DE19510344C1

DE19510344C1 - Verwendung einer Tumorvakzine

Info

Publication number: DE19510344C1
Application number: DE19510344A
Authority: DE
Inventors: Tamas Dr Schweighoffer
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2015-03-23
Also published as: WO1996029093A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Tumorvakzine.

Die Entwicklung von Tumorvakzinen beruht auf drei Voraussetzungen: 1. es bestehen qualitative und quantitative Unterschiede zwischen Tumorzellen und normalen Zellen; 2. das Immunsystem ist gut geeignet, diese Unterschiede festzustellen; 3. dem Immunsystem kann - durch aktive spezifische Immunisierung mit Vakzinen - beigebracht werden, diese Unterschiede zu erkennen und die Abstoßung des Tumors herbeizuführen.

Für das Entstehen einer Anti-Tumorantwort müssen zwei Kriterien erfüllt sein: Erstens muß der Tumor neue Antigene oder Neoepitope, die auf normalen Zellen nicht vorkommen, präsentieren. Zweitens muß das Immunsystem entsprechend aktiviert werden, um auf diese neuen Antigene zu reagieren. Ein wesentliches Hindernis bei der Immuntherapie von Krebs ist die geringe Immunogenizität von Tumoren, besonders im Menschen. Dies ist insofern überraschend, als die große Anzahl von genetischen Veränderungen in fortgeschrittenen Krebserkrankungen zur Entstehung von Peptid-Neoepitopen führen sollte, die im Kontext mit MHC-I-Molekülen von zytotoxischen Lymphozyten erkannt werden sollten.

Für die Immuntherapie von Krebs auf zellulärer Basis wurden zwei allgemeine Strategien entwickelt: Die adoptive Immuntherapie, die sich der in vitro Expansion von tumorreaktiven Lymphozyten und deren Wiedereinführung in den Wirt bedient; andererseits die aktive Immuntherapie, welche Tumorzellen verwendet, in der Erwartung, daß damit entweder neue oder verstärkte Immunantworten gegen Tumorantigene hervorgerufen werden, die zu einer systemischen Tumorantwort führen.

Tumorvakzine auf der Grundlage der aktiven Immuntherapie wurden auf verschiedene Arten hergestellt; ein Beispiel dafür sind bestrahlte Tumorzellen, die mit Adjuvantien wie Corynebacterium parvum versetzt werden, um neue Immunreaktionen hervorzurufen.

In den letzten Jahren wurden vor allem genetisch veränderte Tumorzellen für eine aktive Immuntherapie gegen Krebs verwendet. Eine der jüngsten dieser Strategien verwendet Tumorzellen, die verschiedene Zytokine sekretieren, wobei hier nicht die Expression fremder Gene in Tumorzellen induziert wird, sondern eine Veränderung der immunologischen Umgebung der Tumorzelle angestrebt wird. Damit soll entweder die Präsentierung von tumorspezifischen Antigenen gegenüber dem Immunsystem oder die Aktivierung von tumorspezifischen Lymphozyten verstärkt werden. Eine Übersicht über diese Strategien wird von Pardoll, 1992, gegeben.

Von Tumorzellen, die genetisch verändert wurden, um große Mengen verschiedener Zytokine wie IL-2, GM-CSF zu sekretieren oder um co-stimulierende Moleküle zu exprimieren, wurde in experimentellen Tiermodellen gezeigt, daß sie starke Anti-Tumorreaktionen des Wirts auslösen (Fearon et al., 1991; Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1993). Im Gegensatz dazu könnte es beim Menschen, wenn er bereits eine beträchtliche Tumorbelastung aufweist und eine Toleranz gegen den Tumor entwickeln hat, außerordentlich schwer sein, die ganze Kaskade von komplexen Wechselwirkungen zu erfassen, die benötigt wird, um eine wirkungsvolle Anti-Tumorreaktion auszulösen. Die tatsächliche Wirksamkeit von Zytokine sekretierenden Tumorvakzinen für solche Anwendungen ist noch nicht erwiesen.

Im Zuge der Entwicklung der adoptiven Immuntherapie wurde ein Weg gezeigt, die Immuntoleranz zu brechen, indem CTLs (zytotoxische T-Lymphozyten) gegen das tolerierte Antigen erzeugt wurden (Ohashi et al., 1991; Röcken et al., 1992).

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine neue Tumorvakzine bereitzustellen, mit welcher die Immuntoleranz gegen unbekannte Tumorantigene beseitigt werden kann.

Lehmann et al., 1992, beschreiben die Induktion einer experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) in entsprechend empfänglichen Tieren durch ein Peptid des Proteins MBP ("Myelin Basic Protein"), das einem einzigen Epitop entspricht. Von den aus den behandelten Tieren isolierten MBP-reaktiven T-Zellen wurde überraschenderweise festgestellt, daß sie nicht nur das Originalpeptid erkannten, mit dem immunisiert wurde, sondern auch diverse andere vom MBP-Molekül abgeleiteten Epitope. Diese Erweiterung der Immunantwort auf neue Epitope desselben Antigenmoleküls wurde als "Epitopausweitung" ("Epitope Spreading") oder "Antigenausweitung" ("Antigen Spreading") bezeichnet. Diese Erweiterung der Primärantwort auf unbekannte Epitope findet auf Molekülebene statt. Aus diesem Befund kann abgeleitet werden, daß, sobald ein spezielles Antigen erkannt wird, auch in der Nähe befindliche Antigene mit deutlich verstärkter Effizienz in den T-Zell-Aktivierungsweg geleitet werden.

Ausgehend von dieser Beobachtung wurde nun zur Lösung der gestellten Aufgabe zunächst von der Überlegung ausgegangen, daß als solche "in der Nähe befindlichen" nicht nur Epitope desselben Moleküls anzusehen sind, sondern daß dazu auch andere Moleküle gehören, die von der Zelle stammen, die anfänglich erkannt wurde. Obwohl der Mechanismus des Antigen Spreading noch nicht im einzelnen aufgeklärt ist, ist die Ausweitung des Konzepts auf andere Antigen-Moleküle, die nicht vom selben Protein-Molekül, sondern von der selben Zielzelle stammen, deshalb sinnvoll, weil die Zielzelle nach ihrer Erkennung durch das Immunsystem als ganze zerstört wird und somit die ganze Zelle Antigene zur Verfügung stellt, die von APCs (Antigen Presenting Cells) aufgenommen und prozessiert werden. Es ist nicht bekannt, ob das antigenische Repertoire, das von APCs aufgenommen wird, in irgend einer Weise gesteuert wird, aber da eine große Vielfalt an potentiellen Antigenen, einschließlich Zellfragmenten, ganzen Bakterien und sogar synthetischen Partikeln, von Makrophagen aufgenommen wird, ist eine anfängliche Beschränkung des Repertoires unwahrscheinlich.

