式注射器包含70mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约25mM乙酸盐、约7.3％(w/v)蔗糖、和约0.010％(w/v)聚山梨醇酯80，pH为约5.2±0.2。在另一个实施例中，该预填充式注射器包含140mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约34mM乙酸盐、约6.5％(w/v)蔗糖、和约0.010％(w/v)聚山梨醇酯80，pH为约5.2±0.2。在这些实施例中的任一个中，该预填充式注射器的注射体积可以是约1mL。

在其他实施例中，本发明提供了包含以下的自动注射器：约70mg/mL至约140mg/mL的本文所述的厄瑞努单抗组合物、约20mM至约40mM乙酸盐、约6％至约9％(w/v)蔗糖、和约0.008％至约0.012％(w/v)聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，pH为约4.5至约5.5。在一个实施例中，该自动注射器包含70mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约25mM乙酸盐、约7.3％(w/v)蔗糖、和约0.010％(w/v)聚山梨醇酯80，pH为约5.2±0.2。在另一个实施例中，该自动注射器包含140mg/mL本文所述的厄瑞努单抗组合物、约34mM乙酸盐、约6.5％(w/v)蔗糖、和约0.010％(w/v)聚山梨醇酯80，pH为约5.2±0.2。在这些实施例中的任一个中，该自动注射器的注射体积可以是约1mL。

可以将本文所述的厄瑞努单抗组合物和包含此类组合物的药物配制品用于治疗、预防头痛、或减少头痛发生。因此，本发明包括用于在对其有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的方法，这些方法包括向患者施用包含本文所述的厄瑞努单抗组合物的任何厄瑞努单抗组合物或药物配制品。在某些实施例中，本发明提供了用于在对其有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生中使用的厄瑞努单抗组合物或包含本文所述的厄瑞努单抗组合物的药物配制品。在其他实施例中，本发明包括厄瑞努单抗组合物或包含本文所述的厄瑞努单抗组合物的药物配制品在制备用于在对其有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的药物的用途。“预防头痛或减少头痛的发生”是指与在施用组合物/配制品之前的头痛的频率、持续时间或严重程度相比，或与未被施用组合物/配制品的患者(即，对照受试者)中头痛的频率、持续时间、或严重程度相比，头痛的频率、持续时间或严重程度的降低。

在某些实施例中，通过向患者施用任何厄瑞努单抗组合物或包含本文所述的厄瑞努单抗组合物的药物配制品，本发明的方法和用途在对其有需要的患者中治疗、预防偏头痛、或减少偏头痛的发生。“偏头痛”是与恶心或呕吐、或对光或声音的敏感、和/或由如下至少两种疼痛特征表征的头痛相关联的头痛：单侧疼痛、搏动性疼痛、中度至重度疼痛强度，或因身体活动而加剧的疼痛。根据一些实施例，向患者每月一次施用包含70mg或140mg本文所述的厄瑞努单抗组合物的药物配制品从而在患者中治疗、预防偏头痛、或减少偏头痛的发生。在此类实施例中，药物配制品可以通过皮下注射递送，例如，使用上述注入装置之一(例如，预填充式注射器或自动注射器)。

在一些实施例中，根据本发明的方法待治疗的患者具有、患有、或被诊断患有阵发性偏头痛。当具有偏头痛病史(例如，生命期至少五次偏头痛的发作)的患者每月有14个或更少个偏头痛日时，诊断出阵发性偏头痛。“偏头痛日”包括患者经历有或没有先兆的持续超过30分钟的“偏头痛”的发作、持续或复发的任何日历天数。在一些实施例中，具有、患有或被诊断患有阵发性偏头痛的患者每月有至少4个，但少于15个偏头痛日。在相关的实施例中，具有、患有或被诊断患有阵发性偏头痛的患者平均每月有少于15个头痛日。如本文使用的，“头痛日”是患者经历偏头痛或任何持续超过30分钟或需要急性头痛治疗的头痛的任何日历天数。在某些实施例中，可以将患者分类为具有或患有高频阵发性偏头痛。高频阵发性偏头痛患者是每个月有8至14个偏头痛日的患者。在其他实施例中，可以将患者分类为具有或患有低频阵发性偏头痛。低频阵发性偏头痛患者是每个月有少于8个偏头痛日的患者。

在一些实施例中，根据本发明的方法待治疗的患者具有、患有、或被诊断患有慢性偏头痛。当偏头痛患者(即生命期至少五次发作偏头痛的患者)每月有15个或更多个头痛日且至少有8个头痛日是偏头痛日时，就诊断出慢性偏头痛。在一些实施例中，具有、患有或被诊断患有慢性偏头痛的患者平均每月有15个或更多个偏头痛日。

在某些实施例中，根据本发明的方法待治疗的偏头痛患者先前未接受任何预防性偏头痛治疗。在其他实施例中，根据本发明的方法待治疗的偏头痛患者未能接受或对一种或多种预防性偏头痛疗法不耐受。在一个这样的实施例中，患者未能对使用至少一种偏头痛预防剂的先前治疗作出响应。“未能响应”或“治疗失败”是指预防剂在遵循药剂的标准治疗方案后在患者中减少偏头痛的频率、持续时间和/或严重程度方面缺乏效力。例如，在一个实施例中，先前用偏头痛预防剂治疗失败的患者是如下患者：在用药剂治疗之前与每月偏头痛日的数目相比，在被施用偏头痛预防剂之后经历相同或更多月度偏头痛日。对用偏头痛预防剂的先前治疗未能响应还可能包括不能耐受偏头痛预防剂。例如，在一些实施例中，先前用偏头痛预防剂治疗已经失败的患者是不能对与该药剂相关联的副作用耐受的患者。在这样的实施例中，与药剂相关联的副作用可能加剧或可能与患者具有的另一种医学病症不相容。在某些实施例中，患者用一种或多种药剂的治疗失败或对该治疗不耐受，该一种或多种药剂选自：β-阻滞剂(例如，***、噻吗洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和纳多洛尔)；抗癫痫药(例如，双丙戊酸钠、丙戊酸钠、丙戊酸、托吡酯和加巴喷丁)；三环类抗抑郁药(如阿米替林、去甲替林、多虑平和氟西汀)和奥娜博特兰毒西纳(onabotulinumtoxinA)。

还可以将本文所述的厄瑞努单抗组合物和包含此类组合物的药物配制品用于治疗、预防其他类型的头痛障碍(例如，紧张型头痛、丛集性头痛、偏瘫性偏头痛、经期偏头痛、和视网膜性偏头痛)或减少这些头痛障碍的发生。与CGRP/CGRP受体信号传导相关联的其他疾病或病症也可以用厄瑞努单抗组合物和包含本文所述的此类组合物的药物配制品治疗或改善。与CGRP/CGRP受体信号传导相关联的疾病或病症包括但不限于慢性疼痛(例如，伤害性疼痛、神经性疼痛、炎性疼痛、纤维肌痛、关节炎疼痛)；异常性疼痛；炎症(例如，神经性炎症、牛皮癣、骨关节炎)；II型糖尿病；膀胱过度活动症；和哮喘。

本发明的药物配制品优选肠胃外施用于患者。肠胃外施用包括腹膜内、肌肉内、静脉内、动脉内、皮内、皮下、脑内、脑室内和鞘内施用。在某些实施例中，药物配制品静脉内施用于患者。在其他实施例中，将药物配制品皮下施用于患者，例如通过皮下注射。可以使用本文所述的一个或多个装置(例如，预填充式注射器和自动注射器)将注射液递送给患者。

