JP2013539965A

JP2013539965A - 代替的抗菌剤としてのバクテリオファージ溶菌酵素

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Publication number: JP2013539965A
Application number: JP2013527096A
Authority: JP
Inventors: ブルースエスシール; グレゴリーアールシラグサ; イブンムスタファエイシモンズ; ジョナケイガーリッシュ; ディヴィッドエムドノヴァン
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 2010-09-01
Filing date: 2011-08-17
Publication date: 2013-10-31
Also published as: US8962297B2; EP2611913A2; WO2012030535A3; US20120052546A1; EP2611913A4; CN103443269A; WO2012030535A2

Abstract

本発明は、バクテリオファージＣＰ２６Ｆ及びＣＰ３９Ｏからの単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素、並びにクロストリジウム・パーフリンジェンスを防除するための使用に関する。

Description

本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）菌の防除に有用なバクテリオファージ溶菌酵素又はその機能性フラグメント及び組成物が含まれるが、これに限定されない前記溶菌酵素の使用、並びにＣ．パーフリンジェンスにより引き起こされる疾患の治療方法に関する。

クロストリジウム・パーフリンジェンスは、クロストリジウム属のグラム陽性で桿状の嫌気性胞子形成菌である。Ｃ．パーフリンジェンスは、偏在性の性質があり、腐敗している植物、海底堆積物、ヒト及び他の脊椎動物や昆虫の腸管、並びに土壌の成分として典型的に見出される。偏在性であり、多くの場合に良性であるが、Ｃ．パーフリンジェンスは、また、多くの重篤な動物及びヒトの感染を引き起こす。事実、Ｃ．パーフリンジェンスは、食中毒、ガス壊疽（クロストリジウム性筋壊死）、壊疽性腸炎及び非食品媒介性胃腸感染を引き起こすことが知られている。したがって、Ｃ．パーフリンジェンスは、ヒト及び動物の両方における病原体である（Songer, 1997）。全ての家畜が感染しうるが、Ｃ．パーフリンジェンスは、鶏肉産業にとって特に問題である。事実、Ｃ．パーフリンジェンスが最も破滅的な損失を引き起こすのが家禽種である。

ニワトリでは、Ｃ．パーフリンジェンスは、近代の若鶏群における最も一般的で経済上破滅的な細菌性疾患である、壊疽性腸炎を引き起こす。臨床的疾病は通常非常に短期間であるが、未保護の家禽群における死亡率は破滅的になりうる。事実、多くの場合に群における壊疽性腸炎の徴候だけでも、死亡率が急増する。死亡率の増加に加えて、壊疽性腸炎は、抑うつ、羽根の毛羽立ち及び暗色の下痢を有するトリをもたらしうる。典型的には、疾患は、群において約５〜１０日間持続し、死亡率は約２〜５０％である。

典型的には、壊疽性腸炎は、水又は飼料のいずれかにより予防用量で投与される抗菌薬により防除される。しかし、抗菌剤を動物の飼料に使用することに対する一般市民の反対の声が増えてきている。例えば、ヨーロッパでは、抗菌剤は動物の飼料には既に禁止されている（例えば、van Immerseel et al., 2004, 2008を参照すること）。同じことが近いうちに米国において事実となる可能性がある。Ｃ．パーフリンジェンスにより引き起こされる壊疽性腸炎及び他の疾患の予防のために伝統的な抗菌剤を用いないことは、そのような疾患が鶏肉産業には潜在的にはるかに大きな問題となる可能性がある。

したがって、当該技術において必要なものは、Ｃ．パーフリンジェンス、とりわけ家禽に影響を与えるＣ．パーフリンジェンスにより引き起こされる疾患を予防及び治療するのに有効である、伝統的な抗菌剤の代替薬である。

幸いにも、以下の開示から明らかになるように、本発明はこれら及び他の必要なものを提供する。

一つの実施態様において、本発明は、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を提供し、ここでバクテリオファージ溶菌酵素は、ＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、バクテリオファージ溶菌酵素活性は、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解をもたらす。一つの例示的な実施態様において、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、配列番号１に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。別の例示的な実施態様において、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、配列番号１に従う配列を有する。別の例示的な実施態様において、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、配列番号３に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。さらに別の例示的な実施態様において、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、配列番号３に従う配列を有する。さらに別の例示的な実施態様において、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８１を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８０を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ２６Ｆからなる群より選択されるメンバーであるクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージから単離される。

別の実施態様において、本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素をコードする単離された核酸分子を提供し、ここでバクテリオファージ溶菌酵素は、ＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、バクテリオファージ溶菌酵素活性は、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解をもたらす。一つの例示的な実施態様において、単離された核酸分子は、配列番号１に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸及び配列番号３に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸からなる群より選択されるメンバーである。別の例示的な実施態様において、単離された核酸分子は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。別の例示的な実施態様において、単離された核酸分子は、配列番号３に従うアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。

別の実施態様において、本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を含む、クロストリジウム・パーフリンジェンスに対して効果的な抗菌組成物を提供し、ここでバクテリオファージ溶菌酵素は、ＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、バクテリオファージ溶菌酵素活性は、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解をもたらす。一つの例示的な実施態様において、抗菌組成物は、配列番号１に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。別の例示的な実施態様において、抗菌組成物は、配列番号１に従う配列を有するペプチドを含む。別の例示的な実施態様において、抗菌組成物は、配列番号３に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。さらに別の例示的な実施態様において、抗菌組成物は、配列番号３に従う配列を有するペプチドを含む。別の例示的な実施態様において、抗菌組成物は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８１を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８０を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ２６Ｆからなる群より選択されるメンバーであるクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージから単離される、バクテリオファージ溶菌酵素を含む。

別の実施態様において、本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を含む動物飼料を提供し、ここでバクテリオファージ溶菌酵素は、ＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、バクテリオファージ溶菌酵素は、家畜類のクロストリジウム・パーフリンジェンス感染を防除する有効量で存在する。一つの例示的な実施態様において、動物飼料は、ニワトリへの採餌に適している。

本発明の他の特徴、目的及び利点は、以下の詳細な記載によって明白となる。

配列番号１：バクテリオファージＣＰ２６Ｆリシンアミノ酸配列である。配列番号２：バクテリオファージＣＰ２６Ｆリシンをコードする例示的な核酸配列である。下線を付けた配列は、それぞれの遺伝子の「開始」及び「終止」部位である。配列番号３：バクテリオファージＣＰ３９Ｏリシンアミノ酸配列である。配列番号４：バクテリオファージＣＰ３９Ｏリシンをコードする例示的な核酸配列である。下線を付けた配列は、それぞれの遺伝子の「開始」及び「終止」部位である。ＣＰ２６ＦリシンとＣＰ３９Ｏリシンのアミノ酸配列の比較整列である。

定義
用語「家畜類」は、本明細書で使用されるとき、典型的には食物、繊維又は労働を生み出すためではあるが、必ずしもそうである必要はない農業設定において飼育された１匹以上の家畜化された動物を意味する。例示的な家畜類の種には、ウシ、ブタ、ヒツジ及び家禽が含まれるが、これらに限定されない。

用語「家禽」は、本明細書で使用されるとき、交配、肉若しくは卵の生産又は狩猟の在庫補充供給のために育てている又は捕らえている家畜鳥、例えばニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ハト、狩猟鳥、例えばキジ、ヤマウズラ、走鳥類などを意味する。

用語「抗菌剤」、「殺菌剤」又は他の文法的に同等の表現は、本明細書で使用されるとき、微生物、例えば細菌、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンスの防除に有効な任意の組成物及び／又は物質を意味する。例示的な実施態様において、「抗菌剤」は、クロストリジウム・パーフリンジェンスの防除に有効なバクテリオファージ溶菌酵素を含む抗菌組成物である。

本明細書で使用されるとき、例えば語句：クロストリジウム・パーフリンジェンスの「防除」、クロストリジウム・パーフリンジェンスを「防除する」、「クロストリジウム・パーフリンジェンス個体群を防除する」若しくは「クロストリジウム・パーフリンジェンス感染を防除する」における用語「防除」若しくは「防除する」又は文法的に同等の表現は、感染若しくは蔓延の予防、既に感染した領域若しくは生物の個体群の低減若しくは減少又はクロストリジウム・パーフリンジェンス若しくは「防除」が望ましい他の種の個体群の排除の任意の手段を意味する。事実、「防除する」は、本明細書で使用されるとき、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・パーフリンジェンス感染又はクロストリジウム・パーフリンジェンス個体群の予防、排除、低減又は軽減における成功の任意の徴候を意味する。

表現「クロストリジウム・パーフリンジェンス感染」は、本明細書で使用されるとき、「宿主」の身体中又は上にクロストリジウム・パーフリンジェンス微生物を取得することを意味する。一つの例示的な実施態様において、「宿主」は、動物、例えばニワトリである。別の例示的な実施態様において、「宿主」はヒトである。「クロストリジウム・パーフリンジェンス感染」は、疾患をもたらすことも、もたらさないこともある。表現「疾患」は、本明細書で使用されるとき、身体中又は上にクロストリジウム・パーフリンジェンスを取得した宿主が、外面的な発症、例えば疾患の臨床症状、例えば個体群の死亡率の増加、抑うつ、羽根の毛羽立ち及び暗色の下痢などを有する宿主損傷をもたらすようにクロストリジウム・パーフリンジェンスと相関する、特定の場合のクロストリジウム・パーフリンジェンス感染を意味する。

語句「有効量」若しくは「に有効な量」又は任意の他の文法的に同等な表現は、本明細書で使用されるとき、クロストリジウム・パーフリンジェンスを防除するのに有効な物質、例えば本明細書に開示されている抗菌バクテリオファージ溶菌酵素の量を意味する。当業者は、その技能及び本開示に関して必要以上に試験を行うことなく、本明細書に開示されているクロストリジウム・パーフリンジェンスの防除方法を実施するのに有効な量の抗菌バクテリオファージ溶菌酵素を決定することができる。例えば、特定の抗菌バクテリオファージ溶菌酵素は、より高い又は低い用量でより効果的でありうる。本明細書に記載されている方法を使用して家畜類、例えば家禽、例えばニワトリを評価することによって、当業者は、前記家畜類が治療に反応しているかを決定することができ、それによって投与量レベルをどのように調整するかを知る。