Die erfindungsgemäße Lösung der gestellten Aufgabe besteht nun darin, durch Erweiterung des Antigen Spreadings auf Tumorantigene eine Anti-Tumor-Immunität in tumortoleranten Wirten dadurch zu bewirken, daß man eine im Wirt bereits existierende, gut definierte Zellantwort vom Memory-Typ auslöst und sie gegen Tumorzellen lenkt.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung einer Vakzine, die inaktivierte proliferationsunfähige autologe und/oder allogene Tumorzellen enthält, welche derart modifiziert sind, daß sie ein oder mehrere Antigene enthalten, zur Behandlung von Tumoren bei Individuen, in denen bereits eine Immunantwort auf das enthaltene oder die enthaltenen Antigene existiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Modifikation der Tumorzellen darin, daß sie, nach Transfektion mit einer für das Antigen kodierenden DNA, das Antigen exprimieren.

Als Antigene sind molekulare Einheiten, z. B. komplette Proteine, Fragmente davon, Peptide, Glykolipide oder durch stereospezifische Glykosylierung modifizierte Moleküle, geeignet. Diese Moleküle werden von den Tumorzellen derart exprimiert, daß sie vom Immunsystem, insbesondere von T-Zellen oder von Immunglobulinen, erkannt werden und eine effiziente Immunantwort auslösen können. Für die vorliegende Erfindung wird der Effekt ausgenützt, daß das Immunsystem ein Erinnerungsvermögen für bereits früher wahrgenommene Antigene besitzt. Dieses Erinnerungsvermögen äußert sich auf zellulärer Ebene insbesondere dadurch, daß T-Zellen und Plasmazellen (B-Zellen) auf das erneute Auftreten des Antigens, das nun, beim wiederholten Auftreten, ein "Erkennungsantigen" darstellt, mit erhöhter Reaktivität reagieren, was zu einer raschen Ausschüttung eines erhöhten Volumens von Zytokinen, einer Beschleunigung der Proliferation der T- bzw. B- Zellen sowie einer Beschleunigung der für die Prozessierung dieser Antigene erforderlichen sekundären Reaktionen führt. Die Folge davon ist die Eliminierung des Antigens bzw. der damit assoziierten Elemente (Viren, Bakterien, Zellen) durch eine erhöhte zytolytische Aktivität und/oder Antikörperproduktion. (Die durch erneutes Auftreten des Erkennungsantigens ausgelöste Reaktion des Immunsystems wird als "Memory Response" bezeichnet.)

Mit der erfindungsgemäßen Verwendung der Tumorvakzine wird somit bewirkt, daß die schon existierenden spezifischen Memory-T-Zellen zum Immunogen, also den Tumorzellen des Vakzins, gelangen, weil diese genau das Antigen exprimieren, gegen das die spezifischen Memory-T-Zellen gerichtet sind. Dies führt zu einer wirksamen Erkennung und einer verstärkten Präsentierung nicht nur des von den Zellen aufgrund der gentechnischen Veränderung exprimierten Erkennungsantigens, sondern auch anderer Antigene, die auf den Tumorzellen vorhanden sind, also auch der Tumorantigene, was auf zellulärer Ebene eine Erweiterung einer Primärantwort, also ein Antigen Spreading, auf unbekannte Epitope, darstellt.

Die durch die erfindungsgemäße Verwendung der Tumorvakzine im Wirt ausgelösten Vorgänge führen weiterhin dazu, daß die Re-Fokussierung der Memory-Response auf die Tumorzellen nicht nur die Toleranz des Wirts gegen den Tumor bricht, sondern auch zu einem rascheren und besser vorhersagbaren Aufbau der Anti-Tumorimmunität führt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Verwirklichung des Prinzips, das im Wirt existierende Erinnerungsvermögen an das Erkennungsantigen für die Immunabwehr von unbekannten Tumorantigenen auszunutzen, anhand eines Hybridproteins der Bezeichnung "Heat1" auf der Grundlage des hsp65-Proteins von Mycobacterium bovis BCG gezeigt. Dieses Hybridprotein wurde als Erkennungsantigen verwendet, indem ein dafür kodierendes Plasmid in Zellen der Maus-Melanomzellinie M3 transfiziert wurde, die als Tumorvakzine dient. Es konnte gezeigt werden, daß die Verabreichung einer solchen Tumorvakzine in Mäuse, die entweder mit dem ganzen BCG (Lebend-Impfstoff) oder mit dem gereinigten rekombinanten hsp65-Protein vorimmunisiert worden und somit für eine Memory-Response bereit gemacht worden waren, eine Immunität gegen anschließende Tumorsetzungen mit Wildtyp-M3-Zellen induzieren konnte.

In den durchgeführten Versuchen diente das verwendete hsp65-Hybridprotein als Prototyp eines Erkennungsantigens.

M. bovis BCG ist ein Vertreter von Immunogenen, die eine stabile und langanhaltende, in vielen Fällen lebenslängliche, Immunität hinterlassen. In immunen Menschen kann dieser Schutz als sog. "Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ" ("delayed-type hypersensitivity reaction" DTH) charakterisiert werden. Diese Reaktion wird in erster Linie von T-Zellen des Typs Th1 (inflammatorische T-Zellen) erzeugt (Mutis et al., 1993; ElGhazali et al., 1993); eben dieses Reaktionsmuster dürfte eine Voraussetzung für eine effizienten Anti-Tumorreaktion sein (Puccetti et al., 1994). Von hsp65 des M. bovis war gezeigt worden, daß es eines der Hauptziele dieser Wirtsreaktion ist (Kaufmann, 1988; Kaufmann et al., 1987).

Die Anwendung von Mycobakterien oder deren Derivaten wurde bereits hinsichtlich verschiedener Aspekte für diverse Tumortherapieansätze vorgeschlagen: diese Ansätze beinhalten u. a. die Anwendung verschiedener Formen von BCG als Adjuvans zwecks Verabreichung gemeinsam mit bestrahlten, lysierten oder auf andere Weise wachstumsunfähig gemachten Tumorzellen (Bloemena et al., 1993); Ansätze, die sich der Kreuzreaktivität zwischen BCG-abgeleiteten Proteinantigenen und Tumor spezifischen Antigenen bedienen; Ansätze auf der Grundlage der Transfektion eines kompletten hsp65 von M. leprae in Tumorzellen, um eine Immunantwort hervorzurufen.

Von BCG-hsp65 wurde ferner gezeigt, daß es mit der Hepatom-Zellinie "Line 10" Antigen-Determinanten gemeinsam hat (Ahsan und Sasaki, 1991). Meerschweinchen, die mit sonikierten BCG-Membranen immunisiert worden waren, zeigten keine oder nur eine verzögerte Tumorentwicklung, wenn ihnen mit Zellen der Hepatomlinie ein Tumor gesetzt wurde. Auch zeigten T-Zellen von Ratten, die mit Lebend-BCG behandelte worden waren, eine Zytotoxizität gegen eine H-ras transformierte Fibrosarkom-Zellinie (Tamura et al., 1993); in diesem Fall erwies sich das Säugetier- Homologe hsp70 als Ziel für die Reaktion. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die aufgrund der erfindungsgemäßem Verwendung der Tumorvakzine erreichten Effekte auf anderen Mechanismen beruhen; dies äußert sich u. a. in den Vergleichsversuchen, in denen die Immunisierung von Mäusen mit BCG die Tiere dann nicht vor einer Tumorentwicklung nach Tumorsetzung mit M3-Zellen schützte, wenn der Vakzinierungsschritt mit den Heat1-transfizierten M3-Zellen ausgelassen wurde.