以下实例，包括进行的实验和实现的结果，仅提供解释说明目的，并且不应被解释为限制所附权利要求的范围。

实例

实例1.通过HIC-HPLC鉴定和表征厄瑞努单抗电荷变体

厄瑞努单抗是IgG2亚类的全人单克隆抗体。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组产生抗体，并且该抗体由λ亚类的两条重链和两条轻链组成。每条重链包含具有四个链内二硫键的456个氨基酸。每条轻链包含具有两个链内二硫键的216个氨基酸。厄瑞努单抗包含六个链间二硫化物，总共18个链内和链间二硫键。厄瑞努单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别显示在图1A和1B中。每条重链包含SEQ ID NO:1的位置306处的天冬酰胺残基上共有糖基化位点处的N-联糖聚糖。如对哺乳动物细胞产生的抗体经常观察到的，重链中位置456处的C-末端赖氨酸残基大部分被细胞培养生产过程中存在的羧肽酶去除。此外，重链和轻链上的N-末端谷氨酰胺残基通常在生产过程中转化为焦谷氨酸。具有这些N-和C-末端修饰的厄瑞努单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别显示在图1C和1D中。从两条重链去除C-末端赖氨酸并且具有完整的重链和轻链N-末端焦谷氨酸形成的去糖基化的厄瑞努单抗的经计算的质量为145,872道尔顿。

厄瑞努单抗特异性结合降钙素基因相关肽(CGRP)受体的细胞外结构域，并阻止CGRP结合并激活受体。CGRP是一种调节伤害性信号传导的神经肽，并且是一种与偏头痛病理生理学相关联的血管扩张剂。厄瑞努单抗有效且特异地与CGRP竞争结合CGRP受体，并抑制CGRP诱导的细胞内环腺苷一磷酸(cAMP)信号级联放大的激活。厄瑞努单抗在肾上腺髓质素、降钙素、或糊精受体上没有表现出任何显著的药理活性，并且在CGRP受体上缺乏激动剂活性。

对通过商业规模制造工艺生产的厄瑞努单抗原料药进行生物化学、生物物理和生物表征从而阐明该原料药的结构和功能特性。该实例描述了表现出降低的CGRP受体抑制功能的厄瑞努单抗的电荷变体的鉴定和表征。通过疏水性相互作用色谱-高效液相色谱(HIC-HPLC)评估该实例中厄瑞努单抗的电荷异质性。

HIC-HPLC主要基于分子的表面疏水性分离蛋白质，并且还可能受结构异质性和影响与柱基质的分子相互作用的其他修饰的影响。HIC-HPLC中的峰洗脱是净表面疏水性的函数，其中具有较高表面疏水性的分子比具有较低表面疏水性的分子洗脱更晚。

将厄瑞努单抗原料药的样品加载到疏水性相互作用色谱柱(ProPacHIC-10，5μm粒度，4.6mm×250mm，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))上。流动相A包含10mM乙酸钠，1M硫酸铵(在pH 5.5)并且流动相B由10mM乙酸钠(pH 5.5)组成。用从0min至52min的25％至100％流动相B，和在55.5min至75min返回至25％流动相B产生的递减盐梯度中分离蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测洗脱液。在35℃下操作柱，并以0.5mL/min的流速将流动相施加到柱上。

该HIC-HPLC图谱包含三个不同的区(包括前峰、主峰和后峰)(图2A和2B)。分离跨前峰、主峰和后峰区的七种级分。将收集的级分通过HIC-HPLC再次分析从而表明级分用于表征是足够纯的。将经分离的级分的HIC-HPLC图谱和纯度分别显示在图3和表1中。

表1.富集的级分的HIC-HPLC峰面积百分比¹

¹从相同的原料药批次中收集所有的HIC-HPLC级分。目的级分基于收集时间窗，并且将相对纯度加粗并加下划线。将未检测的峰用破折号表示。

通过各种分析技术(包括尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)、还原的胰蛋白酶肽作图与LC-MS/MS、和基于细胞的生物测定)表征图3和表1中的前峰、主峰和后峰级分。

通过SE-UHPLC，使用BEH200分析型UHPLC柱(1.7μm粒度，4.6mm×150mm，沃特斯公司(Waters Corporation))和包含100mM磷酸钠、250mM氯化钠、pH 6.8的流动相对未分级的原料药和七种HIC-HPLC级分进行分析。相对于未分级的原料药，SE-UHPLC分析表明所有的前峰和在后峰级分富集高分子量(HMW)种类，然而仅最早的前峰级分(F1)和最晚的后峰级分(F7)富集低分子量(LMW)种类(表2)。

表2.富集的HIC-HPLC级分的SE-UHPLC峰面积百分比

样品描述	％HMW	％主	％LMW
				原料药	0.4	99.4	<0.3<sup>1</sup>
前峰级分F1	5.1	93.3	1.6
				前峰级分F2	2.8	96.7	0.5
前峰级分F3	2.8	96.7	0.5
				前峰级分F4	5.0	94.7	0.3
主级分F5	0.6	99.3	<0.3<sup>1</sup>
				后峰级分F6	12.7	87.0	0.3
后峰级分F7	16.8	80.8	2.4

¹定量限＝0.3％

通过还原的胰蛋白酶肽作图(其中通过电喷雾电离串联质谱法(ESI-MS/MS)检测)评估在富集的前峰、主峰、和后峰级分以及未分级的原料药中存在的厄瑞努单抗的生物化学修饰。将原料药和七种HIC-HPLC级分在7.5M盐酸胍溶液中变性，并用0.5M的还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理，并且通过添加0.5M碘乙酸钠(IAA)将所有的半胱氨酸残基烷基化。通过凝胶过滤使被还原和烷基化的样品脱盐，然后在37℃下用胰蛋白酶消化35分钟。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)，使用C18柱(1.8μm粒度，2.1mm×150mm)和具有乙腈梯度的0.1％TFA流动相以流速0.3mL/min分离消化的样品。通过在215nm处的紫外(UV)光吸光度与在线ESI-MS/MS的峰鉴定检测肽。然后针对其预期的MS/MS谱检查每种肽离子的片段化模式。

原料药和富集的级分的叠加呈现在图4中，显示在重链CDR3内两种肽：TH12H13(SEQ ID NO:1的氨基酸残基99至113)和TH13(SEQ ID NO:1的氨基酸残基101至113)的洗脱区。前峰级分F2、F3和F4和后峰级分F6均显示相对于原料药在CDR3肽(TH13)中的变异。对于级分F1和F7，在TH13肽中未观察到差异。前峰级分F2、F3、和F4和后峰级分F6富集重链CDR3肽TH13内的脱酰胺和异构化变体(异天冬氨酸(IsoAsp)和琥珀酰亚胺中间体)中。观察到位置102处天冬酰胺残基的脱酰胺和位置105处天冬氨酸残基的异构化(两个位置相对于于SEQ ID NO:1)。观察到鉴定为IsoAsp105的两种单独的肽在不同的保留时间洗脱。这些肽可能是天冬氨酸异构化过程中产生的结构对映体。还观察到天然肽后洗脱的另外的TH13肽变体，该变体对应于位置105处的琥珀酰亚胺中间体。通过将经修饰的肽的提取离子色谱图(EIC)峰面积与未经修饰的肽产生的峰面积比较来估计修饰水平。质量分析证实了在前峰和后峰区内升高的脱酰胺和IsoAsp变体的存在(表3)。

表3.通过还原的胰蛋白酶肽图观察到的富集的HIC-HPLC级分的修饰的汇总

ND＝未检测到

¹图4中在大约70.5min和71.5min处洗脱的两种IsoAsp¹⁰⁵TH13变体的汇总。

还原前峰级分F1并通过ESI-TOF质谱法进行分析，因为通过rCE-SDS对该级分的分析先前已经显示了显著水平的LMW和中等分子量(MMW)种类。在前峰级分F1中鉴定出总共六个切割片段，其中四个切割位点(Leu³¹⁵/Thr³¹⁶；Ser¹⁹⁷/Val¹⁹⁸；Leu¹⁹⁵/Ser¹⁹⁶；和Leu¹⁹²/Tyr¹⁹³)是在重链CH1和CH2结构域中。在重链的CDR3中还鉴定出两个切割位点(Gly¹⁰⁸/Tyr¹⁰⁹和Asp¹⁰⁵/Ser¹⁰⁶)。对于所有种类，仅检测出C-末端片段。相对于原料药，在前峰级分F1内观察到Leu¹⁹⁵/Ser¹⁹⁶切割片段的升高的水平(表3)。

