CN112142838B - 一种卡利普多人工抗原及其多抗和应用 - Google Patents

一种卡利普多人工抗原及其多抗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种卡利普多人工抗原及其多抗和应用。一种卡利普多人工抗原KAL‑BSA，其特征在于对卡利普多进行化学修饰，偶联BSA获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原。抗卡利普多多克隆抗体，通过采集免疫卡利普多人工抗原KAL‑BSA的动物血清，再通过两步亲和层析法获得。修饰偶联后的KAL‑BSA免疫抗原特异性好，能刺激动物产生大量抗卡利普多多克隆抗体，而非其他不需要的抗体，为后续纯化提供便利。抗卡利普多多克隆抗体通过BSA亲和柱和BGG亲和柱的纯化，在不大幅降低抗体效价灵敏度的情况下，进一步提升灵敏度(检测限可达100ng/ml)，提高纯度。

Description

一种卡利普多人工抗原及其多抗和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种卡利普多人工抗原及其多抗和应用。
背景技术
卡利普多(Carisoprodol)是一种肌肉松弛剂类药物，主要用于治疗慢性背痛。卡利普多是一种临床处方药。在人体中卡利普多由CYP2C19酶通过N-脱烷基作用(N-dealkylation)转化为其活性代谢物氨甲丙二酯(眠尔通,安宁，meprobamate)。卡利普多代谢为其活性代谢物氨甲丙二酯的速度与CYP2C19酶多态性有关。CYP2C19基因多态性能影响卡利普多的药代动力学。
卡利普多的分子式：C12H24N2O4，分子量：260.33，CAS RN 78-44-4,其分子结构如式(I)：
Figure GDA0002798545550000011
式(I)
目前对卡利普多滥用的报道较为少见，但仍需引起注意，尤其是对那些有物质依赖倾向的患者。尽管卡利普多在治疗背痛和活化患者方面被证明很有效，但其被滥用的潜力和其过量服用的毒副作用却也招致很多批评。卡利普多常见的副作用包括头晕、嗜睡、恶心和心理损伤。
目前市面上没有可用于检测卡利普多的快速诊断试纸，也没有可用的卡利普多免疫抗原以及高效价，特异性强的抗卡利普多多克隆抗体。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种卡利普多人工抗原。
卡利普多本身分子量太小，不具有免疫原，即缺乏T细胞表位而无法诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对卡利普多进行修饰，偶联BSA(牛血清白蛋白)，获得能诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体的人工抗原。
卡利普多人工抗原KAL-BSA的合成方法，具体如下：
步骤(1)、碳化二亚胺EDC交联剂平衡到室温；
步骤(2)、将BSA(牛血清白蛋白)加入到偶联缓冲液，得到载有BSA的偶联缓冲液；其中偶联缓冲液为0.1M MES，其pH值为4.8-5.0；
步骤(3)、将卡利普多半抗原溶解到载有BSA的偶联缓冲液，用以导入载体蛋白BSA；
步骤(4)、将EDC加入到上述卡利普半抗原和BSA混合的偶联缓冲液中；
步骤(5)、室温反应2小时，用脱盐柱纯化偶联蛋白，获得KAL-BSA；
步骤(6)、无菌过滤后-20℃保存。
本发明的第二个目的是提供高效价、特异性强的抗卡利普多多克隆抗体。KAL-BSA免疫新西兰大耳兔过程中，不仅产生了抗卡利普多多克隆抗体，也会产生抗BSA抗体及其他杂蛋白，影响最终抗体的特异性和纯度。
本发明采用创新的两步亲和层析法，可在不大影响抗卡利普多多克隆抗体效价，灵敏度同时进一步提升其特异性及纯度，使其能更好的应用于检测卡利普多胶体金免疫诊断试纸条。
抗卡利普多多克隆抗体的制备方法如下：
步骤(1)、将人工抗原KAL-BSA稀释，与佐剂混合后对动物进行多次免疫；
步骤(2)、采集免疫动物的血清，用ELISA测定血清效价，效价不达标继续免疫，达标的话进行下一步纯化；
步骤(3)、制备偶联BSA大分子的亲和柱以及偶联BGG大分子的亲和柱；
具体是将100mlGE-Sepharose-4B填充胶用溴化氢活化，然后等量分成两份；分别将BSA和BGG蛋白溶于0.01M碳酸盐缓冲液(pH＝9.6),立刻加入到活化好的填充胶中，搅拌均匀后过夜；然后用乙醇胺封闭，0.01M PBS冲洗平衡。
步骤(4)、血清用硫酸铵纯化后获得抗体半成品；
