CN1119459A - 肿瘤疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

用免疫刺激多肽的编码DNA和DNA结合物如优选与转铁蛋白偶联的聚赖氨酸的复合物处理肿瘤细胞或成纤维细胞制备肿瘤疫苗。该复合物进一步含有DNA结合物与核内体裂解肽或含有与其它遗传缺陷有关的至少一种E₄缺陷或一种Ela缺陷的腺病毒的偶联物。

Description

肿瘤疫苗的制备方法

本发明涉及基因治疗，特别是其在肿瘤治疗中的应用。

在过去廿年中，有关肿瘤的治疗尚无关键性突破，只有近年来发展了所谓“肿瘤疫苗”才为肿瘤治疗带来了希望。

肿瘤病人免疫***对肿瘤的发展和疾病的预后有显著影响。患有恶性黑色素瘤的病人免疫反应可以导致0.5％病人肿瘤退化。另一方面对多数病人而言，一种免疫反应可以控制肿瘤发展，但是在肿瘤早期并不能逆转所有的肿瘤细胞。在后期经常可以发现肿瘤细胞可以逃脱免疫识别或者免疫***被明显抑制(Hoop等1990)已建议对于经过手术切除原位肿瘤的病人进行肿瘤疫苗治疗。肿瘤疫苗含有已经过遗传改造的肿瘤细胞或者含有与免疫刺激佐剂结合的肿瘤细胞，这种佐剂可以诱导或活化病人的一种肿瘤特异免疫反应。(例如Hoon等1990；Bystryn等1991和1992；Berd等1990；Fearon等1990；Lotee等1992；Pardoll 1992；Rosen berg等1992；Schirrmacher1990)。

为了使肿瘤细胞更具有免疫原性并且显著减少致瘤作用，较染肿瘤细胞的基因可以分为三类：

1)编码肿瘤细胞缺少的蛋白的基因(所谓外源或新抗原)：例如在MHC—I—缺陷的肿瘤细胞中表达同源MHC—I—抗原，或表达外源MHC—I—或MHC—II—抗原或表达病毒蛋白如血浆凝集素(Haemagglutinin)(Itaya等1987；Fearon等.1988；Plaksin等1988和Ostrand—Rosen berg等1990)可能产生所谓“异源基因化”。2)细胞因子基因：

表达这些因子(如白细胞介素2，CSF＝集落刺激因子，干扰素)以活化免疫***从而能作为异物识别肿瘤细胞并排斥它们。3)编码所谓“辅助蛋白”或者“共刺激分子”的基因：新近免疫学发现有效T细胞的激活既要求活化T细胞受体又要求活化T细胞上的第二个受体，这是通过活化抗原递呈细胞表面一种分子而实现的(Jenkins和Johnson 1993)。B7/CD28配对组成了一个单位的这种共刺激分子。B7在黑色素瘤细胞的表达刺激了正常情况下非致免疫细胞的一种免疫反应(Baaker等1993；Chen等1992；Townsend和Allison 1993；Schwarte 1992)。特别在树突状细胞和脾脏B细胞中表达的热稳定抗原HSA也具有共刺激活性(Lin等1992a和1992b)，而且可以表现为与B7协同作以促进T细胞生长。例如B7这种共刺激分子的性质之一可以表现为它们使得肿瘤细胞具有抗原递呈细胞的性质。

假定通过将这些种类中的一种基因转染至肿瘤细胞从而形成了肿瘤特异的免疫反应，以保证：为了防止肿瘤日后复发，在切除肿瘤后，破坏目前临床尚无法检测并且手术也不能切除的微转移。

肿瘤疫苗的治疗不同于免疫***的非特异刺激作用，采用灭活的瘤细胞或其部分的疫苗是一种主动—特异免疫治疗，如果可能瘤细胞尽量来源于同一病人，其结果是以控制方式动员了病人的免疫***，对抗个体肿瘤的抗原或至少同类肿瘤的抗原。

后来发现肿瘤细胞的失活可以导致免疫反应的降低。近来发展了由活瘤细胞制成的疫苗(Rosenberg等1992)。但是出于安全性的考虑，希望制成疫苗的细胞不再能***且只有有限寿命。

制备肿瘤疫苗的关键步骤之一是将基因导入构成疫苗或其一成份的细胞中去。

在应用肿瘤疫苗的过程中，迄今为止最先进的技术是采用重组的逆转录病毒作为载体，将基因导入细胞；这种方法是最近由Rosen berg等人1992年提出来的。但是采用逆转录病毒具有一定问题，因为它会引起付作用例如病毒感染，至少少数情况下有这种风险。另外逆转录病毒只能转导***细胞。然而考虑到这种载体和提出代替逆转录病毒***的重组腺病毒一样，在欲转移的DNA的大小和构建方面有局限性。

近年许多研究表明，基于这些病毒具有释放核内体内容物的能力，利用受体介导的细胞摄粒作用，通过DNA复合物转移基因，因此建议采用非重组腺病毒。由于避免了在细胞内进入溶酶体的DNA复合物被破坏，因此采用腺病毒可以提高基因转移效率(Cruicel等1991；Cruiol等1992a；Zatlukal等1992；Cotton等1992；Wagner等1992；Curiel等1992a)。现已特别提出通过聚赖氨酸结合来改造腺病毒。腺病毒—聚赖氨酸偶联物可以与DNA复合，同时与转铁蛋白—聚赖氨酸结合形成三元的转铁蛋白—聚赖氨酸/腺病毒—聚赖氨酸/DNA复合物(Wagner等1992)。复合物与靶细胞上的转铁蛋白受体及腺病毒受体结合，细胞摄粒作用后，腺病毒会引起核内体破裂，导致核内体物质释放至细胞质中。DNA进入细胞核，基因获得表达，主要是附着体局部化的DNA。与常规的病毒和非病毒基因转移动方法相比，本技术有下列优点：由于在此情形中腺病毒只作为从核内体释放转染复合物的物质，通过遗传或化学方法任选与物理方法相结合，可以使病毒失活，同常规的病毒技术相比较，提高了安全水平(Cotten等1992年)。此外基因构建物通过病毒外进行转移，这不是病毒基因组的部分。因此不需要制备病毒载体，并且对转移的DNA大小和序列基本没有限制。

受体介导的基因转移另外的优点是其对于靶细胞的适用范围。因此含有转铁蛋白和腺病毒偶联物的复合物可以通过转蛋白和/或腺病毒受体而被吸收。而且可以用其他对某些细胞群特异的配体来替代转铁蛋白，例如已证明LDL十分适合于黑色素瘤细胞。采用这种体系对于各种类型细胞基因表达量高。(比逆转录病毒(Lotze等1992；Rosen berg等1992)和用CaPO4共沉淀稳定转染细胞方法(Fearson等1990)高10—100倍)。此外，构建的高拷贝基因可以被转入细胞。***和非***细胞均可以被转染。在汇合细胞培养的条件下(生长停滞)，转入细胞的DNA表达可以维持数月(Zatloukal等1992)。

除了腺病毒和其他病毒或病毒片段外，特定的肽也具有能够使核内体破裂的性质。这种肽也称为“核内体裂解”或“融合基因”肽，在以受体介导的细胞摄粒作用转基团过程中，也可以用以增加基因的表达。利用这种肽进行基因转移在WO93/07283中进行了叙述。

利用腺病毒dl312进行实验表明有毒性问题；已发现在EIA—区缺失的病毒复制缺陷可以部分被转染细胞包围，即缺陷是“漏的”。此外，能产生病毒的包装细胞株虽然可以弥补Ad5dl312的缺陷，但是并不令人满意。

本发明的目的是在改进基因转移体系基础上，提供一种制备肿瘤疫苗的方法。

因此本发明涉及到一种制备肿瘤疫苗的方法。这种疫苗包含有自身的肿瘤细胞。该方法的特征在于培养肿瘤细胞或成纤维细胞，培养的细胞用含下列成份的组合物进行体外转染：

ai)含有一种或多种能在细胞中表达的编码一种或多种相同或不同的免疫刺激多肽的DNA分子，或者多种含有编码不同免疫刺激多肽的序列的DNA分子，

aii)任选的另一DNA分子它不具有编码在转染细胞里有功能活性多肽的序列，

b)DNA结合分子与选自下组的核内体裂解作用剂的偶联物：

i)至少在E4—区突变的腺病毒，

ii)具有除了E1A区缺陷外的其他遗传缺陷的腺病毒，或者

iii)核内体裂解的活性肽，

任意地

c)一种优选与内在化因子偶联的DNA结合分子，内在化因子结合于欲转染的细胞表面分子，并且被内在化至细胞内，

组分b)和c)与在a)定义的DNA一起形成一种基本上电中性的复合物，灭活被转染细胞使它们失去***能力同时保留其表达ai)中定义的DNA的能力，当转染成纤维细胞时，后者和非转染并且失活的肿瘤细胞相混合，细胞群可以任意与药学上可以接受的赋形剂和载体相混合。

b)中定义的偶联物以下称为“核内体裂解偶联物”。

用本发明的方法获得的肿瘤疫苗含有根据Roserberg等1992年提出的肿瘤疫苗灭活的肿瘤细胞，令人意外的是，这些肿瘤细胞尽管被照射，但就其引起的免疫反应而言活性是完全的。这可能是由于转染细胞中，免疫刺激基因高表达的原故，由细胞灭活而引起的抗原性降低或丧失至少部分被补偿。

为每个特殊病人专门制备的肿瘤疫苗，原料由任意与成纤维细胞混合的自身肿瘤细胞构成。成纤维细胞也可能是自身的细胞，但是也可以采用一种成纤维细胞的细胞系，从而不必对每个病例产生不同的成纤维细胞培养物，这将需要若干星期。

首先，从治疗的每个病人的组织样品中分离细胞和/或成纤维细胞。采用的方法是本领域的技术人员已知的。早期黑色素瘤细胞多数很容易分离，例如通过手术从***转移部分切除，转移部分采用无菌条件下的机械方法和任选的酶学方法将其分离出来。

从早期瘤中分离一般是比较困难的，特别是对于较小的肿瘤更是这样。例如在黑色素瘤的情况下，其过程是手术切除肿瘤，机械研磨，加入酶，进行解离。已知可以用于解离的酶有胶原酶、DNA酶和透明脂酸酶。

分离其他肿瘤也可以按同样原则进行。分离解离方法取决于周围的组织。为了分离和培养肿瘤细胞，可以采用文献已知方法，例如在“人肿瘤的初步培养”手册中可以找到这些方法，该书由John.R.W.Masters 1991年出版。

在本发明的一种优选实施方案中，基因的构建物不转入肿瘤细胞，而是进入初生成纤维细胞，然后将其与带有肿瘤抗原经过照射的非转染的肿瘤细胞混合(Fakhrai等，1992)。这种方法的好处在于从病人容易获得大量成纤维细胞，当肿瘤较小时，这是十分重要的，因为只能得到少量瘤细胞。并且将基因转入自身初生成纤维细胞方法标准化，比起转染至从不同病人分离出来的瘤细胞要容易的多。本方法另外的优点是不需要长期培养瘤细胞，这样一来，由于培养而导致部分丧失的抗原谱便可以得到保留。这也可以避免与肿瘤细胞培养有关的缺点，即，避免肿瘤分离物或肿瘤细胞克隆中含有的少量的个别细胞群如成纤维细胞淹没培养物。

从皮肤活组织中分离成纤维细胞，采用已知方法进行培养。这种方法已报道过，如Jones 1989；Freshney 1987；和Sly，Grubb，1979。

培养后，细胞用含有复合物组分a)到c)的培养液进行转染。一般而言，复合物b)和DNA与内在化因子偶联物的复合物同时运用较理想。为了加强基因的表达，这种复合物可以反复采用。

转染后，将细胞从含有转染复合物的过量培养液中分离出来，用新鲜培养液洗涤，再按要求进一步培养。

最好采用与转染成纤维细胞一样的失活方法，使肿瘤细胞或成纤维细胞失活。已知采用的方法有物理方法，如用X射线或γ射线，和/或用有丝***抑制剂进行化学处理如丝裂霉素C。适用的物质是DNA复制阻断剂或所谓的“纺锤体毒素”，即这种物质抑制有丝***纺锤体。

对于失活所需剂量在不同放射剂量或化学灭活试剂浓度下和/或不同处理时间下，一方面可以用测定H³标记胸腺嘧啶掺入的细胞量来确定，或测定其增殖率，另一方面也可以用测量外源基因的表达的方法来确定。

照射转染细胞，从而限制了其寿命，并降低了任何长期付作用。可以实现暂时性、有时间限制的基因表达，这取决于基因剂量。在实验进行过程中，发现γ—射线剂量达到100Gy不会降低转染基因的表达。

最好也使转染的成纤维细胞失活。这一步骤可以排除转染过程和/或培养中产生致瘤性。

制备肿瘤疫苗的方法最好包括一个中间步骤，在控制的条件下，冷冻细胞并加入可以避免霜冻破坏细胞的物质(防冻剂)例如二甲基亚砜(DMSO)。冷冻步骤原则上可以在过程的任何阶段进行，例如培养细胞转染前或转染后，但也可能在最后进行冷冻，即细胞照射后疫苗使用近前进行。冷冻提供了细胞供给，这种细胞是已转染的或将被转染的。这样易于制备等份试样的肿瘤疫苗。制备冷冻品是有用的，因为可以保存，制品只需使用前照射。

任何情况下，在使用肿瘤疫苗前需除去细胞防冻剂。

根据本发明方法在体外制备的疫苗可以对病人使用以触发或再活化肿瘤特异的免疫反应。

每次免疫所需肿瘤细胞数量为10⁵—10⁷个。在培养成纤维细胞并进行转染的方案中，加入的成纤维细胞数量基本是同数量范围，但是可以减少至细胞量的约1/100。

在本发明范围内，用小鼠模型进行了实验，以确定在注射遗传改造过的黑色素瘤细胞(肿瘤细胞)后，可以在注射部位检测出这些细胞。也对这些细胞在血液或不同器官中的分布进行了检测。利用聚合酶链反应进行检测。在制备肿瘤疫苗过程中，用带有白细胞介素2(IL—2)的质粒DNA转染细胞。采用特异引物，IL—2和腺病毒DNA片段可以在不同组织样品中遗传改变的黑色素瘤细胞中作为标记被检出。免疫部分的实验表明，采用由遗传改变的黑色素瘤细胞组成的疫苗，在注射几天后被消除。在免疫后两天，在细胞的降急性期，可以看到在血液、器官或胚细胞里没有转入重组IL—2DNA或腺病毒DNA。

另一方面，本发明涉及由含有一种或多种编码一种免疫刺激多肽的序列的DNA，优选与肿瘤细胞和/或成纤维细胞的内在化因子(特别是聚赖氨酸)偶合的DNA结合分子，和一种由DNA结合分子与上述限定的腺病毒或一种肽组成的核内体裂解偶联物组成的转染复合物，DNA结合分子c)和偶联物b)的DNA结合部分与DNA结合。

已经发现，利用本发明的复合物可能携带足够的基因转移至人黑色素瘤初生细胞和初生人成纤维细胞。转染黑色素瘤细胞的小鼠，每24小时，1×10⁶细胞可以产生24000单位IL—2。这比用其他病毒(Lotee等1992；Rosenberg等1992)或非病毒(Fearou等1990)基因转移技术至少高30倍，而且照射到100Gy不会降低转染基因构建物的表达。在本发明范围内，小鼠黑色素瘤疫苗的效果已在小鼠模型上显示。在使用了致瘤剂量的黑色素瘤细胞后，这种疫苗可以在免疫小鼠中诱导***免疫反应且保护动物不发展肿瘤。动物模型也确认了黑色素瘤疫苗的抗转移作用的有效性。

定义为组分ai)的DNA分子是一种质粒，含有一种编码免疫刺激多肽如细胞因子可表达形式的序列。在本发明范围内，“免疫刺激”的定义也包括所谓共刺激分子如B7(Schwartz 1992；Townsend和Allison 1993)或ICAM(Springer等1987)的免疫应答增强性质；免疫刺激物也包括外源抗原(所谓“新抗原”)例如病毒抗原。编码免疫刺激多肽的序列和能使免疫刺激多肽在靶细胞中高表达的调节序列相连。最好采用强启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等1985)或β—肌动蛋白启动子(Gunning等1987)。通过比较表达水平可以在初步实验中确定合适的构建物。

在本发明的优选实施方案中采用了编码白细胞介素2(IL—2)的序列。

但是，也可以采用其他细胞因子，如白细胞介素4(IL—4)，白细胞介素12(IL—12)，干挠素γ，肿瘤坏死因子a，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)(Pardoll，1992)的编码DNA序列。也可能结合应用细胞因子序列以加强免疫刺激活性如白细胞介素2＋干扰素γ；白细胞介素2＋白细胞介素4；白细胞介素2＋肿瘤坏死因子a或肿瘤坏死因子a＋干扰素γ。最好编码两种不同细胞因子的序列位于不同的质粒上。在这种情况下，如在使用IL—2和IFN—γ的本发明实验中所表明的那样，通过改变两种质粒的比例可以获得细胞因子细微程度的表达。

在本发明的另一具体方案中，采用含有一种或多种编码共刺激分子的DNA分子。优选采用的共刺激分子是热稳定抗原(HSA)。含有编码HSA序列的DNA分子既可以用其自身也可以和编码细胞因子、优选白细胞介素2的DNA结合。