In einem weiteren bekannten Vorschlag wurde von Tumorvakzinen in Form von isolierten hsp- Peptidkomplexen gezeigt, daß sie eine wirksame Schutzimmunität hervorrufen. Dieser Schutz ist jedoch tumorspezifisch, was zeigt, daß er nicht spezifisch für hsp als solches, sondern auf die mit hsp assoziierten Peptide zurückzuführen ist (Udono et al., 1994).

Heat-Shock-Proteine sind sog. molekulare "Chaperones", eine Proteinfamilie mit einem hohen Grad an speziesübergreifender Übereinstimmung. Sie wirken immunogen, vermutlich weil sie Peptide nicht-kovalent an sich binden. Von Lukacs et al., 1993, und in der WO 94/11513 wurde eine Tumorvakzine, bestehend aus Tumorzellen, die mit einem hsp oder einem anderen "Chaperone" transfiziert sind, vorgeschlagen. In diesem System dürfte die Antitumorwirkung eine direkte Folge der Chaperone-Funktion des transfizierten Proteins sein. Die "Chaperone"-Funktion ist eine Art Begleiterfunktion für andere Proteine. Im Fall von hsp65, das ein typischer Vertreter von Chaperone- Proteinen ist, dürfte die Antitumorwirkung auf die verstärkte Chaperone-Funktion für das Tumorsuppressor- Protein p53 zurückzuführen sein, die zur richtigen Faltung und Konformation von inaktivem p53 führt, wodurch dessen Verlust der Tumorsuppressorfunktion aufgehoben wird. Die von Lukacs et al., 1993, durchgeführten Versuche zeigten, daß transduzierte J774-Makrophagen-Tumorzellinien ihre tumorigene Wirkung in normalen (naiven, d. h. noch nie mit dem Antigen bzw. den Tumorzellen konfrontierten) Wirten verlieren und daß ein Inoculum aus solchen Tumorzellen in der Lage ist, auch nachfolgende Tumorsetzungen mit Wildtyp- J774-Zellen abzuwehren.

Von dem in der WO 94/11513 beschriebenen Vorschlag unterscheidet sich die vorliegende Erfindung dadurch, daß für die Herstellung und Anwendung der Tumorvakzine die im Wirt bereits vorhandene Immunantwort benutzt wird, indem diese gegen das von den Tumorzellen der Tumorvakzine exprimierte Antigen gerichtet wird. Daß die Voraussetzung einer existierenden Immunantwort gegeben ist, erweist sich in den durchgeführten Tierversuchen darin, daß Heat1 exprimierende M3-Tumorzellen in naiven Mäusen mit der Kinetik von Wildtyp-Zellen wachsen. Im Gegensatz zu dem von Lukacs et al., 1993, beschriebenen System ist die erfindungsgemäß verwendete Tumorvakzine nicht auf hsp65-Derivate bzw. andere Proteine mit Chaperone-Funktion beschränkt.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Versuchsergebnisse zeigen anhand eines Erkennungsantigens, gegen das eine Immunantwort des Wirts bereits existiert, daß diese Immunantwort gezielt gegen Tumorzellen umgeleitet werden kann, um dem Tumorwachstum Einhalt zu gebieten. Der mit der erfindungsgemäßen Verwendung der Tumorvakzine erzielbare Schutzmechanismus unterscheidet sich von dem der Tumorvakzine des Standes der Technik: das in den Versuchen verwendete Heat1-Protein stellt aufgrund seiner Verkürzung kein hinsichtlich der Chaperone- Wirkung funktionelles hsp dar; außerdem wird es aufgrund seiner angefügten Signalsequenz und der GPI(Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol)-Link-Modifikation einem intrazellulären Biosyntheseweg zugeleitet, der sich von dem des natürlichen hsp unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich vom Stand der Technik vor allem hinsichtlich des ihr zugrunde liegenden Prinzips und der Wirkungsweise der Vakzine hsp65 von BCG wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellvertretend für andere Erkennungsantigene daraufhin untersucht, ob der Mechanismus der Umleitung der Memory-Response auf Tumorzellen und die dadurch vom Wirtsorganismus ausgelösten Abwehrmechanismen gezielt für ein neuartiges Anwendungsprinzip für die Tumortherapie genutzt werden kann.

Aufgrund der Tatsache, daß weite Teile der Weltbevölkerung gegen verschiedene Pathogene geimpft sind, davon ca. 40% mit BCG (Aldovini und Young, 1991), kann die vorliegende Erfindung als allgemeine Strategie für die Immuntherapie von Tumorerkrankungen breit angewendet werden. Neben hsp65 bzw. Fragmenten oder Derivaten davon sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche Proteine bzw. Fragmente als Erkennungsantigene (bzw. die dafür kodierenden Sequenzen) zur Herstellung der Tumorvakzine geeignet, für die eine entsprechende Memory-Response in dem zu behandelnden Organismus vorhanden ist.

Bezüglich der Eignung eines Erkennungsantigen für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind vor allem die folgenden Parameter zu berücksichtigen:

1. Das Antigen muß vom Immunsystem des Wirts gut erkannt werden. Dabei ist es von Vorteil, wenn die bereits existierende Immunantwort als zelluläre Antwort in Form Memory-T-Lymphozyten bzw. in Form eines DTH- Schutzes vorliegt. Die Immunantwort kann sich jedoch auch in Form von Antikörpern gegen das Antigen äußern, sofern im Wirt ein für die Erkennung des Antigens entsprechend hoher Titer vorhanden ist.
2. Es ist von Vorteil, wenn Methoden, insbesondere geeignete Immunoassays, zur Verfügung stehen, mit denen bestimmt werden kann, ob der Wirt eine Immunität gegen das Erkennungsantigen aufweist.
3. Es sollte, für den Fall daß nicht die Antigene als solche, sondern die dafür kodierenden DNA-Moleküle eingesetzt werden, zumindest eine Teilsequenz des Erkennungsantigens bereits bekannt sein (bzw. das Antigen identifiziert und soweit gereinigt sein, um Teilsequenzen zu bestimmen), womit die Herstellung von Vektoren und somit seine Expression auf den für die Tumorvakzine eingesetzten Zellen ermöglicht wird. Solche Antigene können am leichtesten unter den Derivaten von verbreiteten humanen Pathogenen gefunden werden, die eine langfristige "Memory" nach natürlichen Infektionen oder nach Immunisierungen, insbesondere Impfungen, hervorrufen.