与厄瑞努单抗原料药相比，通过基于细胞的生物测定评估富集的HIC-HPLC级分的生物学活性。基于细胞的生物测定通过测量厄瑞努单抗抑制配体诱导的人CGRP受体激活的能力来评估厄瑞努单抗的效力。CGRP受体是G蛋白偶联受体，并且已经显示该受体家族在细胞内产生cAMP作为其信号转导机制的一部分。将表达人CGRP受体(CHO-K1 huCGRP)的稳定中国仓鼠卵巢K1(CHO-K1)细胞系与CGRP配体和不同浓度的厄瑞努单抗参考标准品和测试样品一起孵育。使用竞争性同源时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)测定，在存在或不存在厄瑞努单抗参考标准品和测试样品的情况下，用CGRP孵育之后，测量由细胞产生的cAMP的量，其中当标记的测定组分(用Alexa

647染料标记的cAMP和抗cAMP单克隆抗体-穴状化合物)相互结合时产生可检测的信号。当通过CGRP激活CGRP受体在细胞内产生cAMP时，由细胞产生的天然cAMP与Alexa

647染料标记的cAMP竞争结合穴状化合物标记的抗cAMP单克隆抗体，并且可检测信号减少。因此，由于TR-FRET cAMP测定的竞争性质，产生的信号与细胞中cAMP的浓度成反比。通过酶标仪测量TR-FRET信号。通过将用测试样品产生的信号与用厄瑞努单抗参考标准品产生的信号进行比较来确定测试样品的活性，并报告为相对效力。

如下表4中所示，所有前峰级分显示出效力的显著降低。这些降低是由于高水平的片段化(对于F1级分)或脱酰胺和重链CDR3区中的异构化(对于级分F2-F4)，这些是如上所述的前峰级分中的主要变体。后峰级分也显示效力降低，可能是由于升高的HMW种类和低水平的重链CDR3天冬氨酸(Asp¹⁰⁵)异构化，这些是如上所述的后峰级分中的主要变体。

表4.富集的HIC-HPLC级分的效力

¹3次重复的平均值

在该实例中描述的分析的结果表明厄瑞努单抗原料药的HIC-HPLC图谱包含三个不同的区(包括前峰、主峰和后峰)。通过HIC-HPLC检测的主要厄瑞努单抗变体包括在前峰和后峰区中的重链CDR3天冬氨酸异构化(例如，SEQ ID NO:1的Asp¹⁰⁵的异构化)变体和脱酰胺(例如，SEQ ID NO:1的Asn¹⁰²的脱酰胺)变体。在前峰组中观察到片段化的种类，并且在后峰组中观察到升高水平的HMW种类。如通过基于细胞的生物测定评估，所有厄瑞努单抗HIC-HPLC前峰和后峰级分的效力均低于原料药。由于重链CDR3区中的天冬氨酸异构化和脱酰胺以及高水平的片段化变体，前峰显示效力显著降低。由于HMW种类和重链CDR3异构化变体的水平升高，后峰也显示效力降低。

由于厄瑞努单抗的重链CDR3天冬氨酸异构化变体和天冬酰胺脱酰胺变体的存在影响了组合物的抑制效力，因此通过HIC-HPLC分析按商业规模制造的若干批次的厄瑞努单抗原料药(140mg/mL)以评估如通过HIC-HPLC色谱图中前峰的峰面积百分比所测量的异构化变体和脱酰胺变体的存在和质量。还通过上述基于细胞的效力测定评估原料药批次的效力，并与批号78137的效力进行比较，该批号78137代表用于II期/III期临床试验的厄瑞努单抗原料药。下表5中提供了数据的汇总。

表5.针对厄瑞努单抗原料药批次的HIC-HPLC和效力数据

如表5中的数据所示，按商业规模制造的厄瑞努单抗原料药含有如通过HIC-HPLC前峰所测量的从1.7％至2.1％范围内的一致水平的异构化变体和脱酰胺变体。含有在该范围内的脱酰胺/异构化变体水平的原料药表现出与临床试验中使用的厄瑞努单抗原料药的效力相当的效力。

实例2.对不同储存条件下厄瑞努单抗异构化变体和脱酰胺变体的评价

在制造原料药期间，在厄瑞努单抗重链的CDR3中观察到Asn¹⁰²的脱酰胺和Asp¹⁰⁵向异天冬氨酸的转变(实例1)。与厄瑞努单抗未经修饰的形式相比，具有这些修饰的厄瑞努单抗变体表现出降低的效力(实例1)。为进一步评估Asn¹⁰²脱酰胺变体和Asp¹⁰⁵异构化变体对厄瑞努单抗原料药效力的影响，使厄瑞努单抗原料药经受应激条件以增加脱酰胺变体和异构化变体的形成，并评估经应激的原料药的效力。具体地，厄瑞努单抗原料药经受以下三种应激条件以促进脱酰胺变体和异构化变体的产生：

·热暴露(50℃持续14天)

·生理pH和温度(pH 7.4，在37℃下，持续14天)

·高pH暴露(pH 8.0，在25℃下，持续14天)

通过HIC-HPLC和实例1中所述的还原的胰蛋白酶肽作图方法监测由每种应激条件随时间诱导的脱酰胺变体和异构化变体的形成。对于每种应激条件，在研究持续期间的不同时间点取出样品并冷冻。在最后的时间点后，将所有样品并行分析以最小化分析变异性。

热暴露

在50℃下应激的厄瑞努单抗原料药的HIC-HPLC分析结果显示前峰显著增加(图5和表6)。前峰的这种增加主要是由于暴露于热应激14天后天冬氨酸异构化的增加，如通过下文详细解释的减少的胰蛋白酶肽图分析所揭示的。还观察到后峰的增加，可能是由于HMW种类的水平增加，因为它们作为后洗脱后峰的一部分洗脱，如实例1中的表2所示。

表6.在50℃下应激的厄瑞努单抗的HIC-HPLC峰面积％

评估肽图色谱图在暴露时间内新峰的存在或存在峰的峰面积的显著变化。第0天和第14天样品的扩展比例叠加突显了如图6所示的观察到差异的区域。在重链CDR3(肽TH12H13和TH13)中Asp¹⁰⁵处的天冬氨酸异构化变体是在肽图叠加中观察到的主要降解物。在第14天样品色谱图中还观察到Fc区中Leu³¹⁵和Thr³¹⁶之间肽TH26(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基311至326)的水解片段。

通过实例1中描述的基于细胞的生物测定评估暴露于热应激条件下的厄瑞努单抗原料药的生物学活性。如表7所示，在50℃下暴露14天后热应激对于厄瑞努单抗原料药的相对效力具有负面影响。热应激后效力的降低是由于Asp¹⁰⁵异构化变体和高分子量种类的增加，这两种种类已经显示出影响效力(参见实例1和实例5)。

表7.暴露于热应激的厄瑞努单抗的相对效力

¹3次重复的平均值

生理pH和温度

通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH 7.4)稀释至大约10mg/mL将厄瑞努单抗原料药暴露于生理pH中，并在37℃下孵育(生理温度)14天。将pH对照在37℃下孵育超过14天，该pH对照是稀释于配制品缓冲液(15mM乙酸钠、8.2％(w/v)蔗糖、0.010％(w/v)聚山梨醇酯80)，pH 5.2的原料药。因此，将“生理pH应激样品”暴露于pH和热应激，而“pH对照样品”仅暴露于热应激。

