CN111936156A - 用于治疗癌症的STING激动剂和IL-15/IL15-Ra的组合 - Google Patents

Abstract

本披露涉及包含与IL‑15/IL‑15Ra复合物组合的STING激动剂分子的药物组合物。可以独立地或分开地，以对于治疗癌症是治疗上有效的量施用本发明的组合。还提供了这种组合用于制造药物的用途；这种组合作为药剂的用途；包含这种组合的成套试剂盒；以及这种组合的治疗方法。

Description

用于治疗癌症的STING激动剂和IL-15/IL15-Ra的组合

技术领域

本披露涉及与可增强STING激动剂分子功效的另外的药剂(如包含与IL-15受体α(“IL-15Ra”)结合的白介素-15(“IL-15”)的复合物)组合的STING激动剂分子。在特定的方面，该组合可用于预防、治疗、和/或控制诱导先天性免疫是有益的障碍(例如癌症)。

背景技术

先天性免疫是快速的非特异性免疫应答，可抵抗环境侵害，包括但不限于病原体(例如细菌或病毒)。适应性免疫是较慢但更具特异性的免疫应答，赋予宿主长期或保护性免疫，并涉及初始T淋巴细胞分化和激活为CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞，从而促进细胞和体液免疫。先天性免疫***的抗原呈递细胞(例如，树突状细胞或巨噬细胞)，通过吞噬和处理外来抗原并且在细胞表面上呈递它们给T细胞由此激活T细胞应答，从而作为在先天性和适应性免疫***之间的关键环节。

STING(干扰素基因刺激因子)是内质网衔接子，其促进先天免疫信号传导(Ishikawa和Barber,Nature[自然]2008,455(7213):674-678)。据报道STING包含四个假定的跨膜区域(Ouyang等人,Immunity[免疫力](2012)36,1073)，主要位于内质网中，并能够激活NF-kB、STAT6和IRF3转录途径以诱导I型干扰素(例如，IFN-α和IFN-β)的表达，并在表达后发挥有效的抗病毒状态(Ishikawa和Barber,Nature[自然]2008,455(7213):674-678；Chen等人,Cell[细胞](2011)147,436-446)。相反，STING的缺失使得鼠类胚胎成纤维细胞极易受负链病毒(包括水疱性口炎病毒)感染(Ishikawa和Barber,Nature[自然]2008 455(7213):674-678)。

细胞因子白介素-15(IL-15)是由体内许多细胞产生的四α-螺旋束淋巴因子家族的成员。IL-15在调节先天性和适应性免疫***的活性方面发挥关键作用，例如维持记忆T细胞对入侵病原体的应答、抑制细胞凋亡、激活树突状细胞、以及诱导自然杀伤(NK)细胞的增殖和细胞毒性活性。已证实IL-15信号传导通过IL-15受体的异源二聚体复合物发生，该IL-15受体由三条多肽组成，即类型特异性IL-15受体α(“IL-15Ra”)、IL-2/IL-15受体β(或CD122)(“β”)以及由多种细胞因子受体共有的常见γ链(或CD132)(“γ”)。根据其在免疫***中的多方面作用，已探究了被设计用于调节IL-15介导的功能的多种疗法。最近的报道表明，IL-15在与sIL-15Ra或sushi结构域复合时维持其免疫增强功能。重组IL-15和IL-15/IL-15Ra复合物已显示出在不同程度上促进记忆CD8 T细胞和NK细胞的扩增，并增强多种临床前模型中的肿瘤排斥。此外，在小鼠模型中含有IL-15或IL-15/IL-15Ra复合物的构建体的肿瘤靶向，使移植有同源肿瘤的具有免疫能力的动物或注射有人肿瘤细胞系的T细胞和B细胞缺陷型SCID小鼠(保留NK细胞)中的抗肿瘤应答得以改善。增强的抗肿瘤活性被认为取决于含IL-15部分的半衰期增加以及IL-15在肿瘤细胞表面上的反式呈递，这导致了增强的NK和/或CD8细胞毒性T细胞在肿瘤内的扩增。同样，还报道了被工程化以表达IL-15的肿瘤细胞通过增强T细胞和NK细胞募集、增殖和功能来促进已建立的肿瘤的排斥(Zhang等人,(2009)PNAS USA.[美国国家科学院院刊],106:7513-7518；Munger等人,(1995)CellImmunol.[细胞免疫学]165(2):289-293；Evans等人,(1997)Cell Immunol.[细胞免疫学]179(1):66-73；Klebanoff等人,(2004)PNAS USA.[美国国家科学院院刊]101(7):1969-74；Sneller等人,(2011)Blood.[血液]118(26):6845-6848；Zhang等人,(2012)J.Immunol.[免疫学杂志]188(12):6156-6164)。

因此，当通过在免疫应答的一个或多个阶段靶向多个组分来优化免疫应答时，增强抗肿瘤免疫的治疗方法可以更有效地发挥作用。因此，仍未满足用于治疗疾病，特别是癌症的新的免疫疗法的需要。

发明内容

因此，本文披露了增强抗肿瘤免疫的组合疗法，并且该组合疗法与该组合中的治疗剂的单一疗法施用相比可以例如在障碍的治疗中提供优异的有益效果，例如增强的抗癌作用、减少的毒性、和/或减少的副作用。例如，相比于单一疗法施用，该组合中的一种或多种治疗剂可以以与实现相同治疗效果所需的相比较低的剂量施用，或施用较短的施用时间段或以较低的频繁施用。更具体地，可以施用该组合中的治疗剂之一以增强其他药剂的作用。因此，披露了使用组合疗法来治疗癌症的组合物和方法。

在实施例中，本披露提供如下组合，该组合包含与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子。

在一个实施例中，STING激动剂分子是二核苷酸。在另一个实施例中，STING激动剂分子是环状二核苷酸(CDN)。在本文披露的实施例中，STING激动剂分子选自由以下组成的组：

a)STING100

b)STING101

c)STING102

d)STING103

e)STING104

f)STING105

g)STING106

和

h)STING107

在一个实施例中，该组合的IL-15/IL-15Ra复合物可包含与野生型IL-15Ra或IL-15Ra衍生物共价或非共价结合的野生型IL-15或IL-15衍生物。在一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含野生型IL-15和野生型IL-15Ra。在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含IL-15衍生物和野生型IL-15Ra。在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物呈野生型异源二聚体形式。在另一个实施例中，IL-15是人IL-15，并且IL-15Ra是人IL-15Ra。在特定的实施例中，人IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸残基49至162，并且人IL-15Ra包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段，如表1中所述。在另一个实施例中，IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸残基49至162，并且IL-15Ra包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，如表1中所述。在特定的实施例中，人IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸残基49至162，并且人IL-15Ra包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列，如表1中所述。

在其他实施例中，IL-15Ra被糖基化，以使得糖基化占IL-15Ra质量的至少或超过20％、30％、40％或50％。在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含野生型IL-15和IL-15Ra衍生物。在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含IL-15衍生物和IL-15Ra衍生物。在一个实施例中，IL-15Ra衍生物是野生型IL-15Ra的可溶性形式。在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物包含抑制内源性蛋白酶切割的突变。在特定的实施例中，IL-15Ra的胞外结构域切割位点被异源性蛋白酶特异性识别的切割位点替换。在一个实施例中，IL-15Ra的胞外结构域切割位点被异源性胞外结构域切割位点(例如，异源性跨膜结构域，该异源性跨膜结构域被与内源性加工酶(切割IL-15Ra)无关的另一种酶识别和切割)替换。

在特定的实施例中，本披露提供如下组合，该组合包含与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子，其中i)该STING激动剂分子选自由分子STING100-STING107组成的组；ii)该IL-15/IL-15Ra复合物是人IL-15和人可溶性IL-15Ra的异源二聚体复合物，并且其中该人IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基49至162，并且该人可溶性IL-15Ra包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

组合疗法的用途

本文披露的组合可以导致以下中的一项或多项：抗肿瘤免疫，免疫细胞功能的增加(例如，CD8+T细胞增殖、NK细胞增殖、调节性T细胞功能的抑制、对多种细胞类型(例如CD8+T细胞和NK细胞)的活性的影响中的一种或多种)，以及肿瘤浸润淋巴细胞的增加。在一个实施例中，组合中IL-15/IL-15Ra复合物的使用刺激免疫应答，并且可以增强由于STING激动剂分子的使用而产生的先天性免疫。因此，此类组合可用于治疗或预防希望增强受试者的抗肿瘤免疫的障碍(例如，癌症)。此类组合疗法可以用于例如癌症免疫疗法和其他病症(例如慢性感染)的治疗。在实施例中，本文提供了通过将与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子施用于受试者来治疗(例如，抑制、减轻、改善或预防)受试者的障碍(例如，过度增殖性病症或障碍(例如，癌症))的方法。还提供了与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子，用于治疗(例如，抑制、减轻、改善或预防)受试者的障碍(例如，过度增殖性病症或障碍(例如，癌症))。还提供了与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子，用于制备用于治疗(例如，抑制、减轻、改善或预防)受试者的障碍(例如，过度增殖性病症或障碍(例如，癌症))的药物。

已在如下所述的实例1中证明了STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的抗肿瘤免疫的增强。在一些实施例中，该组合可用于治疗癌症。癌症包括但不限于；多种器官***的肉瘤、腺癌、母细胞癌和癌，例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胆肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮细胞)、***和咽的那些。

