CN111936549B

CN111936549B - 包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的纯化方法

Info

Publication number: CN111936549B
Application number: CN201980023833.0A
Authority: CN
Inventors: 尾木公一; 粒崎拓真; 义村耕平
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: KR20200138244A; WO2019189188A1; KR102542987B1; EP3778703A4; EP3778703A1; JP2019172993A; US20210009756A1; JP7177392B2; EP3778703B1; CN111936549A; US11680137B2; CA3095299A1

Abstract

一种从包含特定三苯甲基的单分散聚乙二醇和特定的双三苯甲基化杂质的混合物中纯化特定的包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的方法，该方法包含步骤(A)、(B)和(C)：步骤(A)：通过特定方法酯化包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的羟基的步骤；步骤(B)：通过特定方法萃取酯化的化合物的步骤；步骤(C)：水解酯化的化合物以获得包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的步骤。

Description

包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的纯化方法

技术领域

本发明涉及用于医药用途的单分散聚乙二醇(PEG)的高效率且高纯度的制造的纯化方法。更具体地，本发明涉及用于去除单分散PEG合成特有的PEG链长延长反应中生成的双三苯甲基化杂质的方法。

背景技术

通过对药物进行修饰而提高药物在血液中的循环的PEG已经在药物递送***(DDS)和医药领域中广泛地使用。近年来，从药物修饰时的功能和安全性的观点，需要这样的PEG具有更高的纯度。

一方面，通过环氧乙烷的开环聚合合成的PEG是具有多种分子量的不均一混合物。另一方面，从诸如低分子量乙二醇的原料逐次合成的单分散PEG是具有单一分子量的单一化合物，并且是以高纯度为特征的新型DDS材料。由于单分散PEG是逐次合成的，与通过开环聚合合成的传统PEG的情况相比，用于延长链长所需要的劳动是繁杂的，并且通常使用的是乙二醇链长数量为48以下的低分子量化合物。

近年来，抗体结合药物(Antibody-Drug Conjugate：ADC)在实践中使用并且引起了高度关注，在抗体结合药物中药物和抗体通过连接物结合，并且能够将药物主动转运至抗原呈递细胞。(非专利文献1和非专利文献2)

当前用作ADC的连接物材料的材料之一是异型单分散PEG。由于异型单分散PEG是在两个末端具有互不相同的官能团的单分散PEG，所以抗体和药物结合于各个末端。然而，当在异型单分散PEG中存在在两个末端具有相同官能团的单分散PEG时，生成了结合了两个抗体的杂质或结合了两个药物的杂质。这些杂质的存在降低了目标ADC的产量，因此，本领域中需要高纯度的异型单分散PEG。

此外，在制造ADC时，由于结合药物的数量通常使用质谱仪或HPLC(高效液相色谱)来确定，当连接物材料中存在具有不同的乙二醇链长的单分散PEG作为杂质时，产生了该确认变得困难的制造上的问题。另外，作为具有不同乙二醇链长的杂质的存在的结果，由于在制造ADC时要加入的抗体和药物的当量不明确，所以产生了下列问题：即必须过量地使用昂贵的抗体和药物以及在药品申请时形成了具有多种分子量的化合物，并且因此使得化合物的鉴定以及各种试验的实施变得必要。因此能够说，对于异型单分散PEG，重要的是高纯度地包含仅一种具有相同乙二醇链长的单分散PEG。

如上文所述，期望的是用作ADC的连接物材料的异型单分散PEG是包含在两个末端具有不同官能团的异型单分散PEG作为主要成分，其是具有均一的乙二醇链长的单分散PEG，特别地具有高纯度。

一般而言，公知的是在单分散PEG的链长延长步骤中，使用具有诸如大体积疏水基团的三苯甲基的羟基保护基团的乙二醇衍生物作为原料。此外，在延长单分散PEG链长的各个步骤，形成了具有不同链长数量或不同官能团的杂质。然而，不同于高分子量PEG，低分子量单分散PEG被官能团极大地影响，并且在许多情况下为液体，使得聚合物特有的简单结晶纯化不能频繁地进行。因此，许多这样的杂质残留在目标物中。另外，在链长延长步骤中，在目标物和杂质之间没有明确的极性差异，因此难以通过任何工业可行的纯化方法对其进行分离。

尽管对于单分散PEG的制造方法有多个报告，但是在专利文献1中，单分散PEG的链长通过以下方法延长。

如上文所述，在链长延长步骤中，作为目标的十二聚体单分散PEG的化合物8包含双三苯甲基化杂质3、6和9。由于这些杂质具有类似于目标物的物理性质，所以难以将其去除，并且纯化方法局限于诸如柱色谱的纯化方法，不适合于放大(scale-up)。另外，专利文献1没有记载用于从化合物8中去除这些双三苯甲基化杂质的纯化方法。

在专利文献1中，在化合物8的羟基被转化为大体积疏水基团的甲苯磺酰基之后，通过分液萃取去除已经进行去三苯甲基化反应从而被转化为二醇化合物的杂质3、6和9。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Toxins,2011,3,p.848-883

非专利文献2：J.Med.Chem.,2011,54,p.3606-3623

专利文献

专利文献1：JP-A-2017-14371

发明内容

本发明解决的问题

如上文所述，在现有的工业可行的纯化方法中，为了去除双三苯甲基化杂质，必须进行一次诸如甲苯磺酰基的大体积疏水基团的转化。然而，在目的为获得在原始官能团转化步骤中不需要这样的大体积疏水基团的化合物的情形下，问题在于增加了用于去除双三苯甲基化杂质的一系列步骤，使得合成过程复杂并且降低了合成效率。

另一方面，在化合物8的羟基被转化为诸如甲基的具有低疏水性的疏水基团之后，当尝试进行专利文献1的上述去三苯甲基化反应和变为二醇体的杂质3、6和9的去除时，不可能通过分液萃取从目标物中分离二醇体杂质。如上文所述，显而易见的是，取决于将要加成的官能团，双三苯甲基化杂质不能通过专利文献1的方法去除。

此外，在使用包含双三苯甲基化杂质的单分散PEG进行反应的情形下，对于准确地计算原料单分散PEG的纯度没有合适的方法，因此不能确定反应中待使用的反应物的恰当用量。另外，当杂质的量变化时，不能总是进行当量反应，并且由于反应物过量有发生副反应的风险，或者由于反应物不足有反应不完全的风险。而且，所获得的产物的纯度不明确。除此之外，对于通常用作单分散PEG的纯化操作的分液萃取的纯化操作带来了不利的影响。双三苯甲基化杂质具有不同的链长，其展现互不相同的亲水性/疏水性，并且分层性低，使得可能出现萃取效率的降低。

如上文所述，对于高效率地去除单分散PEG中包含的并且具有源于链延长步骤的特定分子量的双三苯甲基化杂质的方法存在需求。

本发明涉及作为单分散PEG的链长延长步骤的副产物的具有不同链长的特定双三苯甲基化杂质的纯化。即，本发明的目标是提供一种能够通过工业可行的方法高效率地获得适合于医药用途的高纯度单分散PEG的纯化方法。