用語「予防する」又は「予防」は、本明細書で使用されるとき、症状の寛解、緩解及び／又は減少のような客観的又は主観的パラメーターを含む疾患又は感染の予防又は軽減における成功の任意の徴候を意味する。例えば、用語「予防する」又は「予防」は、本明細書で使用されるとき、クロストリジウム・パーフリンジェンスに関連する疾患の予防；クロストリジウム・パーフリンジェンスに関連する疾患の重篤度の低減；クロストリジウム・パーフリンジェンスに関連する疾患に罹患している家畜類、例えば家禽、例えばニワトリの予測される死亡又は死亡率の低減を意味する。例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスに関連する疾患の予防の成功は、抗菌バクテリオファージ溶菌酵素で採餌しなかった、そうでなければ治療しなかった家禽の総体的症状、罹患率及び／又は死亡率と比較した、抗菌バクテリオファージ溶菌酵素で採餌した、そうでなければ治療した家禽の総体的症状、罹患率及び／又は死亡率を比較すること、並びに抗菌バクテリオファージ溶菌酵素で採餌しなかった、そうでなければ治療しなかった家禽と比較して、家禽の症状の重篤度若しくは発生及び／又は罹患率及び／又は死亡率が少なくなった又は減少した、したがって低減したのを観察することによって測定される。症状の予防、治療、低減又は軽減は、組織試料の理学的検査、生検若しくは顕微鏡検査又は当該技術において既知の任意の他の適切な手段の結果を含む客観的又は主観的パラメーターに基づくことができる。

用語「壊疽性腸炎」は、本明細書で使用されるとき、典型的には家禽、例えばニワトリ、シチメンチョウ及びアヒルに影響を与える急性又は慢性の陽性中毒症を意味する。この状態は世界中で発生し、クロストリジウム・パーフリンジェンスにより引き起こされる。疾患は、とりわけ、通常は小腸の中央部における線維性壊疽性腸炎により特徴付けられる。

用語「生物学的試料」又は用語「診断用試料」は、本明細書で使用されるとき、生体又は死体から得た任意の試料を意味する。生物学的試料の例には、単離された臓器又は身体部分、例えば単離された脾臓、気管、胸腺；粘膜、綿棒、例えば総排出腔用綿棒、口咽頭用綿棒が含まれる。

用語「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」若しくは「バクテリオファージ溶菌酵素」若しくは「溶菌酵素」又は「バクテリオファージリシン」若しくは「リシン」、「バクテリオファージエンドリシン」若しくは「エンドリシン」は、本明細書で使用されるとき、ペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断する又は切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の溶解を引き起こす、溶菌酵素を意味する。例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、配列番号１のアミノ酸１−１５８に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を含む。一つの例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」又は「バクテリオファージ溶菌酵素」は、ペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断する又は切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の溶解を引き起こす、ブダペスト条約の条項によりアメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）に２０１０年６月２３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−１１０８０が指定された、バクテリオファージＣＰ２６Ｆから誘導されたＣＰ２６Ｆリシン（ｐｌｙＣＰ２６Ｆ）であり、ここでＣＰ２６Ｆリシンは、配列番号１のアミノ酸配列１−１５８に少なくとも約９１％の同一性があるアミノ酸配列を含む。他の例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」は、ＣＰ２６Ｆリシンであり、配列番号１のアミノ酸配列１−１５８に少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性があるアミノ酸配列を含む。一つの例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」は、ＣＰ２６Ｆリシンであり、配列番号1のアミノ酸配列１−２１２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性があるアミノ酸配列を有する。別の例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」は、ペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断する又は切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の溶解を引き起こすＣＰ２６Ｆリシンであり、ここでＣＰ２６Ｆリシンは、配列番号１に従うアミノ酸配列を有する。別の例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、配列番号３のアミノ酸１−１５８に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を含む。一つの例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」又は「バクテリオファージ溶菌酵素」は、ペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断する又は切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の溶解を引き起こす、ブダペスト条約の条項によりアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２０１０年６月２３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−１１０８０が指定された、バクテリオファージＣＰ３９Ｏから誘導されたＣＰ３９ＯＦリシン（ｐｌｙＣＰ３９ＯＦ）であり、ここでＣＰ３９Ｏリシンは、配列番号３のアミノ酸配列１−１５８に少なくとも約９１％の同一性があるアミノ酸配列を含む。他の例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」は、ペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断する又は切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の溶解を引き起こすＣＰ３９Ｏリシンであり、ここでＣＰ３９Ｏリシンは、配列番号３のアミノ酸１−１５８に少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性があるアミノ酸配列を含む。一つの例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」は、ＣＰ３９Ｏリシンであり、配列番号３のアミノ酸配列１−２１２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性があるアミノ酸配列を有する。別の例示的な実施態様において、「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素」は、ＣＰ３９Ｏリシンであり、配列番号３に従うアミノ酸配列を有する。

クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、本明細書に開示されているクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列と実質的に同一である限り及びペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、クロストリジウム・パーフリンジェンス種の細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解を引き起こす限り、任意の供給源から単離することができる及び／又は当該技術に既知の方法（例えば、 R. B. Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154、米国特許第４，１９２，７９８号、米国特許第５，７６３，２８４号、米国特許第５，９４２，６０９号などを参照すること）により合成的に作製することができる。ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列の同一性及び「実質的な同一性」を決定する方法は、下記に記載されている。

用語「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋」は、本明細書で使用されるとき、未変性状態で見出されるように、通常伴われる成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。例示的な実施態様において、純度及び均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して決定される。調製物に存在する主な種である核酸は、実質的に精製されている。一つの例示的な実施態様において、単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸、例えば２６Ｆ溶菌酵素は、未変性状態のバクテリオファージ溶菌酵素の核酸に隣接するオープンリーディングフレーム及び／又は他の核酸配列から分離される。例示的な実施態様において、用語「精製された」は、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じる核酸又はタンパク質を示す。典型的には、単離された核酸又はタンパク質は、範囲として表される純度レベルを有する。成分の純度範囲の下限は、約６０％、約７０％又は約８０％であり、純度範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％超である。

用語「核酸」は、本明細書で使用されるとき、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。典型的には、「核酸」ポリマーは、一本又は二本鎖の形態で生じるが、三本以上の鎖を含む構造を形成することも知られている。用語「核酸」には、天然に生じる核酸ポリマー、並びに既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基若しくは結合を含む核酸が含まれ、これらは合成、天然に生じる及び非天然に生じるものであり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様に代謝される。例示的な類似体には、ホスホルチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が非限定的に含まれる。

特に指示のない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変種（例えば、縮退コドン置換）及び相補配列、並びに明確に指示された配列も明確に包含する。具体的には、縮退コドン置換は、３位の１つ以上の選択された（又は全ての）コドンが混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる（例えば、Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)を参照すること）。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために本明細書において交換可能に使用される。この用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー及び非天然に生じるアミノ酸ポリマー、並びに１つ以上のアミノ酸残基が、天然に生じるアミノ酸に対応する人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーに当てはまる。

用語「アミノ酸」は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然に生じるアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を意味する。天然に生じるアミノ酸は、遺伝子コードでコードされたもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物を意味し、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ酸及びＲ基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合しているａ−炭素である。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然の生じるアミノ酸と同じ塩基化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と同様な方法で機能する化合物を意味する。

アミノ酸は、一般的に知られている３文字符号によるか又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている１文字符号により、本明細書において参照される。同様に、ヌクレオチドを慣用的に許容される１文字コードで参照することができる。

「保存的に修飾された変種」は、アミノ酸と核酸の両方の配列に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変種とは、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合では本質的に同一の配列をコードする核酸を意味する。遺伝子コードの縮退のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンのＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全て、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンで特定されるあらゆる位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく記載された対応するコドンのいずれかに変更されうる。そのような核酸変動は、「沈黙変動」であり、これは保存的に修飾された変動の１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列も、核酸のあらゆる可能な沈黙変動を記載する。当業者は、核酸におけるそれぞれのコドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生じうることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれの沈黙変動は、記載されたそれぞれの配列に潜在的に含まれている。

アミノ酸配列としては、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸又は僅かな率のアミノ酸を変更、付加又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個別の置換、欠失又は付加は、「保存的に修飾された変種」であり、変更は、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術において良く知られている（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照すること）。そのような保存的に修飾された変種は、多形変種、種間同族体及び対立遺伝子に追加的なものであり、これらを除外しない。

以下の８つの群は、互いに保存的に置換されている幾つかの例示的なアミノ酸を例示する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アルパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アルパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（ｌ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

ポリペプチド構造のような高分子構造は、多様な組織レベルにおいて記載されている。この組織についての一般的な考察は、例えば、 Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3^rd ed., 1994)及びCantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照すること。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を意味する。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に規則的な三次元構造を意味する。これらの構造はドメインとして一般に知られている。ドメインは、ポリペプチドの小型単位を形成するポリペプチドの部分であり、典型的には５０〜３５０アミノ酸長である。典型的なドメインは、βシート及びαへリックスの伸展のようなより小さな組織のセクションから作製される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を意味する。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有的関連により形成される三次元構造を意味する。異方性の用語は、エネルギー用語としても知られている。

用語「標識」は、本明細書で使用されるとき、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的な手段により検出されうる組成物を意味する。例示的な標識には、³²Ｐ、蛍光染料、高電密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに慣用的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン又はハプテン及び抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質が含まれる。

本明細書で使用されるとき、「核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、１種以上の化学結合を介して、通常は相補的塩基対を介して、通常は水素結合形成を介して、標的アミノ酸の相補配列に結合することができる核酸を意味する。本明細書で使用されるとき、プローブは、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ若しくはＴ）又は修飾された塩基（例えば、７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。加えて、プローブの塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により結合されうる。したがって、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合で結合しているペプチド核酸でありうる。プローブが、完全な相補性を欠いている標的配列をハイブリダイゼーション条件の厳密さに応じてプローブ配列に結合できることは、当業者に理解される。一つの例示的な実施態様において、プローブは、同位体、発色団、発光団、色原体などで直接標識される。他の例示的な実施態様において、プローブは、例えば、ストレプトアビジン複合体を後に結合させてもよいビオチンで間接的に標識される。プローブの存在又は不在をアッセイすることによって、選択した配列又は物質の存在又は不在を検出することができる。

したがって、用語「標識された核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、プローブの存在がプローブに結合した標識の存在を検出することにより検出されうるように、標識に、リンカー若しくは化学結合を介して共有的に又はイオン、ファンデルワールス、静電若しくは水素結合を介して非共有的に結合するプローブを意味する。

用語「プライマー」は、本明細書で使用されるとき、短い核酸、典型的には少なくとも１５ヌクレオチドの長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドを意味する。例示的な実施態様において、プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間にハイブリッドを形成する。次に、アニールされたプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される。プライマー対を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の当該技術において既知の核酸増幅法により、核酸配列の増幅に使用することができる。