Für die Anwendung der Erfindung auf größere Patientenkollektive wird somit in der Praxis zweckmäßig so vorgegangen, daß die zu behandelnden Patienten darauf getestet werden, ob sie eine Immunantwort auf ein vorher definiertes Antigen, ein Pathogen, aufweisen, z. B. ob sie gegen BCG, Tetanus, Röteln, Masern, Hepatitis B, Herpes, Influenza, etc. immun sind. Für diese und andere Infektionskrankheiten sind diagnostische Tests auf der Grundlage immunologischer Methoden, z. B. ELISA-Tests, bekannt und werden routinemäßig angewandt; ein Beispiel dafür ist der Tuberkulintest.

Eine mögliche Anwendungsstrategie kann darin bestehen, beim einzelnen Patienten individuell hergestellte Tumorvakzine auf der Grundlage der bei diesem Patienten individuell festgestellten Immunität gegen bestimmte Antigene einzusetzen; d. h. daß die für die Herstellung der Tumorvakzine verwendeten Antigene von den Pathogenen abgeleitet sind, gegen die der Patient immun ist.

Eine alternative Strategie geht davon aus, entsprechend der statistischen Verteilung, die eine größere Bevölkerungsgruppe hinsichtlich der Immunität gegen verschiedene Pathogene aufweist, eine für diese Bevölkerungsgruppe einheitliche Tumorvakzine zu verwenden. Eine solche Tumorvakzine exprimiert dann ein Gemisch von Antigenen, die diese Verteilung abdeckt.

Die Voraussetzung für die vorliegende Erfindung, daß die zu behandelnden Patienten eine Immunität gegen das von den Tumorzellen der Tumorvakzine exprimierte Antigen aufweisen müssen, stellt für die Praxis keine Beschränkung dar. Aufgrund der vielfachen Kontakte mit Pathogenen, denen ein Mensch im Laufe seines Lebens ausgesetzt ist, existiert ein breites Spektrum von Antigenen, die für die Tumorvakzine in Frage kommen; es ist somit zu erwarten, daß praktisch die gesamte Bevölkerung auf diese Weise therapierbar ist.

Für einige Anwendungen, z. B. wenn beim Patienten aufgrund seines schlechten Immunstatus keine ausreichend starke Memory-Response zu erwarten ist, können dem Patienten als unterstützende Maßnahme allogene Zellen, die anstelle der wirtseigenen Zellen die Funktion der Memory-Zellen übernehmen, verabreicht werden, z. B. vor oder gleichzeitig mit der erfindungsgemäß verwendeten Tumorvakzine bzw. in Mischung damit. Als allogene Memory-Zellen sind z. B. die in der GB-A 2230790 beschriebenen geeignet.

Beispiele für Vertreter geeigneter Antigene sind das Membranprotein LMP des Epstein-Barr-Virus (Trivedi et al., 1991), Influenza-Nucleoproteine (Bowness et al., 1994; DiBrino et al., 1993), Tetanustoxin-Fragmente (Valmori et al., 1994; Reece et al., 1993), Adenovirus- Hüllprotein, bzw. Fragmente davon (Grunhaus et al., 1994; Hermiston et al., 1993), Hepatitis B-Virus- Antigen (Folgori et al., 1994; Lo Man et al., 1993), ein 10 kDa Protein von Mycobakterium tuberculosis (Barnes et al., 1992), Herpes simplex Virusantigene (Bonneau et al., 1993), oder Cytomegalovirusantigene (Berencsi et al., 1993).

Bezüglich der Größe der Moleküle besteht grundsätzlich keine Beschränkung, sofern der für den DNA-Transfer in die Zelle verwendete Vektor die Insertion großer Abschnitte erlaubt; eine etwaige Größenbeschränkung kann somit lediglich gegebenenfalls durch das im einzelnen verwendete Gentransfersystem bedingt sein, z. B. im Falle der Anwendung retroviraler Vektoren, die die Insertion einer Fremdsequenz von nur etwa maximal 7-10 kD erlauben.

Für die Transfektion der Tumorzellen können komplette cDNAs, die für ein Protein eines pathogenen Organismus kodieren, verwendet werden, wie Bakterien- oder Virusproteine, insbesondere Viruskapsidproteine (Marrack und Kappler, 1994). Es sind generell u. a. alle diejenigen Proteine geeignet, die auch für Impfungen gegen Infektionskrankheiten verwendet werden. Zahlreiche dieser Proteine wurden bereits kloniert und sind auf rekombinantem Weg herstellbar (vgl. oben). Neben den kompletten cDNAs können DNA-Fragmente verwendet werden, die für Antigene kodieren, wobei die Größenbeschränkung nach unten dadurch gegeben ist, daß eine MHC-Präsentation oder eine Antikörpererkennung der exprimierten Antigene erfolgen muß, was im allgemeinen bei einer Größe von mindestens 8 Aminosäuren gegeben ist. Im Falle der Verwendung von Fragmenten werden vorzugsweise solche Sequenzabschnitte eingesetzt, die für Epitope kodieren. Es sind Methoden verfügbar, von immunogenen Proteinen die epitopen Regionen zu charakterisieren und somit die Voraussetzung für die Verwendung von Epitopen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu schaffen (Folgori et al., 1994). Bevorzugt werden für eine Tumorvakzine mehrere Fragmente eingesetzt; die verwendeten Mischungen können verschiedene Epitope desselben Proteins sein oder auch aus jeweils einem oder mehreren Epitopen verschiedener Proteine bestehen.

Außer den für die natürlichen Proteine (bzw. Fragmente davon) kodierenden Sequenzen können auch Sequenzabschnitte für die Transfektion der Tumorzellen verwendet werden, die Mutationen aufweisen. Derartige Mutationen, die im Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren und/oder in Deletionen bestehen, dienen vor allem der Erhöhung der Stabilität des exprimierten Antigens, indem z. B. dessen Abbau in der Tumorzelle verlangsamt wird, oder der Verstärkung der Affinität des Antigens zum immunogenen Reaktionspartner.

Eine aufgrund der Mutation erzielte Verbesserung der Wirkung kann in Vergleichsversuchen getestet werden, indem z. B. nach Random-Mutation natürlicher Antigen- Sequenzen die erhaltenen Mutanten in Tumorzellen transfektiert und die erzielte Schutzwirkung mit der der natürlichen Antigene verglichen wird.

Eine weitere Modifikation der antigenen Sequenzen kann darin bestehen, Signal- bzw. regulative Sequenzen anzufügen, die im Hinblick auf die Erkennung des Antigens dessen möglichst vorteilhafte Präsentation fördern. Bei derartigen Signal- bzw. regulativen Sequenzen handelt es sich um natürliche oder von natürlichen Sequenzen abgeleitete, die normalerweise die Synthese und den Transport von zellulären Proteinen steuern, z. B. die GPI-Link-Sequenz (Powell et al., 1991; Chan et al., 1991; Robinson et al., 1991), die Signalsequenz von HSA oder die Insertion-Signalsequenz (Minev et al., 1994; Bacik et al., 1994).