解决问题的手段

为解决上述问题进行了大量研究，作为结果，本发明人已经发现，对于单分散PEG的链长延长步骤之后获得的混合物，在通过酯化包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的羟基而导入羧酸以提高亲水性之后，重复进行特定组成的萃取操作，从而能够将双三苯甲基化杂质萃取并去除至有机层。另外，已经发现，通过随后水解水层中的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG衍生物的酯基，能够快速地获得高纯度的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG。

本发明的特征在于，能够有效率地将羧酸导入包含一个末端三苯甲基的单分散PEG，能够通过在萃取纯化时控制特定的pH、烃类溶剂与芳香溶剂的特定混合比例以及萃取温度，将双三苯甲基化杂质去除至有机层，并且包括随后的水解步骤的三个步骤能够在一系列工艺中连续地进行，本发明是工业可行的并且有效率的纯化方法。

即，本发明如下：

(1)一种包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的纯化方法，包括从包含下列式(1)所示的包含三苯甲基的单分散聚乙二醇和下列式(2)所示的双三苯甲基化杂质的混合物中分离并去除所述双三苯甲基化杂质以获得所述包含三苯甲基的单分散聚乙二醇，

所述方法包括顺序执行下列步骤(A)、(B)和(C)：

其中，在所述式(1)中，n是氧化乙烯单元的重复单元的数量，并且为3以上且48以下；

其中，在所述式(2)中，m是氧化乙烯单元的重复单元的数量，并且为3以上且92以下；

步骤(A)：通过使所述式(1)所示包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的羟基与二元酸酐在下列有机溶剂II中反应，获得含具有酯结构和羧基的酯化合物的反应溶液的步骤；

步骤(B)：通过使用所述步骤(A)中获得的所述反应溶液、一种以上选自由下列有机溶剂I、II和III所组成的组中的有机溶剂、以及pH为3至7的水溶液进行分液萃取纯化，分离水层和有机层，将所述式(2)所示的双三苯甲基化杂质分入有机层并将所示酯化合物分入水层的萃取步骤；

步骤(C)：通过向所述水层加入碱进行所述酯化合物的水解，获得所述包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的步骤：

有机溶剂I：具有3个以下碳原子的醇溶剂，

有机溶剂II：具有总计8个以下碳原子的芳香烃溶剂，

有机溶剂III：具有总计10个以下碳原子的饱和脂肪烃溶剂。

(2)根据(1)所述的方法，其中在所述步骤(A)中，所述二元酸酐选自由丁二酸酐和戊二酸酐所组成的组。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I是一种以上选自甲醇、乙醇和丙醇的溶剂，所述有机溶剂II是一种以上选自由甲苯和二甲苯所组成的组中的溶剂，并且所述有机溶剂III是一种以上选自由戊烷、己烷和庚烷所组成的组中的溶剂。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的方法，其中对于所述步骤(B)中所述有机溶剂的混合比例，所述有机溶剂I的质量比为15-55质量％，所述有机溶剂II的质量比为15-75质量％，并且所述有机溶剂III的质量比为0-50质量％。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中在所述步骤(B)的所述萃取步骤期间的温度为0℃以上且60℃以下。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中所述步骤(B)的所述萃取步骤重复进行。

(7)根据(1)至(6)中任一项所述的方法，其中所述步骤(C)中的所述碱是一种以上选自由氢氧化钠和氢氧化钾所组成的组中的碱。

发明的效果

本发明是一种获得适合于医药用途的高纯度单分散PEG的新型纯化方法。在该纯化方法中，对于在链长延长反应中形成的并且难以通过传统技术有效率地分离的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(式(1))和具有不同链长的特定分子量的双三苯甲基化杂质(式(2))，能够通过对末端羟基的衍生化和萃取纯化有效率地分离。此外，衍生化的官能团部分能够在纯化后的水溶液状态下快速地脱离，并且能够恢复为衍生化前的原始结构。即，可以通过工业上容易进行的连续工艺，高产率地获得其中双三苯甲基化杂质被显著减少的高纯度的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG。

另外，根据本发明，包含一个末端三苯甲基的单分散PEG能够被纯化并分离，因此在迄今为止一直以包含双三苯甲基化杂质的状态进行的下个步骤的官能团转化步骤中，可以以良好的重复性、高纯度和高产率制造单分散PEG衍生物。

附图说明

图1示出实施例1的化合物2的NMR测定结果。

图2示出实施例1的化合物2'的NMR测定结果。

图3示出实施例3的化合物5的NMR测定结果。

图4示出实施例3的化合物5'的NMR测定结果。

图5示出实施例5的化合物8的NMR测定结果。

图6示出实施例5的化合物8'的NMR测定结果。

图7示出实施例6的化合物5在纯化后的NMR测定结果。

图8示出实施例6的化合物5在纯化前后的TLC图谱，左侧为纯化前，右侧为纯化后。

图9示出实施例7的化合物10在分液清洗前(步骤A完成后)的NMR测定结果。

图10示出实施例7的化合物10在分液清洗后(步骤B完成后)的NMR测定结果。

图11示出实施例7的化合物8在纯化后(步骤C完成后)的NMR测定结果。

图12示出实施例7的化合物8在纯化前后的TLC图谱，左侧为纯化前，右侧为纯化后。

图13示出实施例11的化合物14的NMR测定结果。

图14示出实施例11的化合物14'的NMR测定结果。

图15示出实施例13的化合物17的NMR测定结果。

图16示出实施例13的化合物17'的NMR测定结果。

图17示出实施例15的化合物20的NMR测定结果。

图18示出实施例15的化合物20'的NMR测定结果。

图19示出实施例16的化合物20在纯化后的NMR测定结果。

图20示出实施例16的化合物20在纯化前后的TLC图谱，左侧为纯化前，右侧为纯化后。

具体实施方式

本发明的PEG化合物是具有乙二醇链的重复结构的化合物的统称。此外，PEG指代通过环氧乙烷的开环聚合获得的具有多个分子量的大量PEG化合物的混合物。相反地，单分散PEG是具有单一分子量的PEG化合物，目标PEG化合物是使用乙二醇作为原料通过逐次合成获得的。换言之，单分散PEG是乙二醇链长数(氧化乙烯单元的重复单元的数量)单一的PEG化合物。

在单分散PEG的链长延长步骤中，使用三苯甲基作为羟基的保护基团进行一般的链长延长反应。在链长延长时，获得了具有一个三苯甲基并且在另一端具有羟基的目标的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG与作为其中两个末端均为三苯甲基且具有特定链长数的单分散PEG的双三苯甲基化杂质的混合物。根据本发明，从该混合物分离式(2)的双三苯甲基化杂质以获得式(1)的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG。

以下将叙述进行本发明的优选条件。但是，这些实施方式仅出于说明本发明的目的进行叙述，并且不应当被解释为限定本发明的范围，本发明的范围由权利要求书所限定。

本发明的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的乙二醇链长数n为3以上且48以下，优选为4以上且24以下，更优选为4以上且20以下，特别优选为8以上且12以下。相对应的双三苯甲基化杂质的链长数m为3以上且92以下，优选为4以上且44以下，更优选为4以上且36以下，特别优选为8以上且20以下。