ＰＣＲプライマー対は、典型的には、例えばPrimer（Version 0.5 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.）のようなその目的が意図されるコンピュータープログラムを使用して既知の配列から誘導される。当業者は、特定のプローブ又はプライマーの特異性がその長さを増加することを理解する。したがって、例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列の２０の連続ヌクレオチドを含むプライマーは、わずか１５のヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で関連標的配列とアニールする。したがって、例示的な実施態様において、より大きな特異性の核酸プライマー又はプローブは、選択された配列の２０、２５、３０、３５、４０、５０又はそれ以上の連続クレオチドを含むように選択されたプローブ及びプライマーを得る。

核酸プローブ及びプライマーは、本明細書に開示されている核酸配列に基づいて容易に調製される。プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法、並びに標識する方法及び多様な目的に適した標識の選択指針は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory;及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., 1994, John Wiley & Sonsにおいて考察されている。用語「組み換え」は、例えば細胞又は核酸、タンパク質又はベクターを参照して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入により又は未変性核酸若しくはタンパク質の変更により修飾されたこと、或いは細胞がそのようの修飾された細胞から誘導されることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、未変性（非組み換え）形態の細胞において見出されない遺伝子を発現する又はそうでなければ異常に発現する、過剰に発現する、過小に発現する若しくは全く発現しない未変性遺伝子を発現する。

用語「プロモーター」又は「プロモーター複合体」又は「プロモーター配列」は、本明細書で使用されるとき、核酸の転写を指示する一連の核酸発現制御配列を意味する。本明細書で使用されるとき、「プロモーター」又は「プロモーター複合体」又は「プロモーター配列」は、転写の開始部位の近くに例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡエレメントなどのような必要な核酸配列を含んで、機能的に結合している核酸の転写を「制御」する。幾つかの例示的な実施態様において、「プロモーター複合体」又は「プロモーター配列」は、転写の開始部位から数千までの塩基対に位置することができるが、必ずしもそうである必要のない遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも含む。他の例示的な実施態様において、「プロモーター」又は「プロモーター複合体」又は「プロモーター配列」は、機能的に結合した異種核酸の転写、並びに／又は異種核酸の最終タンパク質産物、例えば本明細書に開示されているイントロン配列及び／若しくはイントロン及びユビキチンモノマー配列の発現を促進する配列を含む。

当該技術において良く知られているように、「構成的」プロモーターは、大部分の環境及び生育条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は生育調節、例えば温度に反応する上方制御下で活性なプロモーターである。プロモーターは、その全体を未変性遺伝子から誘導することができる、未変性遺伝子のセグメント若しくはフラグメントを含むことができる又は天然に見出される異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントで構成することができる又は合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。異なるプロモーターが、異なる組織若しくは細胞型において又は異なる生育段階において又は異なる環境若しくは生理学的条件での反応において遺伝子の発現を指示できることは、当業者に理解される。同じプロモーターが異なる組織において異なって発現しうること及び／又は異なる条件下で異なって発現しうることが、更に理解される。

用語「厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる」は、本明細書で使用されるとき、厳密なハイブリダイゼーション条件下（下記に定義される）で第１核酸を第２核酸にアニールすることを意味する。例示的な実施態様において、第１核酸は、試験試料であり、第２核酸は、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素のセンス又なアンチセンス鎖である。第１及び第２核酸のハイブリダイゼーションは、標準的な厳密条件下、例えば、類似していないヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションには好まれない傾向がある高温及び／又は低塩含有量下で実施される。

用語「機能的に結合する」は、核酸発現制御配列（例えば、一連の転写因子結合部位など）と第２核酸配列（例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素核酸配列など）との間の機能的結合を意味し、ここで発現制御配列は、第２配列に対応する核酸の発現、例えば転写を指示する。例示的な実施態様において、異種核酸、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素に「機能的に結合している」プロモーターは、異種核酸の上流及びインフレームに位置する。

用語「異種」は、核酸の部分を参照して使用される場合、核酸が、互いに性質的に同じ関係が見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、新たな機能性核酸を作製するために配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、例えば１つの供給源からプロモーター及び別の供給源からコード領域を有する核酸は、典型的には組み換え的に産生される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、互いに性質的に同じ関係が見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。

「発現カセット」は、本明細書で使用されるとき、典型的には組み換え的又は合成的に生成される核酸作成物を意味し、これは、宿主細胞において特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸エレメントを含む。例示的な実施態様において、発現カセットは、転写される異種核酸、例えばプロモーターに機能的に結合しているクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素、例えば、２６Ｆ溶菌酵素配列、３９Ｏ溶菌酵素配列などを含む。

典型的には、「発現カセット」は、「発現ベクター」の一部である。用語「ベクター」は、本明細書で使用されるとき、選択された宿主細胞又は生物において複製することができる核酸を意味する。ベクターは、自律性構造物として複製することができる、あるは宿主細胞の染色体の中に組み込まれ、よって宿主細胞のゲノムと共に複製することができる。したがって、「発現ベクター」は、選択された宿主細胞又は生物において複製することができる核酸であり、例えば、「発現カセット」を含む、プラスミド、ウイルス、人工染色体、核酸フラグメント又は当該技術に既知の任意の適切な作成物である。

用語「形質転換」は、本明細書で使用されるとき、ウイルスベクターを用いる形質移入、プラスミドベクターを用いる形質転換、並びにエレクトロポレーション、リポフェクション、アグロバクテリウム感染及び粒子銃加速による裸のＤＮＡの導入が含まれるが、これらに限定されない、核酸分子を細胞に導入することができるありとあらゆる技術を包含する。

以下の用語は、２つ以上の核酸又はポリヌクレオチドの配列関係を記載するために使用される：「基準配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の率」及び「実質的な同一性」。「基準配列」は、配列比較の基礎として使用される確定された配列であり、基準配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、配列リストに提示された完全長クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列若しくは遺伝子配列のセグメントでありうる又は完全なクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列若しくは遺伝子配列を含むことができる。

用語「同一」又は「同一性」の率は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、配列比較アルゴリズムを使用することにより又は手動整列及び目視検査により測定して、比較ウインドウ又は指定の領域にわたって最大一致のために比較及び整列したとき、同じである又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定の率（例えば、８５％の同一性、９０％の同一性、９９％若しくは１００％の同一性）を有する２つ以上の核酸又は部分配列を意味する。

語句「実質的に同一」は、２つの核酸又はポリペプチドの文脈において、配列比較アルゴリズムを使用することにより又は目視検査により測定して最大一致のために比較及び整列したとき、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を意味する。例示的な実施態様において、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基の長さである配列の領域にわたって存在する。別の例示的な実施態様において、実質的な同一性は、少なくとも約１００残基の長さである配列の領域にわたって存在する。さらに別の例示的な実施態様において、実質的な同一性は、少なくとも約１５０残基以上の長さである配列の領域にわたって存在する。一つの例示的な実施態様において、配列は、核酸又はタンパク質配列の全長にわたって実質的に同一である。

配列比較では、典型的には一方の配列は基準配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験及び基準配列はコンピューターに入力され、必要な場合には部分配列配位が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。規定値プログラムパラメーターを使用することができるか、又は代替パラメーターを指定することもできる。次に配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一率を計算する。

「比較ウインドウ」は、本明細書で使用されるとき、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに通常には約１００〜約１５０からなる群より選択される隣接位置の数の任意の数のセグメントに対する参照を含み、配列を、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の隣接位置の基準配列と比較することができる。配列を比較する整列方法は当該技術でよく知られている。配列を比較するための最適な整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, (1970)の相同性整列アルゴリズム、Person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, (1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software PackageのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）又は手動整列及び目視検査（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplementを参照すること）により実施することができる。

例示的な配列比較のアルゴリズムはＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的対整列を使用し、一群の関連配列から複数の配列整列を作り出して関係性及び配列同一性率を示す。整列を作り出すために使用されるクラスター化関係を示す樹枝状図もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の漸進的整列方法の増幅を使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)により記載された方法と類似している。プログラムは、それぞれ５，０００ヌクレオチド又はアミノ酸の最大長の配列を３００まで整列することができる。複数整列手順は、２つ最も類似した配列の対整列から始まり、２つの整列配列のクラスターを生成する。次にこのクラスターを、二番目に最も関連する配列又は整列配列のクラスターと整列する。２つの配列クラスターを、２つの個別の配列の対整列を単純に伸長することにより整列する。最終整列は、一連の漸進的対整列によって達成される。プログラムは、特定の配列及びそれらのアミノ酸又は配列比較領域のヌクレオチド配位を指定すること、並びにプログラムパラメーターを指定することにより実施される。ＰＩＬＥＵＰを使用して、基準配列を他の試験配列と比較して、以下のパラメーター：デフォルトギャップウエイト（３．００）、デフォルトギャップ長ウエイト（０．１０）及び重み付エンドギャップを使用して配列同一性関係の率を決定する。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージ、例えばバージョン７．０（Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)）から得ることができる。

配列同一性及び配列類似性の率を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列内の長さＷが短いワードを同定することによって高スコアをもつ配列対（ＨＳＰ）を最初に同定し、これは、データベース配列中の同じ長さを持つワードと整列したとき、一致するか又はいくらかの正の値をもつ閾値スコアＴの条件を満たす。Ｔは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., supra）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索開始のシードとして機能する。ワードヒットは、累積整列スコアが増加されうる限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞０）及びＮ（不一致残基のための罰則スコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は、累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ下降したとき；累積スコアが、１つ以上の負のスコアを与える残基整列の累積のために０若しくはそれ以下になったとき；又はどちらかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、規定値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照すること）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993を参照すること）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される一つの類似性の測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然によって生じる確率の指摘を提供する。例えば、試験核酸と基準核酸の比較で最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は基準配列と類似していると考慮される。

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという指摘は、第１核酸でコードされたポリペプチドが、第２核酸でコードされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することであり、下記に記載される。したがって、ポリペプチドは、例えば２つのペプチドが保存置換のみにより異なっている場合、典型的には第２ポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという指摘は、２つの分子又はそれらの補体が厳密な条件下で互いにハイブリダイズすることであり、下記に記載される。２つの核酸配列が実質的に同一であるというなお別の指摘は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。

語句「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」は、配列が複合体混合物（例えば、全細胞又はライブラリーのＤＮＡ又はＲＮＡ）に存在する場合、厳密なハイブリダイゼーションの条件下で特定のヌクレオチド配列のみに分子を結合、複製又はハイブリダイズすることを意味する。一般に、２つの分子又はそれら補体が厳密な条件下で選択的又は特異的に互いにハイブリダイズする場合、２つの核酸配列は「実質的に同一」であると言われる。

