CN111909257A - 一种卡利普多抗原的合成方法及其应用 - Google Patents

一种卡利普多抗原的合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卡利普多人工抗原，其结构通式如下：
Figure DDA0002605299220000011
本发明还涉及一种卡利普多人工抗原的制备方法和其应用，通过琥珀酸酐在卡利普多N上衍生出羧基，通过羧基与蛋白质偶联得到卡利普多及其衍生物检测抗原。本发明的合成工艺中所使用的材料和催化剂均为普通产品，因此更具实用性，适于工业生产并能产生经济价值。

Description

一种卡利普多抗原的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及利用化学合成方法从卡利普多开始合成卡利普多半抗原及其衍生物，再与大分子蛋白偶联应用于胶体金检测卡中。
背景技术
下面的背景技术用于帮助读者理解本发明，而不能被认为是现有技术。
卡利普多(carisoprodol)是一种中枢作用的骨骼肌松弛剂，常用于肌肉痉挛。虽然确切的作用机制是未知的，它导致镇静，随后，肌肉松弛。早在1978年就有故意误用的报道。
在人体中卡利普多由CYP2C19酶通过N-脱烷基作用(N-dealkylation)转化为其活性代谢物氨甲丙二酯(眠尔通,安宁，meprobamate)。卡利普多代谢为其活性代谢物氨甲丙二酯的速度与CYP2C19酶多态性有关。CYP2C19基因多态性能影响卡利普多的药代动力学。
尽管卡利普多在治疗背痛和活化患者方面被证明很有效，但其被滥用的潜力和其过量服用的毒副作用却也招致很多批评。卡利普多常见的副作用包括头晕、嗜睡、恶心和心理损伤。
随着骨骼肌松弛剂的使用超过某些指南，人们对其滥用的担忧也增加了。有时，它是作为其他药物滥用的替代品，改变其他药物的作用，或阿片类戒断症状的自我启动，但被认为具有明显的效果，其自身也有可能被滥用。
虽然仅由carisoprodol导致的死亡并不常见，但carisoprodol致中毒的数量和严重程度的迅速上升令人担忧。
因此进行卡利普多滥用检测的相关试剂及其产品的开发就成为需要。
发明内容
本发明以卡利普多为原料合成半抗原，酰胺N上交联臂再与具有免疫原性的蛋白质偶联，以此来获得具有反应原性和免疫原性的完全抗原；将这一抗原应用于检测卡中来进行卡利普多是否滥用的检测。为了获得针对半抗原的特异性抗体，交联臂一般要遵循两个原则：①尽量不要具备复杂的结构，一般以烃链为佳，这样可以尽量避免产生抗交联臂的抗体；②要具备一定的长度，一般为1-10个原子，最好是2-6个，这样可以将半抗原暴露在蛋白质的外表，而不是被蛋白质遮掩住。因此合成的免疫抗原选择的交联剂一般是琥珀酸酐等，在通过羧基与蛋白质上的氨基反应，其交联臂为结构简单的烃链，长度为4-8个原子。
具体来说,本发明提供的一种卡利普多检测抗原，其结构通式如下：
Figure BDA0002605299200000021
一些优选的实施方式中，大分子蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
另一方面，本发明还提供卡利普多人工抗原的方法，通过琥珀酸酐在卡利普多N上衍生出羧基，通过羧基与蛋白质偶联得到卡利普多及其衍生物检测抗原，其反应式如下：
Figure BDA0002605299200000022
本发明还提供一种制备卡利普多及其衍生物检测抗原的方法，具体制备步骤如下：
(1)称取一定量的卡利普多于50ml的圆底烧瓶中，加入吡啶；搅拌均匀后，加入丁二酸酐，在110℃下，搅拌过夜；反应结束后，用TLC检测，爬板展开剂的比例为DCM:MeOH＝10：
1，原料点无紫外，碘缸显示有黄色点；产物点有紫外Rf＝0.8；后处理：将反应液通过水浴55℃减压旋蒸拉干后，残留物加入DCM溶解，溶解后加入纯化水，洗涤有机相三次，再用饱和氯化钠洗涤有机相一次，再用无水硫酸钠干燥有机相，最后用水浴45℃蒸干溶剂得粗品SOMA-1；粗品经过纯化过柱得产物A；其中，过柱的淋洗剂比例为PE:EA＝2:1；卡利普多：吡啶：丁二酸酐/戊二酸酐＝1:4.3:1.2-2.0；
(2)产物偶联载体蛋白
a.取一定量产物A溶于2ml DMF，浓度为50mg/ml，配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白；
b.在2ml×50mg/ml产物A中加入EDC、NHS，得产物B，其中，产物B:EDC:NHS＝1:1:1.12，室温搅拌8小时；
c.取a步骤中配置的PBS-BSA蛋白溶液20ml，然后滴入产物B，室温反应16小时，得到终产物卡利普多抗原，PBS透析3天，检测测其浓度。