本发明的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG是不具有分枝结构的直线型单分散PEG。

在本发明的分液萃取时使用的有机溶剂，以从具有强亲水性的溶剂到具有弱亲水性的溶剂的顺序，分类为下列有机溶剂I至III。

有机溶剂I：

具有总计3个以下碳原子的水溶性亲水性醇溶剂，诸如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，优选为甲醇、乙醇或丙醇，更优选为甲醇。

有机溶剂II：

具有总计8个以下碳原子的芳香烃溶剂，诸如苯、甲苯或二甲苯，优选为甲苯或二甲苯，更优选为甲苯。

有机溶剂III：

具有总计10个以下碳原子的饱和脂肪烃溶剂，诸如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，优选为戊烷、己烷或庚烷，更优选为己烷。

步骤(A)

该步骤是酯化反应步骤，其中使用二元酸酐将在链延长步骤中获得的单分散PEG混合物中的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的羟基转化为二元酸酯。所获得的酯化合物具有酯结构和羧基。

酯化反应使用二元酸酐和碱催化剂进行。

所使用的二元酸酐是诸如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、甲基丁二酸酐、甲基戊二酸酐、马来酸酐、邻苯二甲酸酐和酒石酸酐的二元酸酐。为了提高包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的亲水性，具有在开环时具有3个以下碳原子的亚甲基链并且不具有支链的丁二酸酐和戊二酸酐是优选的，并且丁二酸酐是更优选的。二元酸酐通过与溶剂和原料中包含的水反应而开环以形成二元酸，从而优选的是稍微过量添加酸酐。通常摩尔比为1.0至3.0倍，更优选为1.0至2.0倍。当过量的量大时，在随后的萃取步骤中水溶液的酸性增加，因此存在三苯甲基脱离的风险。

优选地，碱催化剂以相对于包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的摩尔比0.01至1.0倍加入，优选以0.5至1.0倍加入。由于碱催化剂为了中和通过二元酸酐与水的开环所生成的二元酸而被消耗，所以当催化剂的添加量小时，反应趋向于缓慢。此外，当碱催化剂不足且溶液中二元酸的量增加时，存在三苯甲基脱离的风险。

酯化反应能够在溶剂中进行，并且使用选自所述有机溶剂II的溶剂。优选地，所使用的溶剂的量相对于包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的质量为1.0至2.0倍。

酯化反应通常在0℃和120℃之间进行，优选为30℃至110℃，更优选为50℃至80℃。当温度低时，反应速率趋向于缓慢，当温度高时，三苯甲基趋向于脱离。反应时间取决于反应条件而变化，但是通常优选为大约1至48小时。

反应之后，可以去除溶剂中残留的衍生自二元酸酐的二元酸以及碱催化剂。在此情况下，在用有机溶剂II稀释反应溶液之后，使用调整了食盐浓度的食盐水进行萃取，从而将二元酸和碱催化剂去除至水层。

上述水溶液的食盐浓度没有特别限定，只要单分散PEG不被分配至水层即可，但是相对于添加的水溶液通常为5-25质量％，优选为15-25质量％。为了改善各个溶液的分层性质，萃取温度通常在10℃至80℃的范围内，优选为30℃至60℃。当萃取温度低时，单分散PEG酯化合物向水层的分配提高，乳化趋向于发生。当萃取温度高时，三苯甲基趋向于脱离。

在步骤(A)中，通过这样的酯化反应，获得了包含羧酸末端的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的二元酸酯。在使用丁二酸酐或戊二酸酐作为二元酸酐的情况下，获得了具有式(3)所示的结构的单分散PEG酯化合物(羧酸衍生物)和双三苯甲基化杂质的混合物。该酯化合物具有酯结构和羧基。

(n是氧化乙烯单元的重复单元的数量，并且为3以上且48以下的整数；x是取决于所使用的二元酸酐而变化的整数，并且为2或3。)

在步骤(A)中，在酯化反应期间在双三苯甲基化杂质的末端发生三苯甲基的脱离的情况下，生成了具有不同的乙二醇链长的单分散PEG酯化合物作为副产物，并且由于该化合物成为不能通过本发明分离的新杂质，所以必须注意。

步骤(B)

该步骤是如下步骤：向步骤(A)中获得的混合物溶液中加入一种以上选自由有机溶剂I、II和III组成的组中的有机溶剂和水溶液，整体通过搅拌或振荡混合并使之静置一定时间，从而将单分散PEG酯化合物分离至水层并且将双三苯甲基化杂质分离至有机层以进行萃取纯化。

单分散PEG酯化合物包含疏水性的三苯甲基和亲水性的羧酸，并且展现两性化合物的溶解性质。因此，尽管取决于乙二醇链长数，但是单分散PEG酯化合物不容易在除亲水性有机溶剂以外的水/有机溶剂中形成均一溶液。另一方面，作为分离目标的双三苯甲基化杂质仅具有疏水性官能团，但是由于其展现源自乙二醇链的亲水性，也可溶解于亲水性溶剂。各自的溶解性如下。

单分散PEG酯化合物的溶解性：

有机溶剂I>有机溶剂II≈水>>>有机溶剂III

双三苯甲基化杂质的溶解性：

有机溶剂I>有机溶剂II>有机溶剂III>水

为了将单分散PEG酯化合物萃取至水层，需要使羧酸离子化以提高水溶性。然而，即使被离子化，如上文所述，也难以均匀地溶解于水层，并且形成了乳化状态。为了抑制乳化，需要添加有机溶剂I或加热，或者添加有机溶剂I并且加热。

另一方面，单分散PEG酯化合物的二元酸酯部分容易在碱性条件下水解。作为结果，该化合物分解为原料包含一个末端三苯甲基的单分散PEG，其通过随后的萃取操作分配至有机层从而损失。

如上所述，为了单分散PEG酯化合物的分液萃取纯化而使用的水溶液的pH为pH 3至7，优选为pH 5至7的弱酸性至中性条件。其中溶解了单分散PEG酯化合物的水层为pH 3至7，优选为pH 5至7的弱酸性至中性条件。

为了使单分散PEG酯化合物离子化，加入调整了pH的水溶液作为水层。调整pH所使用盐没有特别限定，只要能够使羧酸离子化即可，但是通常包括诸如磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、柠檬酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐或乳酸盐的有机盐和无极盐。此外，这些有机盐和无机盐的多个可以组合使用。

盐的浓度没有特别限定，只要单分散PEG酯化合物的分液萃取纯化所使用的水溶液的pH为3至7即可。当盐浓度过高时，单分散PEG酯化合物在使用有机溶剂的萃取清洗期间不能保留在水层中，并且盐在与后文所述的有机溶剂I混合时析出。因此，相对于水的浓度为10质量％以下，优选为5质量％以下。

离子化的单分散PEG酯化合物的溶解性如下：有机溶剂I>水溶液>有机溶剂II>>>有机溶剂III。另一方面，双三苯甲基化杂质的溶解性如下：有机溶剂I>有机溶剂II>有机溶剂III>水溶液。作为结果，各个化合物在水层和有机层之间的分配的差异变得明显，并且通过分液萃取进行纯化成为可能。