对第14天生理pH应激样品与第0天样品的HIC-HPLC图谱的比较显示前峰和后峰都增加(图7和表8)。第14天来自生理pH应激样品和pH对照样品在大约30分钟处显示相似水平的前峰洗脱，这对应于Asp¹⁰⁵异构化变体，表明该异天冬氨酸变体主要由热应激而不是pH驱动。对应于Asn¹⁰²脱酰胺变体的在大约34分钟处洗脱的前峰在第14天生理pH应激样品中增加而不在pH对照中增加，表明Asn¹⁰²的脱酰胺主要由pH应激而非热应激驱动。相对于第0天样品和第14天pH对照样品，在第14天生理pH应激样品中还观察到后峰增加，表明该变化主要由pH应激驱动。

表8.在pH 7.4和37℃应激的厄瑞努单抗的HIC-HPLC峰面积％

通过在胰蛋白酶消化后用质谱法(MS)进行的还原肽作图对在生理pH和温度下应激的厄瑞努单抗原料药的生化修饰进行监测。MS数据的分析显示重链CDR3(Asn¹⁰²)和Fc区(Asn³⁹³和Asn³⁹⁸)中脱酰胺的增加以及重链CDR3Asp¹⁰⁵异构化的量增加(数据未显示)。重链CDR3Asp¹⁰⁵异构化和Asn¹⁰²脱酰胺增加的水平与在通过图7和表8中所示的HIC-HPLC观察到的前峰和后峰的增加一致。

通过基于细胞的生物测定评估在生理pH和温度下应激的厄瑞努单抗原料药的生物学活性。如表9所示，在暴露14天后，生理pH和温度应激导致了厄瑞努单抗原料药效力降低。尽管在这些应激条件下观察到Asn¹⁰²脱酰胺变体和Asp¹⁰⁵异构化变体水平的增加，但仅观察到适度的效力降低。该结果可能是由于这些脱酰胺变体和异构化变体的总体水平(其占原料药的约6％)太低而不能显著影响如通过基于细胞的生物测定所测量的效力。

表9.在pH 7.4和37℃下应激的厄瑞努单抗的相对效力

¹3次重复的平均值

高pH暴露

通过用Tris碱溶液(pH 8.0)稀释至大约10mg/mL将厄瑞努单抗原料药暴露于高pH，并在25℃下孵育14天。将pH对照在25℃下孵育超过14天，该pH对照是稀释于配制品缓冲液(15mM乙酸钠、8.2％(w/v)蔗糖、0.010％(w/v)聚山梨醇酯80)，pH 5.2的原料药。

HIC-HPLC分析的结果显示，相对于第0天样品和pH对照样品，由于Asn¹⁰²脱酰胺作用导致的前峰增加以及第14天高pH应激样品的后峰增加(图8和表10)。

表10.在pH 8.0和25℃应激的厄瑞努单抗的HIC-HPLC峰面积％

通过在胰蛋白酶消化后用MS进行的还原肽作图对在高pH下应激的厄瑞努单抗原料药的生化修饰进行监测。与生理pH应激条件一样，相对于第0天和pH对照样品，在第14天应激样品中观察到在重链CDR3中Asn¹⁰²处的以及在Fc区内Asn³⁹³和Asn³⁹⁸处的脱酰胺的增加。通过基于细胞的生物测定评估在高pH下应激的厄瑞努单抗原料药的生物学活性。如表11所示，高pH应激对暴露14天后的厄瑞努单抗原料药的效力具有适度影响。与用生理pH和温度应激条件获得的结果类似，存在于应激原料药中的Asn¹⁰²脱酰胺变体的总水平太低而不能如通过基于细胞的生物测定所测量的对效力的显著影响。

表11.在pH 8.0和25℃下应激的厄瑞努单抗的相对效力

¹3次重复的平均值

为更好地确定显著降低厄瑞努单抗原料药效力所需的Asn¹⁰²脱酰胺变体和Asp¹⁰⁵异构化变体的水平，用获得自在不同温度下储存的不同厄瑞努单抗批次的数据进行模拟效力与HIC-HPLC前峰面积百分比之间关系的统计分析。将厄瑞努单抗批次按5℃(13个批次)、25℃(4个批次)、30℃(4个批次)、或40℃(5个批次)储存。对于来自5℃储存条件下的数据，存在6个批次仅一个时间点，和9个批次仅两个时间点。所有其他储存条件具有来自至少三个不同时间点的数据。

将如通过基于细胞的生物测定法所测量的％相对效力作为四种不同储存条件下HIC-HPLC色谱图中前峰的％峰面积的函数作图，并进行回归分析(图9)。确定每个温度的拟合回归线的斜率估计值以及针对测试的经调整的p值(以确定斜率是否与零不同)(表12)。对于来自40℃储存条件的数据的回归线的斜率在0.05显著性水平上与零具有统计学显著性。基于来自40℃储存条件的数据的回归分析，HIC-HPLC前峰面积增加1％导致相对效力降低1.14％。

表12.相对效力与HIC-HPLC前峰面积百分比的线性回归参数估计

如通过基于细胞的生物测定所测量的，在临床试验中使用的厄瑞努单抗原料药的相对效力大于70％。为估计Asn¹⁰²脱酰胺变体和Asp¹⁰⁵异构化变体(由HIC-HPLC前峰表示)使得厄瑞努单抗原料药的效力降低到低于临床试验可接受水平(70％)的水平，将图9中所示的40℃储存条件拟合的回归线外推以显示70％相对效力的HIC-HPLC前峰的％面积。如图10所示，基于拟合的回归线，针对70％相对效力的％HIC-HPLC前峰面积的预测值为约28.85％。

该实例中描述的实验结果表明，在厄瑞努单抗原料药中Asn¹⁰²脱酰胺变体水平和/或Asp¹⁰⁵异构化变体水平的增加导致厄瑞努单抗抑制CGRP诱导的CGRP受体激活的效力的丧失。应监测脱酰胺变体和异构化变体的水平并将其控制在原料药中低于约30％，以保持原料药的效力达到与临床试验中使用的厄瑞努单抗原料药相似的水平。在一些实施例中，原料药中Asn¹⁰²脱酰胺变体和/或Asp¹⁰⁵异构化变体的较低水平(例如，低于约15％)是所希望的，因为原料药中约17％的这些变体导致厄瑞努单抗原料药的效力显著降低(参见表6和表7)。

实例3.通过CEX-HPLC鉴定和表征厄瑞努单抗电荷变体

该实例描述了表现出降低的CGRP受体抑制功能的厄瑞努单抗的另外电荷变体的鉴定和表征。通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)评估该实例中厄瑞努单抗的电荷异质性。

CEX-HPLC主要基于表面电荷的异质性分离蛋白质；然而，它还可能受到结构异质性和影响与离子交换树脂的分子相互作用的其他修饰的影响。该方法中的峰洗脱是净表面电荷的函数，其中带负电荷的种类早些洗脱，并且带正电荷的种类晚些洗脱。

将厄瑞努单抗原料药的样品加载到分析型CEX-HPLC柱(BioPro SP-F，5μm粒度，4.6mm×100mm，YMC美国公司(YMC America,Inc.))上。流动相A包含20mM磷酸钠(pH 6.6)，并且流动相B由20mM磷酸钠、500mM氯化钠(pH 6.6)组成。用从0min至4min的5％至12％流动相B，在18min至23％流动相B，在18.5min至20.5min至100％流动相B，和在21min至25min返回至5％流动相B产生的线性盐梯度来分离蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测洗脱液。在28℃下操作柱，并以0.6mL/min的流速将流动相施加到柱上。