在本发明的另一个具体方案中，采用含一种或多种编码新抗原序列的DNA分子。优选的新抗原是一种病毒蛋白或病毒蛋白片段，例如狂犬病毒糖蛋白。含有编码病毒蛋白序列的DNA既可以用其自身，也可以和编码一种细胞因子，最好是白细胞介素2的DNA相结合。

关于DNA构建物的大小，实际上没有限制，所用转基因***已证明适于分子大小为48Kb的构建物(Cotten等1992)。

编码免疫刺激多肽的DNA，即有治疗活性DNA可能存在于与aii)中定义的作为“填料DNA”的DNA分子的混合物中。这种DNA序列不是主要的，除了对纯度的要求外，它应与治疗用活性DNA相当，只需要满足不含任何编码在细胞中有功能活性多肽序列的条件。这种DNA分子大小也不重要，一般其大小相当或小于基因治疗活性DNA分子为宜。

填料DNA可以代替不同量的治疗用活性DNA，考虑到与复合物中其它成份的予定比例，保持DNA的量恒定。其优点在于治疗DNA剂量和在细胞中表达的细胞因子量可以变化，而无需改变其它参数，在标准肿瘤疫苗的生产中，这是十分有利的。在本发明范围内，已经表明在细胞中基因表达量随填料DNA的比例而降低。

在本发明的另一具体方案中，所用质粒DNA不带有脂多糖。令人惊奇的是，已经发现如果质粒DNA基本不带有脂多糖时，表达值显著增加。这些组分经常污染质粒DNA，在大肠杆菌中是经常发生的。为了除去脂多糖。可以采用合适的方法，例如用包括有多粘菌素层析在内的层析方法结合提纯DNA。或为了除去从细胞液来源的脂多糖，可以将脂多糖结合试剂如多粘菌素加至转染培养液中去。

如果靶细胞具有足够量的保证内在化的腺病毒受体，则可以在细胞内有效表达外源DNA。当采用如组分b)的腺病毒偶联物时，用一种不与其他内在化因子如组分c)偶联的DNA结合分子是足够的；一般而言，和偶联物b)所含分子一样，优选采用聚赖氨酸。在本发明的这一方案中，腺病毒本身作为内在化因子，在这种情况下，不需要将DNA结合物与另一内在因子偶联。

在本发明的此方案中，c)是一种非偶联DNA结合物，而DNA是同偶联物b)复合的；在这种情况下，c)主要使复合物紧密从而改进细胞对复合物的摄取(Wagner等.1991a)。在特殊情况下应用时，如当采用小DNA分子，非偶联DNA结合分子如c)组分也可以被一起省略。

在本发明的优选实施例方案中定义为组分c)的DNA结合物质与一种内在化因子偶合。本发明的这一方案特别应用于采用腺病毒偶联物时，靶细胞没有或只有少数腺病毒受体的情况，如采用一种稀有种病毒或当利用一种肽偶联物作为核内体裂解偶联物b)时。当存在其他内因子化偶联物时，病毒偶联物受益于偶联物c)的内在化能力和核酸一起与后种偶联物c)复合，并作为复合物的一种组分被吸收进入细胞，因此成为一种“组合复合物”或“三元复合物”。无意限于这种理论，组合复合物既可以通过结合于内在化因子特异表面受体也可以通过与病毒受体结合或通过与两种受体结合经受体介导的细胞摄粒作用而被细胞吸收。当病毒从核内体释放时，复合物所含DNA也会释放进入细胞质，因此避免了溶酶体的裂解。

在含有像c)那样优选结合在内在化因子和DNA结合分子间的偶联物本身是已知的。

本发明“内在化因子”术语包括配体或其片段，在与肿瘤细胞或成纤维细胞结合后，通过细胞摄粒作用，使其内在化，最好是受体介导的细胞摄粒作用，或者是通过与细胞膜成份结合被结合/内在化的因子。

内在化因子的例子是配体转铁蛋白(Klousner等，1983)、亚洲糖蛋白(如亚洲转铁蛋白，亚洲类血清类粘蛋白或亚洲胎球蛋白)(Aushwell等1982)，外源凝集素(Goldstein等1980；Sharon1987)或者是含有半乳糖并通过亚洲糖蛋白受体内在化的物质；含甘露糖的糖蛋白(Stahi等1978)；溶酶体酶(Sly等1982)；LDL(Gololstein等1982)；改造过的LDL(Gols—tein等1979)；通过受体(Apo B100/LDL)吸收至细胞的脂蛋白；病毒蛋白；抗细胞表面抗原的抗体(Mellman等1984，Kuhn等1982；Abrahamson等1991)或其片段如抗CD₄，抗CD₇，抗CD₃；细胞因子如白细胞介素1(Mizel等1987)，白细胞介素2(Smith等1985)，肿瘤坏死因子(Imamura等1987)，干扰素(Anolerson等，1982)；CSF(集落刺激因子)(Walkdr等1987)，因子和生长因子如胰岛素(Marshel1985)，EGF(表皮生长因子)；(Carpenter 1984)；PDGF(血小板衍生生长因子)(Heldin等1982)TGFa(转移生长因子α)(Massague等1986)；和TGFβ(转移生长因子β)，HGF(肝细胞生长因子)(Nakamura等1989)，神经生长因子(Hasong等1987)，类胰岛素生长因子I(Schalch等1986)，LH，FSH(Ascoli等1978)；生长激素(Hizuka等1981)；催乳素(Posner等1982)；胰高血糖素(Asada—Kubota等1983)，甲状腺激素(Cheng等1980)，α—2—大球蛋白—蛋白酶(Kaplan等1979)。其他例子是免疫球蛋白或其片段作为FC受体的配体或抗免疫球蛋白结合于sIgs的抗体(“表面免疫球蛋白”)。配体可能是天然来源的，或是合成的(参见Trends Pharmacol.Sci，1989和其中引用的参考文献)。

在本发明范围内，转铁蛋白和表皮生长因子是优选的内在化因子。

合适的作为组分c)(非偶联的或作为一种内在化因子偶联物的组分)或作为偶联物b)的部分的DNA结合物，例如包括同源的有机阳离子物质如聚赖氨酸，聚精氨酸，聚鸟氨酸或带有两种或多种不同正电荷氨基酸的异源多阳离子化合物，这些多阳离子化合物可能具有不同链长，以及非肽的合成多阳离子化合物，例如聚乙二胺。其他合适的DNA结合物是天然的具有多阳离子性质的DNA结合蛋白如组蛋白或鱼精蛋白或其类似物或片段，以及精胺或亚精胺。

多阳离子化合物长度并不关键，只要这种复合物基本上是电中性的。如果DNA由6000tp(碱基对)和12000负电荷构成，每毫升DNA聚阳离子化合物的量如为：

60Mol聚赖氨酸200或

30Mol聚赖氨酸400或

120Mol聚赖氨酸100等。

本领域有中等技术的人员就可以通过简单常规实验选择其他多阳离子化合物长度和分子量的结合。

优先选择聚赖氨酸作为本发明的目的，主要是采用200—300赖氨酸长度的链。

如果为了制备偶联物b)，考虑到和核内体裂解试剂尤其是病毒偶联，对DNA进行了改造，例如，如果聚赖氨酸和抗生蛋白链菌素相偶联以与生物素标记的腺病毒连接，为了简化原故，这样进行了改造的DNA结合分子可以用作为组分c)。实际上这意味着利用了过量聚赖氨酸—抗生蛋白链菌素，去制备聚赖氨酸—抗生蛋白链菌素/生物素—腺病毒偶联物，这种过量接管了组分c)的功能。

内在化因子—多阳离子物—偶联物可以采用化学方法制备，或者如果多阳离子物是一种多肽则采用重组方法。所采用的制备方法在EP388 758中予以了说明。

偶联物也可以采用Wagner等人1991b方法进行制备。该方法中糖蛋白(例如转铁蛋白)和DNA结合分子(尤其聚赖氨酸)是通过糖蛋白的一个或多个碳氢链结合在一起的。

优选采用一种在E₄区缺陷的腺病毒偶联物b)。这种腺病毒已由Bridge和Ketner1989年报道过。E₄—区复合物编码蛋白的功能只有部分得以阐明。因此，已知E₄区和E1b区一样，对病毒早期和晚期基因之间表达的转换是必须的，可以关闭宿主蛋白合成，对于病毒复制和病毒颗粒的装配也是必须的。其中有24种EA—mRNA，已确认其中有7个开放阅读框架，据认为框架3和6主要与E₄—表现型有关。开放阅读框架ORF6/7的基因产物具有十分重要的功能。这种蛋白可能结合于细胞的转录因子E2F，从而后者成为高特异性腺病毒的转录因子。已经发现一种E₄—区缺陷的腺病毒作为一种基于受体介导细胞摄粒作用的基因转移体系组成部分，这种情况下，当用于肿瘤细胞时，腺病毒作为一种裂解核内体的试剂，令人惊异的是这种腺病毒毒性低同时基因转移效率高。

根据Bridge和Ketner关于腺病毒的报道，具有完整阅读框架4但是阅读框架3，6以及6/7缺陷的突变株dl1014之所以被选是由于它在合成病毒蛋白上最有效。由于E₄编码的病毒蛋白的功能尚不完全清楚，因此目前尚不可能确定为了达到理想的作有，必须进行突变的阅读框架。除了变株dl1014外，采用Bridge和Ketner所报道方法制备E₄变株，并按实例用标准方法进行转染和细胞毒实验，可以确认合适变株。为了指导转染实验，首先要用报道基因代替细胞因子基因。提供基因表达和细胞毒性值与将dl1014可比或甚至优于dl1014的变株适于作为本发明范围内转染复合物的组分，只要它们也可以满足下列要求：病毒(例如W162细胞系中的dl1014)在补充E₄缺陷的细胞株中能够高滴度培养。

作为E₄区缺陷腺病毒的替代，也可以采用Ela区缺陷的腺病毒，这种病毒除了Eta缺陷外，还有一种或多种通过，化学/物理或遗传方法造成的其他遗传缺陷。

采用化学或物理/化学方法造成的缺陷并不是靶位缺陷，可能是分散于病毒整个基因组的。

在本发明范围内，一种名为dl312(Jones和Shenk1979)用8—甲氧补骨脂素/紫外线失活处理获得的腺病毒突变株已证明适用于制备肿瘤疫苗。

其他合适的Ela变株可以采用文献报道方法制备，和E₄变株方法一样，用多种失活方法和/或剂量处理并测定作为转染复合物的组分来制备肿瘤疫苗的适用性。

和采用8—甲基补骨脂素诱变一样，也可以采用其他补骨脂素衍生物，例如4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素，已证明它可以用于失活转基因用途的腺病毒。(补骨脂类衍生物能够***DNA，用365nm进行紫外照射后，可以形成与病毒DNA的共价链内和链间加成物(Hanson 1992)。然后这些加成物可以使有影响的基因部分失活，因此阻断基因功能，如病毒的转录和复制。)已经发现病毒复制降低大于5log(用CPE实验测定)，病毒复制降低大于7log(用空斑实验测定)伴随着发生转基因放大作用仅降低10^1/2。(COtten等，1992)。

考虑到一般制药力求最大可能的标准化，特别是在制备肿瘤疫苗时，这种标准化扩展至所有的组分和方法参数；对病毒也是这样，最好采用已失活的病毒，如有可能采用可标准化方法失活。化学失活方法尤其符合标准化要求，这方面比化学/物理方法优越。化学失活方法的一个例子是采用β—丙内酯(Margeaus等1993；DeShu等1986；Budowsky和Zalesskaya 1991)。这种方法的优点在于失活试剂在水溶液中不稳定，因此不需要钝化未反应的试剂。另外这种失活作用不要求用紫外线处理，从标准化而言也有好处。已经确定，在本发明的框架内，用2份0.3％β—丙内酯溶液在室温度下处理腺病毒4小时，和采用8—甲氧补骨脂素处理相当，病毒滴度降低5log。转DNA的活性在采用平均浓度0.3％β—丙内酯浓度水平时可以保持，但是浓度为1％β—丙内酯浓度时则会使活性显著丧失。分析失活病毒基因表达表明无论是补骨脂素还是β—丙内酯均相同程度地阻断病毒基因表达(Ela和E₃)。但是更敏感的空斑实验表明，补骨脂素处理病毒失活高于7log，在最高剂量病毒条件下，没有观察到空斑出现。与此相比，β—丙内酯失活只引起病毒降低5log，在高剂量病毒情况下可以看到空斑。

因此，在本发明的另一具体实施方案中，只有采用用化学方法失活的病毒，优选用β—丙内酯失活。

考虑到将它们用于转移基因特别是用于本发明的肿瘤疫苗，失活病毒的方法的适用性可以经初步实验来确定，正如实施例所阐明的用8—甲氧补骨脂素/紫外线，4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素紫外线和β—丙内酯失活腺病毒那样。

有效地确定病毒失活率，例如可以测定病毒滴度和/或用比较敏感的空斑的空斑实验，另外用报导基因测定病毒增强受体介导的基因转移的能力。为了发现失活作用发生在病毒基因组的哪一部分，即哪部分破坏了，采用DNA探针进行杂交，用此探针可以研究病毒是否存在相应的转录本。在本发明范围内，采用了许多失活方法观察它们是否能够阻断病毒复制和转录功能。一种适用的失活方法是产生这样的腺病毒颗粒，该颗粒仍具有核内体裂解活性(这是病毒外壳的一种功能)，这种活性对于DNA转移功能是有用的，同时它们丧失了表达或复制病毒基因的能力，这种表达或限制可在细胞内引起不利变化。已经发现用8—甲氧补骨脂素或4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素处理腺病毒，接着再用紫外线(UVA)照射25分钟，以及用2×0.3％β—丙内酯处理，得到的病毒颗粒保留其有效的DNA转移增强能力。采用细胞病变终点试验(CPE)发现，就病毒滴度的减低而言，三种处理方法是相当的。用β—丙内酯和8—甲氧基补骨脂素/紫外处理后，都没有检出病毒基因组的转录，但是比较敏感的空斑实验表明如果存在足够的互补细胞系；β—丙内酯处理的病毒能够复制。与此相比，用两种补骨脂素衍生物处理病毒均会完全阻断病毒复制，因此进行这种实验没有空斑出现。

对于测定基因表达RNA分析，既可以用腺病毒5Ela探针进行，此探针识别Ela基因(腺病素dl312中缺失此基因)，也可以用5E₃腺病毒探针，这种探针可以识别编码大量E₃19K糖蛋白的E₃区(Ela作为对照；病毒dl312应没有RNA信号，而dl1104中应可检出信号，因为它有野生型E1区)。对于E₃的表达，认为其在对转染细胞的免疫反应中起重要用作，因为至少两种E₃基因调节感染细胞表面的MHC—I类分子和肿瘤坏死因子受体的表面表达。为了采用病毒dl1014进行产生致免疫肿瘤细胞的基因治疗，希望E₃区缺陷，因为这部分表达会干挠对转染细胞的免疫反应。

与聚赖氨酸偶联(或离子结合)的核内体裂解剂优选用作三元聚合物或组合复合物的组分。腺病毒和聚赖氨酸的偶联可以以多种方式进行：

采用化学方法与病毒偶联可以采用已知的肽偶联方法进行，如果需要，在偶联反应前，提供带有连接物(tinker)的单一组分(如没有适于偶联的功能基团如巯基、醇基团存在，则需要这一步骤)。连接物是双功能化合物，它首先和单一组分的功能团进行反应，然后再偶联改造过的单个组分。

在采用一种异双功能试剂修饰缺陷的病毒后，一种偶联病毒和聚赖氨酸的可能方法是类似于产生转铁蛋白—聚赖氨酸偶联物的方法(Wagner等1990)。如果病毒有适合的碳氢链，则可以通过糖蛋白的一种或多种碳氢链与DNA结合物相连接(Wagner等1991b)。

制备病毒—聚赖氨酸偶联物的另一种方法是采用一种转谷氨酰胺酶(Zatleukal等1992)通过酶偶联病毒和DNA结合物，特别是聚胺。

制备腺病毒—聚赖氨酸偶联物的又一种方法是病毒通过一种生物素—蛋白桥，最好是生物素-抗生蛋白链菌素桥而与多阳离子物质偶联(Wagner 1992)。

如果希望，与生物素的结合也可以采用抗生素蛋白进行。

也有可能这样构建病毒和聚赖氨酸之间的键，一方面用生物素标记病毒，另一方面，将抗生物素抗体和聚赖氨酸结合；通过生物素/抗体键构成病毒和聚赖氨酸之间的键，这可采用标准商业化的抗生物素多克隆或单克隆抗体。

病毒和聚赖氨酸之间的键也可以通过聚赖氨酸和与病毒表面糖蛋白有亲合力的外源凝集素相偶联而产生，此类偶联物中的这种结合是通过外源凝集素和糖蛋白之间的键进行的。如果病毒没有自身合适的碳氢侧链，则进行相应改造。

如果在其表面蛋白上有酸性区，从而能够与多阳离子物结合时，病毒也可以以离子键与DNA结合分子连接。

除了选择腺病毒变株外，在b)中定义的偶联物的核内体裂解组分也可能是一种肽，这种肽可以以或离子键与DNA结合分子连接。对这种肽的制备要求以及其与DNA结合分子的偶联参考WO93/07283。

本发明中优选采用一种合成的二聚流感肽，其以离子键与聚赖氨酸结合，采用这种肽可能使白细胞介素2在黑色素瘤细胞中获得高效表达。在上述肽偶联物存在下，使用转铁蛋白—聚赖氨酸偶联物，用IL—2—颗粒DNA转染黑色素瘤细胞，被证明是对肿瘤的形成具有预防保护作用的肿瘤疫苗。