为了分离双三苯甲基化杂质，需要使用有机溶剂II从水层中萃取双三苯甲基化杂质。但是，单分散PEG酯化合物也可溶于有机溶剂II，并且在仅使用有机溶剂II作为有机层时发生单分散PEG酯化合物的损失。因此，添加单分散PEG酯化合物在其中不可溶的有机溶剂III以减少单分散PEG酯化合物的损失，从而可以提高双三苯甲基化杂质的选择性，并且将双三苯甲基化杂质有效率地萃取并分离至有机层。

各个有机溶剂的优选混合比例取决于待纯化的单分散PEG的乙二醇链长数。单分散PEG酯化合物的乙二醇链长越短，则疏水性的三苯甲基的影响越强。由此，难以将化合物保持在水层。因此，随着链长变短，需要增加有机溶剂I和有机溶剂III的混合比例。

另一方面，随着乙二醇链长变长，双三苯甲基化杂质被亲水性的乙二醇链更强地影响，疏水性下降，并且对水层的亲和性上升。因此，随着链长变长，需要增加有机溶剂II的混合比例以提高双三苯甲基化杂质向有机层一侧的萃取效率。

在萃取时，水溶液的量相对于原料单分散PEG化合物通常为0.5至10质量倍，优选为1至5质量倍。在添加有机溶剂I以抑制水层乳化的情况下，溶剂的量相对于水层通常为0.3至4质量倍，更优选为0.8至2.4质量倍。有机溶剂II和III或者由有机溶剂II构成的溶液的总质量通常为水溶液或者水溶液和由有机溶剂I构成的溶液的总质量的0.3至2倍，更优选为0.7至1.2倍。

有机溶剂的混合比例优选为有机溶剂I：0-55％、有机溶剂II：15-75％、有机溶剂III：0-50％(均为质量％)，并且更优选的混合比例为有机溶剂I：15-55％、有机溶剂II：15-75％、有机溶剂III：0-50％(均为质量％)。

对于各个链长，优选的混合比例如下：在乙二醇链长为3至7的情况下，有机溶剂I：25-55％、有机溶剂II：15-45％、有机溶剂III：20-50％(均为质量％)，并且更优选为有机溶剂I：35-45％、有机溶剂II：25-35％、有机溶剂III：30-40％(均为质量％)。

在乙二醇链长为8至24的情况下，混合比例优选为有机溶剂I：20-50％、有机溶剂II：30-70％、有机溶剂III：0-45％(均为质量％)，更优选为有机溶剂I：25-45％、有机溶剂II：40-60％、有机溶剂III：5-25％，进一步优选为有机溶剂I：27.5-32.5％、有机溶剂II：47.5-52.5％、有机溶剂III：17.5-22.5％(均为质量％)。

在乙二醇链长为25至48的情况下，混合比例优选为有机溶剂I：0-45％、有机溶剂II：45-75％、有机溶剂III：0-35％(均为质量％)，更优选为有机溶剂I：25-35％、有机溶剂II：55-66％、有机溶剂III：15-25％(均为质量％)。

因为当温度低时乳化无法避免并且当温度过高时有机溶剂蒸发，所以萃取纯化时的温度通常为0-60℃，优选为30-60℃，更优选为45-55℃。

步骤(C)

该步骤是在萃取后将碱添加至水层，将二元酸酯水解从而将单分散PEG酯化合物恢复为包含一个末端三苯甲基的单分散PEG，然后将单分散PEG萃取至有机层并收集的步骤。

向包含单分散PEG酯化合物的水溶液中加入碱以进行水解。优选的是，将碱性化合物加入水溶液，将水层的pH保持在9以上从而在碱性条件下进行水解反应，由此使酯分解。

水解反应中使用的碱没有特别限定，只要其能够将pH调整为9以上即可，但是优选为具有亲核性的强碱。具体为氢氧化钠或氢氧化钾，更优选为氢氧化钠。

在水解反应后将有机溶剂加入水溶液，并且将目标物质萃取至有机层以收集包含一个末端三苯甲基的单分散PEG。包含一个末端三苯甲基的单分散PEG通过包括浓缩、结晶和干燥的任一项的步骤获得。

在回收包含一个末端三苯甲基的单分散PEG时所使用的有机溶剂是选自甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷的有机溶剂，并且优选为甲苯、氯仿或二氯甲烷，更优选为甲苯。

实施例

以下将通过参考实施例，更详细地描述本发明，但是本发明不应限于下列实施例。

用作本发明的原料的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG是通过参考专利文献1，在实施例1至5和10至15中合成的。所获得的八聚体、十二聚体和二十四聚体的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG包含多种双三苯甲基化杂质。含量的准确定量困难，但是包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的羟基使用三氯乙酰异氰酸酯标记，并且各个步骤中包含的双三苯甲基化杂质的含量由所获得化合物的¹H-NMR测定结果粗略估计。在实施例6至9和16中，对上述实施例中获得的八聚体、十二聚体和二十四聚体的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG进行纯化，并且确认双三苯甲基化杂质的去除。

顺便提及，在各个实施例的反应中，由于不知道包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的准确摩尔数，反应物当量是通过假设总量由包含一个末端三苯甲基的单分散PEG构成而计算的。

关于本发明获得的单分散PEG的测定，在¹H-NMR分析中使用由JEOL Datum Co.,Ltd.制造的JNM-ECP400或JNM-ECA600。在测定中使用φ5mm试管，使用CDCl₃作为氘代溶剂，并且使用四甲基硅烷(TMS)作为内标物。

在TLC分析中，使用由Merck Millipore制造的TLC玻璃板硅胶60F₂₅₄，并且除非另有说明，使用氯仿:甲醇＝85:15(体积比)或者氯仿:甲醇＝9:1(体积比)作为展开溶剂。将碘染色的点与用作标准样品的化合物的点比较并进行评价。为了确认实施例6至9和16中双三苯甲基化杂质通过步骤(A)的酯化反应和步骤(B)的分液萃取的去除，使用包含一个末端三苯甲基的单分散PEG作为标准样品。为了确认步骤(C)中的酯水解反应，使用单分散PEG酯化合物。

实施例1化合物2的合成

将四乙二醇1(2,000mL，11.5mol)置入四颈烧瓶中，并且使用甲苯(500mL×2次)进行两次共沸脱水。茄形烧瓶内用氮气吹扫，加入吡啶(180mL，2.2mol)和三苯甲基氯(TrtCl，400g，1.4mol)，并且将混合物在室温下搅拌3小时。3小时后，通过使用薄层色谱法(TLC，己烷:乙酸乙酯＝1:1(体积比))确认TrtCl消失，并且加入2,000mL离子交换水。在向所得混合物加入甲苯(1,000mL)之后，分层，有机层用1,000mL离子交换水/饱和食盐水(离子交换水:饱和食盐水＝4:1(体积比))的混合溶液清洗一次，用500mL 1M盐酸水溶液清洗一次，并且用500mL饱和食盐水清洗4次。向所获得的有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。在向滤液中加入甲苯(500mL×3次)的同时进行3次共沸脱水，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物2的反应产物。此外，从TLC测定和NMR测定的结果(图1)确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3。

化合物2

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.4(1H,t,-C-(OCH₂CH₂)₄-OH),

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3的),

3.45-3.85(14H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₃-OH,包含源自化合物3的),7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3的)

产量：633g

[式6]

