JP5082125B2 - 新規微生物及び生分解性プラスチック分解酵素 - Google Patents
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Description
現在、農業資材以外の目的に生産されたものも含めて、生分解性プラスチックの国内生産量は10万tを超えたと推測されている。また、これまでに土壌や汚泥、空気等から採取された微生物から生分解性プラスチック分解酵素が単離されている(特許文献1、2、3)。しかしながら、農業資材に必要な強度と生分解性のバランスは難しく、資材に強度を持たせると生分解性が充分に発揮されないといった問題が存在する。また、生分解性プラスチックの種類によっては通常の条件では分解しにくい場合もある。従って、この問題を解決するため、より高い生分解性プラスチック分解活性を有する微生物、及び該微生物の生産する酵素を得ることが求められている。
すなわち、本発明は、不完全菌類の無胞子不完全菌目(Agonomycetales)に属する糸状菌であって、該糸状菌を接種した固体培地上に置いた分子量14-15万のPBSからなる4cm2、厚さ2μmのフィルムを25℃の温度条件下で10日間静置した場合に、該フィルムを面積換算で90%以上分解する、糸状菌を提供する。
さらに、本発明は前記糸状菌の生産する生分解性プラスチック分解酵素を提供する。
さらに、本発明は、(a) 前記糸状菌を生分解性プラスチックを含む培地で培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、(b) 培養液から生分解性プラスチック分解酵素を精製する工程、を含む生分解性プラスチック分解酵素の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、前記方法により得られる、分子量がSDS電気泳動法で約18〜22kDaの生分解性プラスチック分解酵素を提供する。
さらに、本発明は、後述する配列番号4〜8に示されるアミノ酸配列を含み、分子量がSDS電気泳動法で約18〜22kDaであり、かつ、PBSおよびPBSAの分解活性を有するタンパク質を提供する。
さらに、本発明は、前記生分解性プラスチック分解酵素またはタンパク質と生分解性プラスチックとを接触させることを含む、生分解性プラスチックを分解する方法を提供する。
さらに、本発明は、前記糸状菌、および/または、前記生分解性プラスチック分解酵素またはタンパク質を含む、生分解性プラスチック分解製剤を提供する。
さらに、本発明は、配列番号21の配列を含むタンパク質、及び、配列番号21の配列のアミノ酸の1もしくは数個が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、PBSおよびPBSAの分解活性を有するタンパク質を提供する。
さらに、本発明は、前記タンパク質と生分解性プラスチックとを接触させることを含む、生分解性プラスチックを分解する方法を提供する。
さらに、本発明は、前記タンパク質を含む、生分解性プラスチック分解製剤を提供する。
さらに、本発明は、培地に含まれる生分解性プラスチックがPBSAペレットである、前記生分解性プラスチック分解酵素の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、(c) 上記糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地に加える工程、(d) 糸状菌を培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、(e) 工程(d)の培養液を回収する工程、(f) 培養液を回収した後の培養容器に残存する糸状菌に新たな培地を加える工程、(g) 工程(d)-(f)を繰り返す工程、を含む生分解性プラスチック分解酵素の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、(h) 上記糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地で培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、(i) 培養液の上清を凍結乾燥させる工程、を含む、生分解性プラスチック分解酵素粉末の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、上記方法により製造される生分解性プラスチック分解酵素粉末を提供する。
