CN111909862A - 一种高产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高产2‑苯乙醇的基因工程菌，所述基因工程菌是由酿酒酵母将CAN1基因全部缺失得到。CAN1基因编码精氨酸透性酶，调控酿酒酵母对氨基酸的利用，CAN1基因的缺失导致酵母精氨酸利用率的降低，影响了酵母的氮代谢，从而对酿酒酵母中2‑苯乙醇的合成产生影响。本发明所述基因工程菌应用于液态发酵法生产白酒中。

Description

一种高产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种高产2-苯乙醇的酿酒酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

芳香化合物通常具有甜美或宜人的香气，2-苯乙醇是其中最重要的风味化合物之一。2-苯乙醇具有玫瑰香气。存在于玫瑰、茉莉等多种植物精油中，2-苯乙醇是我国规定允许使用的食用香料，用量按正常生产需要。2-苯乙醇作为食品和化妆品制造的香料成分，可用于葡萄酒、黄酒、啤酒等酒类的配制，还可用以配制各种食用香精香精。也可用于调配玫瑰香型花精油等各种花香型香精，广泛用于调配皂用和化妆品香精。2-苯乙醇还可以作为底物合成其他高附加值的香味化合物或者药物，比如乙酸苯乙酯，既可以作为香料又可以配制神经类药物或杀菌剂等。工业上生产2-苯乙醇的方法是采用化学合成法，天然法。化学合成法是以苯或苯乙烯为原料通过化学反应合成2-苯乙醇，不但原料具有致癌风险，而且产物中常含有一些难以去除的副产物，严重影响了产品质量，极大限制了产品的使用范围。天然法生产2-苯乙醇包括采用物理方法从植物中直接提取和微生物合成这两种途径，天然产品纯度高、无毒无害，具有很好的生物安全性，因此市场需求量越来越大。但是从玫瑰等植物精油中提取天然2-苯乙醇的效率很低，提取成本高，难以满足市场需求。微生物合成法生产的2-苯乙醇符合国际标准对食品，药品，化妆品添加剂等原料的要求，具有良好的市场前景，且微生物转化合成2-苯乙醇具有生产成本低，周期短，污染少，对环境温和等优点，但是目前微生物合成2-苯乙醇的产量仍然受到多种因素的影响和制约，目前提高2-苯乙醇产量的研究取得了一定的进展，但菌种的选育，原料的选择和工艺的优化还并不成熟，导致微生物转化法生产的2-苯乙醇难以满足市场需求。目前针对微生物转化法生产2-苯乙醇的研究主要集中在酵母菌上。酵母菌具有合成2-苯乙醇的能力，且对较多的胁迫因素具有较高的耐受性，对工业化环境适应性强，发酵工艺也相对成熟。因此国内外采用微生物转化法生产2-苯乙醇的菌种以酿酒酵母为主等。

酿酒酵母合成2-苯乙醇的途径可分为两个部分：莽草酸途径和艾氏途径。在莽草酸途径中，莽草酸经酶促反应生成苯丙酮酸，苯丙酮酸在脱羧酶的催化下生成苯乙醛，苯乙醛在醇脱氢酶的作用下脱氢还原为2-苯乙醇。酿酒酵母经此途径合成2-苯乙醇的代谢途径长、支路多，并存在多种抑制作用，因此通过莽草酸途径合成2-苯乙醇的产量很低。当培养基中L-苯丙氨酸作为唯一的氮源时，酵母菌主要是通过艾氏途径合成2-苯乙醇的，L-苯丙氨酸经芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅰ或酶Ⅱ催化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸在苯丙酮酸脱羧酶催化下脱羧生成苯乙醛，苯乙醛在醇脱氢酶催化下脱氢生成2-苯乙醇。已有很多相关的报道利用酿酒酵母生产2-苯乙醇，梅建凤(梅建凤,陈虹,王鸿,应国清,&易喻.(2009).水/有机溶剂两相体系中生物转化合成2-苯乙醇.化学反应工程与工艺(1).)调整油酸和水相的比例，转化后测到有机相和水相中2-苯乙醇总浓度分别为14.9g/L和1.74g/L。在微生物转化法生产2-苯乙醇的发酵液中加入有机溶剂进行萃取，可以使2-苯乙醇的产率得到很大的提高，但是采用该方法得到的2-苯乙醇不仅存在萃取剂残留问题，所选的有机萃取剂大部分具有细胞毒性，影响酵母细胞的生长代谢。此外，还有从酵母菌种育种出发，采用基因工程育种的方法进行高产2-苯乙醇菌种的筛选。Rossouw等人(Rossouw,D.,Naes,T.,&Bauer,F.F.(2008).Linking gene regulation and the exo-metabolome:a comparativetranscriptomics approach to identify genes that impact on the production ofvolatile aroma compounds in yeast.BMC genomics,9,530.