腺癌包括恶性肿瘤(例如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌)。在一个实施例中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、腹膜癌、胃癌(stomach或gastric cancer)、食管癌、唾液腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、***癌(penilecarcinoma)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、***、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌(cancer of the penis)、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病症，包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。

在一个实施例中，将STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合分开或一起施用于受试者。在另一个实施例中，同时或顺序施用STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合。

本申请还提供编码本文披露的IL-15/IL-15Ra复合物的核酸、以及包含该核酸的载体、和包含该核酸或该载体的宿主细胞。还提供产生本文披露的IL-15/IL-15Ra复合物的方法，该方法包括：培养表达编码IL-15/IL-15Ra复合物的核酸的宿主细胞；以及从该培养物中收集IL-15/IL-15Ra复合物。

附图说明

图1是显示在结肠直肠癌(MC38)小鼠模型中hetIL15和STING激动剂分子的组合的药效动力学(PD)和功效的表。

图2显示了在结肠直肠癌小鼠模型中的组合的研究设计和给药方案。

图3A/B-图3A显示了在结肠直肠癌模型中小鼠的肿瘤体积的曲线，其中用hetIL15作为单一疗法、STING100作为单一疗法、以及hetIL15/STING100组合(具有增加剂量的STING100)。图3B是具有相同给药方案的小鼠的存活的图。

图4是描绘结肠直肠肿瘤模型中的小鼠的体重的图，表明hetIL15和STING100作为单一疗法以及在组合中都具有良好的耐受性。

图5A/F显示了作为单一疗法的STING100或hetIL15导致仅适度的肿瘤生长延迟，但STING100和hetIL15的组合导致持久的完全应答。图5F表明群组的7只小鼠中有5只完全恢复，完全恢复率达71％。

图6A/C显示hetIL15/STING100组合增强抗肿瘤免疫。图6A是描绘CD8+T细胞的增加的图，而图6B显示NK细胞的增加。图6C表明用hetIL15和STING100作为单一疗法，然后用hetIL15/STING100组合(具有增加剂量的STING100)的CD8+T细胞的数量。

图7A/B显示用hetIL15/STING100组合处理的小鼠发展持久的抗肿瘤免疫。图7A表明当用相同类型的肿瘤细胞(MC38)再次攻击使用hetIL15/STING100组合处理的小鼠时，它们不形成肿瘤。图7B描绘了通过从正常未处理的小鼠取得的脾细胞、从植入了MC38结肠直肠肿瘤的小鼠和用hetIL15/STING100组合处理并再次攻击的小鼠取得的脾细胞产生的IFNγ的量。

具体实施方式

本披露提供包含STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合，以及药物组合物、产生方法和使用这种组合的方法。

定义

除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。

如本文所用，术语“STING激动剂分子”是指能够结合STING并激活STING的化合物。STING活性的激活可以包括，例如炎性细胞因子的刺激，这些炎性细胞因子包括干扰素(例如1型干扰素(包括IFN-α、IFN-β)、3型干扰素(例如IFNγ))、或其他包括促炎分子(但不限于IP10、TNF、IL-6、CXCL9、CXCL10、CCL4、CXCL11、CCL5、CCL3、或CCL8)。STING激动剂活性还可以包括TANK结合激酶(TBK)1磷酸化、STING磷酸化的刺激，干扰素调节因子(IRF)激活(例如IRF3激活)，NFκB激活，STAT6激活，干扰素-γ-诱导型蛋白(IP-10)或其他炎性蛋白和细胞因子的分泌。STING激动剂活性可以例如通过化合物刺激STING途径激活的能力来确定，所述能力如使用干扰素刺激测定法、报告基因测定法(例如hSTING wt测定法或THP-1双重测定法)、TBK1激活测定法、IP-10测定法、STING生化[3H]cGAMP竞争测定法或本领域技术人员已知的其他测定法检测的。STING激动剂活性还可以通过化合物增加基因转录水平的能力来确定，这些基因编码被STING或STING途径激活的蛋白质。可以例如通过定量实时PCR、RNAseq、Nanostring、或用于检测分泌性蛋白的各种测定法(细胞因子珠阵列、ELISA)检测这种活性。在一些实施例中，用于检测化合物在STING敲除细胞系中的活性的测定法可用于确定该化合物是否对STING具有特异性，其中预期对STING具有特异性的化合物在细胞系中(其中STING途径被部分或全部缺失)不具有活性。

“与……组合”或“……的组合”并不旨在暗示必需同时施用组合的药剂和/或配制其用于一起递送，尽管这些递送方法也在本文所述的范围内。可以在IL-15/IL-15Ra复合物之前、同时或之后施用STING激动剂分子，反之亦然，即可以按任何顺序施用STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物。一般而言，每种药剂将以针对该药剂所确定的剂量和/或时间表施用。还应理解，该组合中使用的每种治疗剂可以按单一组合物一起施用或按不同组合物分开施用。一般而言，预期组合的治疗剂以不超过它们单独使用时的水平使用。在一些实施例中，组合中使用的药剂的水平将低于单独使用的水平。在一些实施例中，组合的药剂还可以用作完全分开的、也独立于彼此销售的药物剂型或药物配制品，并且其中在包装设备(例如传单等)或其他信息中提供了它们组合使用的可能性的说明书。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢结合的α碳、羧基基团、氨基基团和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的化合物。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。

术语“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定核酸序列，经保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述的相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是经保守修饰变异中的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG)均可以经修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每种沉默变异。

对于多肽序列，“经保守修饰的变体”包括对多肽序列的单个取代、缺失或添加，从而使某个氨基酸取代为化学上类似的氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域中熟知的。此类经保守修饰的变体是对多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。以下八组含有互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。在一个实施例中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的IL-15/IL-15Ra复合物的结合特征的氨基酸修饰。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以在使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量时获得最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或在没有规定时在整个序列上，60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，则这两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。任选地，同一性存在于长度为至少50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。

对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文所用，“比较窗口”包括提及选自由以下组成的组的多个邻接位置中的任一个的区段：20至600个、通常约50至约200个、更通常约100至约150个，其中在将序列与相同数量的邻接位置的参考序列最佳比对后，可以将两个序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过如下来进行：例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,(1988)PNAS USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575Science Dr.,Madison,Wis.)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)，或通过手动比对和目视检查(参见例如，Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验指南],John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子出版社](ringbou编著,2003))。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,1977,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开地获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到含有其的更长HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的扩展终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(N)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)PNAS USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。

该BLAST算法还对两个序列之间的相似度进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul,(1993)PNAS USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，该最小总和概率提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01、最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],(1988)4:11-17)的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.[分子生物学杂志],(1970)48:444-453)算法，利用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。

除了上述序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其补体在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的又另一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。

术语“核酸”与术语“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，如下文详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081；Ohtsuka等人,1985,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98)。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。典型地，它是指转录调节序列与已转录序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达***中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列可操作地连接至编码序列。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与已转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调节序列增强其转录的编码序列的位置。

如本文所用，术语“优化的”意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞或生物体(通常为真核细胞，例如毕赤酵母属的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列工程化以完全或尽可能多地保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲本”序列。本文优化的序列已被工程化以具有在哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，本文还设想了这些序列在其他真核细胞或原核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指示，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体。

术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指已引入重组表达载体的细胞。应当理解，这种术语不仅意指特定的受试者细胞，而且意指这种细胞的子代。因为某些修饰可以在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”范围内。

术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。

术语“治疗(treat、treated、treating和treatment)”包括施用组合物以缓解或延迟疾病的症状、并发症或生化标记的发作，预防另外的症状的发展，或者阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。可以通过本文所述的治疗措施来测量治疗。“治疗”的方法包括将与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子施用于受试者，以治愈癌症或与癌症相关的病症，降低癌症或与癌症相关的病症的严重程度，或改善癌症或与癌症相关的病症的一种或多种症状，以延长受试者的健康或存活(该健康或存活超过在没有这种治疗的情况下预期的健康或存活)。例如，“治疗”包括将受试者的疾病症状缓解至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。

术语“预防”包括施用STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合物或组合，以预防或延迟疾病的发作、或以预防其临床或亚临床症状的显现(即预防性施用)、或在疾病显现后对症状的治疗性抑制或缓解。

术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，旨在包括这种其他形式的表达载体如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能。

STING激动剂分子

STING激动剂分子的合成实例参见根据WO 2014189805中的合成描述。

具体地，化合物(STING100)，

是根据以下方案合成的：

向5g(5.15mmol)N-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3'-O-[(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨基苯基]腺苷(1)在25ml乙腈中的溶液里添加0.18ml(10毫摩尔)水和1.20g(6.2mmol)三氟乙酸吡啶鎓。在室温下搅拌5分钟后，添加25ml叔丁胺，并将反应在室温下搅拌15分钟。将溶剂在减压下去除，以给出呈泡沫的(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-3-基氢膦酸酯，然后将其与乙腈(2x50ml)共蒸发，然后溶解于60ml二氯甲烷中。向该溶液中添加水(0.9ml，50毫摩尔)和在二氯甲烷中的60ml 6％(v/v)二氯乙酸(44mmol)。在室温下10分钟后，通过添加吡啶(7.0ml，87mmol)将反应淬灭，并浓缩至油状物，将其通过与40ml无水乙腈共蒸发三次进行干燥，给出体积为12ml的(2)。