步骤(5)、将获得的抗体半成品过BSA亲和柱和BGG亲和柱，收集流穿液，中间用ELISA测定效价及抑制率；
步骤(6)、流穿液浓缩后透析多次，收集测定浓度体积，-20℃保存。
本发明的第三个目的是提供上述抗卡利普多多克隆抗体制备卡利普多检测试剂盒中的应用；或在制备用于检测卡利普多的试纸条中的应用。
进一步的，所述的用于检测卡利普多的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫，标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗卡利普多的多克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有卡利普多-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。
本发明的试纸条也是以竞争抑制原理制备的，卡利普多-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗卡利普多多克隆抗体对卡利普多的检测限为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有卡利普多且检测卡利普多的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中卡利普多的含量低于检限，或待测样品中无卡利普多；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.修饰偶联后的KAL-BSA免疫抗原特异性好，能刺激动物产生大量抗卡利普多多克隆抗体，而非其他不需要的抗体，为后续纯化提供便利。
2.免疫获得的抗卡利普多抗体，通过BSA亲和柱和BGG亲和柱的纯化，在不大幅降低抗体效价灵敏度的情况下，进一步提升灵敏度(检测限可达100ng/ml)，提高纯度。
附图说明
图1为卡利普多胶体金检测试纸条。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1卡利普多免疫抗原的制备
1.溶液准备
(1).载体蛋白：10mgBSA(牛血清白蛋白)，采购自SIGMA
(2).偶联缓冲液：0.1M MES PH4.8-5.0
(3).EDC 50mg
(4).半抗原：卡利普多10mg
(5).脱盐柱
2.实验过程
(1).平衡EDC至室温，将10mgBSA加入到1000ul偶联缓冲液，搅拌均匀至完全溶解。
(2).溶解10mg卡利普多半抗原至2500ul偶联缓冲液，搅拌均匀，在加入到1000ul的载体蛋白中，并继续搅拌。
(3).将50mgEDC溶解到5ml超纯水，溶解后立即取500ul该溶液到载体-半抗原溶液中，同时观察溶液状态，若有沉淀产生，则减少EDC的用量。
(4).室温反应2小时，然后12000转离心15分钟取上清，再用脱盐柱纯化偶联蛋白。
(5).透析收样，将溶液12000转离心后取上清，测定浓度，无菌过滤后-20℃保存。
实施例2抗卡利普多多克隆抗体的制备
1.动物免疫及血清采集
(1-1).本发明需要健康新西兰大耳兔，采购自杭州余杭科丰兔业专业合作社，8周以上。
(1-2).本发明所需佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(SIGMA，货号：F5506-10ml)，初次免疫以弗氏完全佐剂和所述免疫原按照体积比1:1混合，免疫计量为500ug。后续采用弗氏不完全佐剂，免疫计量为500ug。
所述佐剂是非特异性免疫增强剂，佐剂增强免疫应答的机制是通过改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原的递呈能力；刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力。当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种；例如氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂是目前动物试验中最常用佐剂。
(1-3).本发明采用脊背皮下5点免疫，免疫周期前四针间隔一周，后面间隔两周，后期可以持续获得大量抗卡利普多抗体。
两次注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。作为优选，本发明所述制备方法每次免疫前四针缩短为间隔一周，可快速激发免疫应答反应，使效价快速提高，同时缩短了制备抗体所需时间。