https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-530)研究发现在葡萄酒酵母VIN13中过量表达BAT1基因能显著提高异丁醇、异戊醇和2-苯乙醇的产量。Kim等(Kim,B.,Cho,B.R.,&Hahn,J.S.(2014).Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for theproduction of 2-phenylethanol via Ehrlich pathway.Biotechnology andbioengineering,111(1),115–124.https://doi.org/10.1002/bit.24993)研究证实在酿酒酵母W303的a型单倍体中过量表达ARO9基因，能够提高2-苯乙醇的得率。近些年来，随着酿酒酵母代谢途径的深入研究和分子生物技术的飞速发展，采用基因工程手段对酿酒酵母进行定向改造，以调控2-苯乙醇生成量越来越受到研究者的关注，选育出具有适宜2-苯乙醇生成量的优良菌株，并减少发酵过程中副产物的生成，最大化地利用发酵中的所有产物，是调控2-苯乙醇合成的最根本途径。

发明内容

本发明的目的是解决酿酒酵母合成2-苯乙醇产量较低的问题，通过定向改造酿酒酵母菌株，构建高产2-苯乙醇的酿酒酵母基因工程菌。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

本发明提供一种基因工程菌，所述基因工程菌是由酿酒酵母将CAN1基因全部缺失得到。

CAN1基因编码精氨酸透性酶，调控酿酒酵母对氨基酸的利用，CAN1基因的缺失导致酵母精氨酸利用率的降低，影响了酵母的氮代谢，从而对酿酒酵母中2-苯乙醇的合成产生影响。

优选地，所述CAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述CAN1基因在NCBI中可查询的Gene ID为：856646。

优选地，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15的单倍体菌株α5。

优选地，所述基因工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，通过同源重组的方法敲除其CAN1基因得到。

在本发明的一种具体实施方式中，所述基因工程菌可以通过如下步骤得到：

(1)以酿酒酵母的基因组为模板，PCR扩增得到CAN1基因的上、下游序列的DNA分子片段；

(2)通过醋酸锂化学转化法，将步骤(1)所述上、下游序列的DNA分子片段以及筛选标记基因转化至所述酿酒酵母中，通过同源重组得到敲除了CAN1基因的重组菌株；

(3)采用Cre-loxP重组***敲除步骤(2)所述重组菌株中的筛选标记基因；

(4)传代培养以使步骤(3)引入的游离质粒丢失，获得酿酒酵母重组菌。

优选地，所述筛选标记基因为KanMX抗性基因。

本发明的另一目的是提供上述基因工程菌在白酒发酵生产中的用途。

在本发明的一种具体实施方式中，所述液态发酵法生产白酒是以本发明所述基因工程菌作为生产菌株，以高粱为原料，制备高粱水解液作为发酵培养基，接种所述基因工程菌，静置发酵。

有益效果：

本发明提供的高产2-苯乙醇酿酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下，抑制精氨酸透性酶的表达，调控酿酒酵母对氨基酸的利用，达到了提高2-苯乙醇的效果，为酿造风味良好，口感独特的液态法白酒奠定了理论基础。

本发明基因工程菌的2-苯乙醇生成量明显提高。在经过液态法发酵后，原始菌株α5的2-苯乙醇生成量是131.06mg/L，本发明得到的缺失CAN1基因的重组菌株α5-ΔCAN1-k-p的2-苯乙醇生成量为400.93mg/L，相比较亲本菌株提高了205.92％。

本发明基因工程菌发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或其他负面情况。此外该菌株除2-苯乙醇以外的其他风味物质的含量基本并未受到影响，完好地保留了白酒中的风味物质。

特别地，本发明提供的缺失CAN1基因的酿酒酵母菌株实现了在提高2-苯乙醇产量的同时提升了酯类物质的含量，显著改善了液态法白酒的风味。

附图说明

图1：实施例中重组菌株α5-ΔCAN1-k-p的构建流程图。

图2：实施例中CAN1A、CAN1B、loxP-KanMX-loxP片段的验证电泳图。

图3：实施例中重组菌株α5-ΔCAN1的验证电泳图。

图4：实施例中重组菌株α5-ΔCAN1-k(敲除KanMX抗性基因)的验证电泳图。

图5：实施例中重组菌株α5-ΔCAN1-k-p(丢弃pSH-Zeocin质粒)的验证电泳图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，酿酒酵母α5仅为其中一种较佳的实施方式，其来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15(保藏编号为No.CICC32315)的单倍体菌株。