为了制备转染复合物，步骤的顺序并非关键，例如，可以按下列步骤进行：

从DNA分子起始，确定正确类型和定量的DNA结合物以保证DNA的复合，得到的复合物优选是基本上电中性的。对于含有病毒偶联物和内在因子偶联物的复合物而言，电中性方面要考虑两种偶联物的阳离子部分。

当决定组分a)、b)和c)的摩尔比时，应该切记发生DNA的复合，要仔细确保形成的复合物与细胞结合，输送进入细胞并且从核内体释放。

内在化因子偶联物DNA的比例选择，初步决定于多阳离子分子大小和正电荷基因的分布和数目，标准是要与被运送DNA的结构和大小相适应，同时也要考虑病毒偶联物。内在化因子：聚赖氨酸的优选摩比例是大约10∶1到约1∶10。

当采用腺病毒偶联物和非结合的DNA结合物时，为了有效转染表达，采用滴定法来确定了偶联物：DNA的最适比例后，也可能确定可以DNA结合物代替的偶联物部分的数量。

最好采用的聚赖氨酸和组分c)一样，优选和一种内在化因子结合，而且也作为腺病毒偶联物b)的一部分。

确定复合物中组分比例的合适方法是首先要确定需被转入细胞的基因结构，并如上所述找出适于转染的病毒。然后，病毒与多阳离子物结合，并与基因构成复合物。从一定数量的DNA出发，用滴定法测定结合病毒偶联物与内在化因子偶联物或非偶联DNA结合物的比例。

通过混合稀溶液中的a)，b)和c)可以制备复合物。

用滴定来决定DNA和偶联物及非偶联DNA结合物的最适比例，即用定量的DNA和不同数量的偶联物/聚赖氨酸进行一系列转染实验，在混合物中偶联物对多阳离子物的最佳比例可以通过常规实验或比较滴定实验中所用混合物的最佳比例而确定。

可在生理盐水浓度下制备DNA复合物。另外一种可能是采用高盐浓度(大约2MNaCl)，通过缓慢稀释或是透析达到生理条件。

对于混合组分的最适顺序，每种情况下通过初步实验来确定。

采用的核内体裂解偶联物的量取决于所进行的特殊转染作用。建议采用确保复合物内在化进入多数细胞并从核内体中释放所需的最低量的核内体裂解偶联物的量。如果采用腺病毒偶联物，偶联物的量适应于细胞的基体类型，特别应考虑病毒对此类细胞的感染性。另外一个标准是具体的内在化因子偶联物，特别要考虑到在靶细胞有一定数量受体的内在化因子。以外，核内体裂解偶联物的数量取决于转入DNA的数量。为了特殊的应用，在初步实验中通过滴定来确定核内体裂解偶联物的最适浓度，采用设想的转染靶细胞和设想的转染载体***，并适当应用就其大小而言与实际应用的基本相符的作为基因构建物的DNA，其含有一种报道基因使得易于测定基因转移效率。在本发明范围内，已经表明荧光素酶适于作为这种实验的报道基因。

另一方面，本发明涉及到用本发明复合物转染的肿瘤细胞或成纤维细胞。

本发明的另一方面涉及根据本发明方法可以得到肿瘤疫苗。这些疫苗是药物制剂，它们含有转染的肿瘤细胞或转染的成纤维细胞，其以药学上可接受的配方与瘤细胞混合。

即用的肿瘤疫苗优选采用悬液形式，这是任选通过胰蛋白酶水解后得到的。细胞悬浮在一种生理液中(生理盐水或缓冲液)，其中含有适当的营养物，特别是细胞要求的氨基酸，以维持在制备疫苗和临床使用的短期内代射要求。

本发明范围内的实验，将黑色素瘤细胞培养于加有胎牛血清(FCS)的RPM1640培养液中。

根据本发明，为了治疗目的，试验了多种培养液以制备肿瘤疫苗的盖仑制剂。

已发现，含有添加剂如牛血清，人血清，人血清白蛋白和/或羟乙基纤维素的细胞培养液可以保证疫苗含有足够数量的活细胞。最适肿瘤疫苗培养液最好采用AB型血清，也可采用自体的血清。如果需要，培养液中含有加入的一定量生长因子或细胞因子如干扰素γ或GM—CSF以对细胞的抗原递呈起有利的作用。

采用本发明方法制备的肿瘤疫苗类型在细胞因子治疗领域构成了新的发展。其优点在于由于细胞因子作用和其形成的局限性而避免了***施用细胞因子出现的严重付作用。除了治疗黑色素瘤、结肠瘤外，也可以用本发明的肿瘤疫苗治疗其他类型肿瘤，如肾癌或乳腺癌。

图1：基因转入培养的初生黑色素瘤细胞。

图2；确定与基因转移复合物的吸收相关的配体。采用非偶联的聚赖氨酸。

图3；采用补骨脂素/紫外失活腺病毒对初生人黑色素瘤基因表达的影响。

图4：测定腺病毒的长期细胞毒性。

图5：照射肿瘤细胞对转染基因表达的影响。

图6：质粒浓度对荧光素酶受体基因表达的影响。

图7：质粒浓度对白细胞介素2和/或干扰素γ表达的影响。

图8：转染小鼠黑色素瘤细胞致瘤能力的消失。

图9：用转染了细胞因子、照射后的肿瘤细胞免疫接种，在小鼠中诱导抗黑色素瘤的***免疫反应。

图10：作为配体，将表皮生长因子(EGF)转入人的皮肤癌细胞系(A：加2％胎牛血清B：没有加胎牛血清)。

图11：利用各种病毒载体，白细胞介素2在小鼠黑色素瘤细胞中的表达。

图12：利用各种病毒载体，白细胞介素2在成纤维细胞中的表达。

图13：在其表面表达HSA的黑色素瘤细胞刺激免疫反应。

图14在其表面表达狂犬病糖蛋白的黑色素瘤细胞刺激免疫反应。

图15：滴定8—甲氧补骨脂素。

图16：滴定4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素

图17：滴定β—丙内酯。

图18：用8—甲氧补骨脂素处理或用低浓度β—丙内酯处理后，腺病素dl1014的基因转移活性。

图19：用8—甲氧补骨脂素，β—丙内酯或4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素失活的腺病素dl1014空斑实验。

图20：用8—甲氧补骨脂素或多种β—丙内酯处理失活的腺病素dl1014空斑实验。

图21：失活病毒的基因表达。

图22：反转录—PCR分析。

图23：在病毒基因组中定位8—甲氧补骨脂素。

图24：人黑色素瘤细胞生长与γ—射线剂量关系。

图25：采用细胞因子转染的黑色素瘤细胞免疫，对抗瘤转移的保护作用(用腺病毒进行转染)。

图26：依赖于细胞因子剂量的肿瘤疫苗的效力。

图27采用细胞因子转染的黑色素瘤细胞免疫对抗瘤转移的保护作用(用核内体裂解肽转染)。

图28：白细胞介素2在人黑色素瘤细胞中表达。

图29：DNA所含内毒素成价对白细胞介素2在人黑色素瘤细胞中表达的影响

在下列实验例中阐明了本发明，采用了下列材料和方法，除非另有说明：

a)质粒构建物

i)含有编码人或鼠白细胞介素2序列的DNA质粒构建物。在实施例6—8中进行的实验中，采用了Karasuyama等人1989年描述的质粒BCMGneo—mIL—2。

也可以制备定名为pWS2m的质粒，其中含有在巨细胞病毒增强子/启动子控制下的鼠白细胞介素2的基因：质粒pBAPr—1(Gunning等1987)被BamHI和ElorI酶切，采用琼脂糖凝胶电泳分离纯化了一个2.5Kb片段，其中含有氨苄青霉素抗性基因、pBR322质粒的复制起始区和SV₄₀—多腺苷化信号。将这一片段与巨细胞病毒启动子/增强子连接，该片段采用多聚酶链反应扩增，作为载体pAD—CMV的0.7Kb片段(在EP—A 393 438已介绍)，用ECoRI/BamHI消化。所得质粒命名为pWS。采用多聚酶链反应(PCR)从质粒BMGneo—mIL—2(Karasuyama和Melcher等1988)得到一个编码鼠白细介素2的cDNA。为了能从第一个ATG编码正确起始转译，将序列GCCGCC连接于5’—末端方向。去掉3’—非编码区。将PCR片段与SalI/BamHI酶切打开的载体pWS相连接。

用于人细胞时，采用载体pWS2，除了用含有编码人IL—2的cDNA的pIL2—50A质粒(Taniguichi等1993)代替质粒BMGneo—mIL—2作为PCR扩增基础外，构建这种质粒的途径和载体pWS2m类似。

替代带有抗氨苄青霉素抗性基因的质粒，制备了含有从pBR327切下来的四环素抗性基因的载体PGShIL—2tet。

对于质粒pCM2，将鼠白细胞介素2序列和5’—、3’—两侧序列一起从BeMGneo—mIL2中作为SalI/BamHI片段切下来，(裂解和兔β—珠蛋白基因的Poly(A))，并将其***载体pAD—CMV1中。

ii)含有鼠干扰素γ编码序列的DNA质粒构建物使用Gray和Goedolle 1983年报道的质粒pSVEmuIFN—γ。

iii)含有HSA编码序列的DNA质粒构建物将HSA—cDNA(Kay等，1990)克隆至质粒pCDM8(Seed 1987)的BstXI酶切位点，得到了含有由CMV—启动子控制的含HSA序列的质粒pHSA。

iv)含有编码狂犬病毒糖蛋白的序列的质粒DNA构建物pWS—RABIES

从含有狂犬病毒糖蛋白cDNA(Anilionis等，1982)的载体pKCV—10(Pharmacia)中，以BglII片段形式分离出编码狂犬病毒糖蛋白的序列，将其克隆至SV₄₀启动子下游BglII位点处。用BglI和BamHI酶切载体pWS2m。通过琼脂糖凝胶电泳分离带有鼠IL—2CDNA的片段，并分离出载体pWS相应的片段与狂犬病毒片段连接。通过测定序列确定了狂犬病毒片段的正确方向。SEQID No：1列出了狂犬病毒糖蛋白的序列。

v)含有鼠(GM—CSF编码序列的质粒DNA构建物pWS—Gm。用SalI，BamHI酶切i)中所述质粒pWS2，用琼脂糖凝胶电泳分离得到白细胞介素2编码片段。采用12种互相重叠的寡核苷酸全合成制备得到编码鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的DNA。所川的序列相应于 Moyatake等1985描述的序列(编码区从第32位至457位)，只是178位(A代替G)、274位(C代替G)和335位(C代替G)的沉然基因交换。此外AGC(446位到448位)被GTC替代。5’—端为SalI可配对粘性末端，而3’—端为BamHI可配对粘性末端。在质粒pWS2中，于5’—端加上白细胞介素2类似序列GCCGCC。通过“鸟枪”克隆方法(Sambrook，1989)将合成的GM—CSF基因克隆至载体pWS2并测序。序列分析表明的误差可以采用硫代磷酸酯方法(Amer—Sham试剂盒)控制突变来校正。

vi)含有人白细胞介素2的编码序列的DNA质粒pGshIL—2tet。

一种含有CMV增强子/启动子白细胞介素2编码序列和SV₄₀—PolyA序列的白细胞介素2“盒”(Cassette)，可以以i)中所述pWS2载体为基础，进行PCR获得。采用ECoRI酶切PCR产物，并克隆至质粒PUC19(Pharmacia)的ECoRI/SmaI位点，得到的质粒命名为pGShIL—2。四环素抗性基因和β—内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性基因)的上游部分来源于质粒pBR327(Soheron等1980)。用SspI和AVaI酶切该质粒。和ECoRI/AVaI连接物一起，将分离得到的四环素抗性基因序列克隆至pGShIl—2的ECoRI/SspI位点。对克隆pGShIL—2tet/anp的IL—2盒进行了序列测定；用Eam11051和SspI切下抗氨苄青霉素的序列，质粒再连接，得到的质粒命名为pGhIL—2tet。

vii)报道质粒构物建pCMVL

从质粒pSTCX556去掉BamHI***部分，再用Klenow大片段酶处理质粒，并且采用HindIII/SspI和Klenow大片段酶处理的pRSVC质粒的片段(含有Photinus Pyralis的荧光素酶基因，该基因受到劳斯肉瘤病毒的LTR增强子/启动子的控制)，得到质粒pCMV(Severne等1988)。此报道质粒命名为pCMVL。

b)制备转铁蛋白—聚赖氨酸偶联物

为了合成转铁蛋白与链长为290赖氨酸基团的聚赖氨酸的偶联物，采用了Wagner等人1991b报道的方法。

c)制备表皮生长因子—聚赖氨酸偶联物

采用凝胶过滤(Sephadex G10)，用HBS为洗脱液纯化了1mg表皮生长因子(Sigma St Louis目录NOE—4127)。在1.5ml HBS中的135nmol(0.8mg)的表皮生长因子用15mM SPDP(1.2μmol)乙醇溶液进行处理。室温下2小时后，改造过的蛋白质进行Sephaden G—10凝胶过滤柱层析，得到了70nmol已经用二巯基吡啶连接物改造过的表皮生长因子。改造过的蛋白质与3—巯基丙内酯修饰的聚赖氨酸(50nmol，平均链长290赖氨酸单体，用巯基丙内酯连接物已进行改造)在充满氩气条件下，于总体积1ml的HBS中反应。采用SephadlexG75进行凝胶渗透柱层析(pharmacia)分离偶联物(缓冲液：0.5MNaCl)。产物流份中含有由20nmol抗生蛋白链菌素和25nmol聚赖氨组成的偶联物。

d)制备抗生蛋白链菌素—聚赖氨酸偶联物。

采用Wager等1990年报道和EP—A1388758所叙的制备转铁蛋白—聚赖氨酸偶联物的方法进行抗生蛋白链菌素和聚赖氨酸的偶联。

溶在1ml 200mM HEPES PH7.9和300mMNacl溶液中的79nmol(4.7mg)抗生蛋白链菌素用15mM SPDP(236nmol)乙醇液进行处理。在室温下1.5小时后，改造过的蛋白质进行SephadexG25柱层析，得到了经196nmol二巯基吡啶连接物改造的75nmol抗生蛋白链菌素。改造过的蛋白与3—巯基丙内酯改造的聚赖氨酸(75nmol，平均链长290赖氨酸单体，用190nmol巯基丙内酯连接物改造过)，在氩气氛下，于由100mMHEPES PH7.9，150mM NaCl构成的2.6ml溶液中反应。采用Mono SHR5柱(pharmacia)进行阳离子交换柱层析分离偶联物(梯度：20—100％缓冲液，缓冲液A：50mM HEPES PH7.9；缓冲液B：缓冲液A加3MNaCl)。在盐浓度1.2M—1.7M洗脱下产物部分，对HBS(20mM HEPES PH7.3 150mM NaCl)进行透析，得到一种由456nmol抗生蛋白链菌素和53nmol聚赖氨酸构成的偶联物。

e)制备生物素标记的失活的腺病毒

i)制备dl312腺病毒

采和由Johnes和Shenk 1979年报道的，在EIa区缺失的腺病毒株dl312。用EIa反式互补的细胞株293进行病毒复制，采用Davidson和Hassell 1987年报道的方法进行大量制备。将提纯的病毒保存于缓冲液中(100mM Tris，PH8.0，100mM Nacl，0.1％BSA，50％甘油)或保存于HBS/40％甘油中，溶液等份保存于—70℃。采用紫外分光光度法分析提取的基因组病毒DNA，确定病毒浓度(公式：一个光密度单位(OD，A₂₆₀)相当于10¹²病毒颗粒/ml；(Chardonnet和Dales 1970))。

ii)制备腺病毒dl1014

在W162细胞株中，培养由Bridge和Ketner报道的腺病毒dl1014，这种细胞株来自于Vero细胞株(ATCC No ecl81)，按照Wein berg和Ketner1983年报道方法进行制备。按照有关dl312的方法，进行大量制备、纯化和测量病毒浓度。

iii)生物素标记腺病毒

2.4ml凝胶过滤(Sephadex G25 PD10 Pharmacia)提纯的腺病毒dl312(大约10¹¹颗粒)在150mM NaCl/5mM HEPES，Ph7.9/10％甘油中的溶液，和10μl(10nmol)1mM NHS—LC—生物素(Pierce 21335)的溶液混合。3小时后在环境温度下，通过凝胶过滤(如上)方法，将生物素标记的病毒和过量的试剂分开。加入甘油(总体积3.2ml)使溶液甘油浓度达到40％，保存于—25℃。逐滴加不同稀释度溶液至亚硝基纤维素膜上后，可以定量测定生物素标记病毒：在真空干燥器中80℃烘干2小时，用牛血清清蛋白进行封闭，和偶联有抗生蛋白链菌素的碱性磷酸酯酶(BRL)一起保温，洗涤并和显影液NBT/X—磷酸盐(硝基兰四毒盐/5—溴—4—氯—3吲哚磷酸盐，甲苯胺盐，Boehringer，Mannheim)，一起保温1小时，可以观察到反应阳性颜色。