上記の分解試験の方法は当業者に知られており、例えば後述する実施例に記載の方法により行うことが可能である。また、PBS及びPBSAの生分解性プラスチックは多く市販されており、当業者は上記の分解性試験に用いるのに適したフィルムを容易に準備または調製することが可能である。また、糸状菌を接種した固体培地は、糸状菌がその生分解性プラスチック分解活性を有効に発揮するように調製することが可能であり、具体的には、例えば後述の実施例に示したようにフィルム中心となる位置に5mm角の菌体を接種して使用することができる。培地の組成についても当業者が任意のものを選択することができる。また、面積換算での分解率の解析は、後述の実施例に示す画像解析などにより、例えばフィルムの輝度を測定することにより調べることができる。
(培養条件)
培地名:ポテトデキストロース寒天培地
培地の組成:
ポテト 200g
ブドウ糖 20g
寒天 20g
蒸留水 1L
培地のpH(滅菌前):5.6
滅菌温度・時間:121℃ 15分
培養温度:25℃
培養期間:7日
酸素要求性:好気性
・上記のジャガイモブドウ糖寒天培地で培養2日後にはコロニーの生育が認められる。
・コロニーの表面は灰白色で裏面は暗オリーブ色の菌叢が生育する。
・ジャガイモブドウ糖寒天培地の他に、コーンミール寒天培地およびオートミール寒天培地上においても同様の生育を示す。
・最適生育条件:25℃、pH5〜9
・生育の範囲:5℃〜35℃、pH3〜10
・その特徴的な形態は以下の通りである。
- 栄養菌糸(vegetative hyphae)は、暗褐色に着色し、寒天表面上もしくは寒天内に形成され、有隔壁菌糸の形成が認められる。
- 菌糸幅はほぼ一定で、菌糸の表面は平滑(smooth)である。かすがい連結(clamp connection)の形成は確認できない。
- 長期間培養しても分生子(conidium)、厚壁胞子(chlamydospore)およびテレオモルフ(teleomorph)の形成は認められない。
(a) 本発明の糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地で培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、
(b) 培養液から生分解性プラスチック分解酵素を精製する工程。
また別の例では、本発明の酵素と基質(PBSA)との親和性及びPBSAが水系溶媒に不溶であることを利用して簡便に精製することが可能である。例えば、限外ろ過によって濃縮及び緩衝液(10mM PIPES、 pH6.8)交換した培養液にPBSAエマルジョンを添加した後遠心分離によって酵素-PBSA複合体を沈殿させ、他のタンパク質等の夾雑物を含む上清を除き、5mM CaCl2を含む10mM Tris-HCl(pH8.0)で酵素-PBSA複合体を再懸濁して30℃下PBSAを完全に分解させ、最終的に透析あるいは限外ろ過によってPBSAの分解物を除去することにより純粋な酵素溶液を得ることができる。
また、本発明の方法により製造された酵素はPBSA及びPBSの分解活性を有する。精製された生分解性プラスチック分解酵素の活性は、例えば、PBSAエマルジョンを20mM Tris-HCl (pH6.8)に懸濁した、吸光度(OD660)が約0.5の水溶液1.8mlを口径13mmの試験管に入れ、粗酵素液や、微生物培養上清液を200μl加え、Spectronic20A(島津)等の装置を用いて透過率を測定することにより判定することができる。
(c) 上記糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地に加える工程、
(d) 糸状菌を培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、
(e) 工程(d)の培養液を回収する工程、
(f) 培養液を回収した後の培養容器に残存する糸状菌に新たな培地を加える工程、
(g) 工程(d)-(f)を繰り返す工程。
1.生分解性プラスチック分解微生物の単離
マルチフィルムの多くが、コハク酸系ポリエステル[ポリブチレンサクシネート(PBS)およびアジピン酸エステルとの混合物(PBSA)]で作られていることから、これらの生プラ分解能力を持つ微生物を、自然界、および保存菌株から探索した。
分離方法としては、始めに寒天平板培地上でPBSAエマルジョン(分子量約1万、1%)分解菌を選抜し、次に、これらの菌から、PBSAおよびPBSのマルチフィルム(分子量約14-15万、厚さ2μm)を分解する菌を選抜する、2段階の選抜方法を作った。