Die Expression des Erkennungsantigens durch die Tumorzelle bewirkt entweder, daß dieses als solches direkt an der Zelloberfläche präsentiert wird (dies ist insbesondere bei Antigenen der Fall, die von Antikörpern erkannt werden), oder daß es innerhalb der Zelle prozessiert wird und ein Fragment davon an der Zelloberfläche mittels MHC- bzw. HLA-Molekülen präsentiert wird.

Die Verabreichung von Antigen-Mischungen ist von Vorteil, insbesondere um die erste Erkennung der Tumorvakzine durch den Wirt zu verstärken bzw. im Hinblick auf die Anwendung auf breitere Bevölkerungsschichten.

Vorzugsweise wird die Auswahl einer geeigneten Kombination von Erkennungsantigenen im Hinblick auf die Anwendung an einem Patienten, von dem man eine bereits gegen diese Antigene existierende Immunantwort von vornherein kennt bzw. diese vor Anwendung der Tumorvakzine bestimmt getroffen. Zweckmäßigerweise liegt für die erfindungsgemäß verwendete Tumorvakzine eine Auswahl von Antigenen in Form von gereinigten Plasmiden vor, die die jeweils dafür kodierende Sequenz enthalten.

Für die Transfektion der Tumorzellen können die für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen bekannten Standardmethoden verwendet werden, zu denen der Gentransfer mittels viraler Vektoren (Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus) oder physikalische Methoden (Transfektion mittels kationischer Peptide) zählen; Übersichten über gebräuchliche Methoden werden z. B. von Mitani und Caskey, 1993; Jolly, 1994; Vile und Russel, 1994; Tepper und Mule, 1994; Zatloukal et al., 1993, gegeben.

Ein bevorzugtes Verfahren für die Transfektion der Tumorzellen beruht auf der Grundlage der in der WO 93/07283 beschriebenen Methode, die auch auf die Herstellung von Tumorvakzinen anwendbar ist. Auf die Offenbarung der WO 94/21808 wird diesbezüglich Bezug genommen. Diese Methode benutzt ein Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einer Substanz mit Bindungsfähigkeit an die DNA, insbesondere einem Polykation wie Polylysin, und beruht auf rezeptorvermittelter Endozytose des Konjugat/DNA- Komplexes, wobei außerdem ein Mittel vorgesehen ist, das die Freisetzung des in die Zelle importieren Komplexes aus den Endosomen erleichtert, insbesondere ein inaktiviertes Adenovirus.

Diese Methode ermöglicht die besonders flexible Anwendung der Erfindung, indem für einzelne Tumorvakzinierungen auf einfache Weise individuell, z. B. mit mehreren Erkennungsantigen-Sequenzen, transfizierte Tumorzellen verwendet werden. Dafür werden z. B. aus einem Vorrat von Plasmiden, die jeweils ein oder mehrere verschiedene für ein Erkennungsantigen kodierende Sequenzen enthalten, das bzw. die jeweils gewünschten ausgewählt, mit geeigneten Konjugaten, z. B. Transferrin-Polylysin-Konjugaten und Adenovirus- Polylysin-Konjugaten, komplexiert und die Tumorzellen mit den so erhaltenen Transfektionskomplexen inkubiert.

Für die Herstellung geeigneter Vektoren steht eine große Auswahl von Standardplasmiden (s. z. B. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2. Auflage) zur Verfügung; diese müssen für die Eignung zur Herstellung der Tumorvakzine lediglich die an Vektoren generell gestellten Anforderungen erfüllen, daß sie geeignete Promotoren aufweisen, die eine effiziente Expression des Erkennungsantigens in der Wirtszelle ermöglichen; zweckmäßigerweise enthalten sie außerdem für die Züchtung in Bakterien erforderliche Sequenzen, wie Selektionsmarker.

Im Falle der Anwendung von Peptiden als Erkennungsantigene ist es auch möglich, statt die Zellen mit der kodierenden DNA zu transfizieren, die Peptide als solche in die Zellen einzubringen, was z. B. durch einfache Ko-Inkubation der Zellen mit den Peptiden ("in vitro loading") erzielt werden kann.

Die Tumorzellen der erfindungsgemäß verwendeten Tumorvakzine sind autologe (patienteneigene) und/oder allogene Zellen. Allogene Tumorzellen (aus Tumorzellinien) können verwendet werden, sofern die auf ihnen vorhandenen Antigene zumindest teilweise mit denen der autologen Tumorzellen des Patienten übereinstimmen. Beispiele für allogene Zellen, die als Grundlage für die Tumorvakzine dienen können, sind z. B. in der WO 91/06866 und in der US-A 5,030,621, beschrieben.

Die Tumorzellen werden inaktiviert, und zwar derart, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression des Antigens ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren.

Die Isolierung, Züchtung, Transfektion, Inaktivierung der Zellen, sowie gegebenenfalls die Formulierung der Tumorzellen mit geeigneten Hilfs- und Trägerstoffen, wird nach bekannten Methoden vorgenommen; bezüglich autologer Zellen wird insbesondere auf die Offenbarung der WO 94/21808 verwiesen.

Der Anteil der modifizieren Zellen an der Gesamtzahl der Zellen kann variiert werden, vorzugsweise beträgt er mindestens etwa 10%.

Das Erkennungsantigen wird von der Tumorzelle in einer Menge exprimiert und präsentiert, die einem ausgewogenen Verhältnis zwischen Erkennungsantigen und den auf der Zelle von vornherein enthaltenen Tumorantigenen entspricht, wodurch gewährleistet ist, daß, im Zuge der Memory-Response auf das Erkennungsantigen, die Tumorantigene miterkannt werden. Diese Menge kann z. B. mittels Serienversuchen festgelegt werden, in denen die Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen oder z. B. mit unterschiedlichen Vektoren, die eine verschieden starke Expression ermöglichen, transfiziert werden.

Die erfindungsgemäß verwendete Tumorvakzine kann gegebenenfalls mit zusätzlichen immunstimulierenden Maßnahmen kombiniert werden. Eine derartige Maßnahme kann darin bestehen, immunstimulierende Proteine, z. B. Zytokine, wie Interleukin-2, TNF-α, IFN-γ, etc. zuzusetzen und/oder die Tumorvakzine in Form einer Mischung von Tumorzellen, die das Erkennungsantigen exprimieren, mit anderen, ein oder mehrere immunstimulierende Proteine produzierenden Tumorzellen, wie sie z. B. in der WO 94/21808 beschrieben sind, oder Fibroblasten, zu verwenden.

Figurenübersicht

Fig. 1: Expression von Heat1 auf transfizierten COS-7- Zellen,

Fig. 2: Western Blot von Heat-Shock-Protein-Derivaten,

Fig. 3: Hemmung des Tumorwachstums durch M3-Zellen, die Heat1 exprimieren,

Fig. 4: Verlust der Tumorigenizität von Wildtyp-M3- Zellen in vorimmunisierten und mit Heat1 exprimierenden M3-Zellen behandelten Versuchstieren,

Fig. 5: Immunhistologischer Nachweis der Beteiligung von T-Zellen an der Reaktion auf die Tumorvakzine.