在腺病毒dl1014的生物素标记中，所用起始材料是用150μl1mM NHS—LC—生物素处理过的15ml腺病毒制品(每ml1.2×10¹²颗粒)。环境温度下3小时后，将混合液对1升HBS加40％甘油液4℃透析过夜，然后用新鲜缓冲液换出原缓冲液进行第二次透析。得到的病毒制品滴度大约为每毫升1.2×10¹²颗粒。

iv)用8—甲氧基补骨脂素失活生物素标记的腺病毒

将200μl生物素病毒制品置于1.6cm组织平板的两个孔中，加入2μl(33mg/ml)8—甲氧基补骨脂素(Sigma，目录号NOM—3501，溶于DMSO中)至每个样品，将平板置于冰上用紫外灯照射10分钟(365nm，UVP TL—33灯)，样品和滤片距离4cm。照射后，合并两个样品，进行凝胶过滤(G50，Nick柱Pharmacia)，柱子预先已用40％甘油HBS溶液平衡过。

用40μl8—甲氧基补骨脂素(33μg/μl，DMSO)与4ml病毒液(1×10¹²颗粒)合并，可以使生物素标记的腺病毒dl1014失活。在环境温度下，于12×300μl培养平板放置样品1小时，按上叙那样，置冰水上，紫外照射25分钟。用G—25 PD10柱子进行凝胶过滤(分两批)，以HBS/40％甘油洗脱，获得4.5ml病毒制品，其滴度为每ml9.4×10¹¹颗粒。

f)制备转染复合物

分三步制备三元复合物。第一阶段在100μlHBS中的生物素标记腺病毒同100μlHBS溶液中的抗生蛋白链菌素聚赖氨酸(Streptpl)混合，在环境温度下，保温30分钟。加入溶于150μlHBS溶液中的6μg质粒DNA，充分混合，再继续保温30分钟。最后加入溶于150μlHBS中的聚赖氨酸—改造的人转铁蛋白(TfPL)，进行充分混合，继续保温30分钟。(腺病毒、StreptpL和Tfpl的量如不同实施例中所述)。考虑到最终复合物电中性，要计算质粒DNA和聚赖氨酸偶联物的比例。进行转染时，要将复合物加至细胞中，总体积为2ml不合Fcs的培养液。37℃保温4小时后，倒掉培养液，加入含有血清的新鲜培养液。

g)细胞素培养液

i)鼠黑色和瘤细胞

鼠黑色素瘤细胞株Cloudman S91(克隆M3)得自ATCC(No.CCL53.1)。细胞培养于6cm用0.1％明胶包被的塑料平血或T25培养皿中的Ham’sF10培养液中，培养基中含有12.5％马血清，2.5％FCS，2mM谷氨酰胺和抗生素。

ii)鼠成纤维细胞

初生鼠成纤维细胞从DBA/2小鼠中，按下列步骤分离出来。断颈杀死4周DBA/2小鼠，浸于70％乙醇。在消毒情况下，从后肢剥除肌肉，并用PBS洗涤。将标本切成小于2mm片状，倒掉多余的PBS。用5ml含有0.25％胰蛋白酶(来自猪胰脏，Signa目录NO.T—2904)，0.1％胶原酶(X1型，Signma目录C—9407)，0.1％牛血清清蛋白(第V部分，Behringer Mammheim，目录No.735094)的PBS溶液洗涤组织碎片3次，倾斜放置，37℃保温30分钟。将组织碎片沉降5分钟，有游离细胞的上清液与5ml含20％Fcs的DMEM混合。非解离的物质再降解30分钟，按前述收集上清液。重复该步骤直到所有材料解离。合并上清液，在500×g离心15分钟，将细胞悬浮于含20％FCS的DMEM溶液，再将细胞转种至培养皿。30分钟后，非粘附的细胞被滤去，加入新鲜培养液。

iii)人黑色素瘤细胞

初生人黑色素瘤细胞是从手术切除的黑色素瘤中分离出来的。在含有5％FCS，2mM谷胺酰胺和抗生素的RPMI1640培养液中，用机械力将瘤块切碎(用镊子和外科刀)。利用注射器的活塞使组织碎块通过金属筛。通过离心和再悬浮将材料洗涤若干次，将游离的细胞种入T25细胞培养皿中。

iv)人成纤维细胞

手术切除后，将皮肤组织置于含有10％FCS，2mM谷胺酰胺和抗生素(青霉素/链霉素，或在人成纤维细胞情况下，加庆大霉素)的4℃DEME中。在层流空气流下，在6cm消毒塑料培养皿中，将活组织用镊子和手术刀在一组织培养装置中切碎。加入3ml含有20％FCS，2mM谷胺酰胺和抗生素的DMEM，置于37℃保温箱内培养。10天后，用含10％FcCS的DMEM置换培养液，然后每星期换2次培养液。从培养开始4周后，从组织碎片中长出来的细胞用胰蛋白酶水解，为了转染，转入新的组织培养皿中。

一种可替代的优选方法是，在切除后，将片状皮肤放至新鲜培养液中，需要时用培养液洗涤1—2次。5—10片组织置于一个T25组织培养皿中，其表面用加有10％FCS的DMEM湿润，均匀分布，然后旋转平皿，使得活组织落下来(“悬降离心”此方法由Johes，1989年描述。)。在恒温箱37℃培养1—3小时后，再旋转平皿，并加入1—2ml培养液。24小时后，任何固定的活组织可以达到5ml；或重复本步骤。6—10天后，首批成纤细胞长了出来，从此时起，每周换一次培养液，一旦细胞连片生长，便将其转入另一T25平皿中。

V)KB细胞

从ATCC(NO.CCL17)可以得到人皮肤癌细胞株KB，将细胞培养于6cm塑料平皿中，培养液MEM含有10％FCS，2mM谷胺酰胺和抗生素。

h)测定基因表达

i)荧光素酶的测定

制备细胞提取物、蛋白质含量标准化和荧光素酶活性测定按照Enke等1990；Cotten等1990在EP388 758中所叙方法进行。

ii)白细胞介素2的测定

采用Kamsuyama和Mclchers1988年报道的生物检测方法测定白细胞介素2的表达。此外根据制造商的建议步骤，采用Becton DickinsonIL—2 ELISA试剂盒(目录No.30032)进行白细胞介素2的产生实验。

iii)干扰素γ的测定

采用IFN—γELISA Intertest—8”(Genzyml目录1577—00)试剂盒进行鼠干扰素γ表达研究。

iv)GM—CSF的测定

采用商业化ELISA(Eudogen)试剂盒测定GM—CSF的表达量。

J)检测复合物组分

为了检验对于配体内在化质量或DNA构建物的效力之实验的预测质量，在初步实验中对不同病毒制品进行了转染实验。实验表明，采用dl312得到的结果可以用于补骨脂素/紫外照射失活的腺病毒dl312和(补骨脂素/紫外失活的)腺病毒dl1014。因此，在某些实验中，可以以dl312为代表。

实施例1

基因转入初生人黑色素瘤培养细胞

从两个不同病人(HMM—1和HMM—2)分离得到的初生人黑色素瘤细胞从开始培养后以不同时间用含有下列成份的复合物进行了转染：1.7×10¹⁰腺病毒颗粒dl312，100ng streptpL，6μgpCMVL—DNA，7μgTfpL。转染24小时后，测定荧光素的表达。以1×10⁶细胞裂解物蛋白质含量为基础，进行表达标准化。这些转染实验的结果示于图1中。

实施例2；

测定与转基因复合物的摄入有关的配体

名为HMM—1的初生人黑色素瘤细胞分离物，在开始培养2周后，用1.7×10¹⁰腺病毒颗粒，100ng streptpL，6μgpCMVL—DNA和7μgTfpL进行转染。与此平行，采和加冰的50mM转铁蛋白作为TpfpL DNA腺病毒复合物内在化的竞争进行转染。可以用作偶联的PL(PL)替代TfpL制备转染复合物改变实验条件。实验的结果已列于图2中。已发现加入游离转铁蛋白会降低荧光素酶的表达，从另一方面看，至少有一部分与转铁蛋白受体结合而摄入。但是在存在游离转铁蛋白情况下，可以看到更明显的基因表达，这说明，与腺病毒受体的结合也起了主要作用。

实施例3

用补骨脂素/紫外失活腺病毒dl312对转染的补生人黑色素瘤细胞长期细胞毒性的影响。

采用由1.2×10¹⁰腺病毒颗粒dl312，1200ng Streptpl，6μgpCMVL和6.6μg TfPl或者7.5×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl312颗粒(dl312PI)，600ng StreptpL，6μgpCMVL和6.6μgTfpL(StreptpL对于多种病毒的最适量已在初步实验中经过滴定测定)组成的复合物，在6cm培养皿中转染3×10⁵HMM—1初生黑色素瘤细胞。转染后1天3天和7天测定每3×10⁵细胞的荧光素酶的表达。8—甲氧补骨脂素/紫外失活作用对基因表达的影响见图3。转染7天后，基因表达明显下降，这和培养细胞的严重病变有关。用8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒转染细胞会显著降低细胞病变，并且在第7天会导致比用未失活病毒转染表达值高10倍。

实施例4

确定腺病毒的长期细胞毒性

从一种恶性黑色素瘤来源的成纤维细胞用或含有腺病毒dl312、8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl312或含有腺病毒dl1014的组合复合物转染。

用含有下列成份的复合物转染细胞：6μgpCMVL—DNA，0.8μg StreptpL，6.8μgTfpL和20μl腺病毒dl312制品(每毫升含0.25×10¹²病毒颗粒)或者40μl8—甲氧基补骨脂素/UV失活的腺病毒dl312制品(0.13×10¹²病毒颗粒/ml)或者3μl腺病毒dl1014制品(4.1×10¹²病毒颗粒/ml)。为了得到如图4说明的病毒∶细胞比，将100μl等份混合液，或经过g系列1∶3稀释的这种混合液加在细胞培养板(每板24孔)上每孔的细胞中，每孔在500μlRPMI＋2％FCS培养液中含细胞量为3×10⁴。37℃保温培养2小时后，用2ml RPMI＋10％FCS换培养液。8天后，移去培养液，将细胞用4％甲醛和150mM NaCl固定5分钟，再用溶于2％乙醇的0.1％结晶紫染色10分钟。用PBS洗涤2次，再用水洗1次照相。细胞毒性实验结果见图4：病毒对细胞标准比例为10000∶1，腺病毒dl312是有细胞毒的；用补骨脂素/紫外处理病毒可以减弱细胞毒。用同样量的腺病毒dl1014对细胞没有细胞毒作用。

实施例5

照射肿瘤细胞对基因表达的影响

用含有3×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl1014颗粒，600ng StreptpL，6μg pEMVL和6.8μgTfpL处理3×10⁵名为HMM—5的初生人黑色素瘤细胞或鼠的黑色素瘤株M—3。在转染6小时后，用剂量0—100Gy照射细胞。照射后48小时，测定转染荧光素酶基因的表达。图5所示值表明，在细胞裂解物中，每微克蛋白中荧光素酶的表达(光单位)。

实施例6

质粒浓度对基因表达的影响

用含有8.6×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl1014颗粒，400ng StreptpL，6μgDNA和5.1μgTfpL的复合物转染3×10⁵M—3鼠黑色素瘤细胞，按不同比例结合的质粒(pCMVL/PSD＝pSP65 Boehringer Manheim；pSVZmu--IFN- γ；IFN—γ/pBCMGneo—mIL—2)构成转染复合物。质粒和基因表达值的比例见表I及图6(荧光素酶表达)和图7(干扰素γ/白细胞介素2)。

实施例7

转染的鼠黑色素瘤细胞丧失致癌作用

用2×10⁹腺病毒dl312颗粒，250ng StreptpL，6μg质粒DNA(含鼠白细胞介素2或鼠干扰素γ序列)和7.5μg TfpL转染M—3鼠黑色素瘤细胞(每一6cm培养皿3×10⁵细胞)。转染4小时后，用Ham’s F10无血清培养液洗涤细胞，然后将1×10⁵细胞皮下注射至6只麻醉的DBA/2鼠背部。作为对照，给另一组DBA/2鼠注射没有转染的1×10⁵M—3细胞。每周监测注射部位的肿瘤生长。图8表明了肿瘤的形成过程。

实施例8

用细胞因子转染的照射的瘤细胞免疫，诱导对黑素色素瘤的***免疫反应(预防性鼠模型)

a)用3×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外活化的腺病毒dl1014颗粒，6ng StreptpL，6μg白细胞介素2质粒DNA或不含***CDNA因而在转染细胞中不表达基因产物的pSP质粒和6.8μgTfpL转染M—3黑色素瘤细胞(每T25培养皿3×10⁵细胞)。转染4小时后，去掉转染复合物，加入含有血清的新鲜培养液。转染细胞用X—射线以剂量20Gy照射6小时，再培养18小时。转染24小时后，用胰蛋白酶处理细胞，用Earl｀s盐缓冲液(EBSS)洗涤2次。将细胞浓度调至1×10⁶/ml。用1×10⁵细胞免疫，给麻醉的DBA/2小鼠于背部皮下注射。与此平行，用照射过并用与转染细胞同样方法进一步处理的M—3非转染细胞免疫一组6只鼠，在第一次免疫一周后，用同第一次免疫相同的细胞制品对小鼠进行了加强免疫。再过一个星期，在远离前次免疫部位以高致癌剂量1×10⁵M—3细胞注射动物。此外，四只没有经过免疫的小鼠以同样方式注射了致癌细胞。在种入肿瘤8周后，所有(4/4)未免疫小鼠均生长了肿瘤，而所有用照射IL—2转染的M—3细胞免疫的小鼠没有长瘤(5只动物没有肿瘤)。用照射过非转染M—3细胞和照射过并转染空质粒(pSP)的M—3细胞转染处理的小鼠，则只有部分保护作用(6只鼠中4只长瘤)。动物长瘤情况见表II和图9。所得结果表明，用IL—2转染照射过的癌细胞免疫小鼠，诱导了全身性免疫反应，可以保护动物不会进一步长瘤。

b)在另外的实验中，按照同样的免疫程序对小鼠进行了处理，对M—3进行了照射，并用含下列成份的复合物进行了转染：3×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl1014颗粒，600ngStreptpL，a)6μgIL—2质粒pBCMGneo—mIL—2(IL—2100％)，b)5.4μgpSP质粒和0.6μgIL—2质粒(IL—20％)，c)5.4μgIL—2质粒和0.6ug干扰素γ质粒(IL—290％＋IFN—γ10％)或d)5.4μgpSP质粒和0.6μgIFN—γ质粒(IFN—γ10％)和4.7μgTfpL。此外一组鼠采用3.6×10⁹失活腺病毒dl312颗粒，600ng StreplpL，6μgIL—2质粒和4.7gTμgL(IL—2100％，d1312)转染并已照射过的M—3细胞进行免疫。一周后，用1×10⁵M—3细接种动物进行加强注射免疫动物。作为对照，也对非免疫动物进行了同样实验。肿瘤的发展情况已总结在表III中。

c)采用与前面实例相同的免疫步骤，用照射过的M—3细胞处理小鼠，该细胞已用含下列组分的复合物进行了转染：3×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外失活腺病毒颗粒dl1014，600ng StreptpL，a)6μgIL—2质粒＝100％IL—2，b)5.76ug pSP质粒和0.24ugIL—2质粒＝4％IL—2或c)6μgpSP质粒和4.7μgTfpL。转染照射细胞产生的IL—2，可以在免疫当天进行测定：已用100％IL—2质粒转染的M—3细胞，每1×10⁶细胞24小时产生33,000单位IL—2，而用4％IL—2质粒转染的细胞，在24小时，每1×10⁶细胞产生396单位IL—2。一周后，对免疫动物进行了加强免疫，注射1×10⁵M—3细胞，作为对照，在非免疫动物中也如此。为了获得更多有关采用不同量IL—2质粒免疫诱导免疫反应程度的信息，在另一组小鼠中分别种入3×10⁵M—3细胞和1×10⁶M—3细胞。为了证明免疫反应对肿瘤是特异的，将1×10⁵性细胞遗传的皮肤癌细胞KLN 205(ATCC NoCRL 1453)种入一组已用100％IL—2转染并照射过的M—3细胞免疫的小鼠中，肿瘤发展见表IV。

实施例9

基因转入一种表皮癌细胞株

KB—细胞在6cm培养皿中以400000细胞密度/6cm平皿进行培养，用多种复合物进行转染：复合物中含有2.5×10⁹腺病毒dl312颗粒，200ng StreptpL，6μgpCMVL—DNA，如需要3.8μg聚赖氨酸，3.8μgEGF—PL(基于聚赖氨酸的量)或6μgTfpL。复合物(每种500μl)与1.5ml含有或不含有2％FCS的培养液混合。在竞争性实验中，再加入1μgEGF复合物和培养基的混合液中。向细胞加入复合物和培养液的混合物。37℃培养2小时后，去掉培养液，加入含有血清的新鲜培养液。

24小时后，收集细胞，从荧光素酶实验获得下列结果(图10A：用2％FCS的实验；图10B：没有FCS的实验)：图10A用EGFPL，得到20845000光单位，这一数值大大高于TfpL的结果(3970000)或聚赖氨酸的结果(Plys10550000)。在用游离的EGF竞争实验中，和TfpL实验对比(TfpL＋EGF 12350000光单位)或聚赖氨酸(Plys＋EGF14055000)，发现所予想的信号降低(EGFPL＋EGF14150000)。这表明基因转移的加强是通过EGF受体的配体特异地进行的。在没有FCS的实验中，(图10B)，EGFPL作用更加明显(EGFPL 15150000，TfpL2000000，Plys5100000，EGFpL＋EGF 5900000光单位)。有50％细胞表达。

类似地，用含有5×10⁹8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl1014颗粒的复合物转染KB细胞，可以获得可以比较的荧光素酶表达值。