将N-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-O-[(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨基苯基]腺苷((3)，6.4g，6.6毫摩尔)溶解于40ml无水乙腈中，并通过与40ml无水乙腈共蒸发三次进行干燥，最后一次剩余20ml。添加

分子筛，并将溶液在氩气中储存直至使用。经由注射器将20ml乙腈中的共沸干燥物(3)(6.4g，6.6毫摩尔)添加至(2)(5.15mmol)在12ml无水乙腈中的溶液中。在室温下搅拌5分钟后，添加1.14g(5.6mmol)的3-((N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)，并将反应在室温下搅拌30分钟。将反应浓缩，并将残余油状物溶解于80ml二氯甲烷中。添加水(0.9ml，50mmol)和在二氯甲烷中的80ml 6％(v/v)二氯乙酸(58mmol)，并将反应在室温下搅拌10分钟。添加50ml吡啶以淬灭二氯乙酸。在减压下去除溶剂，以给出呈固体的粗(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-2-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰硫基)氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-3-基氢膦酸酯，然后将其溶解于150ml干燥吡啶中，并浓缩降至体积为约100ml。然后添加2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2-氧化物(DMOCP，3.44g，18毫摩尔)，并将反应在室温下搅拌5分钟。立即添加3.2ml水，随后添加3-H-1,2-苯并二硫醇1-3-酮(1.3g，7.7毫摩尔)，并将反应在室温下搅拌5分钟。然后将反应混合物倒入含有20g NaHCO₃的700ml水中，并在室温下搅拌5分钟，然后倒入分液漏斗，并用800ml 1:1的乙酸乙酯:二***萃取。将水层用600ml 1:1的乙酸乙酯:二***再次萃取。将有机层合并，并在减压下浓缩以产出约11g含有非对映异构体(5a)和(5b)的油状物。将以上粗混合物溶解于二氯甲烷中，并施加到250g硅胶柱上。使用在二氯甲烷中的乙醇梯度(0-10％)，将所希望的非对映异构体从柱中洗脱。将含有所希望的非对映异构体(5a)和(5b)的级分合并并浓缩，给出2.26g约50％(5a)和50％(5b)。

将来自硅胶柱的2.26g粗(5a)和(5b)转移至厚壁玻璃压力管中。添加60ml甲醇和60ml浓缩水性氨，并将管加热，同时在油浴中在50℃下搅拌16h。将反应混合物冷却至接近环境温度，用氮气流鼓泡30分钟，并然后转移至大的圆底烧瓶。在减压下，小心去除大部分挥发物，以免产生泡沫和暴沸。如果仍然存在水，则将残余物冷冻并冻干至干燥。将冻干的粗混合物吸收在约50ml的CH₃CN/10mM水性三乙基乙酸铵(60/40)中。在0.45微米PTFE过滤后，将4-5ml样品部分应用于C-18Dynamax柱(40x 250mm)上。用乙腈和10mM水性三乙基乙酸铵(经20分钟，以50ml/min流速，30％至50％CH₃CN)的梯度进行洗脱。将来自制备型HPLC运行的、含有纯的(6)的级分合并，蒸发以去除CH₃CN，并冻干，以给出360mg呈双-三乙铵盐的纯的(6)(RpRp非对映异构体)。

向270mg(0.24mmol)的(6)中添加5.0ml纯净的三甲胺三氢氟化物。将混合物在室温下搅拌约40h。通过分析型HPLC确认反应的完成，通过逐滴添加至45ml冷却的、搅拌的1M三乙铵碳酸氢盐将样品进行中和。将经中和的溶液在Waters C-18Sep-Pak上脱盐，并将产物用CH₃CN/10mM水性三乙基乙酸铵(5:1)洗脱。将CH₃CN在减压下蒸发，并将剩余水溶液冷冻并冻干。从水中进行多轮冻干，给出122mg(57％)呈双-三乙铵盐的(T1-2)。¹H NMR(500MHz,45℃,(CD₃)₂SO-15μL D₂O)δ8.58(s,1H),8.41(s,1H),8.18(s,1H),8.15(s,1H),6.12(d,J＝8.0,1H),5.92(d,J＝7.0,1H),5.30(td,J＝8.5,4.0,1H),5.24-5.21(m,1H),5.03(dd,J＝7.5,4.5,1H),4.39(d,J＝4,1H),4.23(dd,J＝10.5,4.0,1H),4.18(s,1H),4.14-4.08(m,2H),3.85-3.83(m,1H),3.73(d,J＝12.0,1H),3.06(q,J＝7.5,12H),1.15(t,J＝7.5,1H)；³¹P NMR(200MHz,45℃,(CD₃)ISO-15pL D₂O)6 58.81,52.54；HRMS(FT-ICR)I/z，针对C20H24O10N10P2S2(M-H)的计算值689.0521，实测值689.0514。

STING激动剂测定法的实例如下。将HEK-293T细胞用人STING(登录号BC047779，在位置232处引入Arg突变，使该克隆成为人STING野生型)和5xISRE-mIFNb-GL4质粒(驱动萤火虫荧光素酶GL4的表达的五个干扰素刺激的应答元件和最小小鼠干扰素β启动子)的混合物进行反转染。通过将FuGENE:DNA混合物添加到悬浮液中的HEK-293T细胞中并接种到384孔板中使用FuGENE转染试剂(3:1FuGENE:DNA比率)转染细胞。将细胞孵育过夜，并用化合物处理。9-14小时后，通过添加BrightGlo试剂(普洛麦格公司(Promega))读板，并在Envision板读数器上读取。计算相对于背景的倍数变化，并将其标准化为50μM的2’3’-cGAMP诱导的倍数变化。各板一式三份运行。如IP-10分泌测定法所述计算EC50值。

IL-15

如本文所用，术语“IL-15”和“白介素-15”是指野生型IL-15或IL-15衍生物。在特定的实施例中，分离并重组产生IL-15。如本文所用，术语“野生型IL-15”和“野生型白介素-15”在蛋白质或多肽的上下文中是指任何哺乳动物白介素-15氨基酸序列，包括未成熟形式或前体形式和成熟形式。各种物种野生型哺乳动物白介素-15的氨基酸序列的GeneBank登录号的非限制性实例包括NP_000576(人)、CAA62616(人)、AAI00964(人)、AAH18149(人)、NP_001009207(家猫(Felis catus))、AAB94536(褐家鼠(Rattus norvegicus))、AAB41697(褐家鼠)、NP_032383(小家鼠(Mus musculus))、AAH23698(小家鼠)、AAR19080(犬)、以及AAB60398(猕猴(Macaca mulatta))。人IL-15的未成熟/前体形式的氨基酸序列包含长信号肽(下划线)和成熟人IL-15(斜体)，如SEQ ID NO:1中所提供的。在一些实施例中，IL-15是哺乳动物IL-15的未成熟形式或前体形式。在其他实施例中，IL-15是哺乳动物IL-15的成熟形式。在特定的实施例中，IL-15是人IL-15的前体形式。在另一个实施例中，IL-15是人IL-15的成熟形式。在一个实施例中，IL-15蛋白/多肽是分离的或纯化的。

如本文所用，术语“IL-15”和“白介素-15”在核酸的上下文中是指编码哺乳动物白介素-15的任何核酸序列，包括未成熟形式或前体形式和成熟形式。用于各种野生型哺乳动物IL-15的核苷酸序列的GeneBank登录号的非限制性实例包括NM_000585(人)、NM_008357(小家鼠)和RNU69272(褐家鼠)。编码人IL-15的未成熟/前体形式的核苷酸序列包含编码长信号肽的核苷酸序列(下划线)和编码成熟人IL-15的核苷酸序列(斜体)，如SEQ ID NO:2中所提供的。在特定的实施例中，核酸是分离的或纯化的核酸。在一些实施例中，核酸编码哺乳动物IL-15的未成熟形式或前体形式。在其他实施例中，核酸编码哺乳动物IL-15的成熟形式。在特定的实施例中，编码IL-15的核酸编码人IL-15的前体形式。在另一个实施例中，编码IL-15的核酸编码人IL-15的成熟形式。

如本文所用，术语“IL-15衍生物”和“白介素-15衍生物”在蛋白质或多肽的上下文中是指：(a)与野生型哺乳动物IL-15多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽；(b)由与编码野生型哺乳动物IL-15多肽的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的多肽；(c)相对于野生型哺乳动物IL-15多肽，含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸突变(即，添加、缺失和/或取代)的多肽；(d)由如下核酸编码的多肽：这些核酸可以在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码野生型哺乳动物IL-15多肽的核酸杂交；(e)由如下核酸序列编码的多肽：该核酸序列可以在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、或至少150个连续氨基酸的野生型哺乳动物IL-15多肽的片段的核酸序列杂交；和/或(f)哺乳动物IL-15多肽的片段。IL-15衍生物还包括包含哺乳动物IL-15多肽的成熟形式的氨基酸序列和异源性信号肽氨基酸序列的多肽。在特定的实施例中，IL-15衍生物是野生型人IL-15多肽的衍生物。在另一个实施例中，IL-15衍生物是人IL-15多肽的未成熟形式或前体形式的衍生物。在另一个实施例中，IL-15衍生物是人IL-15多肽的成熟形式的衍生物。在另一个实施例中，IL-15衍生物是例如Zhu等人,(2009),J.Immunol.[免疫学杂志]183:3598或美国专利号8,163,879中所述的IL-15N72D。在另一个实施例中，IL-15衍生物是美国专利号8,163,879中所述的IL-15变体中的一者。在一个实施例中，IL-15衍生物是分离的或纯化的。