CEX-HPLC图谱包含三个不同的区(包括酸性峰、主峰和碱性峰)(图11)。分离跨酸性峰、主峰、和碱性峰区的九种级分。将收集的级分通过CEX-HPLC再次分析从而表明级分用于表征是足够纯的。将经分离的级分的CEX-HPLC图谱和纯度分别显示在图12和表13中。

表13.富集的级分的CEX-HPLC峰面积百分比¹

¹从相同的原料药批次中收集所有的CEX-HPLC级分。目的级分基于收集时间窗，并且将相对纯度加粗并加下划线。将未检测的峰用破折号表示。

与厄瑞努单抗原料药相比，通过实例1中所述基于细胞的生物测定评估每种富集的CEX-HPLC级分的生物学活性。如表14所示，酸性峰级分F1和F2二者显示出相对于原料药降低的效力，然而剩余的酸性峰、主峰、和碱性峰级分显示无显著差异。

表14.富集的CEX-HPLC级分的效力

¹3次重复的平均值

²3个重复的其中一个不满足测定平行标准

为了更全面地理解酸性级分中的哪些变体对效力有影响，通过各种分析技术表征富集的CEX-HPLC级分，这些技术包括非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(rCE-SDS)、和非还原反相高效液相色谱(RP-HPLC)。

通过nrCE-SDS分析未分级的原料药和九种CEX-HPLC级分。在十二烷基硫酸钠(SDS)和N-乙基马来酰亚胺(pH 6.5)的存在下，通过加热使样品变性，然后在25℃下电动注入填充有SDS凝胶缓冲液的裸熔融二氧化硅毛细管中。在220nm处监测吸光度。如下表15中所示，相对于原料药，酸性级分F1在前峰和后峰种类中富集。前峰种类包括分子量低于完整厄瑞努单抗(主峰)的种类，该种类由肽水解或部分分子组装产生，然而后峰种类相对于主峰尺寸更大。总体而言，前峰种类的相对量在剩余酸性峰、主峰和碱性峰级分(即，F2至F9)和原料药中是一致的，尽管在前峰组内的分布中观察到微小差异。

表15.富集的CEX-HPLC级分的nrCE-SDS峰面积百分比

通过rCE-SDS还分析了厄瑞努单抗原料药和九种CEX-HPLC级分。rCE-SDS的方法类似于nrCE-SDS的方法，除了在注入毛细管之前在SDS和β-巯基乙醇的存在下通过加热使样品还原和变性。rCE-SDS分析的结果显示除酸性峰级分F1之外的所有级分与未分级的原料药对照相似。酸性峰级分F1显著富集最可能对应于肽水解片段的LMW和MMW种类(数据未显示)。酸性峰级分F1和级分F2(较少量)富集对应于非共有糖基化变体的后重链。

接下来，通过RP-HPLC，使用Waters BEH300C4柱(1.7μm粒度，2.1mm×50mm)来分析原料药和CEX-HPLC级分，并且使用含有0.1％TFA的流动相和1-丙醇的梯度在75℃下进行洗脱。检测在215nm处的吸光度。在CEX-HPLC谱中，观察到二硫化物同种型富集的趋势，其中IgG2-B和IgG2-A/B同种型富集在酸性级分中，而IgG2-A二硫化物同种型富集在主峰和碱性峰级分中(图13和表16)。如实例4中更详细描述的，IgG2-B二硫化物同种型的效力显著低于厄瑞努单抗原料药或IgG2-A和IgG2-A/B二硫化物同种型。如上所述，酸性峰级分F1的RP-HPLC图谱与原料药色谱图不一致，这很可能是由rCE-SDS和nrCE-SDS分别观察到的显著水平的可还原和共价片段化的结果。

表16.富集的CEX-HPLC级分的RP-HPLC峰面积百分比

该实例中描述的分析结果表明，对应于CEX-HPLC色谱图中的酸性峰的厄瑞努单抗的某些酸性变体(例如，片段化变体和二硫化物同种型变体)效力低于厄瑞努单抗原料药。具体地，酸性级分F1显示出效力的显著降低，这是通过rCE-SDS和nrCE-SDS检测的高水平片段化的结果。酸性级分F2也显示效力降低，这是由于相对于未分级的原料药，在该级分中富集的IgG2-B二硫化物同种型的水平升高。总之，通过CEX-HPLC检测的主要厄瑞努单抗变体包括二硫化物同种型变体，其中IgG2-B和IgG2-A/B同种型在酸性峰中富集。在酸性峰级分中还检测到脱酰胺、片段化(LMW和MMW)、HMW种类和非共有糖基化变体。

通过CEX-HPLC分析按商业规模制造的厄瑞努单抗原料药的若干批次(140mg/mL)来评估如通过CEX-HPLC色谱图中酸性峰的峰面积百分比所测量的酸性变体(例如，IgG2-B二硫化物同种型)的存在和质量。还通过基于细胞的效力测定评估原料药批次的效力，并与批号78137的效力进行比较，该批号78137代表用于II期/III期临床试验的厄瑞努单抗原料药。下表17中提供了数据的汇总。

表17.针对厄瑞努单抗原料药批次的CEX-HPLC和效力数据

如表17中的数据所示，按商业规模制造的厄瑞努单抗原料药含有如通过CEX-HPLC酸性峰所测量的从28.7％至31.3％范围内一致水平的酸性变体。含有在该范围内的酸性变体水平的原料药表现出与临床试验中使用的厄瑞努单抗原料药的效力相当的效力。

实例4.厄瑞努单抗的二硫化物同种型变体

厄瑞努单抗是IgG2亚类的抗体，并因此可以展示出已经针对IgG2分子描述的二硫化物同种型变体(Dillon等人,JChromatogr A.[色谱A杂志],第1120卷(1-2):112-120,2006；Wypych等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16194-16205,2008；Dillon等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16206-16215,2008)。使用用于鉴定的与电喷雾电离串联质谱法(ESI-MS/MS)偶联的非还原和还原的Lys-C肽图阐明在厄瑞努单抗中检测的二硫键的连接性。通过该方法，阐明了经典IgG2-A结构的预期二硫键，以及对应于IgG2-A/B和IgG2-B结构的二硫键。

在非还原和还原条件下使用内切蛋白酶Lys-C通过肽作图在原料药中鉴定二硫键连接的肽，如图14所示。除了吸光度检测，将反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离的出口与电喷雾电离串联质谱法(ESI-MS/MS)偶联用于正交质量分析。用还原剂三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)处理非还原消化物的一部分，并使用相同的RP-HPLC条件进行分析。

非还原的Lys-C图(图14，顶部迹线)标记有峰“A”至“G”和“a”至“i”，这些在还原条件下消失。还原后这些肽的消失表明它们参与天然蛋白质中的二硫键。在非还原Lys-C消化物中包含二硫键的肽和在还原的Lys-C消化物中相应的还原肽通过它们在吸光度色谱图中的存在或不存在来确定，并通过完整肽质量准确度和诊断型MS/MS产物离子的存在来确认。用于验证二硫键连接的肽的针对所有肽离子的理论和观察质量分别针对非还原和还原肽图显示在表18和表19中。经鉴定的非还原和还原肽解释了预期的IgG2-A二硫键同种型结构，其示意性地显示在图15A中。

表18.在厄瑞努单抗的非还原Lys-C肽图中鉴定的含有IgG2二硫键的肽

^a除非另有说明，质量是单一同位素的。

^b平均质量

H＝重链；L＝轻链；^＝其他重链或轻链；/＝单一二硫键；LL＝Lys-C消化的轻链肽；LH＝Lys-C消化的重链肽；pE＝LH1上N-末端Gln残基的焦谷氨酸；Cys残基编号相对于SEQ ID NO:1(对于重链)和SEQ ID NO:2(对于轻链)

表19.在厄瑞努单抗的还原Lys-C肽图中鉴定的含有半胱氨酸的肽

^a氨基酸残基编号相对于SEQ ID NO:1(对于重链肽)和SEQ ID NO:2(对于轻链肽)