实施例10

采有不同载体表达IL—2

a)M—3细胞

用含于三元复合物中的各种构建质粒转染3×10⁵M—3细胞。3μl腺病毒dl312制品，0.3μl(大约200ng)StreptpL，6μgTfpL和6μg质粒DNA(BCMGneo—mIl—2，PWS2m，EMGneo—mIL—2或pCM2)用HBS补充至总体积500μl。

对于用8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒dl1014进行的实验，采用下列复合物：9μl病毒制品，600ngStreptpL，6μgTfpL和6μgBCMGneo—mIL—2。

根据图11的规定时间间隔，测定IL—2活性。以外，对于BCMGneo—mIL—2，48小时后为64000单位，28天后7128单位(图中未表示)。对于pCM2，48小时后活性为3227单位，28天后950单位。对于BMGneo—mIL—2 24小时后396单位，48小时后604单位，7天后297单位，14天后264单位(图中未示)。

b)成纤维细胞

用IL—2构建物按a)方法对初生成纤维细胞进行转染，如图12所示转染后天数测定IL—2表达。对质粒BCMGneo—mIL—2转染培养液组成和M—3细胞一样；对BMGneo—mIL—2转染复合物也相同。

实施例11

在黑色素瘤细胞表面表达HSA，刺激对抗非改造肿瘤细胞的保护性免疫反应。

将M3细胞培养于加有12.5％马血清，2.5％FCS的Ham｀sF12培养液中，置于用明胶覆盖的塑料培养皿。转染前24小时，将3×10⁵细胞种入25cm²培养并中。对于这一数量的细胞，总体积500μl的转染复合物组成为：9μl生物素标记8—甲氧补骨脂素/紫外失活的dl1014腺病毒(1.4×10¹²颗粒/ml)，5.2μg转铁蛋白聚赖氨酸，800ng抗生蛋白链菌素；聚赖氨酸和6μg结合的质粒DNA(pSP，pWS2m与pSP合并，pHSA同pSP或IL—2连接后同pHSA结合)。将上述500μl溶液加至每一培养瓶中的2ml含有12.5％马血清/2.5％FCS的Ham｀S F12培养液。37℃培养2小时后，用新鲜培养液置换原培养液，并照射(20Gy)细胞。转染24小时后，用胰蛋白酶处理细胞，用HBSS(Hank｀s盐缓冲液)洗涤两次，计数，以100,000细胞数量保存于100μlHBSS中。这些细胞构成可以在60分钟内注射受体鼠的疫苗。

如以上实施例方法注射小鼠。两次疫苗注射分别以100,000细胞数量，一个星期间隔注射于鼠背部不同部位。在第二次注射后一星期，于背部第三个位置注射300μlHBSS中的数目为300,000的未改造未照射的细胞。每周监测肿瘤的发展。

图13表明了这些实验的结果(x轴表示天数，y轴代表以立方毫米计算的肿瘤大小。在终点旁边的数目表示每组带肿瘤小鼠数目与鼠总数之比。pSP：6μgpSP；80IL—2/20pSP：4.8μgpWS2m加1.2μgpSP；20HSA/80pSP：1.2μgpHSA加4.8μgpSP；80IL—2/20HSA：4.8μgpWS2m加1.2μgpHSA)：用转染了空载体pSP照射过的M3细胞免疫不能提供抗肿瘤生长的保护作用；6只鼠中4只长出了明显的肿瘤块。在所有已经长有肿瘤的小鼠实验组内(3/3)产生IL—2的细胞仅有中等程度使肿瘤退化的作用。(这种作用可以归结于选择的实验条件，以检验HSA的有利作用，所用的小鼠注射了3倍剂量的肿瘤细胞，但降低了IL—2DNA剂量)。与此对比，用表达HSA的M3细胞免疫接种，小鼠显示出瘤生长显著受到抑制。无论用表达HSA或是IL—2的M3细胞免疫接种，小鼠瘤生长频率均显著降低了(6只中2只)，与对照组肿瘤大小(用pSP转染细免疫接种)相比肿瘤显著变小；对照1149mm³而接种实验组平均为18mm³。

实施例12：

表面表达狂犬病毒新抗原的黑色素瘤细胞刺激抗未改造瘤细胞的保护性免疫反应。

按实施例11处理和转染M3细胞。唯一区别在于转染复合物的作用时间，复合物完全按实施例11制备(6μg质粒DNA)，对细胞作用4小时而不是2小时。以类似于实施例11的方法注射小鼠只是注射时时间间隔从1周延长至2周外，且注射体积均为100μl。

图14表明了实验结果：图的结构类似于图13。pSP阴性对照表明了预想的肿瘤显著生长。阳性对照只有用pWS2m(＝100％IL—2)转染显示出全部保护；转染后24小时，和注射前转染细胞产生45000IL—2单位/10⁶细胞。对于只给予50％pWS2m(50％为空载体pSP)的实验组鼠，可以看到不完全的保护作用。如果取代空载体，共转染狂犬病表达质粒pWS—狂犬病毒则会有显著改进。在2—4周肿瘤轻度生长，从第五周起退化。

实施例13

比较失活腺病毒的方法

在本实例范围内采用了多种不同方法并比较病毒效价的降低和失活病毒通过受体介导的细胞摄粒作用加强基因转移的能力。通过实验观察哪种病毒基因是经过失活而被关闭的。

a)用8—甲氧补骨脂素失活病毒的实验

i)病毒的失活

将HBS/40％甘油中的生物素标记腺病毒dl1014样品(300μl)加至细胞培养板的4个孔中(Nunc，目录No.176740)。为了获得预想的最终浓度，将分为33mg/ml一份的8—甲氧补骨脂素的DMSO溶液加至病毒中。盖上平板，置于冰中。按e)iv)所叙方法，紫外照射25分钟，样品平板每10分钟改变一次位置，以避免有未照射部分。通过凝胶过滤除去未反应的补骨脂素：为了进行这一步骤，将病毒/补骨脂素样品(2ml)加至一根Pharmacia PD—10凝胶过滤柱上(已用30ml HBS/40％甘油予平衡过)。用0.5mlHBS/40％甘油洗涤样品，上样，用HBS/40％甘油洗脱病毒，弃去第一部分400μl，以后4ml按0.5ml分份收集。为了确定含病毒流份，进行了茚三酮实验，合并阳性流份，测定蛋白浓度，将病毒分份，冷冻保存于—70℃。

ii)滴定8—甲氧补骨脂素(CPE抗基因转移)

为了确定不影响病毒的转DNA能力，同时使病毒全部失活的最适补骨脂素的浓度，进行滴定。(报道表明，如果使用补骨脂素浓度接近于饱和，则失活作用差，在低浓度下较好，这可能是由于结晶从溶液中析出的原故，也可能是由于一种过滤效应，后种情况由于高浓度未结合化合物吸附紫外线照射，因此阻断了通过紫外对DNA结合物的活化作用)。

为了确定病毒滴度，采用W162细胞进行CPE实验(细胞病变实验，Precious和Russell1985)，这种细胞量为50000细胞/孔，培养于24孔板上。用加有2％热失活马血清的DMEM对样品进行了一系列稀释，稀释的病毒加至培养在500μlDMEM/2％加热失活马血清的细胞中。37℃培养2小时后更换新鲜DMEM/10％FCS培养液。37℃4—5天后，用甲醛固定细胞。结晶紫染色。

失活方法对基因转移的适用性，是采用将荧光素酶基因引入K562细胞(ATCC NoCCL243)的方法检验的。按照WO93/07283所叙，用结合的复合物转染，用9μl腺病毒dl1014(1.4×10¹²颗粒/ml)或用β—丙内酯13.5μl失活(9.3×10¹¹颗粒/ml)，800ng抗生蛋白链菌素—聚赖氨酸，6μgpCMNVL—DNA和5.2μg转铁蛋白—聚赖氨酸于500μlHBS溶液中(复合物按方法f叙述制备)。用W162细胞进行CPE实验。可以测定每种病毒制品的相对滴度。滴定结果见图15：图左边数字为病毒相对效价(实心三角)，图左边数字为荧光素酶光单位(空心方块)。X轴代表8—甲氧补骨脂素mg/ml浓度。发现用0.11mg/ml8—甲氧补骨脂素处理病毒会导致效价的下降和在初步实验中使用0.33mg/ml的效果没有区别。在这种浓度下，仍保持转移DNA的活性。在所用条件下，当8—甲氧补骨脂素浓度为0.033mg时，没有作用。(采用至斑实验比较敏感，图19表示0.11mg/ml和0.33mg/ml浓度8—甲氧补骨脂素作用下，病毒效价下降相当)。

b)用4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素失活腺病毒的实验。

i)失活病毒

加入低疏水性的补骨脂素衍生物4’—氨甲基—4，5’—三甲基补骨脂素；经过反应从而使单链RNA病毒和DNA病毒失活，并以5mg/ml浓度溶于水溶液中。从H.R.T获得4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素(目录No.6)，以5mg/ml溶于HBS中。将其等份加至病毒样品后，病毒被失活，并按8—甲氧补骨脂素同样方法提纯。

ii)4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素的滴定(CPE抗基因转移)。

完全按照a)ii)关于8—甲氧补骨脂素所叙方法进行滴定。滴定结果见图16。图左边数字表示病毒相对效价(实心三角)，同时图右边数字代表荧光素酶光单位(空心方块)。X轴代表4’—氨甲基—4，5’—8—三甲基补骨脂素μg/ml浓度。采用0.3和1mg/ml4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素建立条件使得效价至少降低5log，仍能有效地转移DNA。降低4—氨甲基—4，5’，8三甲基补骨脂素浓度(＜0.1mg/ml)只引起病毒效价中等程度降低。空斑实验(见图19)也表明，1.0和0.3mg/ml4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基有脂素降低病毒效价的作用和0.11及0.33mg/ml8—甲氧补骨脂素的效果没有区别。按照a)ii)方法确定失活病毒的转基因能力。此外，每种病毒制品的相对效价可以采用W162细胞进行CPE实验来确定。

c)β—丙内酯失活腺病毒实验

i)病毒失活

在加入10倍浓度β—丙内酯溶液前，将病毒样品置于PH7.9，0.3MHEPE中。使用前立即用HBS稀释，β—丙内酯(Sigma目录No.P5648)，制备β内酯浓溶液。对照实验表明，用0.3MHEPES PH7.9足以缓冲1％丙内酯的1％处理。在环境温度下，将丙内酯等份加至病毒缓冲液中，病毒样品保温4小时，使用前保存于—70℃或用于转染实验。

ii)滴定β—丙内酯(CPE抗转基因)

在环境温度下，用不同浓度β—丙内酯处理腺病毒4小时。实验按照补骨脂素衍生物一样进行。发现(图17)，用0.3％β—丙内酯处理，会导致病毒效价降低大约5log，同时未降低病毒转DNA活性。采用1％或高于这一浓度处理，会导致效价显著下降，但是转DNA活性也受影响。(图左数目表示相对病毒效价(实心三角)，同时，图右数目表示荧光素酶光单位(空心方块)，X轴表示β—丙内酯的百分浓度。)

iii)用若干种低浓度β—丙内酯处理后腺病毒的转基因能力。

在ii)中，采用0.3％和1％之间浓度的β—丙内酯处理后，转基因活性显著下降使研究者认识到，在低浓度下，主要对病毒核酸发生修饰作用，而在高浓度时，则开始修饰病毒壳蛋白和损伤病毒的核内体裂解作用。为了实验这种假设的可靠性，用不同低浓度(＜0.3％)β—丙内酯等份处理腺病毒，希望能够在不影响病毒蛋白情况下修饰病毒DNA。为此目的，先加入一次0.3％β—丙内酯处理病毒样品，再加2次0.3％β—丙内酯，三次0.2％β—丙内酯，四次0.15％β—丙内酯或一次加入1％β丙内酯。掺入f)中所述组合复合物中的这些病毒制品的转基因活性，用K562细胞进行实验：如图18所示，除了1％浓度外，其他浓度处理样品均导致转基因能力降低小于1log。用1％β—丙内脂处理下降大于2log。(样品1：非失活病毒蛋白，样品2：用0.11mg/ml 8—甲氧补骨脂素失活，样品3：用0.3％β—丙内酯失活，样品4：用0.3％β—丙内酯两次处理失活；样品5：用0.2％β—丙内酯三次处理失活；样品6：用0.15％β—丙内酯4次处理失活；样品7：用1％β—丙内酯失活。棒图边所示数目代表荧光素酶光单位。)

d)采用空斑实验测定失活腺病毒复制能力

i)比较用8—甲氧补骨脂素，β—丙内酯或4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素处理失活腺病毒dl1014的空斑实验：

空斑实验提供了对病毒复制能力更敏感的测定方法：为了产生感染细胞，要求渗透10—50病毒颗粒。然后以下所示的CPE实验测定了化学失活病毒引起病变细胞感染的能力，为了能在实验4天内检出，这要求至少10％靶细胞被感染。因此这种实验可以检测出50,000病毒颗粒。与此相比在最适条件下，采用空斑实验，可以检出单个空斑，这是由10—50病毒渗透的结果；因此，比CPE要敏感1000倍。

以下方法为本发明范围内进行的空斑实验：在实验开始前18小时，采用6孔培养板，于每孔中加入500,000W162细胞。倒去培养液，加入新鲜培养液(2％马血清/DMEM)和适量病毒稀释液，使病毒均匀分布于细胞上。37℃平板保温1.5小时，平均20分钟仔细斜放平板一次。同时加入2X琼脂糖溶液(2％(2g/100ml)的低胶凝温度的Seaplaque Agarose(FMC目录No.5010)，溶在5mMHEPES PH7.4溶液中，调PH后高压消毒25分钟)70℃加热，熔化琼脂糖后，在37℃平衡。用类似方法制备2XDMEM/10％FCS溶液(2倍浓度DMEM/2倍浓度青霉素/链霉素/2倍浓度谷胺酰胺/10％FCS(56℃，30分钟加热失活))。当细胞和病毒反应1.5小时后制备了每份50ml的覆盖层(在50ml Falcon管中，25ml2倍琼脂糖＋25ml2倍DHEM/10％FCS)。从培养板移去培养液/病毒溶液，于每孔中加入3.5ml覆盖液。平板在室温和不被搅动情况下，放置至少30分钟，以使在37℃保温前，琼脂糖凝固。在加入病毒后第6天，每孔中又加入另外2—3ml覆盖液。采用这一步骤，在第7—10天可以正常见到空斑。在感染14—18天后，对空斑进行计数。

采用空斑法对多种病毒制品进行的实验表明，用β—丙内酯处理(2×0.3％)会使病毒效价降低大约5log(图19：样品1：非活性病毒；样品2：用0.33ug/ml8—甲氧补骨脂素失活；样品3：用0.11μg/ml8—甲氧补骨脂素失活；样品4：用2×0.3％β—丙内酯失活，样品5；用0.28mg/ml4’—氧甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素失活；样品6：用0.83mg/ml4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素失活。棒图旁的指示数字为pfμ/ml)。无论是用8—甲氧补骨脂素处理(0.33或0.11mg/ml)还是4’—氨甲基—4，5’，8—三甲基补骨脂素处理(0.28或0.83mg/ml)，处理的腺病毒均未观察到空斑。采用非失活dl1014(1×10⁸pfu/ml)和补骨脂素失活样品间一种6log稀释因子，可以发现补骨脂素处理失活的样品，空斑形成单位(pfu)低于10²。而β—丙内酯失活的病毒可以实际观察到可计数的空斑频率。因此即使采用CPE实验来看，β—丙内酯失活与补骨脂素失活相当，而空斑实验则表明两类化合物的显著差别。

ii)比较用8—甲氧补骨脂素或不同β—丙内酯处理失活的腺病毒dl1014空斑实验。

以各种次数加入β—丙内酯(见图20)进行空斑实验，并与用0.11mg/ml8—甲氧补骨脂素失活的腺病毒相比较。(样品1：非失活病毒；样品2：用0.11μg/ml 8—甲氧补骨脂素失活，样品3：用0.3％β—丙内酯失活；样品4：两次用0.3％β—丙内酯失活；样品5：三次用0.2％β—丙内酯处理失活；样品6：4次用0.15％β—丙内酯失活；样品7：用1％β—丙内酯失活。棒边的数字为pfu/ml数)。图20所阐明的实验也表明在补骨脂素处理的样品中，病毒不明显。6.7×10⁸pfu/ml非失活dl1014和补骨脂素失活病毒之间的7log稀释因子表明，在补骨脂素处理失活的样品中存在有少于6.7×10¹pfμ。与此对比，有β—丙内酯处理的所有样品中，均发现有空斑，这相当于大约失活2log(0.3％β—丙内酯)至5log(2×0.3％β—丙内酯)。尽管1％β—丙内酯会导致转DNA活性下降，(图17)，但只导致病毒效价的中等程度下降，这支持下面这种假设：高浓度β—丙内酯主要是对蛋白修饰而不是对DNA修饰，因此对病毒核内体裂解(而进入病毒的能力的)作用要大于对病毒复制的作用。

e)失活病毒的基因表达

根据f)所述方法制备了不同组合复合物，其中含有最适量腺病毒dl312，8—甲氧基补骨素失活的dl312腺病毒dl1014，8—甲氧基补骨脂素失活的dl1014和β—丙内酯失活的dl1014。复合物在500μlHBS中含有大约1×10¹⁰病毒颗粒，800ng抗生蛋白链菌素聚赖氨酸，6μgpCMV—DNA和5.2μg转铁铁蛋白聚赖氨酸。在24孔板每孔中加入2ml复合物至K562细胞中(先在50μM脱铁胺/RPMI/10％FCS中培养24小时，再以250,000细胞/ml数量取出)。经过2小时培养后，用不含脱铁胺的新鲜培养液洗涤，48小时后，收集细胞，以采用三次转染合并物测定其荧光素酶活性或为了选择腺病毒基因进行RNA分析。