在优选的实施例中，IL-15衍生物保留了野生型哺乳动物IL-15多肽结合IL-15Ra多肽的功能的至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本领域熟知的测定法(例如，ELISA、

免疫共沉淀)所测量的。在另一个优选的实施例中，IL-15衍生物保留了野生型哺乳动物IL-15多肽诱导IL-15介导的信号转导的功能的至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本领域熟知的测定法(例如，电泳迁移率变动测定法、ELISA和其他免疫测定法)所测量的。在特定的实施例中，IL-15衍生物结合至IL-15Ra和/或IL-15Rβγ，如通过例如本领域熟知的配体/受体结合测定法所评估的。可以使用本领域技术人员已知的和上文所述的任何方法来确定同一性百分比。

如本文所用，术语“IL-15衍生物”和“白介素-15衍生物”在核酸的上下文中是指：(a)与编码野生型哺乳动物IL-15多肽的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列；(b)编码与野生型哺乳动物IL-15多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽的核酸序列；(c)相对于编码哺乳动物IL-15多肽的核酸序列，含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核酸碱基突变(即，添加、缺失和/或取代)的核酸序列；(d)在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码哺乳动物IL-15多肽的核酸序列杂交的核酸序列；(e)在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码哺乳动物IL-15多肽的核酸序列的片段杂交的核酸序列；和/或(f)对编码哺乳动物IL-15多肽的核酸序列的片段进行编码的核酸序列。在特定的实施例中，IL-15衍生物在核酸的上下文中是编码人IL-15多肽的核酸序列的衍生物。在另一个实施例中，IL-15衍生物在核酸的上下文中是编码人IL-15多肽的未成熟形式或前体形式的核酸序列的衍生物。在另一个实施例中，IL-15衍生物在核酸的上下文中是编码人IL-15多肽的成熟形式的核酸序列的衍生物。在另一个实施例中，IL-15衍生物在核酸的上下文中是编码例如Zhu等人(2009；同上)或美国专利号8,163,879中所述的IL-15N72D的核酸序列。在另一个实施例中，IL-15衍生物在核酸的上下文中是编码美国专利号8,163,879中所述的IL-15变体中的一者的核酸序列。

IL-15衍生物核酸序列包括编码哺乳动物IL-15多肽(包括IL-15多肽的成熟形式和未成熟形式)的密码子优化的核酸序列。在其他实施例中，IL-15衍生物核酸包括编码哺乳动物IL-15RNA转录物的核酸，该哺乳动物IL-15RNA转录物含有这样的突变：该突变消除了潜在的剪接位点和不稳定性元件(例如，富含A/T或A/U的元件)而不影响增加哺乳动物IL-15RNA转录物的稳定性的氨基酸序列。在一个实施例中，IL-15衍生物核酸序列包括PCT公开号WO 2007/084342中所述的密码子优化的核酸序列。在某些实施例中，IL-15衍生物核酸序列是SEQ ID NO:4中的密码子优化的序列(由这种核酸序列编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:5中)。

在一个实施例中，IL-15衍生物核酸序列编码保留了野生型哺乳动物IL-15多肽结合IL-15Ra的功能的至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的蛋白质或多肽，如通过本领域熟知的测定法(例如，ELISA、

免疫共沉淀)所测量的。在另一个优选的实施例中，IL-15衍生物核酸序列编码保留了野生型哺乳动物IL-15多肽诱导IL-15介导的信号转导的功能的至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的蛋白质或多肽，如通过本领域熟知的测定法(例如，电泳迁移率变动测定法、ELISA和其他免疫测定法)所测量的。在特定的实施例中，IL-15衍生物核酸序列编码结合至IL-15Ra和/或IL-15Rβγ的蛋白质或多肽，如通过例如本领域熟知的配体/受体测定法所评估的。

IL-15Ra

如本文所用，术语“IL-15Ra”和“白介素-15受体α”是指野生型IL-15Ra、IL-15Ra衍生物、或野生型IL-15Ra和IL-15Ra衍生物。在特定的实施例中，分离并重组产生IL-15Ra。如本文所用，术语“野生型IL-15Ra”和“野生型白介素-15受体α”在蛋白质或多肽的上下文中是指哺乳动物白介素-15受体α(“IL-15Ra”)氨基酸序列，包括未成熟形式或前体形式和成熟形式以及同种型。各种野生型哺乳动物IL-15Ra的氨基酸序列的GeneBank登录号的非限制性实例包括NP_002180(人)、ABK41438(猕猴)、NP_032384(小家鼠)、Q60819(小家鼠)、CAI41082(人)。全长人IL-15Ra的未成熟形式的氨基酸序列包含信号肽(下划线)和成熟人野生型IL-15Ra(斜体)，如SEQ ID NO:6中所提供的。可溶性人IL-15Ra的未成熟形式的氨基酸序列包含信号肽(下划线)和成熟人可溶性IL-15Ra(斜体)，如SEQ ID NO:7中所提供的。在一些实施例中，IL-15Ra是哺乳动物IL-15Ra多肽的未成熟形式。在其他实施例中，IL-15Ra是哺乳动物IL-15Ra多肽的成熟形式。在某些实施例中，IL-15Ra是哺乳动物IL-15Ra多肽的可溶性形式。在其他实施例中，IL-15Ra是哺乳动物IL-15Ra多肽的全长形式。在特定的实施例中，IL-15Ra是人IL-15Ra多肽的未成熟形式。在另一个实施例中，IL-15Ra是人IL-15Ra多肽的成熟形式。在某些实施例中，IL-15Ra是人IL-15Ra多肽的可溶性形式。在其他实施例中，IL-15Ra是人IL-15Ra多肽的全长形式。在一个实施例中，IL-15Ra蛋白或多肽是分离的或纯化的。

如本文所用，术语“IL-15Ra”和“白介素-15受体α”在核酸的上下文中是指编码哺乳动物白介素-15受体α的任何核酸序列，包括未成熟形式或前体形式和成熟形式。各种野生型哺乳动物IL-15Ra的核苷酸序列的GeneBank登录号的非限制性实例包括NM_002189(人)、EF033114(猕猴)和NM_008358(小家鼠)。编码人IL-15Ra的未成熟形式的核苷酸序列包含编码信号肽的核苷酸序列(下划线)和编码成熟人IL-15Ra的核苷酸序列(斜体)，如SEQID NO:8中所提供的。编码可溶性人IL-15Ra蛋白或多肽的未成熟形式的核苷酸序列包含编码信号肽的核苷酸序列(下划线)和编码成熟人可溶性IL-15Ra的核苷酸序列(斜体)，如SEQID NO:9中所提供的。在特定的实施例中，核酸是分离的或纯化的核酸。在一些实施例中，核酸编码哺乳动物IL-15Ra多肽的未成熟形式。在其他实施例中，核酸编码哺乳动物IL-15Ra多肽的成熟形式。在某些实施例中，核酸编码哺乳动物IL-15Ra多肽的可溶性形式。在其他实施例中，核酸编码哺乳动物IL-15Ra多肽的全长形式。在特定的实施例中，核酸编码人IL-15多肽的前体形式。在另一个实施例中，核酸编码人IL-15多肽的成熟形式。在某些实施例中，核酸编码人IL-15Ra多肽的可溶性形式。在其他实施例中，核酸编码人IL-15Ra多肽的全长形式。

如本文所用，术语“IL-15Ra衍生物”和“白介素-15受体α衍生物”在蛋白质或多肽的上下文中是指：(a)与野生型哺乳动物IL-15多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽；(b)由与编码野生型哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的多肽；(c)相对于野生型哺乳动物IL-15Ra多肽，含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸突变(即，添加、缺失和/或取代)的多肽；(d)由如下核酸序列编码的多肽：该核酸序列可以在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码野生型哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列杂交；(e)由如下核酸序列编码的多肽：该核酸序列可以在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、或至少150个连续氨基酸的野生型哺乳动物IL-15多肽的片段的核酸序列杂交；(f)野生型哺乳动物IL-15Ra多肽的片段；和/或(g)本文所述的特定的IL-15Ra衍生物。IL-15Ra衍生物还包括包含哺乳动物IL-15Ra多肽的成熟形式的氨基酸序列和异源性信号肽氨基酸序列的多肽。在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物是野生型人IL-15Ra多肽的衍生物。在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物是人IL-15多肽的未成熟形式的衍生物。在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物是人IL-15多肽的成熟形式的衍生物。在一个实施例中，IL-15Ra衍生物是哺乳动物IL-15Ra多肽的可溶性形式。在某些实施例中，IL-15Ra衍生物包括哺乳动物IL-15Ra的可溶性形式，其中那些可溶性形式不是天然存在的。IL-15Ra衍生物的其他实例包括本文所述的人IL-15Ra的截短的可溶性形式。在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物是纯化的或分离的。

在优选的实施例中，IL-15Ra衍生物保留了野生型哺乳动物IL-15Ra多肽结合IL-15多肽的功能的至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本领域熟知的测定法(例如，ELISA、