Um die prototypische Funktion des Antigen-Targeting von der der natürlichen Immunogenizität zu unterscheiden und um eine rasche Kontrolle der Qualität der Transfektionen mittels FACS-Analyse zu ermöglichen, wurde für die folgenden Beispiele, die die Erfindung illustrieren, als Erkennungsantigen stellvertretend ein Hybridmolekül, enthaltend ein verkürztes hsp65, das mit der Zelloberflächenmembran über ein GPI-Link verbunden ist, konstruiert.

Beispiel 1 a) Konstruktion des Plasmids pHeat1, kodierend für das BCGhsp65/HSA-Hybridprotein

Zur Herstellung des Expressionsvektors wurde in den Vektor pCDNA1 (Invitrogen) eine cDNA inseriert, die der Reihe nach für die folgenden Regionen kodierte: i) die Signalpeptidregion des Maus-HSA ("heat stable antigen") (Kay et al., 1990); ii) die Sequenz, kodierend für die Aminosäuren 30 bis 480 des BCG-hsp65-Proteins; iii) die GPI-Link-Attachment und Austauschsignalregion des Maus- HSA. Diese Sequenzen wurden wie folgt erhalten:

i) unter Vorlage des Plasmids pAX111 wurde eine PCR- Reaktion mit den Primern 5′-TACGACTCACTATAGGGAGACCGG-3′ und 5′-GGCCCGGGCCCGGAGCAACAGCTGTTTG-3′ durchgeführt und die erhaltenen Reaktionsprodukte mit HindIII und ApaI verdaut;
ii) wurde erhalten durch Verdau des Plasmids pRIB1300 (Thole et al., 1987) mit ApaI und AccI;
iii) PCR-Produkt der Primer 5′- GCTCTAGAGTCTACAGAGGGGGTGGCAGCTCC-3′ und 5′- GCTCTAGAATTCTCCGTGTTTCTGTT-3′ (unter Vorlage des Plasmids pAX111), geschnitten mit XBaI und EcoRI.

Die Fragmente i) und iii) wurden getrennt in pUC19 (Pharmacia) subkloniert, die ein Insert enthaltenden Plasmide wurden mittels Restriktionsanalyse identifiziert und Fragment i) mit HindIII/ApaI- und Fragment iii) mit AccI und EcoRI-Verdau freigesetzt. Die isolierten drei Fragmente wurden in ein HindIII/EcoRI geschnittenes und gereinigtes pUC19- Plasmid hineinligiert; Klone mit der korrekten Reihenfolge i → ii → iii mittels enzymatischem Verdau bestätigt und unter der Kontrolle des CMV/T7-Promotors (Boshart et al., 1985) in den Expressionsvektor pCDNA1 überführt. Der Vektor pHeat2 wurde erhalten, indem ein EcoRI/Sali-Fragment des Plasmids pRIB1300, das die komplette kodierende Sequenz von hsp65 enthält, in pCDNA1 überführt wurde. Die Struktur der beiden Konstrukte wurde mittels Sequenzanalyse bestätigt.

b) Charakterisierung der rekombinanten Proteine

Zellen der Maus-Melanomzellinie Cloudman S91 (Klon M3; ATCC No. CCL 53.1; Zatloukal et al., 1995) bzw. COS-7- Zellen (ATCC CRL1651) wurden in 6 cm Plastikschalen oder T25 Kulturflaschen, beschichtet mit 0.1% Gelatine, in DMEM-Medium, enthaltend 10% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet und anschließend transfiziert.

Die Transfektion der Zellen mit dem Vektor pHeat1 wurde mittels der als "Adenovirus-unterstützten Transferrinfektion" bezeichneten Methode transfiziert (Cotten et al., 1992). Die Transfektionskomplexe wurden hergestellt, indem zunächst biotinyliertes, 8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl 1014 in 100 µl HBS (1.2 × 10¹² Partikel pro ml) mit streptavidinyliertem Polylysin 290 (StreptpL) in 100 µl HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Daraufhin wurden 6 µg Plasmid-DNA in 150 µl HBS beigegeben, gut gemischt und weitere 30 min inkubiert wurde. Dann wurde Polylysin-modifiziertes humanes Transferrin (TfpL) in 150 µl HBS beigegeben, gründlich gemischt und 30 min inkubiert.

3 ô 10⁵ Zellen wurden mit Komplexen behandelt, die 3 × 10⁹ Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, 6 µg pCMVL und 6.8 µg TfpL enthielten. Nach der Transfektion wurde das Kulturmedium gewechselt, und die Zellen wurden vor der Weiterverwendung 24 h stehen gelassen.

Dann wurden die Zellen unter Verwendung der von Zatloukal et al., 1995, beschriebenen Methode (FACS- Analyse, "Fluorescence Activated Cell Scanning") mit Antikörpern der Bezeichnung IIH9, IVD8, CBA1, HAT5, IIC8 ( es handelt es sich um kreuzreaktive monoklonale Antikörper gegen M. leprae oder M. tuberculosis (Young et al., 1.992); die Antikörper wurden bezogen von Hansen Disease Laboratories, CDC, Atlanta, GA.), J11d (ATCC Nr. TIB 183) sowie polyklonalem anti-BCG-Serum (Dako) gefärbt.

Andererseits wurden die Expressionsprodukte im Western- Blot nachgewiesen.

i) Charakterisierung in COS-7-Zellen

Das Heat1-Hybridprotein in COS-7-Zellen exprimiert, weil diese Zellen durch episomale Replikation des Vektors eine hohe Expression erlauben (Simmons, 1993).

Das GPI-Austauschmotiv am N-Terminus des Konstrukts ergibt ein Endprodukt mit einer GPI-Verankerung, die gegen ein Protein auf der äußeren Oberfläche der Zellmembran gerichtet ist und daher eine Identifizierung von positiven Zellen mittels FACS- Analyse erlaubt. Das Ergebnis der Charakterisierung mit den diversen Antikörpern gegen Mitglieder der 65 kDa Heat Shock-Proteinfamilie aus verwandten Mykobakterien, die verwendet wurden, um das gereinigte rekombinante hsp65 und das Heat1-Protein zu erkennen, ist in Tab. I dargestellt.