测量荧光素酶活性表明所有转染的表达量在同一数量级范围内。

i)Northern分析

采用Pae rataKul1988年叙述的方法进行RNA Northern分析。转染48小时后，用HBS洗涤3次并经一系列稀释达到30，000；10,000或3000细胞。采用一种96孔点样仪(Scheicher和Schuell)，将样品加至硝酸纤维膜上。然后在HBS溶液中，细胞用1％戊二醛固定，4℃，60分，然后加入蛋白酶K酶解(20μg/ml)，37℃，在HBS/0.1％SDS溶液中保温30分钟。滤膜然后采用Church缓冲液进行予杂交(0.5M磷酸钠，7％SDS，1mMEDTAPH8.0(65℃，5小时。再用标记的DNA探针在小体积Church缓冲液中进行保温(65℃过夜)。用2×SSC/0.1％SDS 65℃洗涤膜，每次洗后再用0.1×SSC0.1％SDS洗涤30分钟。放射性图经磷照像而显影。(P32)标记探针是从dl1014腺病毒序列的PCR产物制备的。使用根据Ad5，bp736—731(Ela1)和bp1119—1101(Ela2)合成的PCR引物，制备得到了Ela探针(383碱基对)。(这种序列是dl312缺失的区域。作为对照，dl312样品中应没有RNA信号，而dl1014样品中有信号，因为后一种病毒具有野生型E1—区)。采用极强表达基因E3、19K糖蛋白基因(Goooling 1972)制备了E3探针，根据Ad5 bp28722—28737(E3a)、和29157—29142(E3b)序列合成引物(E3表达似对转染细胞的免疫反应中起重要作用，因为E3基因中至少两种调节MHCI类分子以及TNF受体分子在感染细胞表面的表达)。PCR反应后，用低熔点琼脂糖糖凝胶电泳TAE缓冲液纯化产物。从凝胶上切下需要的DNA片段，称重，置于1.3ml/克胶片段的水中。将凝胶片段置于水中加热至95℃10分钟，10μl所得溶液在环境温度下，用随机引物方法进行同位素标记12小时(Feinlerg和Vegelstein 1984)。在有醋酸铵和tRNA的情况下，酒精沉淀，提纯标记DAN。

图21表示了放射自显影结果：发现，对于dl312样品，无论非失活和用8—甲氧补骨脂素失活的病毒均没有Ela表达作用。对于非失活dl1014病毒Ela有强表达，但是对于用8—甲氧补骨脂素处理的病毒和用0.3％β—丙内酯两次处理失活的病毒则完全失去表达。对于非失活dl312腺病毒，E3表达比dl1014低。这种结果符合于Ela作为E3和其他早期基因表达正调节功能的看法(Nevins1991和1992)。在每一种情况下，用8—甲氧补骨脂素或β—丙内酯的失活作用完全阻断了这些基因的RNA合成。

ii)反转录PCR分析

采用非活化腺病毒dl1014或8—甲氧补骨脂素失活的dl1014，根据上述实施例中所述方法进行了转染的细胞为原材料。在两种转染情况下，采用同量病毒。用1×10⁶转染的M3细胞纯化RNA，转染后24小时，加入PBS收集细胞；置于Eppendorf离心管内简单离心，收集细胞。将细胞片溶于1mlTrisolv中(＝酚/硫氰胍的单相溶液；Biotecx)，振荡混合。加入氯仿(500μl)形成两相，水相中含有细胞RAN。加入等体积异丙醇，从水相中沉淀出RNA，离心收集沉淀，用80％乙醇洗涤细胞碎片，再溶于20μl去RNA酶的水中。RNA样品中污染的DNA可以采用无RNA酶的DNA酶除去(Boehringer Mannheim.37℃60分)。进一步在95℃加热5分钟，使DNA酶失活。

反转录反应液中含有10μlRNA溶液，2μl10mM dNTPs，4μl25mM MgCl₂，2μl10×RT缓冲液(100mM Tris·Hcl，900mM KCl，PH8.3)，1μl50μM寡核苷酸d(D)16，1μl20单位/μlRNA酶抑制剂(Perkin Elmer)和1μlMuLV逆转录酶(PerkinElmer)。反转录反应在25℃进行10分钟，42℃15分钟，然后在95℃5分钟以失活逆转录酶。

所采用引物相应于腺病毒5基因组的下列部位：

Ela上游(up)：碱基对1228—1248，

Ela下游(down)：碱基对1545—1526，

E₃上游：碱基对28722—28737，E₃下游：碱基对29157—29140。

聚合酶链反应混合物中含有35μl水，5μlPCR缓冲液(100mMTris，HCl，PH8.9，1MKCl，15mM MgCl₂)，1μl10mM dNTPs，1μl左右引物(25mM)，0.5μlTaq聚合酶(5单位/μ1 BoehrirngeMannheim)和6.5μl稀释的cDNA样品，(RNA作为对照反应)。样品在95℃变性90秒然后95℃ 30秒，60℃ 60秒，72℃ 30秒，循环35次，最后72℃延伸3分钟。DNA扩增产物用2％琼脂糖TAE凝胶电泳分离，以溴化乙锭染色，可以进行观察。图22显示了对于非失活腺病毒，无论从Ela还是E3区都可以看到PCR扩增产物，在1∶100稀释靶核酸情况下(见图上面表)可以检出信号。与此对比，对于补骨脂素失活的病毒，没有信号被检出，在没有发生逆转录酶反应的对照样品中，没有PCR信号，这表明观察的信号是由于RNA扩增而不是来自于核酸制品中污染的腺病毒DNA。

f)分析8—甲氧补骨脂素与腺病毒基因组的结合

i)定量测定8—甲氧补骨脂素与腺病毒基因组的结合

干燥0.41mlH³-标记的8—甲氧补骨脂素(0.8毫居/ml)，溶于20μlDMSO和8.7μl未标记8—甲氧补骨脂素混合(33μg/μlDMSO)。将混合物液加至生物素标记的腺病素dl1014。用如前所述进行紫外照射和PD—10层析纯化。采用液体闪烁计数器对纯化病毒计数测定掺入的H³—8—甲氧补骨脂素。根据所测放射性活性计算的掺入DNA的放射性活性表明，在病毒每800碱基对中有一个补骨脂素分子。比外通过薄层层析分析表明(硅胶，用二氯甲烷为溶剂)，在样品中没有未反应的8—甲氧补骨脂素存在。

ii)研究8—甲氧补骨脂素在病毒基因组存在位置

为了了解8—甲氧补骨脂素是分布于整个病毒基因组还是集中于病毒DNA的特定位置，提纯了病毒DNA，用限制性内切酶酶切以得到10—11个DNA片段：以H³—8—甲氧补骨脂素标记的病毒，将病毒与0.4％SDS/0.4mg/ml蛋白酶K56℃保温45分钟，提纯DNA。用酚/氯仿(1∶1)提取样品2次，氯仿再提取一次，加入1/10体积PH5.0的3M醋酸钠和0.54体积异丙醇，将DNA从水相中沉淀出来。离心沉淀的DNA，用冷却的80％乙醇洗涤2次，空气中干燥，溶于TE缓冲液。将非失活腺病毒DNA或H³—8—甲氧补骨脂素标记的腺病毒DNA等份按厂商指示方法，用限制性内切酶HindIII或Asp718进行酶切(Boehringer，Mannheim)，但用10倍过量酶酶切，以酚/氯仿和氯仿提取，用乙醇沉淀，在溴化乙锭存在的条件下以0.9％琼脂糖/TAE凝胶电泳进行分离纯化(Sambrook等1991)。将凝胶抽干，用荧光闪烁液浸渍(Enhance，Amersham)，然后再和X—光片放置在一起显影。图23表明了用溴化乙锭和荧光剂染色的凝胶；标记图表明H³—8—甲氧补骨脂素是分布于整个基因组的。少数例外的是，Asp718或HindIII酶切片段标记强度和其长度成正比。位于靠基因组末端部分的两个HindIII片段具有较强标记。与此相比，在基因组类似位置Asp718片段并未表现出这种优先的标记。总之，8—甲氧补骨脂素交联均匀分布于病毒基因组。

实施例14

测定失活瘤细胞的放射性剂量

在6个组织培养瓶(T75)中含有20ml正常培养液中6×10⁵人黑色素瘤细胞。在一天后分别用5，10，20，25，50，75或100Gy照射，另外6瓶细胞不照射。所用仪器是Gammacell 40，No126，B(u)型(Nordian International INC造)，具有两个Cs137γ，可以产生约72.5Gy/小时。照射6天后，每组中一瓶的细胞用胰蛋白酶处理、离心取出沉淀物。100μl细胞悬浮液和台盼兰混合，在计数器中计数。余下的细胞和新鲜培养液混合，倒入新培养瓶(第一次传代)。一周后，重复上述步骤，每组中一瓶用胰蛋白酶酶解并计数，第一次传代细胞作为对照也进行记数。未照射细胞和用5Gy照射过的细胞生长显著。再经过一周后重复上述步骤，6周后结束实验。用计数最高的细胞作生长曲线(在原瓶或对照瓶)。从20Gy照射剂量起，原瓶和对照瓶均无细胞生长。用10Gy照射，原瓶中可以看到细胞生长。图24表明了生长曲线。根据三种黑色素瘤培养细胞得到的数值，可以认为100Gy对所有实验为安全剂量。

实施例15

采用PCR反应在体内检测质粒DNA和腺病毒DNA

下列方法用于本实施例：

注射肿瘤疫苗

采用如实施例8c)所述的腺病毒转铁蛋白方法，以重组小鼠白细胞介素2质粒转染M3黑色素瘤细胞。24小时后，测定细胞因子表达量(24小时每百万细胞，白细胞介素2活性为20,000—50,000单位)。用胰蛋白酶酶解细胞，以无血清培养液洗涤之，并调节使每100μl等渗盐溶液中含有3×10⁵或1×10⁶细胞浓度。采用插管法将100μl细胞悬液皮下注射至DBA/2鼠右腹侧(见实例7和8)。

提纯组织样品：

注射小鼠后，在不同时间杀死动物。取注射部位和不同组织样品，用机械方法研碎。与蛋白酶K缓冲液(50mM Tris·Hci，100MNaCl，100mMEDTA，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K)55℃保温过夜。然后用酚/氯仿提取DNA并用0.5体积异丙醇沉淀。含有全部细胞DNA的样品用70％酒精洗涤，并加至TE缓冲液中。

为了提纯外周单核血细胞(PMBC)，进行了心脏穿刺。将血液和柠檬酸缓冲液(10mM)混合，然后采用聚蔗糖(Ficoll)梯度分离。再用蛋白酶K缓冲液酶解PMBC。按前述方法提纯DNA。

聚合酶链反应：

反应混合物中含有1μgDNA，1×PCR缓冲液(Boehringer，Mannheim)，终浓度mM的脱氧核苷酸，3单位Taq聚合酶(Boeringer Mannheim和25Pmol特异引物。在进行白细胞介素2(IL—2)质粒扩增时，加入1000拷贝的内对照。PCR反应时间为95℃变性5分钟，接着于94℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟进行40次循环。然后将扩增产物和样品缓冲液混合，并用2％琼脂糖凝胶电泳分离。特异引物序列如下：

IL—2上游(99—122)(SEQ ID No：3)

GTCAACAGCGCACCACTTCAAGC

IL—2下游(位置548—526)(SEQ ID No：4)

GCTTGTTGAGATGATGCTTTGACA

腺病毒上游(位置1228—1248)(SEQ ID No：5)

GGTCCTGTGTCTGAACCTGAG

腺病毒下游(1545—1525)(SEQ ID No：6)

TTATGGCCTGGGGCGTTTACA

(在测序过程中，由于程序原因，采用的合成寡核苷酸缩写名为“CDNS”于所有分子类型以“5’uTR”为关键字。)根据实验，检测扩增产物的检测限是200—1000拷贝。

a)为了在注射疫苗后不同时间检测注射部位重组IL—2DNA和腺病毒dl1014 DNA，九只DBA/2小鼠，每只用3×10⁵IL—2质粒转染的M3黑色素瘤细胞免疫。在1，2和5天后，杀死3只小鼠，切下免疫部分组织。PCR分析表明，仅2天后，IL—2DNA已经明显分解，5天后，便检测不出这种DNA。类似的实验中，注射五天后，在一只动物注射部位仍可检出IL—2质粒DNA。采用腺病毒特异引物的PCR反应中，第一和第二天可以检出腺病毒DNA，但第五天消失。

b)为了在接种肿瘤疫苗24小时和48小时后从外周单核血细胞中检测IL—2DNA和腺病毒dl1014DNA，用1×10⁶IL—2质粒转染的M3黑色素瘤细胞免疫12只小鼠。在24和48小时后，这段时间注射部位M3细胞大量破裂，杀死6只鼠，取血样。PCR分析表明，在这两个时间，血中检测不出特有的IL—2 DNA或腺病毒DNA。

c)为了检测不同器官组织样品中IL—2 DNA和腺病毒dl1014 DNA，用1×10⁶IL—2质粒转染的M3黑色素瘤细胞免疫6只DBA/2小鼠。在24和48小时杀死3只动物。从注射部位、远离此部位的***、脾、肾、肝、结肠和卵巢取组织样品。只有注射部位可以检出特有的扩增产物。所有实验的组织均为阴性结果。

d)为了排除重组IL—2DNA进入生殖细胞的可能性，分别用1x10⁶IL—2质粒转染的M3黑色素瘤细胞免疫6只雌性和6只雄性DBA/2鼠。在24和48小时后，杀死雌鼠3只，雄鼠3只，分离出生殖细胞。PCR结果表明，DNA不转入生殖细胞。

实施例16

a)试验肿瘤疫苗，对于抗转移的保护作用(治疗鼠模型)

在本实施例中，考虑到使用的转染复合物，采用实施例8同样的步骤培养细胞和进行转染。所有动物均为C57BL/6J品种，每组用8只动物。采用的黑色素瘤细胞为B16—F10，与所用动物品种同源。(NIH，DCT Tumor Depository；Fidder等1975)。

在第一天静脉注射1×10⁵活B16—F10细胞至实验动物，以形成转移。在第4，11和17天，皮下注射肿瘤疫苗，以达到抗转移免疫。

每次注射1×10⁵照射细胞。疫苗含有不同数量已由细胞因子质粒转染过的细胞(以下“转染细胞”表示已经转染处理的细胞；细胞因子表达值以每只鼠在24小时的值表示；所用术语见图25)：

1)对照：

a)只进行了照射的细胞(照射的)

b)用空载体pSP转染的照射过的细胞(空载体)

2)用IL—2质粒转染细胞：

a)100％转染细胞(表达：15,000单位：“IL—2高”)

b)20％转染细胞，80％非转染细胞(表达：3000—4000单位；“IL—2中等”)。

c)2％转染细胞；98％非转染细胞(表达：400单位，“IL—2低”)

3)用GM—CSF—质粒转染的细胞

a)100％转染细胞(表达500ng；“GM—CSF高”)

b)10％转染细胞，90％非转染细胞(表达：50ng；“GM—CSF中等”)

c)1％转染细胞，99％非转染细胞(表达5ng，“GM—CSF低”)

4)用IFN—γ、质粒转染细胞：

a)100％转染细胞(表达：1000ng，“IFN—γ高”)

b)10％转染细胞，90％非转染细胞(表达：100ng“IFN—γ中等”)

c)1％转染细胞，99％非转染细胞(表达：10ng，“IFN—γ低”)

在第28天，通过肉眼观察小鼠肿瘤的形成来分析肿瘤疫苗抗转移形成的保护作用。

结果列于图25。表明肿瘤疫苗发挥了转染基因的作用，而且依赖于基因表达水平。

b)试验肿瘤疫苗消除人工诱导“微转移”作用的能力

为了确定M3细胞致癌量，首先初步实验注射了1×10³或3×10³瘤黑色素瘤细胞后，确定导致在8周内50％小鼠长瘤和十周内全部动物长瘤的细胞数目。

在0天，给动物皮下注射5×10³活M3细胞；未转移的M3细胞可以看作是“微转移”。在1，2和5周后，对所有实验动物注射肿瘤疫苗。每只注射了肿瘤疫苗的鼠细胞因子IL—2表达量：第一次免疫为1020单位，第二次免疫为1870单位，第三次免疫为1400单位。对于GM—CSF，每次免疫每只鼠为14ng，9ng和22ng。实验组每组10只动物，第一组动物用已转有载体pWS2m并被照射过的1×10⁵M3细胞进行了免疫。第二组动物用已转染有质粒pWEGm并照射过的1×10⁵M3细胞免疫。第一对照组用已照射过，但是没有转染的1×10⁵M3细胞进行了处理。第二对照组作为肿瘤生长的对照，注射了5×10³M3细胞。在超过4个月的时间里，对动物进行了观察。发现在2组已注射细胞的实验组里，作为肿瘤疫苗的细胞因子V80％动物自动被保护不长肿瘤。在第一对照组里，所有动物在8周内长瘤。第二对照组除了一只外，所有动物均长瘤。

实施例17.