語句「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブが典型的には核酸の複合体混合物において標的部分配列にハイブリダイズし、他の配列にはしない条件を意味する。厳密な条件は、配列依存性であり、異なる状況下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)において見出される。一般に、厳密な条件は、確定されたイオン強度のｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔ_m）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔ_mは、標的と相補性のある５０％のプローブが平衡で標的配列とハイブリダイズする（確定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下での）温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔ_mでは、５０％のプローブが平衡を占める）。厳密な条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が短プローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長プローブ（例えば、５０ヌクレオチドを越える）では少なくとも約６０℃であるものである。厳密な条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成することもできる。高い厳密性のハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的な高い厳密性又は厳密なハイブリダイゼーション条件には、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳにより４２℃でインキュベートすること又は５×ＳＳＣ及び１％のＳＤＳにより６５℃でインキュベートすることと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳにより６５℃で洗浄することが含まれる。しかし、当該技術に既知の他の高い厳密性のハイブリダイゼーション条件を使用することができる。

厳密な条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードにより許容される最大コドン縮退を使用して作り出される場合に生じる。そのような場合において、核酸は、中程度の厳密ハイブリダイゼーション条件下で典型的にハイブリダイズする。例示的な「中程度の厳密ハイブリダイゼーション条件」には、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝剤による３７℃でのハイブリダイゼーション及び１×ＳＳＣによる４５℃での洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用して同様の厳密性の条件を提供できることを容易に理解する。

Ｉ．序文：
クロストリジウム・パーフリンジェンスは、多様な動物、ヒト及び家禽に疾患症状及び病理発生を引き起こしうる毒素を産生するグラム陽性の嫌気性胞子形成菌である。

米国では、Ｃ．パーフリンジェンス菌は、食品媒介性疾病の三番目に一般的な原因として疾病予防管理センター（ＣＤＣ）により報告されており、経済的な費用は毎年１億２千万ドルを越えると推定される。不十分に調理された食肉及び鶏肉は、ヒトにおけるＣ．パーフリンジェンス中毒の主な供給源であると考えられる（例えば、Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Surveillance for foodborne disease outbreaks - United States, 2006 and MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2009, 58, 609-615を参照すること）。

ヒトに食物媒介性疾病を引き起こすことに加えて、クロストリジウム・パーフリンジェンスは、家禽及び家畜類に対する重要な疾患でもある。ニワトリでは、Ｃ．パーフリンジェンスは壊疽性腸炎の病原体である。壊疽性腸炎は、家禽の小腸における壊死性病巣により典型的に特徴付けられる急性又は慢性の陽性中毒症である。壊疽性腸炎の臨床徴候には、例えば下痢、脱水及び飼料消費の減少が含まれ、死亡をもたらす可能性がある。養鶏業者には恐ろしいことであるが、重篤な急性症例は、５０％の高さの死亡率を有する可能性がある。

家禽の無症状感染が家禽種、例えばニワトリの腸粘膜に損傷を引き起こすことがあり、それによって栄養素吸収の減少、体重増加の制限及び飼料転換率の増加をもたらすので、無症状感染も養鶏業者にとって有害である。

壊疽性腸炎は、飼料に抗生物質を添加することにより典型的に防除される。しかし、動物飼料における抗生物質の使用がヒト細菌病原体の中に抗生物質抵抗性をもたらしうるという証拠が存在する（例えば、Chapin et al., (2005) Fundam. Applied Toxicol., 29: 1-17を参照すること）。更に、幾つかの国々は、動物飼料における抗生物質の使用を既に禁止しているが、その結果として、これらの同じ国々は、クロストリジウム性の壊疽性腸炎、並びに他の動物の健康問題の増加を経験してきた（例えば、Casewell et al., (2003) Journal of Antimicrobial Chemotherapy 52, 159-16を参照すること）。

したがって、クロストリジウム・パーフリンジェンスの改善された防除の必要性が、当該技術において明らかに存在する。クロストリジウム・パーフリンジェンス、並びに動物及びヒトにおける他の疾患を引き起こす病原体を防除するため、現在使用される抗生物質に対して、代替抗菌剤を代用物として開発すること又は補完することが必要である。

したがって、一つの例示的な実施態様において、本発明は、ペプチド部分のＮ−アセチルムラミン酸とＬ−アラニンの間に位置するアミド結合において、細菌ペプチドグリカン細胞壁を含むペプチド部分を切断することができ、それによってクロストリジウム・パーフリンジェンス菌の溶解を引き起こす酵素をコードする、これらに限定されないがアミノ酸配列及び核酸配列を含む単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を提供する。したがって、本発明の幾つかの例示的な実施態様において、開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の防除に有効である。

したがって、一つの例示的な実施態様において、本発明は、本明細書に開示されている単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を使用して、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌を防除する方法を提供する。

ＩＩ．バクテリオファージ溶菌酵素の単離及び発現ベクターの構築
Ａ．一般的方法
本発明は、組み換え遺伝子の分野で日常的な技術を利用する。本発明に使用される一般的方法を開示する基本的な教科書には、Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)が含まれる。特に示されない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、例えば、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出すことができる。

核酸では、サイズは、キロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）のいずれかで提示される。推定値は、典型的には、アガロース若しくはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸又は公開されたＤＮＡ配列から導かれる。タンパク質では、サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）又はアミノ酸残基の数で提示される。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、誘導されたアミノ酸配列又は公開されたタンパク質配列から推定される。

市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載された自動合成機を使用して、 Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981)に最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動又はPearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)に記載されたアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる。

クローン化された遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えばWallace et al., Gene 16:21-26 (1981)の二本鎖テンプレートを配列決定する連鎖停止法を使用して、クローンニングの後に確認することができる。

本明細書に開示されている方法は、微生物学の分野で日常的な技術を利用することもできる。本発明に使用される一般的方法を開示する基本的な教科書には、例えば、Methods for General and Molecular Microbiology, 3rd Edition, C. A. Reddy, et al., eds. ASM Press (2008);及びEncyclopedia of Microbiology, 2nd ed., Joshua Lederburg, ed., Academic Press (2000)が含まれる。

特に示されない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。微生物学における一般的用語の定義は、例えば、Microbiology By Cliffs Notes, I. Edward Alcamo, Wiley (1996); Encyclopedia of Microbiology, (2000) supra; Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994)において見出すことができる。分子生物学における一般的用語の定義は、例えば、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出すことができる。

Ｂ．クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む核酸の単離方法
クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸は、細菌の核酸配列の単離に使用することができる、当業者に既知の多様な方法のいずれかを使用して単離することができる。例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸は、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸遺伝子、例えば２６Ｆ溶菌酵素遺伝子、３９Ｏ溶菌酵素遺伝子などをコードするゲノムＤＮＡフラグメントから単離することができる。例示的な「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子」は、図２に示されている。別の例示的な「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子」は、図４に示されている。用語「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子フラグメント」又は「クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子フラグメント」は、遺伝子のプロモーター及びコード領域全体よりも小さいクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子の部分を意味する。クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素、例えば２６Ｆ溶菌酵素をコードする遺伝子フラグメント及びクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子フラグメントは、下記に開示されるように調製することができる。

例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸配列及び関連する核酸配列を含む核酸配列は、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリーからクローンされる。別の例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸配列及び関連する核酸配列を含む核酸配列は、増幅技術及び標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してゲノムＤＮＡライブラリーからクローンされる。

クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の核酸は、配列番号２により表されている核酸配列のヌクレオチド１−６４２又は配列番号４により表されている核酸配列のヌクレオチド１−６４２に同一である又は実質的な配列同一性（上記に定義された）を示す配列を典型的に含む。

しがたって、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素は、典型的には、厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番号２又は配列番号４の核酸配列の塩基対１−６４２にハイブリダイズする。

ゲノムライブラリーを調製するために、典型的には、ＤＮＡを目的の生物から抽出し、機械的に剪断するか又は酵素的に消化して、約１５〜２０ｋｂのフラグメントを生じる。次にフラグメントを、勾配遠心分離により望ましくないサイズから分け、バクテリオファージラムダベクターに構築する。これらのベクター及びファージを、例えばSambrook, et al. supraに記載されているようにインビトロでパッケージ化する。組み換えファージは、Benton and Davis, Science, 196:180-182 (1977)に記載されているように、プラークハイブリダイゼーションにより分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、M. Grunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965 (1975)において一般的に記載されているように実施される。クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子及び／又はクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子フラグメントをコードするＤＮＡは、例えばサザンブロットによって、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む標識された核酸プローブとハイブリダイズするその能力によりゲノムライブラリーにおいて同定される。ハイブリダイズするＤＮＡ領域は、当業者に周知の標準的な方法により単離される。例えば、Sambrook, et al. supraを参照すること。

例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列は、ＤＮＡライブラリーを、図２に示されているクロストリジウム・パーフリンジェンスＣＰ２６Ｆバクテリオファージ溶菌酵素のＤＮＡ配列、配列番号２のヌクレオチド１−６４２から誘導される配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることにより単離される。別の例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列は、ＤＮＡライブラリーを、図４に示されているクロストリジウム・パーフリンジェンスＣＰ３９Ｏバクテリオファージ溶菌酵素のＤＮＡ配列、配列番号４のヌクレオチド１−６４２から誘導される配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることにより単離される。

さらに別の例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列は、スクリーニング及びファージゲノムの分析により単離される。

当業者に既知の他の方法を使用して、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含むＤＮＡフラグメントを単離することもできる。例えば、既知の配列のＤＮＡ分子に関連するＤＮＡの単離についての他の技術の記載は、Sambrook, et al.を参照すること。

クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列の配列特徴
完全長バクテリオファージ溶菌酵素は、典型的には約６４２のヌクレオチドを含む。完全長ＣＰ２６Ｆバクテリオファージ溶菌酵素の配列は、配列番号２として図２に示されている。完全長ＣＰ２６Ｆバクテリオファージ溶菌酵素の配列は、配列番号４として図４に示されている。

本明細書に開示されているＣＰ２６Ｆ及びＣＰ３９Ｏクテリオファージ溶菌酵素は、高い包括的配列類似性を有する。しかし、類似性は配列の長さにわたって不均一に分布している。例えば、予測タンパク質アミノ酸配列は、Ｃ末端細胞壁結合ドメインと同一であったが、Ｎ末端触媒ドメインでは互いにわずか５６パーセントの同一性を共有した。具体的には、ＰｌｙＣＰ３９Ｏの残基１６４から２１３は、細胞壁結合ドメインをコードするＰｌｙＣＰ２６Ｆの残基１６３から２１２と同一であった。１６２位のタンパク質の可変Ｎ末端領域は、両方ともＮアセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼである。

Ｃ．バクテリオファージ溶菌酵素配列を含むベクターの構築
クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列が単離されると、多様な方法を使用して、発現カセット、ベクター及び他のＤＮＡ作成物を構築することができる。クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む発現カセットは、多様な方法で構築することができる。当業者は、宿主細胞において発現作成物を成功裏に形質転換、選択及び繁殖するために、発現作成物／ベクターに存在しなければならない遺伝子エレメントについて十分に認識している。発現ベクターへの核酸配列のサブクローニング、プローブの標識化、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどのような、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列をコードする核酸の操作技術は、Sambrook, et al., supraにおいて一般的に記載されている。