实施例1：缺失CAN1基因的酿酒酵母菌株的构建

以酿酒酵母α5(Li W,Wang JH,Zhang CY,Ma HX,Xiao DG(2017b)Regulation ofSaccharomyces cerevisiae genetic engineering on the production of acetateesters and higher alcohols during Chinese Baijiu fermentation.J Ind MicrobiolBiotechnol 44:949-960.)为宿主菌，通过同源重组的方法构建缺失CAN1基因的重组基因工程菌株。

具体的构建步骤详述如下：

(1)以出发菌株酿酒酵母α5的基因组为模板，以CAN1A-F和CAN1A-R为引物利用PCR扩增得到CAN1基因的上游DNA分子片段CAN1A(537bp)；以酿酒酵母α5基因组为模板，以CAN1B-F和CAN1B-R为引物利用PCR扩增得到CAN1基因的下游DNA分子片段CAN1B(673bp)。

(2)以质粒pUG6为模板，以CAN1K-F和CAN1K-R为引物利用PCR扩增得到含有KanMX标记基因的PCR产物loxP-KanMX-loxP(1663bp)。KanMX标记基因也可以从其他含有其基因序列的质粒上获取或者直接合成其DNA分子片段。

附图2是CAN1A、CAN1B、loxP-KanMX-loxP片段的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以酿酒酵母α5基因组为模板，CAN1A-F和CAN1A-R为引物对PCR扩增的结果(537bp单一条带)；2泳道是以酿酒酵母α5基因组为模板，CAN1B-F和CAN1B-R为引物对PCR扩增的结果(673bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，CAN1K-F和CAN1K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。

(3)通过醋酸锂化学转化法，将步骤(1)和(2)获得的PCR产物片段CAN1A、CAN1B中间连入loxP-KanMX-loxP转化到所述出发菌株α5中，用G418抗性平板筛选转化子，挑选在G418抗性平板上生长的酵母菌落，提取纯化后的酵母菌株的DNA作为模板，分别以CAN1-M1-U/CAN1-M1-D和CAN1-M2-U与CAN1-M2-D为引物，利用PCR进行转化子的定点验证，分别得到长度为1736bp和1905bp的正确条带。即为正确的阳性转化子，记为重组菌株α5-ΔCAN1。

附图3是重组菌株α5-ΔCAN1的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以重组菌株α5-ΔCAN1的基因组为模板，CAN1-M1-U与CAN1-M1-D为引物对PCR扩增得到的片段(1736bp单一片段)；2泳道是以重组菌株α5-ΔCAN1的基因组为模板，CAN1-M2-U与CAN1-M2-D为引物对PCR扩增得到的片段(1905bp单一片段)；3泳道是以α5的基因组为模板，CAN1-M1-U与CAN1-M1-D为引物对PCR扩增得到的结果；4泳道是以α5基因组为模板，CAN1-M2-U与CAN1-M2-D为引物对PCR扩增得到的结果。

(4)利用Cre-loxP重组***，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤(3)的重组菌株中，分别以重组菌株α5-ΔCAN1的基因组和转化子的基因组为模板，以K-F与K-R为引物利用PCR扩增，以重组菌株α5-ΔCAN1为模板进行PCR扩增得到的片段1613bp，而在以转化子的基因组为模板的PCR扩增中，无条带，证明得到剔除KanMX抗性标记的转化子，记为重组菌株α5-ΔCAN1-k。

附图4是重组菌株α5-ΔCAN1-k的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以重组菌株α5-ΔCAN1的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2泳道是以α5-ΔCAN1-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果。

(5)将步骤(4)所得重组菌株α5-ΔCAN1-k进行传代培养，以丢弃其中游离的pSH-Zeocin质粒，选取第4-5代及以上代数的菌株，从中提取酵母质粒并以此为模板，以Zn-F与Zn-R为引物进行PCR扩增，此外，提取pSH-Zeocin质粒为模板并以Zn-F与Zn-R为引物进行PCR扩增，PCR结果出现1172bp的条带，而以传代后菌株的基因组为模板，无条带。证明获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，记为α5-ΔCAN1-k-p。