糸状菌用誘導型酵素生産株選択培地(FMZ: Czapek-Dox Minimum Medium)
下層
上層B
9cmシャーレに約15mlの下層平板培地を作り、固まった後に45℃のインキュベーター内に保存した。その間に、スターラーを入れた三角フラスコ内で溶解・殺菌した上層Bを約5ml重層した。このとき、上層Bはスターラーで撹拌し、油が均一に混ざるようにした。抗生物質としてクロラムフェニコールを最終濃度40ppmで加えた。
「透過原稿ポジフィルムモード300dpiで膜をスキャンする。解析にはAquacosmos ver2.0を用い、画像をTIFFファイル(グレースケール)で保存する。Aquacosmos上でファイルを開き、計測ウインドウでツールバーを選択して、ドラッグでプラスチック膜の絵を一枚囲う。「前回と同じ計測ウインドウを作成」を選んで、取り込んだ画像上の全ての膜を、同じ大きさの独立した計測ウインドウとして選定する。(この時に未処理の膜および、膜のない白色に抜けた場所も、コントロールとして同じように囲う。)解析メニュー内の「領域解析」から各領域の輝度の計算を行う。コントロールをもとに、膜の分解量を計算する。」
(計測した膜の輝度−未分解膜の輝度)/(白い画面の輝度−未分解膜の輝度)X100=分解(%)
また、当該菌は未精製の培養ろ液においても夾雑タンパク質がほとんど無く、高純粋な分解酵素のみを分泌する能力を示した(図4、M:マーカー、1:酵素液ろ液、2:アフィニティーを利用した精製物)。従って、本発明の糸状菌を宿主として用いることにより、高純度な異種タンパク質を生産することも可能である。前記異種タンパク質の生産は常法により行うことが可能であり、例えば、本発明の糸状菌の生分解性プラスチック分解酵素の遺伝子と異種生物の遺伝子を遺伝子組み換え技術で入れ換え、生分解性プラスチック分解酵素遺伝子の一部と異種生物遺伝子を融合し、生分解性プラスチック分解遺伝子の分泌シグナルのすぐ下流に異種生物遺伝子を接続することにより、前記異種遺伝子由来のタンパク質の生産を誘導することができる。
また、本菌はPBSAやPBS以外の生分解性プラスチックである、ポリカプロラクトン(PCL)の分解能も有していた。分子量4万のPCL 0.25gを5 mlのジクロロメタンで溶解し、その後ドラフト中で直径9cmのペトリ皿に溶解液を薄く伸ばし、ジクロロメタンを揮発させPCLの膜を作成し、PBSA同様に膜の分解率を測定したところ処理後10日間で53.0%分解した。
本菌はジャガイモブドウ糖寒天培地、素寒天培地、ジャガイモニンジン寒天培地、コーンミール寒天培地、オートミール寒天培地、V-8寒天培地、Sabouraudブドウ糖寒天培地、Czapek-Dox寒天培地、Foust寒天培地の8種類の各種培地、近紫外線照射、有傷などの処理を行って培養したが、胞子の形成は全く認められなかった。そこで、ジャガイモショ糖液体培地で3日間培養後、菌体を液体窒素で磨砕し、QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen社製)によりDNAを抽出し、遺伝子解析を行った。DNA抽出液にWhite et al. (1990)の方法に基づき、ITS1 と ITS4の2つのPCRプライマーの含まれた反応混合液を加え、変性(95℃30秒間)、アニーリング(55℃30秒間)、伸長(72℃2分間)のPCR条件で35サイクル繰り返し、DNAの増幅を行った。増幅したrDNAのITS1-5.8SrDNA-ITS2領域を、Dye Terminator法でダイレクトシークエンスを行い塩基配列を決定し、日本DNAデーターバンク(DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)においてBLAST検索を行った。その結果、子のう菌類のNeoplaconema gloeosporioidesのITS1-5.8SrDNA-ITS2の塩基配列と97%の高い相同性が示され、本菌はNeoplaconema属に近縁の子のう菌系の不完全菌類であることが示された。
なお、上記解析の詳細は、以下の文献の記載に準じて行った。
White TJ, Bruns TD, Lee SB, Taylor, JW (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.
In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR Protocols, a guide to methods and applications. Academic, San Diego, CA, pp 315-322.