異種ＤＮＡ配列に機能的に結合しているクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を含むＤＮＡ作成物を、多様なベクターに挿入することができる。典型的には、選択されたベクターは、細菌、例えば大腸菌の形質転換に有用な発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、人工染色体、核酸フラグメントなどでありうる。そのようなベクターは、当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術の使用により構築することができる。次に、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む発現ベクターを標的宿主細胞に形質移入／形質転換することができる。次に、成功裏に形質転換された細胞は、下記に開示されている適切なマーカー遺伝子の存在に基づいて選択される。

多数の組み換えベクターが、細菌及び他の微生物の適切な形質移入における使用のために当業者に利用可能である（例えば、Sambrook, et al., supraを参照すること）。適切なベクターは当業者により容易に選択される。例示的な実施態様において、既知のベクターは、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む発現作成物を作り出すために使用される。

典型的には、形質転換ベクターは、プロモーター配列及び選択可能マーカーに機能的に結合した１つ以上のクローン化されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の遺伝子（又はｃＤＮＡ）を含む。そのような形質転換ベクターは、典型的には、転写開始部位、その発現の制御が望ましい異種核酸、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位及び／又はポリアデニル化シグナルも含む。

（ｉ）調節エレメント
クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列又はその誘導体に加えて、開示されているように調製された発現作成物は、追加のエレメントを含むことができる。例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む発現作成物は、異種タンパク質の発現が増強されうるように、エンハンサー配列も含む。当該技術において知られているように、エンハンサーは、転写の開始の５’において典型的に見出され、多くの場合にコード配列の５’又は３’のいずれかに順方向又は逆方向で挿入することができる。

（ｉｉ）マーカー遺伝子
上記に示したように、形質転換／発現ベクターは、典型的には、形質転換体の容易な同定を可能にする選択可能／スクリーン可能マーカー遺伝子を含む。例示的な選択可能マーカー遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、アンピリシンなどに対する抵抗性）をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。例示的なスクリーン可能マーカーには、例えば、組み換えタンパク質のＣ末端に導入された６アミノ酸ヒスチジンタグが含まれる。

例示的な実施態様において、選択可能又はスクリーン可能マーカー遺伝子は、形質転換体を同定する能力を提供する又は増強するために、目的の特定の遺伝子として用いられる又は目的の特定の遺伝子に加えて用いられる。当該技術において知られているように、「マーカー遺伝子」は、形質転換された細胞がマーカーを有さない細胞から区別されうるように、マーカー遺伝子を発現する細胞に特有の表現型を付与する遺伝子である。一つの例示的な実施態様において、マーカー遺伝子は、化学的な手段により、例えば選択性作用物質（例えば、抗生物質など）の使用を介して「選択」することができる選択可能マーカーをコードする。別の例示的な実施態様において、マーカー遺伝子は、観察又は試験を介して、例えば「スクリーニング」により（例えば、組み換えタンパク質のＣ末端に導入された６アミノ酸ヒスチジンタグを使用して）同定されるスクリーン可能マーカーをコードする。

多数の選択可能マーカー遺伝子が当該技術において知られている（例えば、Sambrook et al, supraを参照すること）。

（ｉｖ）他のベクター作成物
幾つかの例示的な実施態様において、発現ベクターは、発現した異種核酸のコード配列に結合している配列を更に含み、これは初期翻訳産物から翻訳後に除去される。一つの例示的な実施態様において、翻訳後に除去される配列は、細胞内又は細胞外膜の中への又はそれらを通したタンパク質の輸送を促進し、それによって細胞の内側及び／又は外側の区画へのタンパク質の輸送を促進する。例示的な実施態様において、翻訳後に除去される配列は、細胞内分解的崩壊から新生タンパク質を保護する。一つの例示的な実施態様において、選択されたコード配列により上流及びリーディングフレームのリーダーペプチド配列をコードする核酸セグメントが、宿主細胞のコード配列の組み換え発現に使用される。

別の例示的な実施態様において、発現作成物は、細菌の複製起点、例えばＣｏｌＥ１起点を含む。さらに別の例示的な実施態様において、発現作成物／ベクターは、細菌選択可能マーカー、例えば、アンピリシン、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含む。

当該技術において良く知られているように、発現作成物は、典型的には、ベクター構築を促進する制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。例示的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位には、制限エンドヌクレアーゼのＮｏｔＩ、ＡａｔＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＰｍｅＩＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの認識部位が含まれるが、これらに限定されない。

Ｄ．宿主細胞、形質転換及び選択技術
異種ＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列に機能的に結合しているクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含有するＤＮＡ作成物を使用して、細胞を形質転換し、単離されたリシンペプチドを産生することができる。

クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素配列を含む発現作成物による形質転換のための例示的な宿主細胞には、例えば大腸菌が含まれるが、これに限定されない。

適切な形質転換技術は当業者により容易に選択される。当業者に利用可能な例示的な形質転換／形質移入方法には、エレクトロポレーション、塩化カルシウム形質転換などが含まれるが、これらに限定されず、そのような方法は当業者に良く知られている（例えば、Sambrook, supraを参照すること）。

Ｅ．工業規模生産：バッチ及び連続発酵
例示的な実施態様において、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の生産方法が工業規模で実施される。

一般に、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素の単離可能な量を生産することができる微生物を培養する方法を、工業規模生産用に規模拡大するために、微生物の培養を最初にパイロット規模（例えば、０．０７、０．８、１９ｍ³）に拡大し、次に生産規模（例えば、５７ｍ³）に拡大する。一つの例示的な実施態様において、工業生産用に規模拡大されるクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を生産することができる微生物は、大腸菌である。

当業者に理解されるように、特定のバイオプロセスに規模拡大するのに最適な条件を見出すために、有意な数の発酵が多様な環境及び栄養条件下で必要である。

最適化は、典型的には、振とうフラスコ実験により開始され、次に１〜１００リットルの実験室規模バイオリアクターに規模拡大される（例えば、Hebbar, K. P., et al. (1997) Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 714-719; Tholudur, A. et al., Biotechnol. Bioeng. 66: 116 (1999)を参照すること）。最適化に必要な実験の数を減らすために、数学モデル化を使用することができる（例えば、Alvarez-Ramirez, J. et al., J. Chem. Technol. Biotechnol. 74: 78 84 (1999); Boon, M. A. et al., Biotechnol Bioeng. 64: 558 567 (1999); Cooney, M. J. et al., Biotechnol. Prog. 15: 898 910 (1999); Tholudur A. et al., Biotechnol. Bioeng. 66: 116 (1999)を参照すること）。

微生物の増殖のための規模拡大は、通常、反応器のサイズに関係なく液体（培養液）中に一定の溶解酸素濃度を維持することに基づいている。加えて、温度、圧力、ｐＨ及び流速を、極めて特定のレベルに保持して、最適な培養増殖を確実にし、したがって生成物、例えばスチレンの最適な生産を確実にしなければならない（例えば、T. J. Bailey and D. Ollis, Biochemical Engineering, 2nd ed., McGraw-Hill, New York, 1987; D. W. Hubbard, L. R. Harris, and M. K. Wierenga, Chem. Eng. Prog., 84 (8), p. 55 (1988); D. C. Wang et al., Fermentation and Enzyme Technology, Wiley, New York, (1979); H. Scott Fogler, Elements of Chemical Kinetics and Reactor Calculations, Prentice-Hall, New Jersey, (1974); Encyclopedia of Bioprocess Technology, Flickinger, M.C., and Drew, S.W. eds. John Wiley & Sons (2008)を参照すること）。

当該技術において良く知られているように、発酵における混合過程の規模拡大を、独立した相互関連工程に分けることができる（例えば、Oldshue, J. Y. (1966) Biotechnol. Bioeng. 8: 3-24を参照すること）。それによって、気液吸収、流体剪断速度、ブレンド及び熱移転に対する混合効果の考察を、個別に評価することを可能にする。バイオリアクターが三次元であるので、当業者は、長さ寸法が増加すると、立方体の長さ寸法として系の許容量が増加するのを覚えておくことが重要であると理解する。この規模の増加によって、他の変数は、マイナス、ゼロから３以上に変わりうる異なる指数により線形目盛りで上昇する。

考慮される他の要因には、剪断応力の制御が含まれるが、これに限定されず、これは、大きすぎる場合、培養中の細胞の溶解を引き起こす可能性がある。したがって規模拡大と、細胞、栄養素及び酸素の十分な混合とを注意深く釣り合わせる必要がある。加えて、細胞は凝集する可能性があり、このことは、栄養素の供給及び廃棄物の除去を維持するためには問題となる。

本開示及び当該技術の知識を利用する当業者は、本明細書に開示されている方法を使用して大規模発酵方法を決定及び最適化することができる。例示的な実施態様において、方法は、発酵のバッチ法を用いる（例えば、Cinar, A., et al. (2003) Batch Fermentation: Modeling, Monitoring, and Control CRC Pressを参照すること）。別の例示的な実施態様において、方法は、連続発酵法を用いる（例えば、米国特許第４，７４８，１２３号；Karkare, S.B. et al. (1985) Bio/Technology 3, 247-251を参照すること）。

Ｆ．クロストリジウム・パーフリンジェンスの防除方法
幾つかの例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、クロストリジウム・パーフリンジェンスに感染した、ヒトを含む動物の治療に使用される。経口、エアゾール若しくは肺への送達用の他の装置、鼻腔スプレー、静脈内、筋肉内、腹腔内、鞘内、膣内、直腸内、局所、腰椎穿刺、鞘内及び脳への直接的な適用、並びに／又は髄膜が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な投与経路を使用して、バクテリオファージ溶菌酵素を投与することができる。幾つかの例示的な使用が本明細書下記に開示される。

（ｉ）表面消毒剤：
幾つかの例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、例えば（ｉ）安息香酸及びＢＨＴなどであるが、これらに限定されない多様な種類の防腐剤、並びに（ｉｉ）第四級アンモニウム化合物などであるが、これに限定されない、ファージが適合する多様な消毒剤のような既知の表面消毒剤と組み合わされる。

（ｉｉ）抗生物質
例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、例えばバンコマイシン、ナイシン、ダノフロキサシン及びネオマイシンが含まれるが、これらに限定されない既知の殺菌剤（抗生物質及び化学療法剤を含む）と組み合わせて使用される。