在预防小鼠模型中，肿瘤疫苗起细胞因子的给药作用，

在这一实施例中，考虑到所使用的转染复合物，采用了与实施例8相同步骤的细胞培养和转染方法。采用DBA/2小鼠和M₃黑色素瘤细胞。所用的细胞因子质粒与实施例16相同。按实施例8进行免疫，为了接种肿瘤(“攻击”)用3×10⁵细胞而不是用1×10⁵细胞。转染细胞和只照射过细胞的混合比例以及表达值和实施例16相当。在进行“攻击”后，对动物进行了8周肿瘤生长观察，这些实验结果见图26。

实施例18.

采用核内体裂解肽制备肿瘤疫苗。

a).合成肽INF5。

名为INF5(SEQID.No：7)的肽，是用20mg TentaGel S—PHB树脂(Rapp polymer；0.27mM/g)作为固相，采用HBTU活化方法合成的(Knorr等，1989，1mM)。第一个偶联的氨基酸是N—α—N—ε—Fmoc—赖氨酸。从而形成了以C末端赖氨酸为连接氨基酸的头对头二聚体。(采用下列侧链保护基团：(Trt)Asn，(Trt)Cys或(E—Bu)Cys，(t—Bu)Glu，(Trt)His，(t—Bu)Ser。用树脂裂解肽，10—20mg连有肽的树脂用1ml三氟乙酸/水/酚/硫代茴香醚/二巯基乙烷混合(10∶0.5∶0.75∶0.5∶0.25)在环境温度下处理1.5小时，除去了除(t—Bu)Cys外的所有侧链保护基。为了沉淀肽，用取样器取裂解混合物，在搅拌下逐滴加至40ml***中，混合液放置1小时，离心得到肽粗品。再用***洗涤，于氩气中干燥，最后在高真空中干燥。

b)采用INF5将基因转入人黑色素瘤细胞

i)表达荧光素酶报道基因

首先利用报道基因构建质粒pCMVL，进行初步实验。转染的复合物含有1.5μgTfpL290，5μgPL290，40μgINF5，和3μpCMVL。在这些复合物中，肽通过离子键与聚赖氨酸结合。DNA复合物同含10％FCS的0.5mlRPMI1640混合，并加入M3黑色素瘤细胞(在6孔平板上，1×10⁵细胞)。4小时后，换新鲜培养液。转染24小时后，收集细胞，研究其荧光素酶活性。检测出其表达相当于12,866,000光单位。

ii)表达人IL—2

由3μg pGShIL—2tet，1.5μgTfpL290，5μgPL290和40μgINF5构成的转染复合物，如i)所叙，加到黑色素瘤细胞中。转染后1—2天，用ELISA方法检测24小时内分泌至培养基的IL—2量(BiokineIL—2试剂盒，T—细胞诊断盒)。第一天为6500BRMP单位，第二天为11,500BRMP单位。1单位相当于40pgIL—2。

c)在预防黑色素瘤小鼠模型中，以INF5转染瘤细胞作为肿瘤疫苗的实验。

在本实验中，采用C57BL/6J品种小鼠和B16—F10细胞。每7天用1×10⁵细胞进行免疫；在最后免疫7天后，进行攻击(1×10⁵细胞)。用于制备肿瘤疫苗的转染复合物由6μgpWS—Gm—DNA，3μgTfpL，10μgPL和40μgINF5构成。所用肿瘤疫苗含有不同数量带有GM—CSF的质粒。照射并转染过的细胞和只照射过的细胞的比例同例16。含有用INF5转染细胞的肿瘤疫苗结果见图27。发现在中等和高剂量GM—CSF的情况下，具有抗肿瘤形成的保护作用。

实施例19

在人黑色素瘤细胞中表达白介素

手术切除一周后，在6cm细胞培养器中培养的3×10⁵黑色素瘤细胞用2ml转染复合物进行转染(0.5ml HBS原液含有生物素标记的8—甲氧补骨脂素/紫外失活腺病毒(0.54×10¹²颗粒/ml)100ng/μl抗生蛋白链菌素—聚赖氨酸，6μg质粒DNApGShIL—2tet和1μg/ml TfpL，用1.5ml培养液稀释)。用已照射过(100Gy)和未照射的细胞进行实验。经过如图28所规定的时间后，测定IL—2值；这是24小时内10⁶细胞的IL—2值。

实施例20.发展肿瘤疫苗的盖仑制剂

原材料为用质粒pGShIl—2tet转染并用100Gy照射过的MM3黑色素瘤细胞。在37℃20小时培养后，用胰蛋白酶处理细胞，采用台盼兰来测定细胞数和存活率。为了实验4种不同冷冻培养基，将细胞分为相同的四组。在和冷冻培养基混和前，以800rpm(120g)离心RPMI 1640培养液中的4种样品。将细胞沉片置于1ml冷冻培养基中。为了测定细胞数目和存活率，取出等份样品，并立即放至冷冻装置中，通过温度梯度程序(—1℃/分)冻至—100℃，并转至液氮中。试验用的冷冻培养基组分为：培养基1：70％RPMI，20％FCS，10％DMSO；培养基2：20％人血清清蛋白，10％DMSO：培养基3：12％HES(羟乙基淀粉)，Ringer溶液(Leopold Pharna No.2870)，5％DMSO；培养基4：12％HES，Ringer溶液。

38天后，融化细胞，然后立即用台盼兰测定细胞数目和存活率。第一次用相应培养基(没有DMSO的冷冻培养基)洗涤样品，第2，3次用Ringer溶液洗涤，然后离心再悬浮于Ringer溶液中。再测定一次细胞数目和存活率。此外，在4℃24小时和48小时后，再测细胞数目和存活率，这些结果见表V。

此外，从每一样品组(培养基1—4)取300μl样品和3ml完全培养基一起加至T25培养瓶中，37℃保温，24和48小时后，取出上清液，测定IL—2表达(培养基1样品组)，并测定上清液中细胞数目。原先置于4℃Ringer溶液中的其他样品，如上所述在24和48小时后，也取出300μl等份并如上所述于37℃培养(测定培养基1样品组IL—2)。这些实验的结果(“4°盖仑制剂”)见表VI。

实施例21

在初生黑色素瘤细胞中，DNA内毒素含量对IL—2表达的影响

在本实施例中采用下列材料和方法

a)制备DNA

过夜培养大肠杆菌(培养于含有5μg/ml四环素的LB培养基中)从中得到质粒pGSHIL—2tet

b)提纯内毒质素粒DNA(脂多糖)

i)Triton(曲拉通)X—114提取

为了得到均一的洗涤剂制品，根据Bodier 1981方法，将曲拉通X—114(Sigma)进行0℃/30℃三次温度循环处理。从DNA样品中提取脂多糖按下列修改的发表方法进行：(Aida和Pabst，1990，Manthorpe等1993)：DNA样品(0.5—1.5mg/ml，10mMTris，0.1mM EDTA，PH7.4(TE))加至0.3M醋酸钠(PH7.5)中。然后，每100μlDNA溶液加入3μl曲拉通X—114。通过振荡充分混合样品，在冰中放置10分钟。以形成可分开的两相溶液。在30℃放置5分钟，加至予热过的Eppendorf离心管中，2000rpm离心2分钟，将水相置于新的Eppendorf试管中。再进行两次以上提取，在环境温度下，用0.6体积异丙醇沉淀最后的水溶液。离心收集沉淀样品，用80％乙醇洗涤2次，在空气中干燥。再溶于TE缓冲液，测定含量。为了这一目的，用RNA酶，蛋白酶K，酚/氯仿和氯仿处理样品，再沉淀，最后，将DNA样品悬于TE缓冲液，假定0.05mg/ml DNA吸收值为1，在260nm测定紫外吸收值。

ii)多粘菌素层析

与DNA样品相当的1体积多粘菌素树脂(Affi—Prep—Polymyxin，BioRad)和3倍体积的0.1NNaOH混合，然后用5倍于树脂体积的TE缓冲液洗涤3次。取出树脂和DNA样品(0.8—1.2mg/ml，TE)混和，4℃过夜搅拌。将样品加至已用0.1NNaOH予处理过的一次性柱子，并用TE洗脱。收集洗脱液，再用另一体积的TE洗涤树脂，合并洗脱液和洗涤液。用1/10体积PH5的3M醋酸钠和2倍体积乙醇沉淀合并样品的DNA。按前述方法进一步处理沉淀并测定DNA。

c)细胞培养

分离初生黑色素瘤细胞，在加有100I.U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mML一谷氨酰胺，1％丙酮酸钠和10％热灭活FCS的RPMI1640培养基中进行培养。

d)内毒素实验

采用基于变形细胞，鲎凝集反应的产色鲎实验确定脂多糖含量(Iwanaga 1993购自Biowhittaker OCL—1000)。在实验进行前，所有生物材料和试剂要经实验确认不含脂多糖(＜0.1内毒素单位(EU)/50μl溶液)。

e)制备转染复合物

转铁蛋白—聚赖氨酸，抗生蛋白链菌素聚赖氨酸和生物素标记的8—甲氧补骨脂素/紫外失活的腺病毒(dl1014(8μl1×10¹²颗粒/ml)和质粒DNA(6μg，稀释至指定脂多糖含量的100μl)构成的三元复合物，按前述实施例所述制备。

定名为H225的人黑色素瘤细胞(2×10⁵细胞/6cm培养皿)用6μg质粒转染。质粒是采用图29所示多种方法提纯的。提纯前质粒DNA中内毒素含量在图中以黑色棒图表示。采用多粘菌素树脂或曲拉通X—114提取后，所有制品中含有低于0.1EU脂多糖/6μgDNA。采用ELISA方法测定细胞上清液中的IL—2含量。(T Cell Diagnostics Inc，CamBridge，MA，USA)，图中所示值表明了24小时内的每10⁶细胞的单位数。在本例中，表明了在提纯DNA中加入脂多糖会导致基因不表达。如在培养液中加入多粘菌素后，至少会部分恢复表达。

实施例22

采用细胞因子转染的照射过的结肠癌细胞免疫诱导***免疫反应(预防结肠癌模型)

在本实施例中，对于所用转染复合物，采用了如实施例8所用同样方法，进行细胞培养和转染。同时对于所用细胞因子DNA和其剂量，以及对照(空载体，只照射细胞)按照实施例16的细节进行操作。图30所用术语相当于实施例16和图25。采用名为G26的结肠癌细胞株细胞，已由Brattain等1988年报道。实验动物为BALB/C品种小鼠。两次免疫采用1×10⁵细胞，用3×10⁵细胞进行“攻击”。表VII表明24小时内IL—2(单位/鼠)，干扰素γ和GM—CSF(均为ng/鼠)在照射细胞和注射间隔时间的分泌值(第一次免疫/第二次免疫)。图30表明，结肠癌肿瘤疫苗对抗肿瘤形成的保护作用。

                         表1

质粒比例	基因表达
		IFN-γ100％/IL-20％IFN-γ75％/IL-225％IFN-γ50％/IL-250％IFN-γ25％/IL-275％IFN-γ10％/IL-290％荧光素酶光单位/μg蛋白pCMVL100％/pSP0％pCMVL75％/pSP25％pCMVL50％/pSP50％pCMVL25％/pSP75％pCMVL12.5％/pSP87.5％pCMVL6.3％/pSP93.7％pCMVL3.1％/pSP96.9％	ng IFN-γ    单位IL-2(每106细胞/24h)369.6            -290.4           7920204.6           1188083.8            1452042.9            181501531438119166070005220991448352146327324

                     表IIM—3黑色素瘤在DBA/2小鼠中的发展

免疫    (2x)(1×105细胞，照射)未免疫未转染M—3pSP 100％(dl1014)IL-2 100％(dl1014)	肿瘤植入后周数
											1w2/40/60/60/5	2w4/42/63/60/5	3w4/44/63/60/5	4w4/44/63/60/5	5w4/43/63/60/5	6w4/43/63/60/5	7w4/63/60/5	8w4/64/60/5	9w4/64/60/5	10w5/64/60/5

                             表IIIM—3黑色素瘤在DBA/2小鼠中的发展

免疫    (2x)(1×105细胞，照射)未免疫IL-2 100％(dl1014)IL-2 10％(dl1014)IL-2 90％＋IFN-γ10％(dl1014)IFN-γ 10％(dl1014)IL-2 100％(dl312)	植入瘤细胞后周数
										1w6/60/60/50/64/61/5	2w6/60/62/50/65/61/5	3w6/60/62/50/65/61/5	4w6/60/62/50/65/61/5	5w6/60/62/50/65/61/5	6w6/60/62/50/65/61/5	7w6/60/62/50/65/61/5	8w0/62/50/65/62/5	9w0/62/50/65/62/5

                 表IV肿瘤在DBA/2鼠中的发展

免疫         (2x)(1×105M-3细胞)未免疫pSP(dl1014)IL-2 100％(dl1014)IL-2 4％(dl1014)IL-2 100％(dl1014)IL-2 4％(dl1014)IL-2 100％(dl1014)IL-2 4％(dl1014)IL-2 100％(dl1014)	植入肿瘤后周数
		1w     2w     3w      4w1×105 M-30/6    2/6    6/6    6/60/6    1/6    3/6    4/60/6    0/6    0/6    0/60/5    0/5    1/5    1/53×105M-30/5    0/5    0/5    2/50/5    2/5    3/5    4/51×106M-30/4    0/4    1/4    1/31/5    3/5    4/5    4/51×105KLN2050/6    2/6    6/6    6/6

              表V冷冻盖仑制剂细胞：用人   IL—2较染并用100grey照射的

    MM3，氮冷冻，38天后融化

时间	冷冻前即刻		熔化后即刻		盖仑制剂		24 h    4℃		48 h    4℃
											冷冻培养基	细胞数(×106)	存活(％)	细胞数(×106)	存活(％)	细胞数(×10°)	存活(％)	细胞数(×106)	存活(％)	细胞数(×106)	存活(％)
70％RPM1＋20％FCS＋10％DMSO	3.1	99％	2.8	98％	1.6	80％	1.7	77％	1.7	80％
											20％HSA＋10％DMSO	3.0	100％	2.9	98％	0.8	62％	0.5	31	0.4	30％
12％HES，Ringers＋5％DMSO	2.9	98％	2.0	86％	0.8	50％	0.82	50	0.8	53％
											12％HES inRingers	2.8	94％	0.4	40％	0.3	47％	nd	nd	nd	nd

                      表VI

4℃种入MM3细胞制备盖仑制剂的时间	0h4℃		24h4 ℃		48h4℃
							冷冻培养基	出现率(上清液中细胞％)	IL-2表达单位/24h/1×106细胞	出现率(上清液中细胞％)	IL-2表达单位/24h/1×106细胞	出现率(上清液中细胞％	IL-2表达单位/24h/1×106细胞
70％RPMI＋20％FCS＋10％DMSO	24h：10％48h：10％	24h：1119548h：7069	24h：50％48h：50％	24h：464648h：4862	24h：50％48h：60％	26h：594048h：3794
							20％HSA＋10％DMSO	24h：70％48h：80％		24h：95％48h：95％		24h：100％48h：100％
12％HES inRingers＋5％DMSO	24h：20％48h：20％		24h：60％48h：60％		24h：70％48h：70％
							12％HES inRingers	24h：40％48h：40％

                     表Ⅶ疫苗                                         表达

                              第一次免疫/第二次免疫GM-CSF(高)                                   241/184GM-CSF(中)                                   24/18GM-CSF(低)                                   2.4/1.8IL-2(高)                                     4302/4624IL-2(中)                                     860/925IL-2(低)                                     86/93IFN-γ(高)                                   129/63IFN-γ(中)                                   13/6IFN-γ(低)                                   1.3/0.6参考文献Abrahamson，D.R.et al.，1981，J.Cell.Biol.91，270-

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Januar 90，38-50.Schwartz，R.H.，1992，Cell 71，1065-1068.Seed，B.，1987，Nature 329，840-842.Severne，Y.，Wieland，S.，Schaffner，W.and Rusconi，S.，

1988，EMBO J.7，2503-2508.Sharon，N.，1987，Cell Separation：Methods and Selected

Applications，Vol.5，Academic press Inc.，pp.13-44.Sly，W.S.and Grubb，J.，1979，Isolation of Fibroblasts

from Patients，Methods in Enzymology，Vol.LVIII.Sly，W.et al.，1982，J.Cell.Biochem.18，67-85.Smith，K.A.etal.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，

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Gene 9，287.Springer，T.A.，Dustin，M.L.，Kishimoto，T.K.and

Marlin，S.D.，1987，Annu.Rev.Immunol.5，223.Stahl，P.D.etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，

1399-1403.Taniguchi，T.，Matsui，H.，Fujita，T.，Takaoka，C.，

Kashima，N.，Yoshimoto，R.and Hamuro，J.，1983，

Nature 302，305-310.Townsend，S.E.and Allison，J.P.，1993，Science 259，

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Biochem.82，1425-1433.Wagner，E.，Zenke，M.，Cotten，M.，Beug，H.and

Birnstiel，M.L.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，

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1991a，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4255-4259.Wagner，E.，Cotten，M.，Mechtler，K.，Kirlappos，H.and

Birnstiel，M.L.，1991b，Bioconjugate Chem.2，226-

231.Wagner，E.，Zatloukal，K.，Cotten，M.，Kirlappos，H.，

Mechtler，K.，Curiel，D.T.and Birnstiel，M.L.，

1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6099-6103.Walker，F.et al.，1987，J.Cell.Physiol.130，255-261.Weinberg，D.H.and Ketner，G.，1983，Proc.Natl.Acad.