以及，本发明还提供卡利普多及其衍生物检测抗原在制备免疫检测试剂盒中的应用。
此外，本发明还提供卡利普多胶体金检测试纸卡的方法，包括如下步骤：
S1.用柠檬酸钠还原四氯化金制备直径在20-40nm的胶体金，然后将胶体金标记到卡利普多的抗体上，形成金标抗体，用λmax的吸光值(OD)来表示金标抗体的浓度；
S2.将金标抗体上样到金标机上，将一定OD值的金标抗体均匀地喷聚酯膜(金标垫)上，喷好后放入37度烘箱烘8h；切成合适的大小，放入装有干燥机的铝箔袋内，室温存放备用；
S3.将卡利普多抗原稀释到合适浓度，用点膜机点到硝酸纤维素膜上相应检测线位置，37度烘干12h；
S4.玻璃纤维经过缓冲液和表面活性的处理，37度烘干10h备用；
S5.按金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜，吸水纸，大卡组装成胶体金检测试纸卡。
本发明具有以下有益效果：
本发明的合成工艺中所使用的材料和催化剂均为普通产品，因此更具实用性，适于工业生产并能产生经济价值；
此发明合成的抗原可以特异性的和抗体结合，并且技术指标完全符合要求。
本发明没有用到氯仿等，毒性较低，更具有安全性。
附图说明
图1为卡利普多抗原的结构通式；
图2为胶体金检测卡的结构示意图；
图3为色卡示意图；
图4为实施例1的卡利普多抗原对于小分子检测结果图；
图5为实施例1的卡利普多抗原的加速稳定性结果图；
图6为实施例4的卡利普多抗原对于小分子检测结果图；
图7为实施例4的卡利普多抗原的加速稳定性结果图。
附图标记：
样品垫201、金标垫202、硝酸纤维素膜203，吸水纸204，大卡205，检测试纸条200，检测线(T线)206，控制线(C线)207
具体实施方式
下面结合附图对本发明卡利普多抗原的合成及其在制备免疫检测试剂盒中的应用的各项性能进行详细说明。
利普多为原料合成半抗原，酰胺N上交联臂再与具有免疫原性的蛋白质偶联，以此来获得具有反应原性和免疫原性的完全抗原。
一、合成卡利普多抗原
实施例1：42.3mg丁二酸酐制备卡利普多抗原
(1)中间产物的制备
取卡利普多100mg(mw＝260，1eq，0.38mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入5ml(mw＝79；1.62mmol)吡啶。搅拌均匀后，加入丁二酸酐42.3mg(mw＝100，1.2eq，0.423mmol)。在110℃下，搅拌反应16小时。反应结束后，用TLC检测，爬板展开剂的比例为DCM:MeOH＝10：1，原料点无紫外，碘熏有黄色点，产物有紫外点Rf＝0.8。后处理：将反应液通过水浴55℃减压将溶剂旋蒸拉干后，残留液加入20毫升DCM溶解，水洗有机相三次，每次20毫升，分液后再用20毫升饱和氯化钠洗有机相一次，分离出有机相，有机相再用无水硫酸钠干燥，45℃蒸干有机相溶剂得108mg。粗品经过过柱纯化得100mg产物A。过柱的淋洗剂比例为PE:EA＝2:1；收率为72.5％。
13CNMR(DMSO)δ:157.3,70.6,28.5,70.9,157.2,42.8,23.6,23.6,17.4,35.4,17.6,14.6,175.7,28.5,31.2,177.0；
(2)中间产物偶联载体蛋白
1.取100mg产物A溶于2ml DMF，浓度为50mg/ml。配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白；
2.在2ml×50mg/ml产物A中加入67mg EDC，41.4mg NHS,得产物B，室温搅拌8小时；
3.取1步的PBS-BSA蛋白溶液20ml，然后滴入产物B，室温反应16小时得到终产物卡利普多抗原，用PBS透析3天，测得浓度为6.5mg/ml。
产物B的13CNMR(DMSO)δ:157.3,70.6,28.5,70.9,157.2,42.8,23.6,23.6,17.4,35.4,17.6,14.6,175.7，29.1,26.5,173.2,173.2,26.0,26.0,173.2；
实施例2：52.8mg丁二酸酐制备卡利普多抗原
(1)中间产物的制备
取卡利普多100mg(mw＝260，1eq，0.38mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入5ml(mw＝79；1.62mmol)吡啶。搅拌均匀后，加入丁二酸酐52.8mg(mw＝100，1.2eq，0.423mmol)。在110℃下，搅拌反应16小时。反应结束后，用TLC检测，爬板展开剂的比例为DCM:MeOH＝10：1，原料点无紫外，碘熏有黄色点，产物有紫外点Rf＝0.8。后处理：将反应液通过水浴55℃减压将溶剂旋蒸拉干后，残留液加入20毫升DCM溶解，水洗有机相三次，每次20毫升，分液后再用20毫升饱和氯化钠洗有机相一次，分离出有机相，有机相再用无水硫酸钠干燥，45℃蒸干有机相溶剂得101mg。粗品经过过柱纯化得92mg产物A。过柱的淋洗剂比例为PE:EA＝2:1；收率为66.8％；