（ｉｉｉ）界面活性剤
例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、既知の界面活性剤と組み合わせて使用され、食物加工機器を処理するために使用される。界面活性剤は、バクテリオファージ溶菌酵素が多様な表面を覆って分布されるように表面を湿潤すること及び汚物を可溶化し、除去することを助ける。例示的な界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ８０、２０及び８１、並びにＤｏｂａｎｏｌｓが含まれる。

（ｉｖ）バクテリオファージ溶菌酵素を含む家畜類飼料の発酵
例示的な実施態様において、添加剤としてバクテリオファージ溶菌酵素を含む動物飼料配合物が調製される。

幾つかの例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、例えばそれらを飼料生成物に含めることによって、動物の治療に使用される。バクテリオファージ溶菌酵素の送達用のビヒクルとして使用される特定の飼料生成物は、当業者に理解される。

幾つかの例示的な実施態様において、バクテリオファージ溶菌酵素は凍結乾燥形態であり、後に飼料配合物に添加される。バクテリオファージ溶菌酵素の投与量は、約４０ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であると考慮される。他の例示的な実施態様において、バクテリオファージ溶菌酵素の投与量は、約５０ｍｇ／ｋｇ／日であると考慮される。他の例示的な実施態様において、バクテリオファージ溶菌酵素の投与量は、約６０ｍｇ／ｋｇ／日であると考慮される。他の例示的な実施態様において、バクテリオファージ溶菌酵素の投与量は、約７０ｍｇ／ｋｇ／日であると考慮される。他の例示的な実施態様において、バクテリオファージ溶菌酵素の投与量は、約８０ｍｇ／ｋｇ／日であると考慮される。他の例示的な実施態様において、バクテリオファージ溶菌酵素の投与量は、約９０ｍｇ／ｋｇ／日であると考慮される。バクテリオファージ溶菌酵素は、クロストリジウム・パーフリンジェンスの防除が成功するまで、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンスの量が実質的に低減するまで投与される。

異なる配合物が異なる家畜類の種のために調製されるが、例示的な実施態様において、家禽に採餌するのに適した飼料配合物が調製される。

飼料又は飼料組成物という用語は、動物、例えば家禽が摂取するのに適した又は摂取することが意図される任意の化合物、調製物、混合物又は組成物を意味する。例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は飼料に直接添加される。他の例示的な実施態様において、本明細書に開示されているバクテリオファージ溶菌酵素は、後に飼料に添加される（又は治療過程に使用される）飼料添加物又はプレミックスのような１つ以上の中間体組成物の生成に使用される。

以下の実施例は、説明のために提供され、本発明を制限しない。

実施例１：
以下の実施例は、クロストリジウム・パーフリンジェンスのためのクテリオファージ溶解の単離を説明する。

細菌宿主、バクテリオファージ単離及び繁殖
Ｃ．パーフリンジェンス単離体３９及び２６を、０．４５μｍの濾過臓物洗浄水（Ｏ）又は地元のジョージア州アセンズ（Athens）のニワトリ加工施設のニワトリ糞便（Ｆ）から得たバクテリオファージの繁殖用の宿主として利用した。宿主株を、標準的な方法及び１６Ｓ配列分析（Collins et al., 1994; Wise and Siragusa, 2005）により特徴決定した。Ｃ．パーフリンジェンスのバクテリオファージ溶解のための初期スクリーニングを、家禽（腸材料）、土壌、汚水及び家禽加工廃水から得た濾過飼料で実施した。Ｃ．パーフリンジェンスの菌株を溶解することができる細菌ウイルスを、単離したファージに感受性のある菌株の斑点試験及び滴定により同定した。Ｃ．パーフリンジェンス特異的バクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びＣＰ２６Ｆを、嫌気性チャンバーを使用し、Ｃ．パーフリンジェンス単離体３９及び２６宿主細菌培養（Wise and Siragusa, 2005）を使用して、標準的な手順（Ackermann and Nguyen, 1983）により繁殖させた。バクテリオファージを、３回のプラーク精製に付し、ＴＭＧＳ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１０ｍＭのＭｇ＋＋、０．５５％のＮａＣｌ、０．１％のゼラチン）に一定に懸濁した。続いて、バクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びＣＰ２６Ｆを、ウイルス精製及びＤＮＡ抽出用の嫌気性条件下で平板溶解法（Helms et al., 1985）を利用して繁殖させた。

バクテリオファージの精製、ゲノムＤＮＡの精製及び電子顕微鏡法。ブダペスト条約の条項によりアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２０１０年６月２３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−１１０８１が指定された、バクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びブダペスト条約の条項によりアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２０１０年６月２３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−１１０８０が指定されたバクテリオファージＣＰ２６ＦのゲノムＤＮＡを、２つの方法で精製した。嫌気性チャンバーにおける平板溶解（例えば、Helms et al., (1985) DNA. 4:39-49を参照すること）の後、バクテリオファージ遺伝子ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＬａｍｂｄａＰｈａｇｅＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ材料を使用して精製した。加えて、バクテリオファージを、４１９０×ｇによる２０分間の遠心分離により細胞細片及び低融点アガロースを除去することにより平板溶解産物から精製した。清澄化した上澄みを使用して、１０３，８００×ｇによる９０分間の遠心分離、続く１ｍＬのＴＢＳ（２０ｍＬのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）における懸濁によりウイルスをペレット化した。バクテリオファージ懸濁液を１５〜５５％のスクロース−ＴＢＳ勾配にわたって層状にし、Ｂｅｃｋｍａｎ（商標）ＪＳ２４．３８ローターにより１０３，８００×ｇで９０分間遠心分離した。バクテリオファージバンドを収集し、遠心分離により濃縮し、懸濁ペレットを、２０％〜５０％の連続酒石酸カリウム勾配（Misra et al., 1981）に置き、Ｂｅｃｋｍａｎ（商標）ＪＳ２４．１５ローターにより１０５，０００×ｇで９０分間遠心分離した。バクテリオファージバンドを勾配から引き出し、ＴＢＳで希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ（商標）ＪＳ２４．１５ローターにより１０５，０００×ｇで９０分間遠心分離し、続いてＴＢＳに懸濁した。バクテリオファージの純度を、当該技術に既知の方法により電子顕微鏡法で検査した。バクテリオファージペレットを、０．１％のサルコシル及び０．２ＭのＥＤＴＡの存在下でプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）消化、続いてフェノール−クロロホルム抽出（Sambrook et al., supra）に付し、エタノール沈殿によりゲノムＤＮＡを得た。

実施例２：
以下の実施例は、分子クローニング、配列決定、ゲノムＤＮＡの注釈及び統計発生解釈を説明する。

バクテリオファージゲノムＤＮＡの精製の後、核酸を、２６０／２８０ｎｍで分光光度系の読み取り及び制限酵素消化、続いてアガロースゲル電気泳動に付して、純度を評価した（Sambrook et al., supra)。バクテリオファージゲノムの完全長遺伝子配列決定は、米国ノースカロライナ州ハイポイント（High Point）ＭＷＧバイオテック社（Biotech,Inc）において完了した。簡潔には、ファージゲノムＤＮＡは、平滑末端が修復及び脱リン酸化されたネブライザーを使用して剪断された（Sambrook et al., 1989）。望ましいサイズのＤＮＡフラグメント（１〜４ｋｂ）を、形質転換後の大腸菌の繁殖のためにｐＳｍａｒｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（商標））に平滑末端連結した。プライマーウオーキングを含んだゲノムのためにおよそ１４倍の重複を得て、ギャップを埋めるように、クローンを配列決定した（Fouts et al., 2006）。分子クローニングも、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｌｕＩ及びＣｌａＩを使用してファージゲノムＤＮＡを切断し、続いてＴａｇポリメラーゼ（Lewis et al., 1992）により処理し、ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））にクローニングして、完成した。加えて、末端修復及びＧテーリングを、ヌクレオチド配列決定のために制限酵素フラグメントをｐＳｍａｒｔベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ（商標））にクローニングして完了した。蛍光標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターを使用した二本鎖ヌクレオチド配列決定反応を完了し、自動配列決定装置（Smith et al., 1986;アプライドバイオシステム社（Applied Biosystems Inc.））を使用して配列を決定した。

アミノ酸配列及び整列のヌクレオチド配列編集、分析、予測は、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓＧｅｎｅＷｏｒｋｓ２．５．１（商標）（カリフォルニア州マウンテンビュー（Mountain View）インテリゲネティクス社（IntelliGenetics））、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ７．２（商標）（カリフォルニア州サンジエゴ、アクセルリス社（Accelrys））及びＤＮＡＳＴＡＲ（商標）（ウイスコンシン州マジソン）ソフトウエアを使用して実施した。最終ゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、原核生物用のＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍ（http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark; Lukashin and Borodovsky. 1998）及びＯＲＦＦｉｎｄｅｒ（http://ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）ソフトウエアを使用して予測した。予測タンパク質アミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990）及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴＰ（Altschul et al., 1997; Schaffer, 2001）、並びに保存ドメインデータベース（Marchler-Bauer, 2007）アルゴリズムを使用してタンパク質データベースから検索した。タンパク質配列の間の系統発生関係は、ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓＵｓｉｎｇＰａｒｓｉｍｏｎｙ（PAUP*4.0b; Swofford, 2001）ソフトウエアを使用して構築した。生成された全ての系統発生関係を、２０００のブートストラップ複製（Hedges, 1992）により評価した。大型のターミナーゼタンパク質を利用して、ＤＮＡパッケージングの機構及びビリオン末端の構造を予測した（Casjens et al., 2005）。

実施例３：
以下の実施例は、単離されたＣＰ３９Ｏ（ＰＴＡ−１１０８１）及びＣＰ２６Ｆ（ＰＴＡ−１１０８０）バクテリオファージのビリオン精製、二次元電気泳動及びプロテオミクス分析を説明する。

二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動のための精製ビリオン試料調製物。バクテリオファージタンパク質の精製は、４容量の冷（−２０℃）アセトンを遠心分離ファージペレットに少なくとも１時間加えることにより完成した。アセトン中の可溶性タンパク質画分を、１６，０００×ｇにより４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを冷アセトン／水（４：１）で３回洗浄し、続いて遠心分離し、真空下で乾燥した（Champion et al., 2001; Lee and Lee, 2003）。再現性を確実にするため、ゲル電気泳動精製ビリオンタンパク質画分を、アセトンで抽出する前に、製造会社の説明書（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ（商標））に従いＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）により３７℃で１時間消化して、Ｎ結合糖タンパク質からオリゴ糖を切断した（Maley et al., 1989）。加えて、初期抽出の後で得られた水アセトンペレットを、「２Ｄゲルクリーンアップ」の手順に従って更に精製して、塩、洗剤、脂質又はフェノールのような妨害物質を除去した（Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標））。