また、使用したプライマーの配列は以下の通りである。
ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCG (配列番号2)
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(配列番号3)
未同定菌株 47-9の斜面培地(ポテト・デキストロース寒天培地)から10白金耳ずつを100mlの糸状菌用誘導型酵素生産培地 (FMZ: Fungal Minimum Medium Czapek-Dox Base)で培養した。培地組成はNaNO3 0.2 %、KCl 0.05%、K2HPO4 0.1%、MgSO4・7H2O 0.05%、FeSO4・7H2O 0.001%(オートクレーブ後、別殺菌したものを加えた)、PBSAエマルジョン 1.0 %(ビオノーレエマルジョンEM-301 昭和高分子株式会社製)であった。培養条件は、300ml容の三角フラスコで90rpm/minで28℃で7日間培養し、この培養液をろ過した上清から酵素を精製した。
上記の47-9株の培養液上清から精製した生分解性プラスチック分解酵素の内部アミノ酸配列を決定した。
前記酵素をトリプシンで分解し、以下の条件のHPLCカラムで分離したもののうち、1番、2番、3番、4番および5番のピークN末端配列を特定した(図5参照)。
HPLC条件
カラム 逆相 C18
サイズ 2mmID × 150mm
溶媒 A=0.1%TFA B=0.075TFA/MeCN
流速 0.2ml/分
検出 216nm
画分 0.1ml/画分 開始:20分、終了:70分
1番:GGIPGYPQDR(配列番号:4)
2番:NEAPAFLISK(配列番号:5)
3番:GSTETGNLGTLGAPLGDALE(配列番号:6)
4番:YGASNVWVQGVGGPYDAALGDNALP(配列番号:7)
5番:VVAGGYSQGAALAAAAISDAST(配列番号:8)
栄研2号角形シャーレ(縦10cm 横14cm 高さ1.5cm:栄研化学株式会社製)に園芸培土(くみあい園芸用育苗培土:呉羽化学社製)を70g敷きつめ、その上にPBS、PBSA、およびPBS/PBSA混合フィルム(ビオマルチ:タキイ種苗社製)(厚さ 20μm)をシャーレ同型(縦10cm 横14cm)に切断したものを置いた。ガーゼでろ過した酵素液70mlを上から注ぎ、30℃の恒温器に静置した。なお、酵素液は、47-9菌株の斜面培地(ポテト・デキストロース寒天培地)から20白金耳ずつを、2L容の三角フラスコ中の1Lの糸状菌用誘導型酵素生産培地で90rpm/minで28℃で14日間培養し、この培養液をガーゼでろ過した上清を用いた。
培養6日後には各フィルムに当該菌が生育し、分解が認められた(図6)。各フィルムをはがし、蒸留水で洗浄後に充分乾燥させて重さを量り、対照との比を求めた(3反復)。
その結果PBSAフィルムが最も分解しており、マルチフィルム全面が崩壊していて剥がすことができず、対照に比べて91.2%のフィルムが分解された。PBSおよびPBS/PBSA混合フィルムはそれぞれ23.7%と14.6%分解した。分解は空気と触れていると効果が高く、栄研2号角形シャーレの底に各種フィルムを敷いてから土を入れた場合は各フィルムともほとんど分解されなかった。
上記の4で特定した生分解性プラスチック分解酵素の、配列番号7及び4の内部アミノ酸配列に含まれる「NVWVQG」および「PGYPQD」の配列をもとに、プライマーF6(5’-aaygtytgggtccaggg-3’)(配列番号9)およびR10(5’-tcctgrgggtanccgg-3’)(配列番号10)を設計、合成した。一方、Wizard Genomic DNA Purification Kit(プロメガ社)を用いて47-9株のゲノムDNAを抽出した。
抽出したゲノムDNAを鋳型にし、設計した前記プライマーを用いてPCRを行った結果、約350bp(F6-R10増幅断片)が得られた。F6-R10増幅断片の塩基配列を解読し、結果をもとに、さらにプライマーTSP1-1(5’-aagggcgttgtcaccaagag-3’)(配列番号11)、TSP1-2(5’-ttgtcaccaagagctgcgtcgta-3’)(配列番号12)、TSP1-3(5’-acgccctggacccaaacatt-3’)(配列番号13)、TSP2-1(5’-acaccaagaaccagcaaaac-3’)(配列番号14)、TSP2-2(5’-agaaccagcaaaaccgtggcgg-3’)(配列番号15)、TSP2-3 (5’-agcaaaaccgtggcggcatc-3’)(配列番号16)を設計した。