免疫共沉淀)所测量的。在另一个优选的实施例中，IL-15Ra衍生物保留了野生型哺乳动物IL-15Ra多肽诱导IL-15介导的信号转导的功能的至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本领域熟知的测定法(例如，电泳迁移率变动测定法、ELISA和其他免疫测定法)所测量的。在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物结合至IL-15，如通过本领域熟知的方法(例如ELISA)所评估的。

如本文所用，术语“IL-15Ra衍生物”和“白介素-15受体α衍生物”在核酸的上下文中是指：(a)与编码哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列；(b)编码与野生型哺乳动物IL-15Ra多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽的核酸序列；(c)相对于编码哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列，含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核酸突变(即，添加、缺失和/或取代)的核酸序列；(d)在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列杂交的核酸序列；(e)在高严格杂交条件或中等严格杂交条件下与编码哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列的片段杂交的核酸序列；(f)对编码哺乳动物IL-15Ra多肽的核酸序列的片段进行编码的核酸序列；和/或(g)编码本文所述的特定IL-15Ra衍生物的核酸序列。在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物在核酸的上下文中是编码人IL-15Ra多肽的核酸序列的衍生物。在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物在核酸的上下文中是编码人IL-15Ra多肽的未成熟形式的核酸序列的衍生物。在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物在核酸的上下文中是编码人IL-15Ra多肽的成熟形式的核酸序列的衍生物。在一个实施例中，IL-15Ra衍生物在核酸的上下文中是指编码可溶的哺乳动物IL-15Ra多肽的衍生物的核酸序列。在某些实施例中，IL-15Ra衍生物在核酸的上下文中是指编码哺乳动物IL-15Ra的可溶性形式的核酸序列，其中该可溶性形式不是天然存在的。在一些实施例中，IL-15Ra衍生物在核酸的上下文中是指编码人IL-15Ra的衍生物的核酸序列，其中该人IL-15Ra的衍生物是非天然存在的IL-15Ra的可溶性形式。在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物核酸序列是分离的或纯化的。

IL-15Ra衍生物核酸序列包括编码IL-15Ra多肽(包括IL-15Ra多肽的成熟形式和未成熟形式)的密码子优化的核酸序列。在其他实施例中，IL-15Ra衍生物核酸包括编码IL-15Ra RNA转录物的核酸，该IL-15Ra RNA转录物含有这样的突变：该突变消除了潜在的剪接位点和不稳定性元件(例如，富含A/T或A/U的元件)而不影响增加IL-15Ra RNA转录物的稳定性的氨基酸序列。在某些实施例中，IL-15Ra衍生物核酸序列是SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:13中的密码子优化的序列(由这种核酸序列编码的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14中)。

在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物核酸序列编码保留了野生型哺乳动物IL-15Ra多肽结合IL-15的功能的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的蛋白质或多肽，如通过本领域熟知的测定法(例如，ELISA、

免疫共沉淀)所测量的。在另一个优选的实施例中，IL-15Ra衍生物核酸序列编码保留了野生型哺乳动物IL-15Ra诱导IL-15介导的信号转导的功能的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的蛋白质或多肽，如通过本领域熟知的测定法(例如，电泳迁移率变动测定法、ELISA和其他免疫测定法)所测量的。在特定的实施例中，IL-15Ra衍生物核酸序列编码结合至IL-15的蛋白质或多肽，如通过本领域熟知的方法(例如ELISA)所评估的。

本文描述了人IL-15Ra的可溶性形式。本文还描述了作为人IL-15Ra的截短的可溶性形式的特定IL-15Ra衍生物。这些特定IL-15Ra衍生物和人IL-15Ra的可溶性形式部分基于人IL-15Ra的蛋白水解切割位点的鉴定。本文还描述了IL-15Ra的可溶性形式，这些可溶性形式基于IL-15Ra的糖基化来表征。

人IL-15Ra的蛋白水解切割发生在残基(即，Gly170和His171)之间，这些残基以粗体显示并在所提供的野生型全长人IL-15Ra的未成熟形式的氨基酸序列中以下划线表示：

因此，在一个方面，本文提供了人IL-15Ra的可溶性形式(例如，人IL-15Ra的纯化的可溶性形式)，其中人IL-15Ra的可溶性形式的氨基酸序列终止于野生型膜结合的人IL-15Ra的蛋白水解切割位点。具体而言，本文提供了人IL-15Ra的可溶性形式(例如，人IL-15Ra的纯化的可溶性形式)，其中人IL-15Ra的可溶性形式的氨基酸序列以PQG(SEQ ID NO:20)终止，其中G为Gly170。在特别的实施例中，本文提供了人IL-15Ra的可溶性形式(例如，人IL-15Ra的纯化的可溶性形式)，该可溶性形式具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了IL-15Ra衍生物(例如，IL-15Ra衍生物的纯化形式和/或可溶性形式)，它是如下的多肽：(i)与SEQ ID NO:7具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性；和(ii)以氨基酸序列PQG(SEQ ID NO:20)终止。在其他特别的实施例中，本文提供了人IL-15Ra的可溶性形式(例如，人IL-15Ra的纯化的可溶性形式)，该可溶性形式具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了IL-15Ra衍生物(例如，IL-15Ra衍生物的纯化形式和/或可溶性形式)，它是与SEQ ID NO:10具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽，并且任选地，其中IL-15Ra衍生物的可溶性形式的氨基酸序列以PQG(SEQ ID NO:20)终止。

在一些实施例中，本文提供了人IL-15Ra的IL-15Ra衍生物，其中IL-15Ra衍生物是可溶性的，并且：(a)IL-15Ra衍生物的C末端的最后几个氨基酸由氨基酸残基PQGHSDTT(SEQID NO:15)组成；(b)IL-15Ra衍生物的C末端的最后几个氨基酸由氨基酸残基PQGHSDT(SEQID NO:16)组成；(c)IL-15Ra衍生物的C末端的最后几个氨基酸由氨基酸残基PQGHSD(SEQID NO:17)组成；(d)IL-15Ra衍生物的C末端的最后几个氨基酸由氨基酸残基PQGHS(SEQ IDNO:18)组成；或(e)IL-15Ra衍生物的C末端的最后几个氨基酸由氨基酸残基PQGH(SEQ IDNO:19)组成。在某些实施例中，这些IL-15Ra衍生物的氨基酸序列与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施例中，这些IL-15Ra衍生物是纯化的。

在另一个方面，本文提供了IL-15Ra的糖基化形式(例如，IL-15Ra的纯化糖基化形式)，其中IL-15Ra的糖基化占IL-15Ra的质量(分子量)的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、或20％至25％、20％至30％、25％至30％、25％至35％、30％至35％、30％至40％、35％至40％、35％至45％、40％至50％、45％至50％、20％至40％、或25％至50％，如通过本领域技术人员已知的技术所评估的。IL-15Ra的糖基化所占的IL-15Ra(例如，纯化的IL-15Ra)的质量(分子量)的百分比可以使用例如但不限于以下步骤来确定：凝胶电泳和凝胶的定量光密度测定，并且比较IL-15Ra的糖基化形式(例如，IL-15Ra的纯化糖基化形式)与IL-15Ra的非糖基化形式(例如，IL-15Ra的纯化非糖基化形式)的平均质量(分子量)。在一个实施例中，IL-15Ra(例如，纯化的IL-15Ra)的平均质量(分子量)可以使用在配备有CovalX HM-1高质量检测器的Voyager

上使用芥子酸作为基质进行的MALDI-TOF MS谱来确定，并且可以将IL-15Ra的糖基化形式的质量(例如，IL-15Ra的纯化糖基化形式)与IL-15Ra的非糖基化形式的质量(例如，IL-15Ra的纯化非糖基化形式)进行比较，以确定糖基化所占的质量的百分比。

在另一个方面，本文提供了IL-15Ra的糖基化形式，其中IL-15Ra在某些氨基酸残基处是糖基化(N-糖基化或O-糖基化)的。在某些实施例中，本文提供了在以下糖基化位点中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部处糖基化的人IL-15Ra：

(i)IL-15Ra中的氨基酸序列

的第5位苏氨酸的O-糖基化；

(ii)IL-15Ra中的氨基酸序列

的第7位丝氨酸的O-糖基化；

(iii)IL-15Ra中的氨基酸序列

的第8位丝氨酸的N-糖基化，或IL-15Ra中的氨基酸序列

的第8位丝氨酸的N-糖基化；

(iv)IL-15Ra中的氨基酸序列

的Ser 18的N-糖基化；

(v)IL-15Ra中的氨基酸序列

的第20位丝氨酸的N-糖基化；

(vi)IL-15Ra中的氨基酸序列

的第23位丝氨酸的N-糖基化；和/或(vii)IL-15Ra中的氨基酸序列

的第31位丝氨酸的N-糖基化。

在特定的实施例中，糖基化的IL-15Ra是野生型人IL-15Ra。在其他特定的实施例中，糖基化的IL-15Ra是人IL-15Ra的IL-15Ra衍生物。在一些实施例中，糖基化的IL-15Ra是野生型可溶性人IL-15Ra，例如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10。在其他实施例中，糖基化的IL-15Ra是作为人IL-15Ra的可溶性形式的IL-15Ra衍生物。在某些实施例中，糖基化的IL-15Ra是纯化的或分离的。