^b质量是单一同位素的

—不适用；LL＝Lys-C消化的轻链肽；LH＝Lys-C消化的重链肽；ND＝未检测到；pE＝LH1上N-末端Gln残基的焦谷氨酸

Lys-C肽作图揭示了次要的二硫键连接的肽峰，这些肽峰对应于铰链肽与分子的其他区之间的二硫键对的异质性。除了图14中标记的主要的二硫键连接的肽峰之外，在非还原图中存在次要的晚洗脱峰(“a”至“i”)，这些洗脱峰在还原图中是不存在的，表明它们涉及天然蛋白质中的二硫键。这些晚洗脱的肽通过质谱法鉴定为针对已知的IgG2的结构同种型的链间二硫键结合的肽(Wypych等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16194-16205,2008；Dillon等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16206-16215,2008；和Zhang等人.,Anal Chem.[分析化学],第82卷(3):1090-1099,2010)。肽“a,”“b,”“d,”和“e”对应于结构同种型IgG2-B，然而肽“c,”“f,”和“i”对应于结构同种型IgG2-A/B。IgG2-A/B和IgG2-B二硫化物同种型结构的示意图分别描绘于图15B和15C中。用于验证IgG2-A/B和IgG2-B二硫键连接的肽的所有肽离子的理论质量和观察质量显示在表18中。分析表明，厄瑞努单抗的二硫键与先前观察到的IgG2抗体的二硫键相一致(Wypych等人,2008；Dillon等人,2008；和Zhang等人,2010)。

如上所述，肽作图显示存在二硫键连接的肽(对于主要的IgG2-A结构)，以及具有与另外的IgG2-A/B和IgG2-B二硫键结构同种型相关联的连接性的肽。如图15所示，在IgG2-B同种型中，两个Fab臂都与铰链区连接，而在IgG2-A同种型中，Fab臂都不与铰链连接。IgG2-A/B同种型是这两种形式之间的杂合体，其中仅一个Fab臂与铰链二硫键连接。先前已经报道了通过非还原反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离IgG2二硫化物同种型(Wypych等人,2008和Dillon等人,2008)。在这些研究中，在RP-HPLC峰级分中鉴定出对应于二硫键同种型A、A/B和B的肽(Wypych等人,2008和Dillon等人,2008)。通过非还原RP-HPLC分析的厄瑞努单抗原料药的代表性图谱显示在图16A中，其中标记的二硫化物同种型峰与由Wypych等人,2008报道的洗脱顺序一致。晚洗脱峰被鉴定为IgG2-A同种型，并针对报告相对百分比与IgG2-A峰归组。在厄瑞努单抗原料药中二硫化物同种型的相对水平是大约59.5％IgG2-A、34.7％IgG2-A/B、和4.4％IgG2-B，其中大约1.5％是早期洗脱前峰种类。

尽管非还原RP-HPLC是用于测定二硫化物同种型变体相对量的有效方法，但流动相和分离条件与用于测定厄瑞努单抗抑制效力的基于细胞的生物测定不相容。因此，如实例3所述从半制备型CEX-HPLC中收集富集二硫化物同种型的级分，并使用实例1所述的基于细胞的生物测定测试效力。相对于原料药，如以下详细的描述，分析富集二硫化物同种型IgG2-A、IgG2-A/B、和IgG2-B的三种CEX-HPLC级分(表16和图13A)的效力。通过非还原RP-HPLC，分析富集的IgG2-A、IgG2-B、和IgG2-A/B二硫化物同种型CEX-HPLC级分以在效力评估之前确认足够的纯度。相对于未分级的原料药，三种CEX-HPLC收集的级分的RP-HPLC叠加显示在图16B中，并且将RP-HPLC二硫化物同种型分布数据提供在表20中。

表20.CEX-HPLC纯化的级分的非还原RP-HPLC相对面积％¹

¹从相同的原料药批次中收集所有的CEX-HPLC级分。将来自每种收集的CEX-HPLC级分的目的同种型的纯度加粗并加下划线。

如表21所示，富集IgG2-A和IgG2-A/B的同种型级分的相对效力类似于厄瑞努单抗原料药的相对效力。然而，相对于原料药和富集的IgG2-A/B和IgG2-A同种型级分，富集IgG2-B二硫化物同种型的级分显示出显著降低的效力。

表21.厄瑞努单抗二硫化物同种型的效力

¹3次重复的平均值

²原料药批次，从其纯化富集二硫化物同种型的级分

这些数据表明，厄瑞努单抗铰链区中二硫键的结构构象对于抗体的生物活性是重要的。特别是，原料药中IgG2-B二硫化物同种型水平的升高显著影响抑制效力。对按商业规模制造的若干批次的厄瑞努单抗原料药的分析表明原料药中IgG2-B二硫化物同种型的水平一致，如通过非还原RP-HPLC所测量的该水平在从4.6％至5.2％的范围内。在这些厄瑞努单抗原料药批次中IgG2-A/B和IgG2-A二硫化物同种型的水平也与在从34.2％至35.5％范围内的IgG2-A/B水平和从57.4％至59.3％范围内的IgG2-A水平相一致。

实例5.厄瑞努单抗尺寸变体的鉴定和表征

该实例描述了表现出降低的CGRP受体抑制功能的厄瑞努单抗的尺寸变体的鉴定和表征。厄瑞努单抗的尺寸变体可以包括高分子量(HMW)种类和低分子量(LMW)种类。HMW种类是比单体更大的种类(例如，二聚体和更高级的低聚种类)可以通过非共价缔合、可还原性共价缔合、和/或非可还原性共价缔合形成。LMW种类可以通过多肽主链的片段化和/或亚基成分(例如轻链和重链)的不完整组装而产生。

在该实施例中，通过SE-UHPLC评估了厄瑞努单抗的尺寸异质性。SE-UHPLC主要基于流体力学体积的差异来分离蛋白质。SE-UHPLC方法在非还原性、非变性条件下进行，以评估在天然条件下厄瑞努单抗的尺寸分布。将厄瑞努单抗原料药的样品加载到分析型SE-UHPLC柱(BEH200柱，1.7μm粒度，4.6mm×150mm，沃特斯公司(Waters Corporation))上，并且使用包含100mM磷酸钠、250mM氯化钠(pH 6.8)的流动相等度分离蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测洗脱液。在环境温度下操作柱，并以0.4mL/min的流速将流动相施加到柱上。

在厄瑞努单抗原料药的SE-UHPLC图谱中存在明显的三个不同的区，如在图17A和17B中所示包括主要的单体(主峰)峰和低水平的HMW(前峰)以及LMW(后峰)。收集来自前峰、主峰和后峰区的级分，并对级分中分离的变体进行表征。SE-UHPLC的HMW峰(图17B)由两个未完全解析的种类构成，并因此被收集为分别代表HMW峰的前缘和尾缘的两个独立级分。使用半制备型SE-HPLC分离两个HMW峰和主峰，然后通过分析型SE-HPLC进一步富集。在表征分析之前，使用分子量截止过滤器对经收集的HMW和主峰级分进行浓缩，并将缓冲液交换到15mM乙酸钠(pH 5.2)中。由SE-UHPLC进行的LMW峰组(图17B)由两个小峰构成，这些小峰的总和低于原料药中0.3％的测定定量限。如下文更详细描述的，使用分析型SE-UHPLC分离和富集LMW峰组，并进行有限的表征测试。

SE-UHPLCHMW级分的表征

分别在图18和表22中显示的分离的HMW和主峰级分的SE-UHPLC图谱和纯度表明这些级分具有足够的纯度用于表征。

表22.富集的级分的SE-UHPLC峰面积百分比¹

¹从相同的原料药批次中收集所有的SE-UHPLC级分。

²LOQ＝0.3％

通过各种分析技术表征图18和表22中富集的HMW和主峰级分，这些技术包括具有静态光散射检测的SE-UHPLC、还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(rCE-SDS)、非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、和基于细胞的生物测定。