次に、47-9株のゲノムDNAを鋳型にし、プライマーTSP1-1、TSP1-2、TSP1-3およびDNA walking SpeedUPTM Premix Kit(Seegene社)を用いて、PCR法でF6-R10増幅断片の上流遺伝子を増幅させ、約700bpの増幅断片(TSP1増幅断片)を得た。同様にTSP2-1、TSP2-2、TSP2-3を用いてF6-R10増幅断片の下流遺伝子を増幅させ、約650bpの増幅断片を得た。さらにTSP1増幅断片の上流の遺伝子断片を得るために、TSP1増幅断片の塩基配列を解読し、結果をもとにプライマーTSP3-1 (5’-ggtgaatgaaggaccactcc-3’)(配列番号17)、TSP3-2(5’-ctccgctgcaccaagtaaagatg-3’)(配列番号18)、TSP3-3(5’- taaagatggaaccgtgtggt-3’)(配列番号19)を設計した。同様に47-9株のゲノムDNAを鋳型にし、TSP3-1、TSP3-2、TSP3-3を用いて、TSP1増幅断片の上流の約850bpの増幅断片を得た。
TSP3増幅断片、TSP1増幅断片、F6-R10増幅断片およびTSP2増幅断片TSP3増幅断片を結合し、アミノ酸配列に置換した後、N末のアミノ酸配列の結果をもとにORFと分泌された酵素のアミノ酸配列を決定した。得られたヌクレオチド配列及び酵素の全長アミノ酸配列をそれぞれ配列番号20及び21に示す。
さらに、上記の47-9株から得た生分解性プラスチック分解酵素のDNA配列およびアミノ酸配列と相同性が高い既登録配列を、国立遺伝研究所内DNA data bank of Japan (DDBJ)でBLAST search法を用いて検索した。検索条件は、検索条件 上位10件 期待値 10ギャップ1 フィルター1とした。「DNA-DNA比較」、「DNA配列→アミノ酸配列翻訳をしたDNA 配列-アミノ酸配列比較」、「DNA配列→アミノ酸配列翻訳をしたDNA 配列-アミノ酸翻訳したDNA配列比較」の、3つの方法で比較した。その結果、各々の検索で最も高い相同性を示したものは、「DNA-DNA比較」では、M16876|M16876.Soybean lipoxygenase-1 mRNA, 3’ end,clone pLX-65 score:56 E-Value:3e-04、「DNA配列→アミノ酸配列翻訳をしたDNA 配列-アミノ酸配列比較」では、tr|QOTWK1| QOTWK1_PHANO SubName: Full=Putative uncharacterizedprotein score:249 E-Value:2e-64、「DNA配列→アミノ酸配列翻訳をしたDNA 配列-アミノ酸翻訳したDNA配列」では、CU633899| CU633899. 1 Podospora anserine genomic DNA chromosome 1, supercontig 4 score:127 E-Value:7e-63であった。以上より、今回特定されたDNA配列およびアミノ酸配列は、既知遺伝子配列やアミノ酸配列とは異なる新規の配列であることが推察された。
上記の項目3では、PBSAエマルジョンを含む培地を使用して糸状菌47-9株を培養して生分解性プラスチック分解酵素を生産したが、このPBSAエマルジョンの代わりにPBSAペレットを含む培地を使用して同様の生分解性プラスチック分解酵素を生産できるか確認した。
使用した培地の組成は以下の通りである。
図7の結果から、本願の生分解性プラスチック分解菌は、PBSAエマルジョンを含む培地のみならず、PBSAペレットを含む培地を使用して培養した場合であっても増殖し、生分解性プラスチック分解酵素を生産できることが分かった。
本願生分解性プラスチック分解菌を継代培養することによって連続的に生分解性プラスチック分解酵素を生産できるか確認した。
容量2lのジャーファーメンター(サクラ精機株式会社 バイオリアクター TBR-2-1)を使用し、培養液800ml、28℃、100 rpm/min、通気0.6l/minの条件で本願生分解性プラスチック分解菌を培養した。一日毎に培養液を回収し、培養液を回収した後のジャーファーメンターに新しい培地を加えて再び培養を行った。回収した各培地について活性を測定した。なお、培地組成及び活性測定法は特開2008-237212号公報に記載したものに従った。