IL-15/IL-15Ra复合物

如本文所用，术语“IL-15/IL-15Ra复合物”是指包含彼此共价或非共价结合的IL-15和IL-15Ra的复合物。在优选的实施例中，IL-15Ra对IL-15具有相对高的亲和力，例如如通过本领域已知的技术(例如，KinEx A测定法、等离子体表面共振法(例如，

测定法))测量的KD为10至50pM。在另一个优选的实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物诱导IL-15介导的信号转导，如通过本领域熟知的测定法(例如，电泳迁移率变动测定法、ELISA和其他免疫测定法)所测量的。在一些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物保留了特异性结合βγ链的能力。在特定的实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物从细胞中分离。

本文提供了结合至IL-15受体的βγ亚基，诱导IL-15信号转导(例如，Jak/Stat信号转导)和增强IL-15介导的免疫功能的复合物，其中这些复合物包含共价或非共价结合至白介素-15受体α(“IL-15Ra”)的IL-15(“IL-15/IL-15Ra复合物”)。IL-15/IL-15Ra复合物能够结合至βγ受体复合物。

IL-15/IL-15Ra复合物可包含野生型IL-15或IL-15衍生物和野生型IL-15Ra或IL-15Ra衍生物。在某些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含野生型IL-15或IL-15衍生物和上文所述的IL-15Ra。在特定的实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含野生型IL-15或IL-15衍生物和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的IL-15Ra。在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含野生型IL-15或IL-15衍生物和上文所述的IL-15Ra的糖基化形式。

在特定的实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含野生型IL-15或IL-15Ra衍生物和可溶性IL-15Ra。在另一个特定的实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物由IL-15衍生物和IL-15Ra衍生物组成。在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物由野生型IL-15和IL-15Ra衍生物组成。在一个实施例中，IL-15Ra衍生物是IL-15Ra的可溶性形式。上文描述了IL-15Ra的可溶性形式的具体实例。在特定的实施例中，IL-15Ra的可溶性形式缺乏野生型IL-15Ra的跨膜结构域，以及任选地野生型IL-15Ra的胞内结构域。在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物是IL-15Ra的胞外结构域或其片段。在某些实施例中，IL-15Ra衍生物是IL-15Ra的胞外结构域(含有sushi结构域或外显子2)的片段。在一些实施例中，IL-15Ra衍生物包含IL-15Ra的胞外结构域(含有sushi结构域或外显子2)的片段，以及由外显子3编码的至少一个氨基酸。在某些实施例中，IL-15Ra衍生物包含IL-15Ra的胞外结构域(含有sushi结构域或外显子2)的片段，以及IL-15Ra铰链区或其片段。在某些实施例中，IL-15Ra包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在另一个实施例中，IL-15Ra衍生物包含胞外结构域切割位点中的突变，该突变抑制切割野生型IL-15Ra的内源性蛋白酶所进行的切割。在特定的实施例中，IL-15Ra的胞外结构域切割位点被异源性的已知蛋白酶识别和切割的切割位点替换。这些异源性蛋白酶切割位点的非限制性实例包括由弗林蛋白酶(furin protease)识别和切割的Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO:25)；以及由凝血酶蛋白酶识别和切割的A-B-Pro-Arg-X-Y(SEQ ID NO:26)(A和B是疏水性氨基酸，并且X和Y是非酸性氨基酸)和Gly-Arg-Gly。

在另一个实施例中，IL-15由经优化以增强IL-15的表达的核酸序列编码，该优化例如使用如PCT公开号WO 2007/084342和WO 2010/020047；和美国专利号5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；和6,794,498中所述的方法。

在某些实施例中，本文提供了包含人IL-15Ra的IL-15/IL-15Ra复合物，该人IL-15Ra在上文以及参考SEQ ID NO:22、23和24所述的糖基化位点中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部处被糖基化。在特定的实施例中，糖基化的IL-15Ra是野生型人IL-15Ra。在其他特定的实施例中，糖基化的IL-15Ra是人IL-15Ra的IL-15Ra衍生物。在一些实施例中，糖基化的IL-15Ra是可溶性人IL-15Ra，例如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10。如本文所用，“hetIL15”是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基49至162的人IL-15和包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的人可溶性IL-15Ra。在其他实施例中，糖基化的IL-15Ra是作为人IL-15Ra的可溶性形式的IL-15Ra衍生物。在某些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物是纯化的或分离的。

除IL-15和IL-15Ra之外，IL-15/IL-15Ra复合物可以包含异源性分子。在一些实施例中，异源性分子增加了蛋白质稳定性。此类分子的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、IgG免疫球蛋白的Fc结构域或其片段、或增加IL-15或IL-15Ra的体内半衰期的白蛋白。在某些实施例中，IL-15Ra缀合/融合至免疫球蛋白(例如，IgG1)的Fc结构域或其片段。在特定的实施例中，IL-15RaFc融合蛋白包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在另一个实施例中，IL-15RaFc融合蛋白是Han等人,(2011),Cytokine[细胞因子]56:804-810，美国专利号8,507,222或美国专利号8,124,084中所述的IL-15Ra/Fc融合蛋白。在包含异源性分子的那些IL-15/IL-15Ra复合物中，异源性分子可以缀合至IL-15和/或IL-15Ra。在一个实施例中，异源性分子缀合至IL-15Ra。在另一个实施例中，异源性分子缀合至IL-15。

IL-15/IL-15Ra复合物的组分可以使用非共价键或共价键来直接融合(例如，通过肽键来组合氨基酸序列)，和/或可以使用一个或多个接头来组合。适用于制备IL-15/IL-15Ra复合物的接头包括肽、烷基基团、化学取代的烷基基团、聚合物、或能够将两种或更多种组分结合在一起的任何其他共价键合的或非共价键合的化学物质。聚合物接头包括本领域已知的任何聚合物，包括聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，接头是长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸的肽。在特定的实施例中，接头足够长以保持IL-15结合IL-15Ra的能力。在其他实施例中，接头足够长以保持IL-15/IL-15Ra复合物结合βγ受体复合物以及充当介导IL-15信号转导的激动剂的能力。

在特别的实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物在本文所述的方法中施用之前(例如，在使细胞接触IL-15/IL-15Ra复合物之前或在将IL-15/IL-15Ra复合物施用于受试者之前)预先偶联。在其他实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物在用于本文所述的方法之前未预先偶联。

在特定的实施例中，相对于未施用IL-15/IL-15Ra复合物的受试者中的免疫功能，IL-15/IL-15Ra复合物增强或诱导受试者中的免疫功能达至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％，使用本领域熟知的测定法(例如，ELISPOT、ELISA和细胞增殖测定法)所测定的。在特定的实施例中，免疫功能是细胞因子释放(例如，干扰素-γ、IL-2、IL-5、IL-10、IL-12或转化生长因子(TGF)-β)。在一个实施例中，IL-15介导的免疫功能是NK细胞增殖，它可以例如通过流式细胞术(检测表达NK细胞的标记物(例如，CD56)的细胞数)来测定。在另一个实施例中，IL-15介导的免疫功能是抗体产生，它可以例如通过ELISA来测定。在一些实施例中，IL-15介导的免疫功能是效应子功能，它可以例如通过细胞毒性测定法或本领域熟知的其他测定法来测定。

产生组合的多肽的方法

还提供了表达载体和宿主细胞，用于产生组合的IL-15/IL-15Ra复合物，如上所述。可以使用各种表达载体来表达编码IL-15和IL-15Ra多肽的多核苷酸。基于病毒和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生多肽。非病毒载体和***包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)、和人类人工染色体(参见例如，Harrington等人,(1997)Nat Genet.[自然遗传学]15:345)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，圣地亚哥，加利福尼亚州)，MPSV载体，和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、***瘤病毒、HBP EB病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)的载体。参见，Brent等人,同上；Smith,(1995)Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年度评论]49:807；和Rosenfeld等人,(1992)Cell[细胞]68:143。

表达载体的选择取决于要表达该载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一个实施例中，除诱导条件外，使用诱导型启动子来阻止***序列的表达。诱导型启动子包括例如***糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除了启动子之外，还可能需要或期望其他调节元件以高效表达。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过包括适合于使用的细胞***的增强子提高表达效率(参见例如，Scharf等人,(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125；和Bittner等人,(1987)Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。

表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与由IL-15或IL-15Ra序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的是，***序列在包含在载体中之前与信号序列连接。

用于携带并表达IL-15和IL-15Ra蛋白质的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达IL-15和IL-15Ra多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)(如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia))以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)的物种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、β-内酰胺酶启动子***或来自噬菌体λ的启动子***。启动子典型地任选使用操纵基因序列控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，以用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，例如酵母，也可以用于表达IL-15和IL-15Ra多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。

在一个实施例中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或含有外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常非永生的或正常或异常的永生动物或人细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物细胞系的实例包括但不限于COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HepG2、MCF7、HEK 293、HEK293T、RD、PC12、杂交瘤、前B细胞、293、293H、K562、SkBr3、BT474、A204、M07Sb、TFβ1、Raji、Jurkat、MOLT-4、CTLL-2、MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y、C127、N0和BE(2)-C细胞。作为用于表达的宿主的其他哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括许多得自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)的永生化细胞系。利用哺乳动物组织细胞培养表达多肽一般在例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES[从基因到克隆],VCH出版商,纽约,纽约州,1987中讨论。