从通过使用三氯乙酰异氰酸酯处理所获得的包含化合物2的反应产物以标记其羟基的化合物2'的¹H-NMR测定结果(图2)确认，以约7mol％的量包含化合物3。

以δ3.23处的峰为基准的化合物3含量的计算公式：

(((2-[δ4.38])/4H)/([δ4.38]/2H))×100(mol％)

化合物2'

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3的),

3.45-3.85(12H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₂-OCH₂ CH₂-OCO-,包含源自化合物3的)

4.38(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-NH-COCCl₃),

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3的)

实施例2化合物4的合成

将包含上述化合物2的反应产物(化合物2：628g，小于0.14mol)和2,000mL四氢呋喃(THF)置于茄形烧瓶中，整体冷却至0℃。加入氢氧化钠水溶液(200g，5.0mol/600mL)，随后在0℃下搅拌20分钟。在30分钟期间向反应混合物逐滴加入甲苯磺酰氯(TsCl)/THF溶液(300g，1.6mol/600mL)，将混合物在0℃下搅拌4小时。4小时后，通过使用TLC(己烷:乙酸乙酯＝1:1(体积比))确认化合物2消失，然后，将混合物在室温下搅拌15小时以使未反应的TsCl消失。15小时后，通过TLC确认TsCl的消失，并且加入300mL离子交换水和500mL***。混合溶液用500mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗一次，并且用500mL饱和食盐水清洗三次。向有机层中加入活性炭(5.0g)和硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物4的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定，确认了所获得的反应产物也包含上述化合物3。

产量：818g

实施例3链长为8的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物5)的合成

向二颈茄形烧瓶中投入氢化钠(81g)，内部用氮气置换。用无水己烷(500mL×2次)清洗两次，加入1,800mL THF，整体冷却至0℃。将用500mL甲苯共沸脱水三次的四乙二醇1(2,000mL，11.5mol)置于滴液漏斗中，在30分钟期间逐滴加入其中。在逐滴加入完成后，将已使用500mL甲苯共沸脱水三次的实施例2中获得的包含化合物4的反应产物(化合物4：813g，小于1.4mol)与1,000mL THF混合，将所得物置于同一滴液漏斗中并在15分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将反应混合物加热至40℃并搅拌19小时。19小时后，使用TLC(乙酸乙酯)确认化合物4消失，使混合物冷却至室温。向反应混合物加入离子交换水(2,000mL)和饱和食盐水(2,000mL)，分层。对水层加入500mL***进行萃取。分离的有机层用500mL离子交换水/饱和食盐水(离子交换水:饱和食盐水＝1:1(体积比))的混合溶液混合并清洗一次，用500mL饱和食盐水清洗5次。向有机层中加入活性炭(5.0g)和硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物5的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定的结果(图3)确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3和6。

化合物5

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.58(1H,t,-C-(OCH₂CH₂)₈-OH),

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6的),

3.45-3.85(30H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₇-OH,包含源自化合物3、6的)

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3、6的)

产量：788g

从通过使用三氯乙酰异氰酸酯处理所获得的包含化合物5的反应产物以标记其羟基的化合物5'的¹H-NMR测定结果(图4)确认，以约12mol％的量包含化合物3和6(化合物3：7mol％，化合物6：5mol％，大致估计)。

以δ3.23处的峰为基准的化合物3、6含量的计算公式：

(((2-[δ4.42])/4H)/([δ4.42]/2H))×100(mol％)

对于化合物3的含量，使用实施例1中的数值。

化合物5'

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6的),

3.45-3.85(28H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₆-OCH₂ CH₂-OCO-,包含源自化合物3、6的)

4.42(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-NH-COCCl₃),

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂-,包含源自化合物3、6的)

实施例4化合物7的合成

将实施例3中合成的包含化合物5的反应产物(化合物5：598g，小于0.83mol)和甲苯(2,450mL)置于茄形烧瓶中，茄形***内部用氮气吹扫，并且加入三乙胺(139mL，1.00mol)。在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(71mL，0.92mol)，随后在室温下搅拌2小时。2小时后，通过TLC测定确认化合物5消失，并且加入700mL 1M盐酸水溶液，分层。有机层用700mL 1M盐酸水溶液清洗一次，用700mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用700mL饱和食盐水清洗一次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物7的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3和6。

产量：561g

实施例5链长为12的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物8)的合成

向二颈茄形烧瓶中投入氢化钠(46g)，内部用氮气置换。用无水己烷(350mL×2次)清洗两次，加入1,400mL MeCN，整体冷却至0℃。将用2,450mL甲苯共沸脱水三次的四乙二醇1(1,120mL，6.5mol)与350mL MeCN混合，将所得物置于滴液漏斗中，在30分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将已使用350mL甲苯共沸脱水三次的实施例4中获得的包含化合物7的反应产物(化合物7：561g，小于0.81mol)与350mL MeCN混合，将所得物置于同一滴液漏斗中并在15分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将反应混合物加热至80℃并搅拌3小时。3小时后，通过¹H-NMR(CDCl₃)确认化合物7消失，使混合物冷却至室温。反应混合物在减压下浓缩，向残留物加入1,400mL甲苯。该甲苯溶液用700mL饱和氯化铵水溶液清洗两次，并且用700mL饱和食盐水清洗三次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物8的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定的结果(图5)确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3、6和9。

化合物8

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.57(1H,b,-C-(OCH₂CH₂)12-OH,

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6、9的),

3.45-3.85(46H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₁-OH,包含源自化合物3、6、9的)

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3、6、9的)

产量：598g

从通过使用三氯乙酰异氰酸酯处理所获得的包含化合物8的反应产物以标记其羟基的化合物8'的¹H-NMR测定结果(图6)确认，以约15mol％的量包含化合物3、6和9(化合物3：7mol％，化合物6：5mol％，化合物9：3mol％，大致估计)。

以δ3.23处的峰为基准的化合物3、6、9含量的计算公式：

(((2-[δ4.42])/4H)/([δ4.42]/2H))×100(mol％)

对于化合物3、6的含量，使用实施例1和3中的数值。

化合物8'

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6、9的),

3.45-3.85(44H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₁-OCH₂ CH₂-OCO-,包含源自化合物3、6、9的)

4.42(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-NH-COCCl₃),

实施例6链长为8的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物5)的纯化

步骤(A)

将包含化合物5作为主要组分的混合物(38g，62mmol，实施例3的化合物3、6合计约12mol％、约17质量％)、乙酸钠(3g，37mmol)和甲苯(38g)加入配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶。烧瓶内用氮气吹扫，加入丁二酸酐(7g，68mmol)。将混合物在70℃下搅拌1小时。1小时后，通过TLC测定确认化合物5消失，将整体冷却至40℃以下。在加入甲苯(61g)之后，加入23.4wt％食盐水(228g)，并且在55℃下进行总计三次分液清洗。

步骤(B)

将己烷(38g)、甲醇(61g)和pH 5.5的柠檬酸磷酸(0.2M)缓冲液(60.8g)投入有机层以分层。确认浑浊的水层的pH为6至7，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。确认上下层透明，并且弃去有机层。向水层加入甲苯(99g)和己烷(38g)，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。分层为上下层之后，弃去有机层。在使用甲苯(99g)和己烷(38g)进行又两次分液清洗之后，通过TLC测定确认源自双三苯甲基化杂质(3、6、9)的点消失。