通过具有静态光散射检测的SE-HPLC(SE-HPLC-SLS)分析HMW和主峰级分连同未分级的原料药以确定每个色谱图中主要峰的摩尔质量。使用Agilent 1100HPLC***进行SE-HPLC-SLS分析。该柱是TSK-GEL G3000SWxl，5μm粒度，7.8mm ID x 300mm长柱(TosohBiosep)。使用的检测器是Wyatt Heleos II光散射检测器、Wyatt Optilab rEX RI检测器、和AgilentUV检测器，其中波长设定在280nm处。SE-HPLC运行在室温下进行，其中将100mM磷酸钾、250mM氯化钾、pH 6.8缓冲液用作流动相，且流速为0.5mL/min。注射体积为4.3μL以注射300μg的蛋白质。对于分子量(MW)计算，使用LS(光散射)和RI(折射率)信号以及0.185的样品折射增量(dn/dc)值。

来自主峰级分的单体(包含2条重链和2条轻链的完整抗体)的所测量的质量是149kDa，并且来自原料药对照的单体质量是143kDa，这两者与厄瑞努单抗单体的理论质量(148.8kDa)相一致(表23)。两种HMW富集级分(HMW 1和HMW 2)的HMW峰的所测量的质量分别为292kDa和279kDa，两者均与厄瑞努单抗二聚体的分子量(297.6kDa)一致(表23)。这些数据表明富集HMW1和HMW2二者的级分主要由厄瑞努单抗二聚体构成。

表23.富集的HMW和主峰级分的SE-HPLC-SLS测量的摩尔质量

根据实例3所述的方法，通过nrCE-SDS对富集的级分和未分级的原料药的分析表明两种HMW级分在后峰是富集的，对应于比单体(主峰)更大的共价高分子量种类，并且具有与对照相当的前峰面积(表24)。

表24.富集的SE-UHPLC级分的nrCE-SDS峰面积百分比¹

¹从相同的原料药批次中收集所有的SE-UHPLC级分。

非共价和共价二聚体的比例可通过比较在天然条件下富集的级分的纯度与变性条件下富集级分的纯度来估计。在比较天然条件下的二聚体水平(在表22中SE-UHPLC：％HMW)与变性条件下的共价二聚体水平(在表24中nrCE-SDS：％后峰)中，可以在天然原料药中估计共价二聚体的水平。基于该比较，厄瑞努单抗原料药中大多数天然二聚体种类与约68％的HMW1二聚体种类共价，并且几乎所有的HMW2二聚体在变性测试条件下保留。

根据实例3所述的方法通过rCE-SDS还分析了厄瑞努单抗原料药和富集的HMW种类和主峰级分。如图19所示，rCE-SDS分析的结果显示相对于原料药，HMW1和HMW2级分均富集中等分子量(MMW)和高分子量(HMW)种类。类似于共价和非共价二聚体种类水平的评估，可以将rCE-SDS用于估计原料药中可还原和非可还原二聚体种类的水平。在对天然条件下的二聚体水平(SE-UHPLC：％HMW)与还原和变性条件下的非可还原性二聚体水平(rCE-SDS：％HMW)的比较中，可以在天然原料药中估计非可还原性二聚体的水平。基于表25中所示的比较，厄瑞努单抗原料药中大多数天然二聚体种类可被还原，其中大约87％的HMW 1二聚体种类和约93％的HMW 2二聚体种类在还原和变性条件下还原成单组分。

表25.对厄瑞努单抗原料药(DS)中可还原性和非可还原性二聚体的估计

与厄瑞努单抗原料药相比，通过实例1中所述的基于细胞的生物测定评估富集的SE-UHPLC级分的生物学活性。如表26所述，HMW1和HMW 2富集的级分二者显示出相对于原料药和相对于富集的主峰降低的效力。如上所述，这些级分中HMW种类的显著部分是共价连接的且不可解离的。自缔合施加空间限制，这可能导致构象变化，该构象变化反过来可能影响分子与CGRP受体靶的结合，从而解释观察到的效力降低。

表26.富集的SE-UHPLC级分的效力

¹3次重复的平均值

SE-UHPLCLMW级分的表征

通过SE-UHPLC在单一级分中收集LMW峰(图17B)，并使用分子量截止过滤器进行浓缩，然后表征分析。在SE-UHPLC上重新注入LMW级分显示LMW种类富集至约34.4％(数据未显示)。通过在非还原条件下的全质量分析来对经收集的富集LMW级分进行分析，以表征LMW种类的性质。

使用与电喷射离子化飞行时间质谱法偶联的RP-HPLC，在天然、非还原条件下，通过质谱法分析来确定富集的LMW级分的质量。分析结果表明，相对于未分级的原料药，经收集的LMW级分富集共价连接的轻链二聚体(LC-LC)。

该实例描述的分析结果表明，厄瑞努单抗在非变性条件下通过SE-UHPLC主要作为包含2条重链和2条轻链(约99.2％的原料药)的完整抗体以其预期的单体形式存在。剩余部分由HMW种类(0.5％的原料药)组成，主要由二聚体以及痕量水平的LMW种类组成。没有观察到更高级的低聚物。相对于厄瑞努单抗的单体形式，富集HMW种类的厄瑞努单抗原料药的SE-UHPLC级分表现出降低的抑制效力。

厄瑞努单抗二聚体主要由共价连接的单体亚基构成，并且在变性条件下不会解离。大多数二聚体是可还原性的，在还原和变性条件下转变为重链和轻链组分，并且因此通过二硫键结合。非可还原性种类作为共价二聚体的次要组分存在，通过rCE-SDS在重链峰之后迁移。SE-UHPLC LMW峰的表征显示待富集轻链二聚体的峰。

通过SE-UHPLC分析按商业规模制造的若干批次的厄瑞努单抗原料药(140mg/mL)来评估如通过SE-UHPLC色谱图中HMW和LMW峰的峰面积百分比所测量的尺寸变体(例如，HMW和LMW种类)的存在和质量。还通过基于细胞的效力测定评估原料药批次的效力，并与批号78137的效力进行比较，该批号78137代表用于II期/III期临床试验的厄瑞努单抗原料药。以下表27提供了数据的汇总。

表27.针对厄瑞努单抗原料药批次的SE-UHPLC和效力数据

如表27中的数据所显示，按商业规模制造的厄瑞努单抗原料药包含如通过SE-UHPLC测量的一致水平的约0.6％HMW种类。含有该水平的HMW种类的原料药表现出与临床试验中使用的厄瑞努单抗原料药的效力相当的效力。

将表27中三个批次的原料药(63131、63132、和63133)在25℃下储存三个月，并且使这些样品经历SE-UHPLC分析和效力测试以评估由于尺寸变体随着时间的变化水平对原料药效力的任何影响。该稳定性研究的结果如表28所示。

表28.在25℃下储存的厄瑞努单抗原料药批次的SE-UHPLC和效力数据

含有高达1.6％的HMW种类水平的原料药具有与临床试验中使用的厄瑞努单抗原料药相当的效力。

为了评估厄瑞努单抗在热应激条件下形成尺寸变体的敏感性，将厄瑞努单抗原料药在50℃下孵育14天。在研究持续期间的不同时间点取出样品并冷冻。在最后的时间点后，将所有样品并行分析以最小化分析变异性。通过根据上述方法的SE-UHPLC和通过实例1所述基于细胞的生物测定评估样品。