在另一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物通过在CHO细胞中表达而被糖基化，其中复合物中的每个多肽的至少0.5％、1％、2％、3％、5％或更多具有α2,3-连接的唾液酸残基。CHO细胞表达提供了如下：IL-15/IL-15Ra复合物中的多肽均不含有二等分GlcNAc。

用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见例如，Queen等人,(1986)Immunol.Rev.[免疫学评论]89:49-68)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或源自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、***诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP poIIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人类即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。

用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物轰击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合(Elliot和O'Hare,(1997)Cell[细胞]88:223)、试剂增强的对DNA的吸收和离体转导。

对于重组IL-15和IL-15Ra多肽的长期、高产量产生，可以产生稳定细胞系。例如，可以使用本文所述的核酸构建体来转化细胞系，这些核酸构建体可以在相同的核酸构建体或不同的核酸构建体上含有选择标记基因。可以通过共转染将选择标记基因引入相同的细胞中。在引入载体之后，允许细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将它们更换至选择性培养基，以允许生长和回收成功表达所引入的核酸的细胞。可以使用本领域熟知的适合细胞类型的组织培养技术来增殖稳定转化细胞的抗性克隆。在特别的实施例中，细胞系已适应在无血清培养基中生长。在一个实施例中，细胞系已适应在摇瓶中的无血清培养基中生长。在一个实施例中，细胞系已适应在搅拌瓶或旋转瓶中生长。在某些实施例中，细胞系在悬浮液中培养。在特别的实施例中，细胞系是非贴壁的或已适应作为非贴壁细胞生长。在某些实施例中，细胞系已适应在低钙条件下生长。在一些实施例中，细胞系是培养的或适应在低血清培养基中生长。

在特定的实施例中，通过在DHFR缺陷型CHO细胞中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)扩增，通过使用连续增加水平的氨甲蝶呤来进行重组IL-15和IL-15Ra多肽的高收率产生的特别优选的方法，如美国专利号4,889,803中所述。从这些细胞获得的多肽可以是糖基化形式。

在一个实施例中，将细胞系工程化以表达人IL-15和可溶性人IL-15Ra的稳定异源二聚体，然后可以纯化稳定异源二聚体，并施用于人。在一个实施例中，当从重组表达IL-15和IL-15Ra二者的细胞系产生IL-15和IL-15Ra时，IL-15/IL-15Ra异源二聚体的稳定性增加。

在特定的实施例中，宿主细胞重组表达IL-15和全长IL-15Ra。在另一个特定的实施例中，宿主细胞重组表达IL-15和IL-15Ra的可溶性形式。在另一个特定的实施例中，宿主细胞重组表达IL-15和IL-15Ra的膜结合形式，该IL-15Ra不从细胞表面切割并且保持与细胞结合。在一些实施例中，重组表达IL-15和/或IL-15Ra(全长或可溶性形式)的宿主细胞也重组表达另一种多肽(例如，细胞因子或其片段)。

在某些实施例中，除IL-15Ra多肽之外，这种宿主细胞还重组表达IL-15多肽。编码IL-15和/或IL-15Ra的核酸可以用于产生大量重组表达IL-15和IL-15Ra以便分离和纯化IL-15和IL-15Ra的哺乳动物细胞，优选地IL-15和IL-15Ra缔合成复合物。在一个实施例中，大量IL-15/IL-15Ra复合物是指由细胞表达的IL-15/IL-15Ra复合物的量，该量是对照细胞(例如，未经基因工程化为重组表达IL-15、IL-15Ra、或IL-15和IL-15Ra二者的细胞，或包含空载体的细胞)内源性表达的IL-15/IL-15Ra复合物的量的至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍或超过20倍。在一些实施例中，本文所述的宿主细胞表达大约0.1pg至25pg、0.1pg至20pg、0.1pg至15pg、0.1pg至10pg、0.1pg至5pg、0.1pg至2pg、2pg至10pg或5pg至20pg的IL-15，如通过本领域技术人员已知的技术(例如，ELISA)所测量的。在某些实施例中，本文所述的宿主细胞表达大约0.1pg/天至0.25pg/天、0.25pg/天至0.5pg/天、0.5pg/天至1pg/天、1pg/天至2pg/天、2pg/天至5pg/天或5pg/天至10pg/天的IL-15，如通过本领域技术人员已知的技术(例如，ELISA)所测量的。在特定的实施例中，IL-15Ra是IL-15Ra的可溶性形式。在特定的实施例中，IL-15Ra是在稳定异源二聚体中与IL-15结合的IL-15Ra的可溶性形式，该稳定异源二聚体增加了生物活性异源二聚体IL-15/可溶性IL-15Ra细胞因子的收率并简化了其产生和纯化。

可以使用本领域熟知的重组蛋白质产生和纯化的方法来纯化重组IL-15和IL-15Ra，例如参见PCT公开号WO 2007/070488。简而言之，多肽可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌至培养基中。可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化包含多肽的细胞溶解物或上清液。用于蛋白质纯化的其他技术(例如在离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上的色谱、在肝素SEPHAROSE^TM(凝胶过滤物质；法玛西亚公司(Pharmacia Inc.)，皮斯卡特维，新泽西州)上的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀)也是可用的。

在一些实施例中，IL-15和IL-15Ra由不同的细胞合成或重组表达，随后分离并且体外组合以形成IL-15/IL-15Ra复合物，然后施用于受试者。在其他实施例中，IL-15和IL-15Ra由不同的细胞合成或重组表达，随后分离并且将IL-15/IL-15Ra复合物原位或体内同时施用于受试者。在另外其他实施例中，IL-15和IL-15Ra由相同的细胞合成或一起表达，并分离所形成的IL-15/IL-15Ra复合物。

预防和治疗用途

本披露提供了治疗与增加的细胞增殖或癌症相关的疾病或障碍的方法。在特定的实施例中，本披露提供治疗适应症的方法，这些适应症包括但不限于多种器官***的肉瘤、腺癌、母细胞癌和癌，例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胆肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮细胞)、***和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤(例如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌)。在一个实施例中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、腹膜癌、胃癌(stomach或gastriccancer)、食管癌、唾液腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、***癌(penile carcinoma)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、***、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌(cancer of the penis)、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病症，包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。

此外，STING激动剂分子与IL-15/IL-15Ra复合物的组合尤其可用于治疗、预防、延迟、或逆转对其他癌症疗法具有抗性或难治性的患者的疾病进展。通过施用与IL-15/IL-15Ra复合物组合的STING激动剂分子，可部分或完全增强抗肿瘤免疫。

在另外的实施例中，本文描述的STING激动剂分子与IL-15/IL-15Ra复合物的组合可以与如下所讨论的另一种治疗剂结合施用于有需要的患者。例如，本披露的组合可以与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用，例如，一种或多种抗癌剂、细胞毒性剂或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法。在其他实施例中，该组合可以与其他治疗性治疗方式(包括手术、放射、冷冻手术和/或热疗)一起施用。此类组合疗法可以有利地使用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。

如本领域技术人员所理解的，使用本披露的组合的疗法可以与上文所述的多种类别的药剂结合施用。当将本披露的组合与另一种药剂或多种药剂一起施用时，可以按任何顺序施用或同时施用这两种(或更多种)药剂。在一些方面，将本披露的组合施用于也接受采用一种或多种其他药剂或方法的疗法的受试者。在其他方面，将组合与手术治疗结合施用。该治疗方案可以是加和的，或者它可以产生协同结果。

药物组合物

本披露提供如下药物组合物，其包含与药学上可接受的载剂一起或分开配制的STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合。STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物可以以“非固定组合”施用于患者，该非固定组合意指STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物作为单独的实体同时、并行或顺序施用(无特定的时间限制)，其中此类施用在患者体内提供治疗有效水平的两种药剂。因此，术语“非固定组合”特别定义了“成套试剂盒(kitof parts)”，其意义在于如本文定义的(i)STING激动剂分子和(ii)IL-15/IL-15Ra复合物的组合药剂能彼此独立地给药或通过使用具有不同量的组合药剂的不同固定组合给药，即同时或在不同时间点给药，其中组合药剂还可以用作完全分开的、也独立于彼此销售的药物剂型或药物配制品，并且其中在包装设备(例如传单等)或例如提供给医师和医务人员的其他信息中提供了它们组合使用的可能性的说明书。独立配制品或成套试剂盒的各部分可随后例如同时施用，或按时间交错施用，例如对于成套试剂盒的任何部分在不同的时间点且以相等或不同的时间间隔施用。在特定的实施例中，所选择的时间间隔使得组合使用该部分对所治疗的疾病的效果大于仅使用组合药剂(i)和(ii)中任一种所获得的效果，因此具有共同活性。组合制剂中待施用的组合药剂(i)与组合药剂(ii)的总量的比率可变化，例如以满足待治疗患者亚群的需要或单个患者的需要，这些不同的需要可能是由于患者的年龄、性别、体重等。

本披露的药物组合物可另外含有一种或多种其他治疗剂，这些治疗剂适用于治疗多种器官***的肉瘤、腺癌、母细胞癌和癌，例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胆肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮细胞)、***和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤(例如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌)。在一个实施例中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、腹膜癌、胃癌(stomach或gastric cancer)、食管癌、唾液腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、***癌(penile carcinoma)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、***、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌(cancer of the penis)、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病症，包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。