分液清洗时的溶剂质量比：

有机溶剂I:有机溶剂II:有机溶剂III＝30.8％:50.0％:19.2％

步骤(C)

清洗之后，向水层(pH 6.3)加入400g/L的氢氧化钠水溶液(11g)，将混合物在25℃下搅拌2小时。2小时后，从水层(pH 12.8)的TLC测定确认化合物11消失。

向水层加入甲苯(331g)，将混合物在30℃下搅拌15分钟。在使混合物静置并确认分层之后，从TLC测定确认化合物5没有残留在水层中，并且弃去水层。向有机层加入20wt％食盐水(228g)，并且在30℃下进行分液清洗。收集的有机层用硫酸钠(38g)脱水，使用甲苯过滤，然后浓缩以获得化合物5(21g)。NMR测定结果(图7)的积分值与理论值一致，并且从化合物5纯化前后的TLC结果比较(图8)确认不包含双三苯甲基化杂质。

双三苯甲基化杂质3、6N.D.(TLC测定，参见图8)，产量21g，产率67％

化合物5(纯化后)

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.52(1H,s,-C-(OCH₂CH₂)₈-OH)

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ -),

3.45-3.85(30H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₇-OH),

7.21-7.47(15H,m,(C_6H5)₃C-O-CH₂-)

实施例7链长为12的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物8)的纯化

步骤(A)

将包含化合物8作为主要组分的混合物(145g，化合物8：184mmol，实施例5的三苯甲基化杂质3、6、9合计约15mol％、约18质量％)、乙酸钠(9g，110mmol)和甲苯(145g)加入配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶。烧瓶内用氮气吹扫，加入丁二酸酐(20g，202mmol)。将混合物在70℃下搅拌1小时。1小时后，通过TLC测定确认化合物8消失，将整体冷却至40℃以下。在加入甲苯(232g)之后，加入23.4wt％食盐水(870g)，并且在55℃下进行总计三次分液清洗。

步骤(B)

将己烷(145g)、甲醇(232g)和pH 5.5的柠檬酸磷酸(0.2M)缓冲液(232g)投入有机层以分层。确认浑浊的水层的pH为5至6，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。确认上下层透明，并且弃去有机层。向水层加入甲苯(378g)和己烷(145g)，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。在分层为上下层之后，弃去有机层。在使用加入的甲苯(378g)和己烷(145g)进行又两次分液清洗之后，通过TLC测定确认源自双三苯甲基化杂质(3、6、9)的点消失，并且分液清洗后的NMR测定结果与理论值一致(清洗前：图9，清洗后：图10)。

化合物10(纯化后)

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.62(4H,m,-OCO-CH₂ CH₂ -COOH)

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ -),

3.45-3.85(44H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₀-OCH₂ CH₂-O-CO-),

4.25(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-CH₂CH₂-),

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-O-CH₂-)

分液清洗时的溶剂质量比：

有机溶剂I:有机溶剂II:有机溶剂III＝30.7％:50.1％:19.2％

步骤(C)

清洗之后，向水层(pH 6.0)加入400g/L的氢氧化钠水溶液(32g)，将混合物在25℃下搅拌2小时。2小时后，从水层(pH 13)的TLC测定确认化合物10消失。

向水层加入甲苯(1,260g)，将混合物在30℃下搅拌15分钟。在使混合物静置并确认分层之后，从TLC测定确认化合物8没有残留在水层中，并且弃去水层。向有机层加入20wt％食盐水(870g)，并且在30℃下进行分液清洗。收集的有机层用硫酸钠(145g)脱水，使用甲苯过滤，然后浓缩以获得化合物8(98g)。NMR测定结果(图11)的积分值与理论值一致，并且从化合物8纯化前后的TLC结果比较(图12)确认不包含双三苯甲基化杂质。

双三苯甲基化杂质3、6、9N.D.(TLC测定，参见图12)，产量98g，产率82％

化合物8(纯化后)

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.57(1H,s,-OCH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₁₁-OH)

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-),

3.45-3.85(46H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₁-OH),

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-O-CH₂CH₂-)

实施例8链长为12的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG的纯化，使用戊二酸酐

步骤(A)

将包含化合物8作为主要组分的混合物(30g，38mmol，实施例5的三苯甲基化杂质3、6、9合计约15mol％、约18质量％)、乙酸钠(1.9g，23mmol)和甲苯(30g)加入配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶。烧瓶内用氮气吹扫，加入戊二酸酐(4.8g，42mmol)。将混合物在70℃下搅拌1小时。1小时后，通过TLC测定确认化合物8消失，将整体冷却至40℃以下。在加入甲苯(48g)之后，加入23.4wt％食盐水(180g)，并且在55℃下进行总计三次分液清洗。

步骤(B)

将己烷(30g)、甲醇(48g)和pH 5.5的柠檬酸磷酸(0.2M)缓冲液(48g)投入有机层以分层。确认浑浊的水层的pH为5至6，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。确认上下层透明，并且弃去有机层。向水层加入甲苯(78g)和己烷(30g)，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。分层为上下层之后，弃去有机层。再进行三次分液清洗，通过TLC测定确认源自双三苯甲基化杂质(3、6、9)的点消失。

分液清洗时的溶剂质量比：

有机溶剂I:有机溶剂II:有机溶剂III＝30.8％:50.0％:19.2％

步骤(C)

清洗之后，向水层(pH 6.12)加入400g/L的氢氧化钠水溶液(6.6g)，将混合物在25℃下搅拌4小时。4小时后，从水层(pH 13.5)的TLC测定确认化合物12消失。

向水层加入甲苯(261g)，将混合物在30℃下搅拌15分钟。在使混合物静置并确认分层之后，从TLC测定确认化合物8没有残留在水层中，并且弃去水层。向有机层加入20wt％食盐水(870g)，并且在30℃下进行分液清洗。收集的有机层用硫酸钠(30g)脱水，使用甲苯过滤，然后浓缩以获得化合物8(15g)。NMR测定结果的积分值与理论值一致，并且从化合物8纯化前后的TLC结果比较确认不包含双三苯甲基化杂质。

双三苯甲基化杂质N.D.，产量15g，产率62％

实施例9在实施例7中有机溶剂III的比例高的实例

进行与实施例7的步骤(A)相同的操作，加入溶剂，使得步骤(B)中的溶剂比例变为甲醇(231g)、pH 5.5的柠檬酸磷酸(0.2M)缓冲液(222g)、甲苯(378g)和己烷(290g)。以此溶剂比例进行分液清洗，然后通过加入甲苯(378g)和己烷(290g)重复进行9次分液清洗操作。通过TLC测定确认源自双三苯甲基化杂质(3、6、9)的点消失。

分液清洗时的溶剂质量比：

有机溶剂I:有机溶剂II:有机溶剂III＝25.7％:42.0％:32.3％

在步骤(C)中，进行与实施例7相同的操作，以获得化合物8(76g)。NMR测定结果的积分值与理论值一致，并且从化合物8纯化前后的TLC结果比较确认不包含双三苯甲基化杂质。