Die Expression von Heat1 auf transfizierten COS-7- Zellen ist in Fig. 1 dargestellt: In der Figur zeigen die Tafeln a, b und c die Expression in COS-Zellen, die mit dem Plasmid pAX111, das die für Maus-HSA kodierende Sequenz enthielt, transfiziert waren; die Figuren d, e und f zeigen die entsprechenden Versuche mit pHeat1. Die Ergebnisse mit 24 h lang inkubierten Zellen, die mit dem monoklonalen Antikörper HAT5 gefärbt wurden, sind auf den Tafeln b und e, die mit J11d gefärbten in c und f, und die nur mit dem FITC-markierten Ziegen anti-Maus-Reagens behandelten sind in a und d dargestellt. Die Regionen entsprechend 0-95%, 95-99% und 99-100% der Kontrollen sind mit horizontalen Linien der Bezeichnung 1, 2 und 3 kenntlich gemacht, um die Wirkung der Transfektion sichtbar zu machen. Es zeigte sich, daß die Transfektion der Zellen mittels Adenovirus-unterstützter Transferrinfektion eine spezifische Expression des Heat1-Proteins bewirkte, die mit dem monoklonalen Antikörper HAT5 erkannt wurde. Nicht transfizierte COS-7-Zellen reagierten weder mit HAT5 noch mit dem Maus-HSA-spezifischen monoklonalen Antikörper J11d, während Zellen, die mit dem Plasmid pAX111 transfiziert waren, das für das Maus-HSA kodiert, mit J11d, nicht jedoch mit HAT5 angefärbt wurden.

ii) Charakterisierung in M3-Zellen

Auch in der Maus-Melanomzellinie M3 wurde die Expression von Heat1 nachgewiesen mittels FACS-Analyse, wobei eine etwas geringere Anzahl von M3-Zellen eine hohe Expression zeigten als die COS-7-Zellen (23% gegenüber 50%, was offensichtlich auf eine bessere Transfektierbarkeit von COS-7-Zellen zurückzuführen ist).

iii) Nachweis im Western Blot

Lysate von Heat1-transfizierten COS-7-Zellen wurden auf 10% nicht-reduzierenden Gelen mit SDS-PAGE aufgetrennt und das rekombinante Protein mittels Western Blot unter Verwendung einer Mischung der oben aufgezählten Antikörper als Primärantikörper nachgewiesen. Die für die Vorimmunisierung zu verwendenden Präparate des rekombinanten bakteriellen hsp65 wurden quantitativ bestimmt, indem sie in einem Sandwich-ELISA unter Verwendung des polyklonalen anti-BCG-Serums als Beschichtungsantikörper und den monoklonalen Antikörpern IIH9 oder IIC8 als markierter Antikörper mit einem Standardpräparat verglichen wurden.

Ein Pool von hsp65-kreuzreaktiven Antikörpern erkannte ein Standardpräparat von rekombinantem hsp65 (Thole et al., 1987), einen gereinigten Extrakt von E.coli, der das rekombinante hsp65 exprimiert (B032) sowie das Heat1-Protein im Lysat von pHeat1-transfizierten COS-7- Zellen. Nicht-transfizierte Kontrollzellen und HSA- exprimierende COS-7-Zellen zeigten keine Reaktivität (Fig. 2). Das Heat1-Protein erschien in Mehrfachbanden, von denen zwei Hauptbanden deutlich identifiziert werden konnten: eine scharfe Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kDa (in Übereinstimmung mit dem auf Grundlage der kodierenden Sequenz berechneten Molekulargewicht) und ein Pool bei ca. 70 kDa (möglicherweise Vorläufer des reifen Produkts, deren Molekulargewicht höher ist als erwartet, entweder weil der N-terminale Teil noch nicht durch die GPI-Gruppe ersetzt ist, und/oder weil einige mögliche Glykosylierungsstellen, die vom HSA-Teil des Heat1- Hybrids stammen, einen hohen Mannoseanteil aufweisen).

c) Herstellung der Tumorvakzine

M3-Tumorzellen wurden gezüchtet, wie unter b) beschrieben. Wo erforderlich, wurden die Zellen mit 50 Gy mit einem Gammastrahlengerät (Nordion, Kanada) bestrahlt.

Beispiel 2 a) Vorimmunisierung von Mäusen

6 bis 8 Wochen alte Mäuse wurden subkutan oder intraperitoneal mit

i) 5 × 10⁵ Zellen von lebendigem M. bovis BCG, Stamm Pasteur, zugelassen für den Gebrauch im Menschen, gemischt mit inkomplettem Freund′s Adjuvans (IFA) in einem Gesamtvolumen von 100 µl; oder mit
ii) zwei 100 µg Dosen rekombinantes hsp65 in IFA (Incomplete Freund′s Adjuvans); oder mit
iii) ca. 10⁹ Zellen E.coli M1456, enthaltend das hsp65- Expressionsplasmid, nach Bestrahlung mit 50 Gy injiziert und vor den weiteren Behandlungen 4 bis 15 Wochen ruhen gelassen.

b) Behandlung von vorimmunisierten Mäusen mit einer Tumorvakzine aus Heat1 exprimierenden M3-Zellen

i) Um das Auswachspotential der Heat1 exprimierenden Zellen zu bestimmen, wurden 10⁵ transfizierte Zellen ohne Bestrahlung den Mäusen nach der Ruheperiode subkutan injziert.

Für die Impfung wurden 10⁵ der transfizierten M3-Zellen 24 h nach der Transfektion bestrahlt und 2 × mit einer Woche Abstand subkutan den Versuchstieren injiziert. Nach einer weiteren Woche erhielten die Mäuse zwecks Tumorsetzung 10⁵ Wildtyp-M3-Zellen. Das Wachstum der Tumore wurde mittels wöchentlicher Größenbestimmung der Tumore verfolgt. Der Tumorindex wurde nach der Formel TI = (x+0.5)×(y+0.5)×(z+0.5)-0.5³ berechnet, wobei x, y und z die Dimensionen darstellen und alle Angaben in mm ausgedrückt sind (diese Formel gibt einen Meßfehler von 0.5 mm wieder und ermöglicht es, quasi zweidimensionale Tumore, d. h. solche, die keine meßbare dritte Dimension haben, zu beurteilen, während der berechnete Tumorindex proportional dem Tumorvolumen bleibt).

Die immuntherapeutische Behandlung der Mäuse wurde durchgeführt, indem 10⁵ pHeat1-transfizierte M3-Zellen (nicht bestrahlt) subkutan injiziert wurden in
unbehandelte Mäuse;
mit löslichem rekombinantem hsp65 vorimmunisierte Mäuse;
mit ganzem BCG vorimmunisierte Mäuse.

Im Anschluß daran wurde das Tumorwachstum verfolgt: die Entwicklung der Tumore in den Gruppen von Mäusen, die unbehandelt waren und die mit rekombinantem hsp65 vorimmunisiert waren, verlief ähnlich wie in der Kontrollgruppe, die mit nicht-transfizierten M3-Zellen behandelt worden war, während die meisten mit BCG vorimmunisierten Mäuse tumorfrei blieben und ein Tier verlangsamtes Tumorwachstum zeigte. Der Verlauf dieser Experimente ist in Fig. 3 dargestellt, wobei der Tumorindex auf der Ordinate dargestellt ist: a zeigt die Versuche mit Heat1 exprimierenden M3-Zellen, die in naive Mäuse injiziert wurden; b zeigt den Verlauf der Tumorbildung bei Mäusen, die mit Lebend-BCG vorimmunisiert waren; für die in c dargestellten Versuche wurde lösliches rekombinantes hsp65 verwendet. Der Tumorindex ist als dicke Linie für jedes Tier eingezeichnet, das einen Tumor entwickelte, d.s. 3 von 4 in a, 1 von 4 in b und 4 von 4 in c. Diese Versuche zeigen somit, daß M3-Melanomzellen, die Heat1 exprimieren, ihre tumorigene Wirkung in BCG- vorimmunisierten Tieren verlieren.

ii) Um die Schutzwirkung der Tumorvakzine gegen Tumorbildung nach Tumorsetzung mit Wildtyp-M3-Zellen festzustellen, wurde wie folgt vorgegangen:
Die Mäuse wurden zunächst vorimmunisiert, wie oben angegeben. Nach zwei Immunisierungen (einwöchiger Abstand) mit Tumorvakzinen aus 10⁵ pHeat1-trans fizierten, bestrahlten M3-Zellen wurden die Mäuse nach einer weiteren Woche Ruhepause mit 10⁵ Wildtyp-M3- Zellen behandelt, was einer 100fachen tumorigenen Dosis entsprach.