図8は、初代培養における酵素活性の変化を示す。また、図9は、継代培養を行い、継代回数ごとに回収した培養液の酵素活性を示す。これら結果より、本発明の生分解性プラスチック分解菌は、継代培養することによって繰り返し生分解性プラスチック分解酵素を生産させることが可能であることが分かった。なお、今回の実験においては、6回繰り返して、液交換後一日で酵素が再生産できることが確認された。
本発明の生分解性プラスチック分解菌の培養液から菌体を除去した上清を様々な温度条件下に放置し、その後酵素活性を測定することにより、本発明の生分解性プラスチック分解酵素の保存安定性を確認した。
まず、4℃及び28℃の温度条件下で98日間放置した上清について、特開2008-237212号公報に記載された方法に従いPBSAと30分反応させた後に酵素活性を測定した。なお、再現性の確認のため5つの上清サンプルをとって保存し、それぞれについて酵素活性を測定した。その結果、図10に示されるように、28℃および4℃の条件で98日間放置しても活性の大きな低下は認められなかった。
同様に、-20℃の条件で115日間放置しても活性の大きな低下は認められなかった(図11)。
以上より、本発明の生分解性プラスチック分解酵素は、培養液から菌体を除去した上清の状態で28℃〜-20℃、の範囲の各温度条件で長期間にわたって安定的に保存出来ることが分かった。
上清10mlを300mlのフラスコに入れ、マルト商会株式会社製のフリーズモバイル12によって−80℃で6時間乾燥させたところ、上清1mlあたり4.19±0.53mgの粉末が得られた。その後、前記粉末を乾燥以前の濃度と同等になるように滅菌蒸留水で溶解したところ、乾燥前と同等の活性が認められた(図12)。
Claims (17)
- 受託番号NITE P-573の糸状菌。
- 請求項1記載の糸状菌の生産する生分解性プラスチック分解酵素。
- (a) 請求項1記載の糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地で培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、
(b) 培養液から生分解性プラスチック分解酵素を精製する工程、
を含む、生分解性プラスチック分解酵素の製造方法。 - 請求項3記載の方法により得られる、分子量がSDS電気泳動法で18〜22kDaの生分解性プラスチック分解酵素。
- 請求項2または4記載の生分解性プラスチック分解酵素と生分解性プラスチックとを接触させることを含む、生分解性プラスチックを分解する方法。
- 請求項1記載の糸状菌、および/または、請求項2または4記載の生分解性プラスチック分解酵素を含む、生分解性プラスチック分解製剤。
- 配列番号20の塩基配列を含む核酸。
- 請求項7記載の核酸を含むベクター。
- 請求項7記載の核酸がコードするタンパク質。
- 配列番号21の配列を含むタンパク質。
- 配列番号21の配列のアミノ酸の1もしくは数個が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、PBSおよびPBSAの分解活性を有するタンパク質。
- 請求項9〜11のいずれか1項記載のタンパク質と生分解性プラスチックとを接触させることを含む、生分解性プラスチックを分解する方法。
- 請求項9〜11のいずれか1項記載のタンパク質を含む、生分解性プラスチック分解製剤。
- 培地に含まれる生分解性プラスチックがPBSAペレットである、請求項3記載の方法。
- (c) 請求項1記載の糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地に加える工程、
(d) 糸状菌を培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、
(e) 工程(d)の培養液を回収する工程、
(f) 培養液を回収した後の培養容器に残存する糸状菌に新たな培地を加える工程、
(g) 工程(d)-(f)を繰り返す工程、
を含む、生分解性プラスチック分解酵素の製造方法。 - (h) 請求項1記載の糸状菌を、生分解性プラスチックを含む培地で培養して生分解性プラスチック分解酵素を培養液に分泌させる工程、
(i) 培養液の上清を凍結乾燥させる工程、
を含む、生分解性プラスチック分解酵素粉末の製造方法。 - 請求項16記載の方法により製造される生分解性プラスチック分解酵素粉末。
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