双三苯甲基化杂质N.D.，产量76g，产率64％

实施例10化合物13的合成

将通过实施例3所述方法合成的包含化合物8的反应产物(化合物8：90g，小于0.11mol)和甲苯(451mL)置于配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶。烧瓶内用氮气吹扫，加入三乙胺(29mL，0.21mol)。在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(14mL，0.18mol)，将混合物在室温下搅拌2小时。2小时后，通过TLC测定确认化合物8消失，并且加入450mL 5％磷酸二氢钠水溶液，分层。有机层用450mL5％磷酸二氢钠水溶液清洗一次，用450mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用450mL饱和食盐水清洗一次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物13的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3、6和9。

产量：96g

实施例11链长为16的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物14)的合成

将氢化钠(6.3g)置于配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶，在内部用氮气置换之后，加入192mL MeCN，随后冷却至0℃。将用53mL甲苯共沸脱水的四乙二醇1(108mL，0.56mol)与96mL MeCN混合，将所得物置于滴液漏斗中，在30分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将实施例10中获得的包含化合物13的反应产物(化合物13：96g，小于0.11mol)与96mL MeCN混合，将所得物置于同一滴液漏斗中并在15分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将反应混合物加热至75℃并搅拌3小时。3小时后，通过¹H-NMR(CDCl₃)确认化合物13消失，使混合物冷却至40℃以下。向反应混合物加入170mL饱和氯化铵水溶液和146mL己烷，分层。去除己烷层(上层)，下层在减压下浓缩，向残留物加入481mL甲苯。该甲苯溶液用260mL饱和氯化铵水溶液清洗一次，并且用480mL饱和食盐水清洗三次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物14的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定的结果(图13)确认，所获得的反应产物中也包含上述化合物3、6、9和15。

化合物14

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.78(1H,b,-C-(OCH₂CH₂)₁₆-OH,

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15的),

3.45-3.85(62H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₁-OH,包含源自化合物3、6、9、15的)

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15的)

产量：103g

从通过使用三氯乙酰异氰酸酯处理所获得的包含化合物14的反应产物以标记其羟基的化合物14'的¹H-NMR测定结果(图14)确认，以约19mol％的量包含化合物3、6、9和15(化合物3：7mol％，化合物6：5mol％，化合物9：3mol％，化合物15：4mol％，大致估计)。

以δ3.23处的峰为基准的化合物3、6、9、15含量的计算公式：

(((2-[δ4.43])/4H)/([δ4.43]/2H))×100(mol％)

对于化合物3、6、9的含量，使用实施例1、3和5中的数值。

化合物14'

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15的),

3.45-3.85(60H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₄-OCH₂ CH₂-OCO-,包含源自化合物3、6、9、15的)

4.43(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-NH-COCCl₃),

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂-,包含源自化合物3、6、9、15的)

实施例12化合物16的合成

将实施例11中合成的包含化合物14的反应产物(化合物14：100g，小于0.10mol)和甲苯(500mL)置于配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶中，***内部用氮气吹扫，并且加入三乙胺(20mL，0.14mol)。在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(9.6mL，0.12mol)，随后在室温下搅拌2小时。2小时后，通过TLC测定确认化合物14消失，并且加入500mL 5％磷酸二氢钠水溶液，分层。有机层用500mL 5％磷酸二氢钠水溶液清洗一次，用500mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用500mL饱和食盐水清洗一次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物16的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3、6、9和15。

产量：106g

实施例13链长为20的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物17)的合成

将氢化钠(5.7g)置于配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶，在内部用氮气置换之后，加入208mL MeCN，随后冷却至0℃。将用48mL甲苯共沸脱水的四乙二醇1(97mL，0.5mol)与105mL MeCN，混合，将所得物置于滴液漏斗中，在30分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将实施例12中获得的包含化合物16的反应产物(化合物16：109g，小于0.10mol)与105mL MeCN混合，将所得物置于同一滴液漏斗中并在15分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将反应混合物加热至75℃并搅拌3小时。3小时后，通过¹H-NMR(CDCl₃)确认化合物16消失，使混合物冷却至40℃以下。向反应混合物加入190mL饱和氯化铵水溶液和159mL己烷，分层。去除己烷层(上层)，下层在减压下浓缩，向残留物加入524mL甲苯。该甲苯溶液用285mL饱和氯化铵水溶液清洗一次，并且用520mL饱和食盐水清洗三次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物17的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定的结果(图15)确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3、6、9、15和18。

化合物17

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.64(1H,b,-C-(OCH₂CH₂)₂₀-OH,

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15、18的),

3.45-3.85(78H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₉-OH,包含源自化合物3、6、9、15、18的)

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15、18的)

产量：109g

从通过使用三氯乙酰异氰酸酯处理所获得的包含化合物17的反应产物以标记其羟基的化合物17'的¹H-NMR测定结果(图16)确认，以约23mol％的量包含化合物3、6、9、15和18(化合物3：7mol％，化合物6：5mol％，化合物9：3mol％，化合物15：4mol％，化合物18：4mol％，大致估计)。

以δ3.23处的峰为基准的化合物3、6、9、15、18含量的计算公式：

(((2-[δ4.43])/4H)/([δ4.43]/2H))×100(mol％)

对于化合物3、6、9、15的含量，使用实施例1、3、5和11中的数值。

化合物17'

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.45-3.85(76H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₁₈-OCH₂ CH₂-OCO-,包含源自化合物3、6、9、15、18的)

4.43(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-NH-COCCl₃),

实施例14化合物19的合成

将实施例13中合成的包含化合物17的反应产物(化合物17：107g，小于0.094mol)和甲苯(535mL)置于配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶中，***内部用氮气吹扫，并且加入三乙胺(18mL，0.13mol)。在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(8.7mL，0.11mol)，随后在室温下搅拌2小时。2小时后，通过TLC测定确认化合物17消失，并且加入535mL 5％磷酸二氢钠水溶液，分层。有机层用535mL 5％磷酸二氢钠水溶液清洗一次，用535mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用535mL饱和食盐水清洗一次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物19的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3、6、9、15和18。

产量：112g

实施例15链长为24的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物20)的合成

将氢化钠(5.2g)置于配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶，在内部用氮气置换之后，加入221mL MeCN，随后冷却至0℃。将用44mL甲苯共沸脱水的四乙二醇1(88mL，0.46mol)与111mL MeCN，混合，将所得物置于滴液漏斗中，在30分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将实施例14中获得的包含化合物19的反应产物(化合物19：113g，小于0.092mol)与111mL MeCN混合，将所得物置于同一滴液漏斗中并在15分钟期间逐滴加入。在逐滴加入完成后，将反应混合物加热至75℃并搅拌3小时。3小时后，通过¹H-NMR(CDCl₃)确认化合物19消失，使混合物冷却至40℃以下。向反应混合物加入200mL饱和氯化铵水溶液和168mL己烷，分层。去除己烷层(上层)，下层在减压下浓缩，向残留物加入556mL甲苯。该甲苯溶液用300mL饱和氯化铵水溶液清洗一次，并且用555mL饱和食盐水清洗三次。向有机层中加入硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的包含化合物20的反应产物。此外，通过TLC测定和NMR测定的结果(图17)确认，所获得的反应产物也包含上述化合物3、6、9、15、18和21。