本披露的药物组合物可以与药学上可接受的载剂一起施用以增强或稳定该组合物，或促进该组合物的制备。药学上可接受的载剂包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

本披露的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和/或模式可以根据所希望的结果而变化。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下或在靶标部位附近施用。药学上可接受的载剂应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即STING激动剂分子和/或IL-15/IL-15Ra复合物)可以包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。

该组合物应该是无菌和流动的。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的长期吸收。

本披露的药物组合物可以按照本领域熟知和常规实施的方法制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践],MackPublishing Co.[马克出版公司],第20版,(2000)；和Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems[缓控释药物递送***],J.R.Robinson编辑,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),New York[纽约],(1978)。药物组合物优选在GMP条件下制造。典型地，治疗有效(effective或efficacious)剂量的STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合可以用于药物组合物中。通过本领域技术人员已知的常规方法将STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需应答(例如，治疗应答)。例如，如由治疗情况的需求所指示的，对于该组合的各组分，可以施用单次推注，可以随着时间施用几个分次剂量，或可以按比例减少或增加剂量。可以特别有利地以单位剂型配制肠胃外组合物以易于施用和实现剂量均匀性。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生期望治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载剂。

可以改变本披露的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所需的治疗应答，而对该患者没有毒性。所选的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用组合的特定组合物的活性，施用途径，施用时间，正在使用的特定化合物的***速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史，以及类似因素。

医生可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中组合的剂量，并且逐渐增加剂量直至达到期望效果。一般而言，用于治疗本文所述的障碍的本披露的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。对于STING激动剂分子的施用，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重，且更通常为0.01至15mg/kg宿主体重。示例性治疗方案需要每两周或每月一次或每3至6个月一次全身施用。对于IL-15/IL-15Ra复合物的皮下施用，剂量范围为约0.25至8μg/kg/天。示例性治疗方案需要以每周三次持续两周的治疗周期，然后在重复该治疗周期前休息两周来进行皮下施用。

对于包含STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物的组合，该STING激动剂分子和/或IL-15/IL-15Ra复合物可在多种情况下施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中CD8+T细胞所指示的，间隔也可以是无规律的。可替代地，该组合的组分可以作为持续释放配制品施用，在这种情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率根据IL-15/IL-15Ra复合物在患者体内的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔给予相对较高的剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。

具体实施例、引用和参考文献

本文引用了各种参考文献，包括专利申请、专利和科学出版物；每个这样的参考文献的披露内容通过引用以其全文特此并入本文。

实例

提供以下实例以说明但不限制本披露的范围。本发现的其他变型对本领域普通技术人员而言将是显而易见的，且也为所附权利要求书所涵盖。

实例1：在MC38肿瘤模型中hetIL15和STING100的组合

通过IL-15/可溶性IL-15Ra复合物(“hetIL-15”)刺激NK细胞和CD8+T细胞。STING100刺激先天性免疫***，并因此这两种免疫活性药剂可通过如下协同并驱动稳健的抗肿瘤免疫应答：1)增加在肿瘤内的免疫浸润，和2)增强免疫组分浸润肿瘤的活性作用。为了证明这种效果，如下文详述地进行在MC38肿瘤模型中的体内组合实验。

MC38鼠类结肠癌细胞(NCI，罗克维尔(Rockville)，马里兰州)在DMEM+10％热失活胎牛血清中生长。6-8周龄的C57Bl/6小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(巴尔港，缅因州)。在植入之前，将MC38细胞在PBS中洗涤一次，并以1x 10⁶个细胞/100μL PBS重悬，并且将1x 10⁶个细胞皮下植入右上腹侧。允许肿瘤生长6天，并将其随机分配到平均肿瘤大小为约109mm³的治疗组中。在肿瘤植入后的第6天，将STING100以1μg或10μg的剂量注入50μL体积的PBS中的肿瘤中，或者注射相同体积的PBS作为对照。在肿瘤植入后的第6、8和10天，将hetIL15以3μg(单链IL-15等效物)注入腹腔。两种分子的给药量如图1中所示，给药时间如图2中所示。然后在研究期间通过卡尺测量来自各组的八(8)只预先分配的小鼠，直到肿瘤达到1500mm³的最大尺寸。

在肿瘤植入后的第11天，使来自各组的5只预先分配的小鼠安乐死，并且分离脾脏、引流***(腋窝)、非引流***(对侧腹股沟)和肿瘤。通过使器官通过70μm的过滤器进入PBS+2％胎牛血清+2mM EDTA中产生脾脏和***的单细胞悬浮液。将肿瘤在胶原酶、分散酶和DNA酶的溶液中消化约3轮(每轮20分钟)，伴随每轮之间的机械破碎。然后将细胞用抗体板染色，在BD

上运行(BD公司(Becton-Dickinson)，富兰克林湖，新泽西州)，并且在

中分析免疫存在和激活。

对于受到初始攻击且在50天后未见可检测的肿瘤的小鼠，通过将1x 10⁶个MC38注入这些小鼠以及一组先前未受到攻击(初始)的年龄相匹配的对照小鼠的对侧上腹侧进行再次攻击，并且通过卡尺再次对小鼠进行监测。再次攻击后二十一(21)天，从如上所述的小鼠中分离脾细胞，并且将这些脾细胞以1)单独，2)与辐射(10,000rad)MC38的比例为10:1，或3)与抗-CD3/28Dynabeads(Gibco公司)的比例为1:2在DMEM+10％FBS中培养48小时。然后使用ELISA(R&D公司#DY485)测量IFN-γ产生。

在hetIL15和STING100之间观察到强协同作用，包括改善的对初始攻击的存活(图3A/B)。hetIL15/STING100组合的施用具有良好的耐受性且体重无变化(图4)。图5A/F中显示了各单独小鼠群组的结果，包括如图5F中所示的71％(5/7)的小鼠中的完全应答和肿瘤的根除。观察到稳健的免疫浸润和激活，特别是对于肿瘤特异性CD8+T细胞和NK细胞(图6A/C)。最后，在体外和体内均观察到对再次攻击的强应答(图7A/C)，这表明hetIL15/STING100组合产生持久的抗肿瘤免疫。

表1.序列表

Claims (30)

1.一种组合，所述组合包含：

i)STING激动剂分子；和

ii)白介素-15(IL-15)/IL-15受体α(IL-15Ra)复合物。

2.根据权利要求1所述的组合，其中所述IL-15/IL-15Ra复合物是人IL-15和人可溶性IL-15Ra的异源二聚体复合物。

3.根据权利要求2所述的组合，其中所述人IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基49至162，并且所述人可溶性IL-15Ra包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述STING激动剂分子选自由STING100、STING101、STING102、STING103、STING104、STING105、STING106、和STING107组成的组。

5.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述STING激动剂分子包含STING100。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述IL-15/IL-15Ra复合物是糖基化的。

7.根据权利要求1所述的组合，用作药物，其中同时或顺序施用所述STING激动剂分子和所述IL-15/IL-15Ra复合物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合，所述组合包含用于治疗癌症的治疗有效量的所述STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物。

9.根据权利要求1所述的组合用于制造用于治疗癌症的药物的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症包括结肠癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、卡波西氏肉瘤、和鳞状细胞癌。

11.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症包括T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。

12.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1所述的组合，其中所述癌症具有抗性或难治性。

13.根据权利要求12所述的方法，其中同时或顺序施用所述STING激动剂分子和所述IL-15/IL-15Ra复合物。

14.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。

15.一种促进肿瘤特异性CD8+T细胞扩增的方法，所述方法包括施用与STING激动剂分子组合的有效量的IL-15/IL-15Ra复合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述STING激动剂分子选自由STING100、STING101、STING102、STING103、STING104、STING105、STING106、和STING107组成的组。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述STING激动剂分子包含STING100。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Ra复合物是人IL-15和人可溶性IL-15Ra的异源二聚体复合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述人IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基49至162，并且所述人可溶性IL-15Ra包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

20.根据权利要求15所述的方法，所述方法包括同时或顺序施用所述STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物。

21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述肿瘤特异性CD8+T细胞扩增对于治疗结肠癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、卡波西氏肉瘤、和鳞状细胞癌是治疗上有效的。

22.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述肿瘤特异性CD8+T细胞扩增对于治疗以下是治疗上有效的：T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。

23.一种促进肿瘤特异性NK细胞扩增的方法，所述方法包括施用与STING激动剂分子组合的有效量的IL-15/IL-15Ra复合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述STING激动剂分子选自由STING100、STING101、STING102、STING103、STING104、STING105、STING106、和STING107组成的组。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述STING激动剂分子包含STING100。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Ra复合物是人IL-15和人可溶性IL-15Ra的异源二聚体复合物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述人IL-15包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基49至162，并且所述人可溶性IL-15Ra包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

28.根据权利要求23所述的方法，所述方法包括同时或顺序施用所述STING激动剂分子和IL-15/IL-15Ra复合物。

29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述肿瘤特异性NK细胞扩增对于治疗结肠癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、卡波西氏肉瘤、和鳞状细胞癌是治疗上有效的。

30.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述肿瘤特异性NK细胞扩增对于治疗以下是治疗上有效的：T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。

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