(2)中间产物偶联载体蛋白的过程与实施例1中相同。
实施例3：70.5mg丁二酸酐制备卡利普多抗原
(1)中间产物的制备
取卡利普多100mg(mw＝260，1eq，0.38mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入5ml(mw＝79；1.62mmol)吡啶。搅拌均匀后，加入丁二酸酐70.5mg(mw＝100，1.2eq，0.423mmol)。在110℃下，搅拌反应16小时。反应结束后，用TLC检测，爬板展开剂的比例为DCM:MeOH＝10：1，原料点无紫外，碘熏有黄色点，产物有紫外点Rf＝0.8。后处理：将反应液通过水浴55℃减压将溶剂旋蒸拉干后，残留液加入20毫升DCM溶解，水洗有机相三次，每次20毫升，分液后再用20毫升饱和氯化钠洗有机相一次，分离出有机相，有机相再用无水硫酸钠干燥，45℃蒸干有机相溶剂得93mg。粗品经过过柱纯化得85mg产物A。过柱的淋洗剂比例为PE:EA＝2:1；收率为61.6％；
(2)中间产物偶联载体蛋白的过程与实施例1中相同。
实施例4：戊二酸酐制备卡利普多抗原
(1)中间产物的制备
取卡利普多100mg(mw＝260，1eq，0.38mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入5ml(mw＝79,1.62mmol)吡啶。搅拌均匀后，加入戊二酸酐52.6mg(mw＝114.1，1.2eq，0.46mmol)。在110℃下，搅拌过夜。反应结束后，用TLC检测，爬板展开剂的比例为DCM:MeOH＝10：1，原料点无紫外，碘熏有黄色点，产物有紫外点Rf＝0.8。后处理：将反应液通过水浴55℃减压将溶剂旋蒸拉干后，残留液加入20毫升DCM溶解，水洗有机相三次，每次20毫升，分液后再用20毫升饱和氯化钠洗有机相一次，分离出有机相，有机相再用无水硫酸钠干燥，45℃蒸干有机相溶剂得粗品SOMA-1 86mg,为产物a，收率为61.5％；
13CNMR(DMSO)δ：157.3，70.6,28.5,70.9,157.1,42.8,23.6,23.6,17.4,35.5,17.8,14.6,174.5,33.1,20.5,34.8,177.0；
(2)中间产物偶联载体蛋白
1.取86mg产物a溶于1.72ml DMF，浓度为50mg/ml。配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白；
2.在1.72ml×50mg/ml产物a中加入57.6mg EDC，35.6mg NHS,得产物b，室温搅拌8小时；
3.取1步的PBS-BSA蛋白溶液17.2ml，然后滴入产物b，室温反应过夜得到终产物卡利普多抗原，PBS透析3天，测得浓度为6.8mg/ml。
产物b的13CNMR(DMSO)δ：157.3，70.6,28.5,70.9,157.1,42.8,23.6,23.6,17.4,35.5,17.8,14.6,174.5,32.7,21.1,173.2,26.0,26.0,173.2,30.1,172.5；
实施例5：碳酸钾和溴丁酸乙酯制备卡利普多抗原
取卡利普多100mg(mw＝260，1eq，0.38mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入5ml(mw＝41.06,95mmol)乙腈。搅拌均匀后，加入碳酸钾159mg(mw＝138，4.18mmol)，加热至80℃。边搅拌边缓慢加入60.5微升的溴丁酸乙酯(mw＝195，0.423mmol)，滴加完毕后，80℃反应16h。经过TLC检测，反应不进行。
二、抗原在胶体金检测试纸条的应用
用柠檬酸钠还原四氯化金制备直径在20-40nm的胶体金，然后将胶体金标记到抗卡利普多的抗体到上，用λmax的吸光值(OD)来表示金标抗体的浓度；
将金标抗体上样到金标机上，将一定OD值的金标抗体均匀地喷聚酯膜(金标垫202)上，喷好后放入37度烘箱烘8h；切成合适的大小，放入装有干燥机的铝箔袋内，室温存放备用；
将卡利普多抗原稀释到合适浓度，用点膜机点到硝酸纤维素膜203上相应T线位置206，同样在硝酸纤维素膜203上相应C线207位置加上相应的鼠抗原(用于检测该检测卡是否有效)，37度烘干12h；
样品垫201---玻璃纤维经过缓冲液和表面活性的处理，37度烘干10h备用；
按样品垫201、金标垫202、硝酸纤维素膜203，吸水纸204，大卡205组装成胶体金检测试纸卡见图2；