化合物20

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.66(1H,b,-C-(OCH₂CH₂)₂₄-OH,

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15、18、21的),

3.45-3.85(94H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₂₃-OH,包含源自化合物3、6、9、15、18、21的)

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-,包含源自化合物3、6、9、15、18、21的)

产量：115g

从通过使用三氯乙酰异氰酸酯处理所获得的包含化合物20的反应产物以标记其羟基的化合物20'的¹H-NMR测定结果(图18)确认，以约27mol％的量包含化合物3、6、9、15、18和21(化合物3：7mol％，化合物6：5mol％，化合物9：3mol％，化合物15：4mol％，化合物18：4mol％，化合物21：4mol％，大致估计)。

以δ3.23处的峰为基准的化合物3、6、9、15、18、21含量的计算公式：

(((2-[δ4.43])/4H)/([δ4.43]/2H))×100(mol％)

对于化合物3、6、9、15、18的含量，使用实施例1、3、5、11和13中的数值。

化合物20'

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.45-3.85(92H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₂₂-OCH₂ CH₂-OCO-,包含源自化合物3、6、9、15、18、21的)

4.43(2H,t,-OCH₂CH₂ -OCO-NH-COCCl₃),

实施例16链长为24的包含一个末端三苯甲基的单分散PEG(化合物20)的纯化

步骤(A)

将包含化合物20作为主要组分的混合物(97g，74mmol，实施例15包括双三苯甲基化杂质3、6、9、15、18、21合计约27mol％、约30质量％)、乙酸钠(6.0g，74mmol)和甲苯(97g)加入配备有冷凝管、温度计和氮气进气管的四颈烧瓶。烧瓶内用氮气吹扫，加入丁二酸酐(11g，110mmol)。将混合物在70℃下搅拌4小时。4小时后，通过TLC测定确认化合物20消失，将整体冷却至40℃以下。在加入甲苯(155g)之后，加入23.4wt％食盐水(582g)，并且在55℃下进行一次分液清洗。

步骤(B)

将己烷(33g)、甲醇(226g)和pH 6.8的磷酸(0.3M)缓冲液(222g)投入有机层以分层。确认浑浊的水层的pH为5至7，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。确认上下层透明，并且弃去有机层。向水层加入甲苯(252g)，将混合物在45-50℃下搅拌15分钟，然后静置。分层为上下层之后，弃去有机层。再进行两次分液清洗之后，通过TLC测定确认源自双三苯甲基化杂质(3、6、9、15、18、21)的点消失。

分液清洗时的溶剂质量比：

有机溶剂I:有机溶剂II:有机溶剂III＝44.2％:49.3％:6.5％

步骤(C)

清洗之后，向水层(pH 6.68)加入400g/L的氢氧化钠水溶液(19g)，将混合物在35℃下搅拌4小时。4小时后，从水层(pH 11.3)的TLC测定确认化合物22消失。

向水层加入二氯甲烷(643g)，将混合物在30℃下搅拌15分钟。在使混合物静置并确认分层之后，从TLC测定确认化合物20没有残留在水层中，并且弃去水层。向有机层加入20wt％食盐水(582g)，并且在30℃下进行分液清洗。收集的有机层用硫酸钠(97g)脱水，使用二氯甲烷过滤，然后浓缩以获得化合物20(68g)。NMR测定结果的积分值与理论值一致(图19)，并且从化合物20纯化前后的TLC结果比较确认不包含双三苯甲基化杂质(图20)。

双三苯甲基化杂质N.D.(TLC测定，参见图20)，产量68g，产率70％

化合物20(纯化后)

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.69(1H,s,-OCH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₂₃-OH),

3.23(2H,t,(C₆H₅)₃C-OCH₂ CH₂-),

3.45-3.85(94H,m,-OCH₂CH₂ -(OCH₂ CH₂ )₂₃-OH)

7.21-7.47(15H,m,(C₆ H₅ )₃C-OCH₂CH₂-)

以上实施例6至9和16说明，双三苯甲基化杂质能够在链延长步骤之后立即从包含一个末端三苯甲基的单分散PEG中去除。

此外，在实施例9中说明，尽管能够去除双三苯甲基化杂质，但是为了去除双三苯甲基化杂质所需要的分液清洗次数增加，并且与实施例7的情况相比产率下降。

比较例1水溶液pH过高的实例

进行与实施例7的步骤(A)相同的操作，进行分液萃取，使得步骤(B)中的溶剂比例变为如下：碳酸氢钠(4wt％，pH 8)水溶液(232g)、甲醇(232g)、甲苯(378g)和己烷(145g)。水溶液的pH为8，在本发明的范围之外。

通过TLC测定确认，源自双三苯甲基化杂质(3、6、9)的点在进行4次分液萃取之后消失。但是，在分液萃取期间，化合物10水解成为化合物8，其被萃取至有机层从而损失。

在步骤(C)中，进行与实施例1相同的操作，以获得化合物8(53g)。NMR测定结果的积分值与理论值一致，并且从化合物8纯化前后的TLC结果比较而确认不包含双三苯甲基化杂质。

双三苯甲基化杂质N.D.，产量53g，产率45％

工业实用性

根据本发明，提供了一种能够获得适合于医药用途的高纯度单分散PEG的新型纯化方法。

尽管已详细地并参考具体实施方式对本发明进行了描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离其精神和范围时，在其中做出各种改变和修改。

本发明基于2018年3月29日提交的日本专利申请号2018-63421，其内容通过引用并入本文。

Claims

1.一种包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的纯化方法，包括从包含下列式(1)所示的包含三苯甲基的单分散聚乙二醇和下列式(2)所示的双三苯甲基化杂质的混合物中分离并去除所述双三苯甲基化杂质，以获得所述包含三苯甲基的单分散聚乙二醇，

所述方法包括：顺序执行下列步骤(A)、(B)和(C)：

步骤(B)：通过使用所述步骤(A)中获得的所述反应溶液、一种以上选自由下列有机溶剂I、II和III所组成的组中的有机溶剂、以及pH为3至7的水溶液进行分液萃取纯化，分离水层和有机层，将所述式(2)所示的双三苯甲基化杂质分入有机层并将所述酯化合物分入水层的萃取步骤；

有机溶剂I：具有3个以下碳原子的醇溶剂，

有机溶剂II：具有总计8个以下碳原子的芳香烃溶剂，

有机溶剂III：具有总计10个以下碳原子的饱和脂肪烃溶剂，

其中对于所述步骤(B)中所述有机溶剂的混合比例，所述有机溶剂I的质量比为15-55质量％，所述有机溶剂II的质量比为15-75质量％，并且所述有机溶剂III的质量比为0-50质量％，并且

其中在所述步骤(B)的所述萃取步骤期间的温度为0℃以上且60℃以下。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤(A)中，所述二元酸酐选自由丁二酸酐和戊二酸酐所组成的组。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I是一种以上选自甲醇、乙醇和丙醇的溶剂，所述有机溶剂II是一种以上选自由甲苯和二甲苯所组成的组中的溶剂，并且所述有机溶剂III是一种以上选自由戊烷、己烷和庚烷所组成的组中的溶剂。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(B)的所述萃取步骤重复进行。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(C)中的所述碱是一种以上选自由氢氧化钠和氢氧化钾所组成的组中的碱。