タンパク質試料を電気泳動緩衝剤（５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２％のＣＨＡＰＳ、２％のＳＢ３−１０、０．２％の３／１０両性電解質と４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）に懸濁した。試料を渦にし、続いて１６，０００×ｇにより２２℃で１０分間遠心分離した。プロテオミクス分析を、細菌に適用したように（Champion et al. 2001; Lee and Lee, 2003）、二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動（O'Farrell, 1975）により完了した。タンパク質を溶解緩衝剤に懸濁し、続いて最初に一次元で、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより（O'Farrell, 1975; Bjellqvist et al., 1993）等電点電気泳動した（ｐＨ３〜１０）。スポット検出及びパターンマッチングを、ＰＤＱｕｅｓｔバージョン７．３．０で各単離体のゲルを三重に分析するＢｉｏ−ＲａｄＶｅｒｓａＤｏｃ４０００画像化装置（カリフォルニア州ハーキュリーズ（Hercules）バイオラド社（Bio-Rad））により定性的に完了した。目的のタンパク質スポットを、２Ｄゲルから抜き取り、ペプチド質量分析フィンガープリント法によりタンパク質を抽出した。スポットをＢｉｏＲａｄＥＸＱｕｅｓｔカッターで切断し、ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓＰｒｏｐｒｅｐ（Finhout and Lee, 2003）を使用して消化した。

質量分析による精製バクテリオファージタンパク質の同定。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦＭＳ（Aebersold et al., 1987; Lahm and Langen, 2000）により得たトリプシンペプチド分子質量を利用して、全米バイオテクノロジー情報センター、ＲＩＰ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのタンパク質配列ＭａｓｃｏｔデータベースをＰｒｏＦｏｕｎｄ（ニューヨーク州ニューヨーク、プロテオミクス社）により検索してタンパク質を同定し、バクテリオファージゲノムからアミノ酸配列を予測した。具体的には、試料を、ミリポアからのＺｉｐＴｉｐｕ−Ｃ１８を使用して調製し、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）標的にスポットした。試料を吸引し、ＺｉｐＴｉｐｕ−Ｃ１８で分配し、５ｍｇ／ｍｌのＭＡＬＤＩマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を含有する条件付け溶液（７０％のＡＣＮ、０．２％のギ酸）で溶出し、０．５μｌをＭＡＬＤＩ標的にスポットした。

試料を、ＴＯＦ／ＴＯＦＯｐｔｉｃｓを有するＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７００ＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＡｎａｌｙｚｅｒを使用して分析した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳデータを、内部標準として、８４２．５１及び２２１１．１０のｍ／ｚのトリプシン自己溶解生成物を使用して、７００〜４０００のｍ／ｚ範囲で収集した。データを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＧＰＳＥｘｐｌｏｒｅｒＳｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。全ての質量分析データを、ＡＢＩ４７００ＭＡＬＤＩＴＯＦ／ＴＯＦ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を使用して収集した。データを７００〜４０００ダルトンの質量範囲から反射体モードで得て、１２５０レーザーショットをそれぞれの質量スペクトルで平均化した。トリプシン自己溶解において８４２．５１及び２２１１．１０のイオンが両方とも存在する場合、各試料を内部的に較正した。両方のイオンが見出されない場合、器具は既定値の目盛りを使用する。ＭＳ分析で除外リストに載っていない８つの最も強力なイオンを、ＭＳ／ＭＳに付した。ＭＳ／ＭＳ分析では、質量範囲は、各スペクトルで平均５０００レーザーショットの前駆体ウインドウが−１〜３ダルトンである前駆イオンに対して７０であった。データをオラクル社データベースに記憶した。

ペプチドデータをオラクル社データベースから抽出し、ピークリストを、ＡＢＩ４７００から生成した生データからＧＰＳＥｘｐｌｏｒｅｒソフトウエア（アプライドバイオシステムズ社）により作成した。このピークリストは、信号対雑音フィルタリング及び除外リストに基づいており、脱同位体化を含んだ。次に、得られたファイルをＭａｓｃｏｔ（マトリックスサイエンス社）により検索した。試料が内部的に較正された場合は２０ｐｐｍの許容値を使用し、既定値目盛りが適用された場合は２００ｐｐｍ許容値を使用した。タンパク質同定は、以下の基準により確認した：修飾されていない、全てのＭＳイオン及び少なくとも２つのＭＳ／ＭＳスペクトルにおける全てのイオンおいて、２０ｐｐｍを越える質量精度が説明されなければならないこと。データベース検索パラメーターには、１つの切断抜け、メチオニンの酸化及びシステインのカルバミドメチル化が含まれる。

実施例４
以下の実施例は、バクテリオファージリシン遺伝子のＰＣＲクローニングを説明する。増幅プライマーは、バクテリオファージＣＰ２６Ｆリシン及びバクテリオファージＣＰ３９Ｏリシン遺伝子を増幅し、同時に当該技術に既知の方法により配列決定及び発現ベクターにサブクローニングするための制限酵素部位を導入するように設計した（例えば、Pritchard, D.G. et al. (2004) Microbiology 150:2079-2087.; Donovan, D.M. et al., (2006) Appl. Environ. Microbiol. 72:2988-96を参照すること）。ｐｌｙＣＰ２６Ｆ遺伝子をｐｅｔ２１ｄにクローニングするため、精製されたｐｈｉＣＰ２６ＦのＤＮＡをテンプレートとして使用し、プライマーでｐｌｙＣＰ２６ＦｅｘｐＦ（５’ ＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴ３’［配列番号５］）及びｐｌｙＣＰ２６Ｆ−ｐｌｙＣＰ３９ＯｅｘｐＲ（５’ ＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＴＴＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＴ３’［配列番号６］）を増幅した。ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限部位には、順方向及び逆方法プライマーにおいてそれぞれ下線を付けた。ｐｌｙＣＰ３９Ｏ遺伝子をｐｅｔ２１ｄにクローニングするため、精製されたｐｈｉＣＰ３９ＯのＤＮＡをテンプレートとして使用し、プライマーでｐｌｙＣＰ３９ＯｅｘｐＦ（５’ ＧＣＡＣＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡ３’［配列番号７］）及びｐｌｙＣＰ２６Ｆ−ｐｌｙＣＰ３９ＯｅｘｐＲ（５’ ＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＴＴＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＴ３’［配列番号８］）を増幅した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位には、順方向及び逆方法プライマーにおいてそれぞれ下線を付けた。ＰＣＲ産物をスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ（商標））で精製し、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ（ｐｌｙＣＰ２６Ｆ）により又はＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（ｐｌｙＣＰ３９Ｏ）により消化した。消化されたＰＣＲ産物をスピンカラム精製し、同様に消化されたベクターｐｅｔ２１ｄ及びｐｅｔ２１ａにそれぞれ連結した。次に、得られた作成物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して形質転換した。形質転換体を、直接ヌクレオチド配列決定した対応する制御酵素ｎａｄを用いて、単離したプラスミドを消化することによってスクリーンした。次に、発現にとって正確な指向の遺伝子を含有するプラスミドを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株に形質転換した。

したがって、バクテリオファージエンドリシンＰｌｙＣＰ３９０及びＰｌｙＣＰ２６Ｆをコードする遺伝子は、精製されたバクテリオファージゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、Ｍｅｔ開始及び終止部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーでＰＣＲ増幅して、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含めた。

増幅産物を、配列決定及び発現プラスミドにクローンし、大腸菌に形質転換した。Ｃ．パーフリンジェンスはグラム陽性生物であるので、Ｒｏｓｅｔｔａ株を遺伝子発現に利用し、それは、当該技術において知られているように、これらの細菌が、大腸菌において異種タンパク質を発現するとき、コドンバイアスを軽減する適切なｔＲＮＡ遺伝子を提供するプラスミドも含有するからである（例えば、Kane, (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:494-500を参照すること）。ｐｌｙＣＰ３９Ｏでは、Ｍｅｔ開始は、無傷であったが、ＡＴＧは、元のｐｌｙＣＰ２６Ｆ遺伝子のＮ末端アミノ酸が予測タンパク質のＶａｌをコードしたので、ｐｌｙＣＰ２６Ｆ開始部位プライマーに組み込まれた。

クローン化されたバクテリオファージＤＮＡの一次ヌクレオチド配列決定は、対応するバクテリオファージエンドリシンの予測アミノ酸配列を有するタンパク質をコードするエンドリシン遺伝子が両方とも存在することを確認した。次に遺伝子をＣ末端Ｈｉｓ標識タンパク質として発現し、Ｎｉカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製されたタンパク質を、ゲル電気泳動により分析して、それぞれほぼ２５，０００の分子サイズに対応する相対移動度がある２つのタンパク質の検出をもたらした。発現されたリシンを含有する大腸菌溶解産物及び精製されたタンパク質は、両方とも、スポットアッセイの後、コンフルエントなＣ．パーフリンジェンスのプレートに明澄な「プラーク」を産生することができた。

実施例５
以下の実施例は、バクテリオファージリシンの発現、抽出調製物及びタンパク質精製を説明する。

大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞を有する上記の実施例４に記載されたプラスミド作成物を、１００μｇ／ｍｌのアンピリシン及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した２００ｍｌのＬｕｒｅａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液において振とうしながら３７℃繁殖させた。中間対数期（ＯＤ_600nmの０．４〜０．６）培養を氷上に３０分間置き、続いて１ｍＭのイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、振とうしながら、２０℃で１８時間インキュベートした。培養を５０００×ｇにより４℃で２０分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。ペレットを氷上で解凍させ、４ｍｌの溶解緩衝剤（５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール、ｐＨ８）に懸濁した。次に懸濁液を超音波処理し（１５×５秒パルスでパルス間に１５秒の氷上での休止）、５０００×ｇにより４℃で３０分間遠心分離した。得られた上澄みを清澄溶解産物として使用した。１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ（ニッケルマトリックス）スラリーを、製造会社の説明書（カリフォルニア州バレンシア（Valencia）キアゲン社（Qiagen））に従って清澄溶解産物に加え、４℃で１時間穏やかに振とうした。次にスラリーをカラムに適用し、その中を重力で流動させた。カラムを４ｍｌの洗浄緩衝剤（５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、２ｍｌの試料緩衝剤（５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール、ｐＨ８．０）で溶出した。