Im Zuge dieser Versuche, deren Ergebnis in Fig. 4 dargestellt ist (die Art der Darstellung ist analog wie in Fig. 3), wurde eine erste Gruppe mit Lebend-BCG vorimmunisiert und nach 6 Wochen Ruhezeit mit der Tumorvakzine aus Heat1-transfizierten M3-Zellen immunisiert. Nur eines von 8 Versuchstieren entwickelte einen Tumor mit annähernder Wildtyp-Kinetik, während alle anderen nach der Tumorsetzung tumorfrei blieben (Fig. 4a). In einem Parallelversuch entwickelten einige Mäuse 2 Wochen nach der Tumorsetzung kleine, dunkel pigmentierte Flecken. Diese Flecken zeigten kein Wachstum und schienen die Gesundheit der Tiere nicht zu beeinträchtigen.

Eine zweite Versuchsgruppe von Mäusen erhielt bei ansonsten identischen Versuchsparametern die Präimmunisierung in Form von je 50 µg bakteriellem rekombinantem hsp65. Die Erfolgsrate war ähnlich wie in der ersten Gruppe, wobei auch hier nur ein Tier einen Tumor mit Wildtyp-Kinetik entwickelte (Fig. 4b).

In einer dritten Versuchsgruppe (Kontrolle für die Vorimmunisierung) wurden Mäuse mit ganzen bestrahlten E.coli Bakterien des Stammes M1456, die das rekombinante hsp65-Protein exprimieren, immunisiert. 6 von 8 Tieren aus dieser Gruppe entwickelten nach der Behandlung mit M3-Wildtypzellen Tumore, meistens mit Wildtyp-Kinetik (Fig. 4c).

Eine vierte Versuchsgruppe diente zur Kontrolle für die tumorspezifische Immunisierung. Die Mäuse dieser Gruppe wurden nach Prä-Immunisierung mit Lebend-BCG mit M3- Wildtypzellen behandelt, ohne vorher mit den Tumorvakzinen aus Heat1-transfizierten M3-Zellen immunisiert worden zu sein. Alle Tiere aus dieser Gruppe entwickelten Tumore (Fig. 4d).

Beispiel 3 Beteiligung von T-Zellen an der Reaktion auf die Tumorvakzine

In Versuchen mit IL-2 sekretierenden Tumorvakzinen war gefunden worden, daß u. a. makrophagenähnliche Zellen, Granulozyten und NK-Zellen für die Eliminierung dieser Inokula verantwortlich sind, während jedoch keine Beteiligung von T-Zellen nachgewiesen worden war.

Für die entsprechende immunhistologische Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Tumorvakzine wurden von den Versuchstieren Schnitte hergestellt, wie von Zatloukal et al., 1995, beschrieben, und mit den folgenden Antikörpern inkubiert: 145-2C11-Biotin (CD3), RM4-5-Biotin (CD4), 53-6. 7-Biotin (CD8), B220-Biotin (CD45-R), M1/70 (Mac-1, CD11b), Gr-1 (RB6-8C5), (alle diese Antikörper wurden von Pharmingen bezogen); F4/80- Biotin (Serotec) und anti-Asialo-GM1-Antiserum (Wako Chemicals). Streptavidin-alkalische Phosophatase (Boehringer Mannheim) oder Kaninchen-anti-Kaninchen alkalische Phosphatase (Serotec) wurden als FITC-mar kierte Antikörper eingesetzt.

Im Gegensatz zu den von Zatloukal et al., 1995, erhaltenen Ergebnissen wurde festgestellt, daß nach Injektion von pHeat1-transfizierten Zellen in Mäuse, die mit Lebend-BCG vorimmunisiert waren, mit anti-CD3- und anti-CD4-Antikörpern eine geringe, jedoch signifikante Anzahl positiver Zellen nachweisbar ist (Fig. 5: a: F4/80, b: CD11b, c: CD4 (jeweils 50fache Vergrößerung), d: CD3 (100fache Vergrößerung). Positive Zellen sind mit Pfeilspitzen markiert. Insgesamt ähnelte die qualitative Zusammensetzung der Zellpopulation derjenigen, die an der Stelle der Tumorsetzung in IL-2-Tumorvakzin-behandelten Mäusen beobachtet wurde (Zatloukal et al., 1995).

Tabelle I

Reaktivität von Antikörpern gegen hsp65-Derivate

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Claims

1. Verwendung einer Vakzine, die inaktivierte proliferationsunfähige autologe und/oder allogene Tumorzellen enthält, welche derart modifiziert sind, daß sie ein oder mehrere Antigene enthalten, zur Behandlung von Tumoren bei Individuen, in denen bereits eine Immunantwort auf das enthaltene oder die enthaltenen Antigene existiert.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen mit rekombinanter DNA transfiziert sind, die eine oder mehrere für ein Antigen kodierende Sequenzen enthält.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA Plasmid-DNA ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA ein retroviraler Vektor ist.

5. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA ein adenoviraler Vektor ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einem Humanpathogen abgeleitet ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einem Virusprotein abgeleitet ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Protein oder Proteinfragment von Epstein- Barr-Virus, Influenza-Virus, Adenovirus, Hepatitis B- Virus, Herpes simplex Virus oder Cytomegalovirus, oder ein Derivat davon ist.

9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einem bakteriellen Protein abgeleitet ist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Mycobacterium-Protein abgeleitet ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Mycobacterium tuberculosis abgeleitet ist.

12. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Mycobacterium bovis abgeleitet ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Bacillus Calmette Guerin abgeleitet ist.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Heat Shock Protein oder ein Fragment oder Derivat davon ist.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen hsp65 oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen mit einer Sequenz modifiziert ist, die von einer natürlichen Signal- oder regulatorischen Sequenz abgeleitet ist, die normalerweise Synthese und/oder Transport zellulärer Proteine steuert.

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe GPI-Link- Sequenz, Signalsequenz von MSA und Insertion- Signalsequenz.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen gegenüber dem natürlichen Antigen eine oder mehrere Mutationen aufweist.

19. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zellen einer Tumorzellinie enthält.

20. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Fibroblasten enthält, die ein oder mehrere Zytokine exprimieren.

21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interleukin-2 ist.

22. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen außerdem ein oder mehrere Zytokine enthalten.

23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interleukin-2 ist.