配制相应浓度的小分子溶液，加入到样品垫201上，5min后读取结果；
产品对卡利普多的Cutoff值的要求是1000ng/ml，即-50％为500ng/ml，+50％为1500ng/ml。
备注1：所有待测小分子均溶于阴性尿液中。
备注2：标准色卡:标准色卡的比色范围在0-10之间，即G1-G10，颜色从无到有，颜色深度依次递增，见图3所示。
备注3：检测标准：将检测试纸条的检测T线206与标准色卡进行对比：
线条深度大于G8时表示阴性；
-50％cutoff情况下，线条深度﹥G4为合格；
+50％cutoff情况下，线条深度﹤G3.5为合格
表一：实施例1的抗原对卡利普多小分子的检测灵敏度结果(图4)
Figure BDA0002605299200000071
表二:实施例1的抗原的加速稳定性(将组装好的检测卡55℃烘72小时)结果(图5)
Figure BDA0002605299200000072
Figure BDA0002605299200000081
表三：实施例4的抗原对卡利普多小分子的检测灵敏度结果(图6)
Figure BDA0002605299200000082
表四:实施例4的抗原的加速稳定性(将组装好的检测卡55℃烘72小时)结果(图7)
Figure BDA0002605299200000083
由上述表一至表四，以及实施例5可知：
实施例1的抗原产物符合QC标准，且热稳定性好，检测抗原合格(表一和表二)；
实施例4的抗原与抗体几乎不结合，抗原不合格(表三和表四)；
实施例5由于半抗原合成过程不反应，所以未得到相应的抗原(实施例5)。

Claims (6)

1.一种卡利普多人工抗原，其特征在于，其结构通式如下：
Figure FDA0002605299190000011
2.根据权利要求1所述的卡利普多人工抗原，其特征在于，大分子蛋白为牛血清白蛋白。
3.一种制备如权利要求1所述的卡利普多人工抗原的方法，其特征在于，通过琥珀酸酐在卡利普多N上衍生出羧基，通过羧基与蛋白质偶联得到卡利普多及其衍生物检测抗原，其反应式如下：
Figure FDA0002605299190000012
4.一种制备如权利要求1所述的卡利普多及其衍生物检测抗原的方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
(1)称取一定量的卡利普多于50ml的圆底烧瓶中，加入吡啶；搅拌均匀后，加入丁二酸酐或者戊二酸酐，在110℃下，搅拌过夜；反应结束后，用TLC检测，爬板展开剂的比例为DCM:MeOH＝10：1，原料点无紫外，碘缸显示有黄色点；产物点有紫外Rf＝0.8；后处理：将反应液通过水浴55℃减压旋蒸拉干后，残留物加入DCM溶解，溶解后加入纯化水，洗涤有机相三次，再用饱和氯化钠洗涤有机相一次，再用无水硫酸钠干燥有机相，最后用水浴45℃蒸干溶剂得粗品SOMA-1；粗品经过纯化过柱得产物A；其中，过柱的淋洗剂比例为PE:EA＝2:1；卡利普多：吡啶：丁二酸酐/戊二酸酐＝1:4.3:1.2-2.0；
(2)产物偶联载体蛋白
a.取一定量产物A溶于2mlDMF，浓度为50mg/ml，配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白；
b.在2ml×50mg/ml产物A中加入EDC、NHS，得产物B；其中，产物B:EDC:NHS＝1:1:1.12，室温搅拌8小时；
c.取a步骤中配置的PBS-BSA蛋白溶液20ml，然后滴入产物B，室温反应16小时，得到终产物卡利普多抗原，PBS透析3天，检测其浓度。
5.如权利要求1-4任意一项所述的卡利普多及其衍生物检测抗原在制备免疫检测试剂盒中的应用。
6.一种卡利普多胶体金检测试纸卡的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.用柠檬酸钠还原四氯化金制备直径在20-40nm的胶体金，然后将胶体金标记到卡利普多的抗体上，形成金标抗体，用λmax的吸光值(OD)来表示金标抗体的浓度；
S2.将金标抗体上样到金标机上，将一定OD值的金标抗体均匀地喷聚酯膜(金标垫)上，喷好后放入37度烘箱烘8h；切成合适的大小，放入装有干燥机的铝箔袋内，室温存放备用；
S3.将卡利普多抗原稀释到合适浓度，用点膜机点到硝酸纤维素膜上相应检测线位置，37度烘干12h；
S4.玻璃纤维经过缓冲液和表面活性的处理，37度烘干10h备用；
S5.按金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜，吸水纸，大卡组装成胶体金检测试纸卡。
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