実施例６
以下の実施例は、バクテリオファージリシンタンパク質の生化学的特徴決定を説明する。

上記の実施例５に記載されたように調製された試料におけるタンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad）インビトロゲン社）を使用して決定した。溶出されたタンパク質及びＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（商標）タンパク質標準（カリフォルニア州カールスバッド、インビトロゲン社）を、製造会社の説明書に従って、ＢｉｏＲａｄＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ３ゲル機器によりトリス−ヘペス−ＳＤＳ緩衝剤において１２０Ｖで１時間駆動させた４〜２０％の正確なタンパク質ゲル（イリノイ州ロックフォード、ピアース社（Pierce））を用いて分析した（例えば、Hames, B.D. (1981) An introduction to polyacrylamide gel electrophoresis. In: B.D. Hames and D. Rickwood (Eds), Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. pp. 1-91を参照すること）。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲ−２５０（カリフォルニア州ハーキュリーズ、バイオラド社）で１時間染色し、蒸留水で一晩洗浄し、写真を撮影した。

精製された組み換えバクテリオファージリシンをエドマン分解により直接アミノ酸配列決定した。試料をＰｒｏＳｏｒｂ装置（ＡＢＩ社）で濾過してＰＶＤＦに適用した。配列決定は、当該技術に既知の方法によりＡＢＩＰｒｏｃｉｓｅ４９２ＨＴ配列決定装置で標準パルス液体サイクルを使用して実施した（例えば、Niall, H.D. (1973) Meth. Enzymol. 27: 942-1010を参照すること）。加えて、タンパク質配列は、当該技術に既知の幾つかの変更を有する質量分析により決定した（例えば、Hunt et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:6233-7; Rosenfeld, J. et al., (1992) Anal. Biochem. 203: 173-179を参照すること）。全ての質量分析データは、4000 Series Explorerソフトウエアｖ．３．６を使用し、ＡＢＩ４７００ＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＡｎａｌｙｚｅｒＭＡＬＤＩＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析機（カリフォルニア州アプライドバイオシステムズ社）を使用して収集した。データをオラクル社データベースから抽出し、ピークリストを、ＡＢＩ４７００から生成した生データからＧＰＳＥｘｐｌｏｒｅｒソフトウエアｖ．３．６（アプライドバイオシステムズ社）により作成した。分析は、ＭＳ＋ＭＳ／ＭＳの組み合わせで実施した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの単一バンドを抽出し、上記に記述されたようにＮ末端アミノ酸配列及び質量分析による分析に付した。両方の技術は、タンパク質の一次アミノ酸配列が、それぞれクローンされた遺伝子のヌクレオチド配列から予測されたとおりであることを確認した。バクテリオファージリシンのＢＬＡＳＴ分析は、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ又はＭｕｒＮＡｃ−ＬＡＡ（ペプチドグリカン、アミノヒドロラーゼ、ＮＡＭＬＡアミダーゼ、ＮＡＭＬＡＡ、アミダーゼ３及びペプチドグリカンアミダーゼ；ＥＣ３．５．１．２８としても知られている）であると予測されるタンパク質をそれぞれもたらし、これらは、細菌の細胞壁グリコペプチドにおいてＮ−アセチルムラモイルとＬ−アミノ酸のアミド結合を加水分解する自己溶解素である（例えば、 Vollmer et al. (2008) FEMS Microbiol Rev. 32:259-86を参照すること）。

リシン遺伝子を、Ｃ．パーフリンジェンスの個別の単離体に限定されている宿主範囲を有する２つのバクテリオファージからクローンした。全体的に、これら２つのバクテリオファージのゲノムは、９５％を越える配列類似性を共有した。。前記に示されているように、２つのゲノムの間の全体的に高い配列類似性にもかかわらず、リシンの予測タンパク質アミノ酸配列は、Ｃ末端細胞壁結合ドメインでは同一であるが、Ｎ末端触媒ドメインでは互いにわずか５５パーセントの同一性しかない（図５）。特に、ＰｌｙＣＰ３９Ｏの１６４から２１３の残基は、ＰｌｙＣＰ２６Ｆの１６３から２１２の残基と同一であった。１６２位のタンパク質の可変Ｎ末端領域は、両方ともＮアセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼであると予測された。更に、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ及びＰｌｙＣＰ２６Ｆは、Ｃ．パーフリンジェンスよりも、Ｃ．ディフィシルで報告された公開バクテリオファージアミダーゼ型リシンに緊密に関連した。しかし、Ｃ．ディフィシルのアミダーゼ型リシンは、タンパク質の細胞壁結合ドメインがＣ．ディフィシルとＣ．パーフリンジェンスでは異なるので（このことが種の特異性を説明する）、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌を溶解すると予想されない。

ＢＬＡＳＴ分析は、多様な他のグラム陽性菌のゲノムにおいてコードされた緊密に関連する予測タンパク質の存在を明らかにしたが、

実施例７
以下の実施例は、スポット及び濁度アッセイを使用して、単離された、クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージリシン活性の能力の試験を説明する。

バクテリオファージリシンを発現する精製された組み換えタンパク質又は大腸菌溶解産物を、当該技術に既知の方法を使用して細菌平板培養でＣ．パーフリンジェンスを溶解する単離されたリシンの能力を決定するために使用した（例えば、Zimmer et al., 2002; Donovan et al., (2006) supraを参照すること）。ファージ誘導リシンに活性よる標的細胞溶解の結果としての濁度の低減は、経時的な光学濃度（ＯＤ_600nm）の変化をモニタリングすることにより測定した（Zimmer et al., 2002; Donovan et al., 2006）。標的細胞を、ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培養液（ニュージャージー州フランクリンレークス（Franklin Lakes）ベクトンディケンソン社（Becton Dickenson））の中間対数期（ＯＤ_600nmの０．４〜０．６）まで増殖させ、リジン緩衝剤Ａ（ＬＢＡ５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１０ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．２）でＯＤ_600nmの約１．０に濃縮した。アッセイを、各ウエルに３４４μｌの標的細胞懸濁液を有する９６ウエルマイクロタイタープレート、処理試料では１０μｌの精製ペプチド（約２．５μｇ）、対照試料では１０μｌの緩衝剤により完了した。ＯＤ_600nmの変化を、３７℃でインキュベートした１時間後に記録した。活性を計算する前に、細胞試料のみにおける変化を、リシンを有する試料から差し引いた（ＯＤ_600nmの変化ｍｇタンパク質^-1分^-1）。

バクテリオファージ誘導リシン活性に対するｐＨの効果。ｐＨに反応したファージ誘導リシンの活性を、濁度アッセイ法に記載されたとおりであるが、氷酢酸又は水酸化アンモニウムのいずれかを使用してＬＢＡのｐＨを調整して測定した（Yoong et al., 2004）。最高活性のｐＨを任意に１００％に設定し、他のｐＨ値の活性をこの最適活性に対して表した。

組み換えリシンの濁度アッセイ及びｐＨ範囲。両方の組み換え溶菌酵素を、濁度アッセイにおいてＣ．パーフリンジェンスの溶解の測定に使用した（図２）。組み換えバクテリオファージ溶菌酵素は、濁度低減アッセイにおいて、Ｃ．パーフリンジェンスの親バクテリオファージ宿主株と細菌の他の１３の単離体の両方を溶解することができた。すなわち、ＰｌｙＣＰ３９Ｏは、ブダペスト条約の条項によりアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２０１０年８月１３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−１１２６５が指定された、宿主Ｃｐ３９及びブダペスト条約の条項によりアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２０１０年８月１３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−１１２６４が指定された宿主Ｃｐ２６を溶解することができ、一方、ＰｌｙＣＰ２６Ｆは、単離体Ｃｐ２６又はＣｐ３９を用いた場合、濁度を低減することができた。このことは、予測Ｎ末端酵素領域がアミノ酸配列の５５％異なっているという事実にもかかわらずにそうであった。濁度の低減は、１時間のインキュベーションの後のＢＨＩ（脳心臓注入）アガープレートにおける生存可能なＣ．パーフリンジェンスの３対数ｃｆｕ／ｍｌまでの低減を伴った。アッセイされた全てのＣ．パーフリンジェンス単離体は溶解を受けたが、どの酵素もクロストリジウム属の他のメンバーを溶解することができなかった。最適なｐＨ範囲は、ＰｌｙＣＰ２６Ｆでは５．５〜９．９に変動したが、ｐＨ最大値は、ＰｌｙＣＰ３９Ｏでは８．２であった。

本明細書で記載された実施例及び実施態様は、説明の目的のみのためであり、それに関して多様な修正又は変更が当業者には示唆され、本明細書の精神及び範囲内、並びに添付の請求項の範囲内に含まれることが理解される。

Claims

バクテリオファージ溶菌酵素がＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、
バクテリオファージ溶菌酵素活性が、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解をもたらす
単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素。
バクテリオファージ溶菌酵素が、配列番号１に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素。
バクテリオファージ溶菌酵素が、配列番号１に従う配列を有する、請求項２に記載の単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素。
バクテリオファージ溶菌酵素が、配列番号３に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素。
バクテリオファージ溶菌酵素が、配列番号３に従う配列を有する、請求項４に記載の単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素。
バクテリオファージ溶菌酵素が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８１を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８０を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ２６Ｆからなる群より選択されるメンバーであるクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージから単離される、請求項１に記載の単離されたクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素。
バクテリオファージ溶菌酵素がＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、
バクテリオファージ溶菌酵素活性が、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解をもたらす
クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素をコードする単離された核酸分子。
単離された核酸分子が、配列番号１に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸及び配列番号３に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項７に記載の単離された核酸分子。
単離された核酸分子が、配列番号１に従うアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、請求項８に記載の単離された核酸分子。
単離された核酸分子が、配列番号３に従うアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、請求項８に記載の単離された核酸分子。
バクテリオファージ溶菌酵素がＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、
バクテリオファージ溶菌酵素活性が、クロストリジウム・パーフリンジェンス菌の細胞の溶解をもたらす
クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を含むクロストリジウム・パーフリンジェンスに対して効果的な抗菌組成物。
バクテリオファージ溶菌酵素が、配列番号１に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１１に記載の抗菌組成物。
バクテリオファージ溶菌酵素が配列番号１である、請求項１２に記載の抗菌組成物。
バクテリオファージ溶菌酵素が、配列番号３に少なくとも約９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１１に記載の抗菌組成物。
バクテリオファージ溶菌酵素が配列番号３である、請求項１４に記載の抗菌組成物。
バクテリオファージ溶菌酵素が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８１を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ３９Ｏ及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０８０を有するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージＣＰ２６Ｆからなる群より選択されるメンバーであるクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージから単離される、請求項１１記載の抗菌組成物。
バクテリオファージ溶菌酵素がＣＰ２６Ｆリシン及びＣＰ３９Ｏリシンからなる群より選択されるメンバーであり、
バクテリオファージ溶菌酵素が、家畜類におけるクロストリジウム・パーフリンジェンス感染を防除するのに有効な量で存在する
クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージ溶菌酵素を含む動物飼料。
家畜類がニワトリである、請求項１７に記載の動物飼料。