图20显示了在50℃下应激的厄瑞努单抗原料药在第0天和第14天样品的天然SE-UHPLC图谱。图20中显示的峰的相对峰面积％连同通过基于细胞的生物测定法评估的样品的％相对效力示于表29中。HMW种类是显示出超过14天的增加、在主峰中相应减少的主要降解物。产生的HMW种类主要由高级聚集体(高于二聚体的HMW种类)构成。在第14天也观察到LMW种类的增加。厄瑞努单抗原料药的热应激样品显示出显著降低的效力。降低的效力主要是由于HMW种类的增加以及Asp¹⁰⁵异构化变体的增加，该异构化变体在厄瑞努单抗原料药的热应激样品中也增加(参见实例2)。

表29.在50℃下应激的厄瑞努单抗的SE-UHPLC峰面积％和相对效力

¹3次重复的平均值

对按商业规模制造的另外的厄瑞努单抗原料药批次进行另外的热应激研究。将表27中三个批次的原料药(63131、63132、和63133)在40℃下储存长达30天，并且使这些样品经历SE-UHPLC分析和基于细胞的效力测试以进一步评估由于尺寸变体随着时间的变化水平对原料药效力的任何影响。将该热应激研究的结果示出在表30中。

表30.在40℃下储存的厄瑞努单抗原料药批次的SE-UHPLC和效力数据

该研究的结果显示了随着HMW和LMW种类的增加，效力降低的一般趋势。特别是，原料药中高于约2.5％的HMW种类的水平与原料药效力的降低相关联。值得注意的是，63132批次的30天样品未显示效力降低，然而，这可能是由于基于细胞的生物测定的可变性。

本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全部内容并入本文。应理解，披露的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不意图限制所附权利要求的范围。

本领域的技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述发明的具体实施例的许多等效形式。此类等效物旨在由以下权利要求所涵盖。

Claims

1.一种组合物，该组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体，其中该一种或多种厄瑞努单抗变体包括异构化变体和脱酰胺变体，并且其中该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量少于约30％。

2.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量少于约15％。

3.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量少于约8％。

4.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量少于约4％。

5.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量是从约1％至约10％。

6.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量是从约1％至约4％。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中该异构化变体在厄瑞努单抗的一条重链或两条重链(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)的氨基酸位置105处具有异天冬氨酸残基或琥珀酰亚胺。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中该脱酰胺变体在厄瑞努单抗的一条重链或两条重链(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)的氨基酸位置102处的天冬酰胺残基转变为天冬氨酸残基、琥珀酰亚胺、或异天冬氨酸残基。

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中通过疏水性相互作用色谱-高效液相色谱(HIC-HPLC)确定该组合物中该异构化变体和脱酰胺变体的量。

10.一种组合物，该组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗酸性变体，其中该组合物中酸性变体的量少于约40％。

11.如权利要求10所述的组合物，其中该组合物中酸性变体的量少于约35％。

12.如权利要求10所述的组合物，其中该组合物中酸性变体的量是从约25％至约38％。

13.如权利要求10所述的组合物，其中该组合物中酸性变体的量是从约26％至约34％。

14.如权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中一种或多种酸性变体包含二硫化物同种型变体、片段化变体、或其组合。

15.如权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)确定该组合物中酸性变体的量。

16.一种组合物，该组合物包含厄瑞努单抗和其一种或多种二硫化物同种型变体，其中该一种或多种二硫化物同种型变体包括IgG2-B同种型，并且其中该组合物中该IgG2-B同种型的量少于约20％。

17.如权利要求16所述的组合物，其中该组合物中该IgG2-B同种型的量少于约10％。

18.如权利要求16所述的组合物，其中该组合物中该IgG2-B同种型的量是从约4％至约6％。

19.如权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中该一种或多种二硫化物同种型变体进一步包括IgG2-A/B同种型。

20.如权利要求19所述的组合物，其中该组合物中该IgG2-A/B同种型的量是从约34％至约37％。

21.如权利要求16至20中任一项所述的组合物，其中通过非还原反相高效液相色谱(RP-HPLC)确定该组合物中二硫化物同种型变体的量。

22.一种组合物，该组合物包含厄瑞努单抗和厄瑞努单抗的高分子量(HMW)种类，其中该组合物中该HMW种类的量少于约2.5％。

23.如权利要求22所述的组合物，其中该组合物中该HMW种类的量是约1.8％或更少。

24.如权利要求22所述的组合物，其中该组合物中该HMW种类的量是约1.2％或更少。

25.如权利要求22至24中任一项所述的组合物，其中该HMW种类包含厄瑞努单抗的共价连接的二聚体。

26.如权利要求22至25中任一项所述的组合物，其中通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)确定该组合物中该HMW种类的量。

27.一种组合物，该组合物包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体，其中所述厄瑞努单抗变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、HMW种类、或其组合，其中该组合物具有以下特征中的一种或多种：

(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约25％至约38％；

(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约2.1％或更少；以及

(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约8％或更少。

28.如权利要求27所述的组合物，其中该组合物具有以下特征中的一种或多种：

(a)如通过CEX-HPLC所测量的，该组合物中酸性变体的量是从约26.5％至约33.6％；

(b)如通过SE-UHPLC所测量的，该组合物中HMW种类的量是约1.2％或更少；以及

(c)如通过HIC-HPLC中的前峰所测量的，该组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量是约3.2％或更少。

29.如权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中厄瑞努单抗包含SEQ ID NO:1的重链和SEQ ID NO:2的轻链。

30.如权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中厄瑞努单抗包含SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:4的轻链。

31.一种药物配制品，该药物配制品包含如权利要求1至30中任一项所述的组合物、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

32.一种用于在有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求31所述的药物配制品。

33.如权利要求32所述的方法，其中该头痛是偏头痛。

34.如权利要求33所述的方法，其中该偏头痛是阵发性偏头痛或慢性偏头痛。

35.如权利要求1至30中任一项所述的厄瑞努单抗组合物，该组合物用于在有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生的方法中使用。

36.如权利要求35所述的厄瑞努单抗组合物，其中该头痛是偏头痛。

37.如权利要求36所述的厄瑞努单抗组合物，其中该偏头痛是阵发性偏头痛或慢性偏头痛。

38.如权利要求1至30中任一项所述的厄瑞努单抗组合物在制备药物中的用途，该药物用于在有需要的患者中治疗、预防头痛、或减少头痛发生。

39.如权利要求38所述的用途，其中该头痛是偏头痛。

40.如权利要求39所述的用途，其中该偏头痛是阵发性偏头痛或慢性偏头痛。

41.一种用于评估厄瑞努单抗组合物的质量的方法，该方法包括：

获得包含厄瑞努单抗和一种或多种厄瑞努单抗变体的厄瑞努单抗组合物；

测量该组合物中一种或多种厄瑞努单抗变体的量，其中所述厄瑞努单抗变体包括异构化变体、脱酰胺变体、酸性变体、HMW种类、及其组合；

将该一种或多种厄瑞努单抗变体的所测量与预定参考标准进行比较；以及

如果该比较表明满足该预定参考标准，则制备该厄瑞努单抗组合物的药物配制品或药物产品。

42.如权利要求41所述的方法，其中测量异构化变体和脱酰胺变体的量，并且该预定参考标准是约10％或更少。

43.如权利要求42所述的方法，其中通过HIC-HPLC测量该厄瑞努单抗组合物中异构化变体和脱酰胺变体的量。

44.如权利要求41所述的方法，其中测量酸性变体的量，并且该预定参考标准是约38％或更少。

45.如权利要求44所述的方法，其中通过CEX-HPLC测量该厄瑞努单抗组合物中酸性变体的量。

46.如权利要求41所述的方法，其中测量HMW种类的量，并且该预定参考标准是约2.5％或更少。

47.如权利要求46所述的方法，其中通过SE-UHPLC测量HMW种类的量。

48.如权利要求41至47中任一项所述的方法，其中该厄瑞努单抗组合物获得自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，该细胞系表达编码SEQ ID NO:1的重链的核酸和编码SEQ ID NO:2的轻链的核酸。