附图5是重组菌株α5-ΔCAN1-k-p(丢弃pSH-Zeocin质粒)的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以α5-ΔCAN1-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。

本实施例中所用PCR引物的核苷酸序列如表1所示。

表1 PCR引物序列表

实施例2：重组菌株α5-ΔCAN1-k-p液态法白酒发酵实验

(1)发酵工艺路线：

高粱颗粒→粉碎→液化、糖化→加入酸性蛋白酶→冷却→过滤→高粱汁糖度调整→分装→灭菌→接种、发酵→蒸馏；

(2)主要的工艺条件如下：

粉碎条件：粉碎度以没有整粒的高粱为宜，粉碎程度不易过细，以免造成过滤压力过大；

液化、糖化条件：粉碎后的高粱以料水比1:4的比例加入30℃的温水，充分搅拌均匀后，放置于恒温水浴锅中，90℃保持60min，进行液化。调节水浴锅温度至60℃，保持30min，进行糖化。液化和糖化过程中每隔5min充分搅拌一次；糖化完成后，调节水浴锅温度至40℃，加入酸性蛋白酶搅拌均匀，并保持16h，使蛋白酶充分发挥作用。

过滤条件：使用双层纱布过滤高粱水解液，调节高粱水解液糖度为18度。

灭菌条件：将上述高粱水解液分装至三角瓶中并于115℃灭菌20min。冷却至室温，即为发酵培养基。

(3)发酵实验：

将在相同实验条件下活化好的酿酒酵母出发菌株α5和重组菌株α5-ΔCAN1-k-p种子液分别接种到(2)中制备好的发酵培养基中(接种量为5×10⁶CFU/mL)，在30℃的培养箱中静置进行液态法白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵96h时，出发菌株α5和重组菌株α5-ΔCAN1-k-p发酵液的失重不再减小，认为发酵结束，停止培养；测定发酵液的失重、酒精度、残糖以及主要香气成分含量。以失重、酒精度、残糖表征其综合性能，结果见表2。主要香气成分含量结果见表2。

(4)GC分析测定高级醇和酯含量：发酵液经蒸馏后，酒样进行气相色谱分析，色谱条件为：毛细管色谱柱LZP-930，50m×320μm×1.0μm，载气为纯度为99.99％的氮气，分流比1:10。进样口温度200℃，检测器温度200℃，进样量1μL。采用程序升温，50℃保持8min，5℃/min升温，升温至150℃，保持15min。为保持数据的准确性，每个样品进样两次，取平均值。在同一色谱条件下，用已知的高级醇类和酯类标准品色谱峰的保留时间与样品中高级醇类物质色谱峰的保留时间对照进行分析。

表2高粱原料液态法白酒发酵的发酵性能

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值，*p<0.05,**p<0.01。

表2表明：液态法白酒发酵实验时，本发明所获得的酿酒酵母重组菌株与出发菌株相比，发酵性能没有明显变化。这说明本发明中敲除CAN1基因，没有对酿酒酵母α5的发酵性能产生影响。

表3高粱原料液态法发酵白酒的主要香气成分含量(mg/L)

表3表明：就高级醇的生成量来看，原始菌株α5的2-苯乙醇生成量是131.06mg/L，本发明重组菌株α5-ΔCAN1-k-p的2-苯乙醇生成量为400.93mg/L，相比较亲本菌株提高了205.92％。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上提高液态法白酒中2-苯乙醇的含量。从总高级醇生成量来看，原始菌株α5的高级醇生成总量是479.70mg/L，本发明重组菌株α5-ΔCAN1-k-p的高级醇生成总量为1486.89mg/L，相比较亲本菌株提高了209.96％。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上提高液态法白酒中总高级醇的含量，为酿造风味良好，口感独特的液态法白酒奠定了理论基础。。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种高产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1773