Sci.USA 80，5383-5386.Zatloukal，K.，Wagner，E.，Cotten，M.，Phillips，S.，

Plank，C.，Steinlein，P.，Curiel，D.and Birnstiel，

M.L.，1992，Ann.New York Acad.Sci.660，136-153.Zenke，M.，Steinlein，P.，Wagner，E.，Cotten，M.，Beug，

H.and Birnstiel，M.L.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 87，3655-3659.Trends Pharmacol.Sci.10，1989，458-462.Human Cancer in Primary Culture，1991，Hsg.John R.W.

Masters，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht-

Boston-London序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)名称：Boehringer Ingelheim International GmbH

(B).街道：：Binger Strase 173

(C)城市：Ingelheim am Rhein

(E)国家：Germany

(F)邮编：D-55216

(G)电话：06132/772822

(H)传真：06132/774377

(I)电传：4187910 bi d

(ii)申请题目：肿瘤疫苗的制备方法

(iii)序列数：7

(iv)计算机阅读形式：

(A)数据载体：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作***    PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.0，Version#1.25(EPA)(2)SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1664碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA到mRNA(iii)假设：无(iii)反义：无(vi)原始来源

(A)生物：狂犬病病毒(ix)性质：

(A名称/关键字：5′UTR

(B)位置：1.6(ix)性质：

(A)名称/关键字：CDS

(B)位置：7..1581(ix)性质：

(A名称/关键字：单肽

(B)位置：7..63(ix)性质：

(A)名称/关键字：mat-肽

(B)位置：64..1578(xi)序列：SEQ ID NO：1：TCTAAT ATG GTT CCT CAG GCT CTC CTG TTT GTA CCC CTT CTG GTT TTT    48

   Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu  Val Phe

   -19             -15                 -10CCA TTG TGT TTT GGG AAA TTC CCT ATT TAC ACG ATC CCA GAC AAG CTT   96Pro Leu Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu-5                   1               5                  10GGT CCC TGG AGC CCG ATT GAC ATA CAT CAC CTC AGC TGC CCA AAC AAT   144Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Ash Ash

         15                  20                  25TTG GTA GTG GAG GAC GAA GGA TGC ACC AAC CTG TCA GGG TTC TCC TAC   192Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr

    30                   35                  40ATG GAA CTT AAA GTT GGA TAC ATC TTA GCC ATA AAA ATG AAC GGG TTC 240Met Glu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe

 45                  50                   55ACT TGC ACA GGC GTT GTG ACG GAG GCT GAA ACC TAC ACT AAC TTC GTT 288Thr Cys Tnr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val60                  65                  70                  75GGT TAT GTC ACA ACC ACG TTC AAA AGA AAG CAT TTC CGC CCA AA CCA  336Gly Tyr Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro

            80                   85                  90GAT GCA TGT AGA GCC GCG TAC AAC TGG AAG ATG GCC GGT GAC CCC AGA 384Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg

         95                 100                 105TAT GAA GAG TCT CTA CAC AAT CCG TAC CCT GAC TAC CGC TGG CTT CGA 432Tyr Glu Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg

    110                 115                 120ACT GTA AAA ACC ACC AAG GAG TCT CTC GTT ATC ATA TCT CCA AGT GTA 480Thr Val Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val

125                 130                 135GCA GAT TTG GAC CCA TAT GAC AGA TCC CTT CAC TCG AGG GTC TTC CCT 528Ala Asp Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro140                 145                 150                 155AGC GGG AAG TGC TCA GGA GTA GCG GTG TCT TCT ACC TAC TGC TCC ACT 576Ser Gly Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr

            160                 165                 170AAC CAC GAT TAC ACC ATT TGG ATG CCC GAG AAT CCG AGA CTA GGG ATG 624Asn His Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met

        175                 180                 185TCT TGT GAC ATT TTT ACC AAT AGT AGA GGG AAG AGA GCA TCC AAA GGG 672Ser Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly

    190                 195                 200AGT GAG ACT TGC GGC TTT GTA GAT GAA AGA GGC CTA TAT AAG TCT TTA 720Ser Glu Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu

205                 210                 215AAA GGA GCA TGC AAA CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTA GGA CTT AGA CTT 768Lys Gly Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu220                 225                 230                 235ATG GAT GGA ACA TGG GTC GCG ATG CAA ACA TCA AAT GAA ACC AAA TGG 816Met Asp Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp

            240                 245                 250GC CCT CCC GAT CAG TTG GTG AAC CTG CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAA 864Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu

        255                 260                 265ATT GAG CAC CTT GTT GTA GAG GAG TTG GTC AGG AAG AGA GAG GAG TGT  912Ile Glu His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys

    270                 275                 280CTG GAT GCA CTA GAG TCC ATC ATG ACA ACC AAG TCA GTG AGT TTC AGA  960Leu Asp Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg

285                 290                 295CGT CTC AGT CAT TTA AGA AAA CTT GTC CCT GGG TTT GGA AAA GCA TAT  1008Arg Leu Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr300                 305                 310                 315ACC ATA TTC AAC AAG ACC TTG ATG GAA GCC GAT GCT CAC TAC AAG TCA  1056Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser

            320                 325                 330GTC AGA ACT TGG AAT GAG ATC CTC CCT TCA AAA GGG TGT TTA AGA GTT  1104Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val

        335                 340                 345GGG GGG AGG TGT CAT CCT CAT GTG AAC GGG GTG TTT TTC AAT GGT ATA  1152Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile

    350                 355                 360ATA TTA GGA CCT GAC GGC AAT GTC TTA ATC CCA GAG ATG CAA TCA TCC  1200Ile Leu Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser

365                 370                 375CTC CTC CAG CAA CAT ATG GAG TTG TTG GAA TCC TCG GTT ATC CCC CTT  1248Leu Leu Gln GLn His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu380                 385                 390                 395GTG CAC CCC CTG GCA GAC CCG TCT ACC GTT TTC AAG GAC GGT GAC GAG  1296Val His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu

            400                 405                 410GCT GAG GAT TTT GTT GAA GTT CAC CTT CCC GAT GTG CAC AAT CAG GTC  1344Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val

        415                 420                 425TCA GGA GTT GAC TTC GGT CTC CCG AAC TGG GGG AAG TAT GTA TTA CTG  1392Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu

    430                 435                  440AGT GCA GGG GCC CTG ACT GCC TTG ATG TTG ATA ATT TTC CTG ATG ACA  1440Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr

445                 450                 455TGT TGT AGA AGA GTC AAT CGA TCA GAA CCT ACG CAA CAC AAT CTC AGA  1488Cys Cys Arg Arg Val Asr Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg460                 465                 470                 475GGG ACA GGG AGG GAG GTG TCA GTC ACT CCC CAA AGC GGG AAG ATC ATA   1536Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile

            480                 485                 490TCT TCA TGG GAA TCA CAC AAG AGT GGG GGT GAG ACC AGA CTG TGAGGACTGG 1588Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

        495                 500                 505CCGTCCTTTC AACGATCCAA GTCCTGAAGA TCACCTCCCC TTGGGGGGTT CTTTTTGAAA 1648AAAAAAAAAA AAAAAA                                                 1664(2)SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：524氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列              SEQ ID NO：2：Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu-19             -15                 -10                  -5Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

          2               5                  10Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

 15                  20                  25Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu30                  35                  40                  45Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

             50                  55                  60Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

         65                  70                  75Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

     80                  85                  90Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

 95                 100                 105Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val110                 115                 120                 125Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

            130                 135                 140Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly

        145                 150                 155Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

    160                 165                 170Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

175                 180                 185Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu190                 195                 200                 205Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

            210                 215                 220Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

        225                 230                 235Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

    240                 245                 250Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

255                 260                 265His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp270                 275                 280                 285Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

            290                 295                 300Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

        305                 310                 315Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

    320                 325                 330Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

335                 340                 345Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu350                 355                 360                 365Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

           370                  375                 380Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His

        385                 390                 395Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu

    400                 405                 410Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly

415                 420                 425Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala430                435                  440                 445Gly Ala Leu Thr Ala Leu Mit Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys

            450                 455                 460Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Tnr

        465                 470                 475Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

    480                 485                 490Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

495                 500                 505(2)SEQ ID NO：3的信息

(i)列特征：

  (A)长度：24碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：    cDNA

(ix)性质：

  (A)名称/关键词：5′UTR

  (B)位置：1..24

(xi)序列：SEQ ID NO：3：GTCAACAGCG CACCCACTTC AAGC(2)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征

   (A)长度：24碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)性质：

  (A)名称/关键字：5′UTR

  (B)位置：1..24

(xi)序列：SEQ ID NO：4：

GCTTGTTGAG ATGATGCTTT GACA

(2)SED ID NO：5的信息

(i)序列特征：

    (A)长度：21碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)性质：

    (A)名称/关键字：5′UTR

    (B)位置：1..21

(xi)序列：SEQ ID NO：5：GGTCCTGTGT CTGAACCTGA G(2)SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征：

    (A)长度：21碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)性质：

    (A)名称/关键字5′UIR

    (B)位置：1..21

(xi)序列：SEQ ID NO：6：TTATGGCCTG GGGCGTTTAC A(2)SED ID NO：7的信息

(i)序列特征：

    (A)长度：41氨基

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽(ix)性质：

    (A)名称/关键字：肽

    (B)位置：1..41

(ix)性质：

    (A)名称/关键字：修饰点

    (B)位置：17

    (D)其他资料：   /note＝“Xaa is Nle”

(ix)性质：

    (A)名称/关键字：修饰点

    (B)位置：25

    (D)其他资料：   /note＝“Xaa is Nle”

(xi)序列：SEQ ID NO：7：Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phs Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly1               5                   10                  15Xaa Ile Asp Gly Lys Gly Asp Ile Xaa Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile

        20                   25                  30Phe Gly Glu Ile Ala Glu Phe Leu Gly

     35                  40

Claims (55)

1.制备含自身肿瘤细胞的肿瘤疫苗的方法，其特征在于培养肿瘤细胞或成纤维细胞，培养细胞在体外用含有下列成份的组合物进行转染：

ai)含有一种或多种在细胞中可表达序列的一种DNA分子，该序列编码一种或多种相同或不同的免疫刺激多肽，或者含有不同免疫刺激多肽的编码序列的若干DNA分子；

aii)不含编码在被转染的细胞中有功能活性多肽的序列的另一可选择的DNA分子；

b)DNA结合分子和一种选自下组的核内体裂解作用剂的偶联物：

i)至少在E₄区突变的腺病毒，

ii)除了E1a区缺陷外，有一个或多个其它遗传缺陷的腺病毒，或

iii)核内体裂解活性肽；可选择地，

c)优选与内在化因子偶联的DNA结合分子，其中内在化因子与被转染细胞表面分子结合并被内在化于这些细胞中；

组分b)和c)与a)中限定的DNA形成一种基本电中性的复合物，

使转染细胞失活，保留表达ai)限定的DNA的能力，丧失***能力，当转染成纤维细胞时，将后者与未转染并失活的瘤细胞混合，任选将细胞群与药用赋型剂和载体混合。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于ai)中限定的DNA是一种表达质粒，其含有编码细胞因子的一种或多种序列。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于ai)中限定的DNA含有编码人白细胞介素2的序列。

4.根据权利要求2的方法，其特征在于ai)中限定的DNA含有编码人干挠素γ的序列。

5.根据权利要求2的方法，其特征在于两种质粒用作ai)所限定的DNA，其中一种含有编码人白细胞介素2的序列，另一种含有编码干扰素γ的序列。

6.根据权利要求2的方法，其特征在于ai)中限定的DNA含有人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)的编码序列。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于ai)中所限定的DNA是一种含有一种或多种编码共刺激分子的序列的表达质粒。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于DNA含有一种编码热稳定抗原的序列。

9.根据权利要求1的方法，其特征在于ai)中限定的DNA是一种含有一种或多种编码新抗原的序列的表达质粒。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于新抗原是一种病毒蛋白或其片段。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于病毒蛋白是狂犬病毒糖蛋白。

12.根据权利要求2—11之一的方法，其特征在于另外使用质粒作为aii)中限定的一种DNA分子，其不含有编码在转染细胞中有功能活性多肽的序列。

13.根据权利要求1的方法，其特征在于一种聚赖氨酸，其链长优选为200—300个赖氨酸基团，用作DNA结合分子b)和任选的c)。

14.根据权利要求13的方法，其特征在于c)中聚赖氨酸与作为内在化因子的人转铁蛋白偶联。

15.根据权利要求13的方法，其特征在于c)中聚赖氨酸与作为内在化因子的人表皮生长因子(EGF)偶联。

16.根据权利要求1的方法，其特征在于一种偶联物用作b)组分，它含有至少在E₄区有缺陷的腺病毒。

17.根据权利要求16的方法，其特征在于名为dl1014的腺病毒用作E₄变株。

18.根据权利要求1的方法，其特征在于作为组分b)使用一种偶联物，它含有一种E1a区缺陷，并用补骨脂素/紫外失活的腺病毒。

19.根据权利要求1的方法，其特征在于b)组分使用一种偶联物，它含有一种已被β—丙内酯失活的腺病毒。

20.根据权利要求1的方法，其特征在于一种偶联物用作b)组分，其中肽序列SEQ.ID NO：7以离子键与聚赖氨酸相连。

21.根据权利要求1的方法，其特征在于被转染细胞用X—射线或γ—射线失活。

22.根据权利要求1的方法，其特征在于肿瘤细胞为黑色素瘤细胞。

23.根据权利要求1的方法，其特征在于肿瘤细胞是结肠癌细胞。

24.根据权利要求1的方法，其特征在于成纤维细胞被转染并失活。

25.根据权利要求24的方法，其特征在于成纤维细胞是自体的成纤维细胞。

26.根据权利要求24的方法，其特征在于成纤维细胞是一种成纤维细胞系的细胞。

27.根据权利要求24—26之一的方法，其特征在于被转染并失活的成纤维细胞与自体的失活瘤细胞相混合。

28.根据权利要求27的方法，其特征在于瘤细胞是黑色素瘤细胞。

29.根据权利要求27的方法，其特征在于瘤细胞是结肠癌细胞。

30.可用权利要求1—29之一的方法获得的肿瘤疫苗。

31.制备肿瘤疫苗的转染复合物，其特征在于它含有下列成份：

ai)含有一种或多种可编码一种或多种相同或不相同免疫刺激多肽在细胞中可表达序列的一种DNA分子，或者含有编码不同免疫刺激多肽的序列的若干DNA分子；

aii)任选的另一DNA分子，它不含有编码在转染细胞中有功能活性的多肽的序列；

b)DNA结合分子和一种选自下组的核内体裂解作用剂的偶联物：

i)至少在E₄区突变的腺病毒，

ii)具有一个或多个附加基因缺陷并在E1A区有缺陷的腺病毒，或

iii)核内体裂解活性肽；

可选择地

c)优选与一种结合于转染细胞表面分子并被内在化于其中的内在化因子偶联的一种DNA结合分子，

组分b)和组分c)与a)中限定的DNA形成一种基本电中性的复合物。

32.根据权利要求31的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA是一种含有一种或多种编码细胞因子的序列的表达质粒。

33.根据权利要求29的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA含有编码人白细胞介素2的序列。

34.根据权利要求32的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA含有编码人干扰素γ的序列。

35.根据权利要求32的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA含有编码人GM—CSF的序列。

36.根据权利要求33的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA由两种质粒组成，一种含有编码人IL—2的序列，另一含有编码IFN—γ的序列。

37.根据权利要求31的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA是一种表达质粒，它含有一种或多种编码共刺激分子的序列。

38.根据权利要求37复合物，其特征在于DNA含有编码热稳定抗原的序列。

39.根据权利要求31的复合物，其特征在于ai)中限定的DNA是含有一种或多种编码新抗原的序列的一种表达质粒。

40.根据权利要求39的复合物，其特征在于新抗原为一种病毒蛋白或其片段。

41.根据权利要求40的复合物，其特征在于病毒蛋白是狂犬病毒糖蛋白。

42.根据权利要求31至34之一的复合物，其特征在于它还含有一种作为aii)中限定的DNA分子的质粒，该质粒不含在转染细胞中有功能活性多肽的编码序列。

43.根据权利要求31—42之一的复合物，其特征在于DNA中基本不含脂多糖。

44.根据权利要求31的复合物，其特征在于它含有作为DNA结合分子b)和任选的c)的一种聚赖氨酸，其优选链长为大约200—300个赖氨酸。

45.根据权利要求44的复合物，其特征在于c)的聚赖氨酸与作为内在化因子的转铁蛋白偶联。

46.根据权利要求44的复合物，其特征在于聚赖氨酸与作为内在化因子的人EGF偶联。

47.根据权利要求31的复合物，其特征在于它含有作为组分b)的一种含至少在E₄区有缺陷的腺病毒的偶联物。

48.根据权利要求47的复合物，其特征在于它含有名为dl1014的腺病毒作为E₄突变株。

49.根据权利要求31的复合物，其特征在于它含有作为组分b)的一种含有由β—丙内酯失活腺病毒的偶联物。

50.根据权利要求31的复合物，其特征在于它含有作为组分b)的一种含有E1a缺陷并被补骨脂素/紫外失活的腺病毒的偶联物。

51.根据权利要求31的复合物，其特征在于它含有作为组分b)的一种其中序列为SEQ 1D NO：7的肽以离子键与聚赖氨酸结合的偶联物。

52.以权利要求31—51之一限定的一种复合物转化的人肿瘤细胞。

53.以权利要求31—51之一限定的一种复合物转化的人成纤维细胞。

54.根据权利要求53的成纤维细胞，其与人肿瘤细胞混合。

55.含有根据权利要求52或54的细胞和药用营养和赋型剂的药物制剂。

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