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atgacaaatt caaaagaaga cgccgacata gaggagaagc atatgtacaa tgagccggtc 60

acaaccctct ttcacgacgt tgaagcttca caaacacacc acagacgtgg gtcaatacca 120

ttgaaagatg agaaaagtaa agaattgtat ccattgcgct ctttcccgac gagagtaaat 180

ggcgaggata cgttctctat ggaggatggc ataggtgatg aagatgaagg agaagtacag 240

aacgctgaag tgaagagaga gcttaagcaa agacatattg gtatgattgc ccttggtggt 300

actattggta caggtctttt cattggttta tccacacctc tgaccaacgc cggcccagtg 360

ggcgctctta tatcatattt atttatgggt tctttggcat attctgtcac gcagtccttg 420

ggtgaaatgg ctacattcat ccctgttaca tcctctttca cagttttctc acaaagattc 480

ctttctccag catttggtgc ggccaatggt tacatgtatt ggttttcttg ggcaatcact 540

tttgccctgg aacttagtgt agttggccaa gtcattcaat tttggacgta caaagttcca 600

ctggcggcat ggattagtat tttttgggta attatcacaa taatgaactt gttccctgtc 660

aaatattacg gtgaattcga gttctgggtc gcttccatca aagttttagc cattatcggg 720

tttctaatat actgtttttg tatggtttgt ggtgctgggg ttaccggccc agttggattc 780

cgttattgga gaaacccagg tgcctggggt ccaggtataa tatctaagga taaaaacgaa 840

gggaggttct taggttgggt ttcctctttg attaacgctg ccttcacatt tcaaggtact 900

gaactagttg gtatcactgc tggtgaagct gcaaacccca gaaaatccgt tccaagagcc 960

atcaaaaaag ttgttttccg tatcttaacc ttctacattg gctctctatt attcattgga 1020

cttttagttc catacaatga ccctaaacta acacaatcta cttcctacgt ttctacttct 1080

ccctttatta ttgctattga gaactctggt acaaaggttt tgccacatat cttcaacgct 1140

gttatcttaa caaccattat ttctgccgca aattcaaata tttacgttgg ttcccgtatt 1200

ttatttggtc tatcaaagaa caagttggct cctaaattcc tgtcaaggac caccaaaggt 1260

ggtgttccat acattgcagt tttcgttact gctgcatttg gcgctttggc ttacatggag 1320

acatctactg gtggtgacaa agttttcgaa tggctattaa atatcactgg tgttgcaggc 1380

ttttttgcat ggttatttat ctcaatctcg cacatcagat ttatgcaagc tttgaaatac 1440

cgtggcatct ctcgtgacga gttaccattt aaagctaaat taatgcccgg cttggcttat 1500

tatgcggcca catttatgac gatcattatc attattcaag gtttcacggc ttttgcacca 1560

aaattcaatg gtgttagctt tgctgccgcc tatatctcta ttttcctgtt cttagctgtt 1620

tggatcttat ttcaatgcat attcagatgc agatttattt ggaagattgg agatgtcgac 1680

atcgattccg atagaagaga cattgaggca attgtatggg aagatcatga accaaagact 1740

ttttgggaca aattttggaa tgttgtagca tag 1773

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcaccaaga atagagttt 19

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgcagcgt acgaagcttc agctgagcag acggagtaga agc 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttctactc cgtctgctca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatacaggca acaagtgatg cataggccac tagtggatct gata 44

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatcagatcc actagtggcc tatgcatcac ttgttgcctg tatc 44

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcactgtat ctgctgctt 19

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgcctttgat agtgcc 16

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctaatacctg gaatgctg 18

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtataaatg ggctcg 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcggtggtc tcaaca 16

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cccacacacc atagcttca 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agcttgcaaa ttaaagcctt 20

Claims (9)

1.本发明提供一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是由酿酒酵母将CAN1基因全部缺失得到。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述CAN1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母是酿酒酵母AY15的单倍体菌株α5。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，通过同源重组的方法敲除其CAN1基因得到。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过如下步骤得到：

(1)以酿酒酵母的基因组为模板，PCR扩增得到CAN1基因的上、下游序列的DNA分子片段；

(2)通过醋酸锂化学转化法，将步骤(1)所述上、下游序列的DNA分子片段以及筛选标记基因转化至所述酿酒酵母中，通过同源重组得到敲除了CAN1基因的重组菌株；

(3)采用Cre-loxP重组***敲除步骤(2)所述重组菌株中的筛选标记基因；

(4)传代培养以使步骤(3)引入的游离质粒丢失，获得酿酒酵母重组菌。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述筛选标记基因为KanMX抗性基因。

7.权利要求1-6任一项所述基因工程菌在液态发酵法生产白酒中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述液态发酵法生产白酒是以所述基因工程菌作为生产菌株，以高粱为原料，制备高粱水解液作为发酵培养基，接种所述基因工程菌，静置发酵。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌的接种量为5×10⁶CFU/mL，30℃静置发酵。

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