(1-4).免疫抗原一周以后，使用3ml注射器采集兔耳动脉血，一次采集6毫升血。4℃冰箱静止4小时以上，6000转离心5分钟，取上血清备用。
2.血清的ELISA测定
(2-1).用0.01M PH7.4的PBS缓冲液稀释KAL-BSA至1ug/ml,96孔酶标板每孔中分别加入100ul稀释后的KAL-BSA抗原，4℃包被过夜。第二天每孔加300μL的1％的BSA(TBST配制)进行封闭，置37℃孵育6小时，之后弃封闭液。
(2-2).将50ul浓度为100ng/ml卡利普多标准品加入纵向一排酶标孔中，再将采集获得的抗卡利普多多克隆抗体血清样品稀释1000倍,再1:3倍比稀释，每孔100ul。最后留一个对照孔，取50μL加入含有标准品的纵向酶标孔中。
(2-3).向原先倍比稀释的孔加入50ul 0.01PBS作为对照。
(2-4).36℃～38℃条件下温育30min，洗涤3次后加入酶标记二抗，36℃～38℃条件下温育30min，洗涤后，加显色液显色，最后终止反应。所述酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的二抗，显色液为TMB显色液。
(2-5).在450nm下测定其OD值，竞争抑制率的计算式为：
Figure GDA0002798545550000051
表1各稀释倍数下竞争抑制ELISA结果
稀释倍数 对照OD值 竞争抑制OD值 竞争抑制率
1：1000 2.077 0.824 60.32％
1：3000 1.877 0.732 61.00％
1：9000 1.522 0.683 55.12％
1：27000 1.143 0.521 54.41％
1：81000 0.872 0.398 54.35％
1：243000 0.678 0.301 55.60％
1：729000 0.587 0.273 53.49％
对照PBS 0.050 0.047 无
(2-6).由表1可见免疫后采集的血清可测效价达到1：729000以上，综合抑制率在55％左右。
3.多克隆抗体纯化
(3-1).亲和柱制备：将100mlGE-Sepharose-4B填充胶用溴化氢活化，然后等量分成两份。分别将BSA和BGG蛋白溶于0.01M碳酸盐缓冲液PH＝9.6,立刻加入到活化好的填充胶中，搅拌均匀后过夜。第二天用乙醇胺封闭，0.01M PBS冲洗平衡后备用。
(3-2)用浓度为0.01M PH7.4的PB，流速以60mL/h对BSA亲和层析柱进行预处理；将50％饱和硫酸铵处理的抗卡利普多多抗蛋白溶液加入预处理的层析柱中，之后用100mL浓度为0.01M PH7.4的PB以流速60mL/h流穿，接紫外检测仪，待度数在10以上后接取流穿液，度数回落到10以下后停止接取。
(3-3).流穿后的蛋白溶液用50％饱和硫酸铵溶液浓缩，然后在浓度为0.01MPH7.4的PB溶液总透析3次，每次6小时以上。亲和柱用PH2.5，0.1M的glycine-HCl将绑定在上面的杂蛋白洗脱下来，然后再用0.01M PH7.4的PB清洗平衡。
(3-4).将收集完成的蛋白稀释至1ug/ml，做ELISA检测，方法如实施例2.2，结果见表2.
表2 BSA亲和柱纯化后各稀释倍数下竞争抑制ELISA结果
稀释倍数 对照OD值 竞争抑制OD值 竞争抑制率
1：1 1.988 0.585 70.57％
1：3 1.781 0.525 70.52％
1：9 1.502 0.460 69.37％
1：27 1.103 0.377 65.82％
1：81 0.799 0.241 69.83％
1：243 0.654 0.201 69.26％
1：729 0.498 0.175 64.85％
对照PBS 0.059 0.044 无
由表2分析得到，BSA亲和柱纯化后的抗体可测效价依然达到1：729000以上，综合抑制率在70％左右，抗体效价没有明显下降，且抑制率显著提升。
(3-5).用浓度为0.01M PH7.4的PB，流速以60mL/h对BGG亲和层析柱进行预处理；将BSA亲和柱处理完的抗卡利普多多克隆抗体蛋白溶液加入预处理的层析柱中，之后用100mL浓度为0.01M PH7.4的PB以流速60mL/h流穿，接紫外检测仪，待度数在10以上后接取流穿液，度数回落到10以下后停止接取。
(3-6).流穿后的蛋白溶液用50％饱和硫酸铵溶液浓缩，然后在浓度为0.01MPH7.4的PB溶液总透析3次，每次6小时以上。亲和柱用PH2.5，0.1M的glycine-HCl将绑定在上面的杂蛋白洗脱下来，然后再用0.01M PH7.4的PB清洗平衡。
(3-7).将收集完成的蛋白稀释至1ug/ml，做ELISA检测，方法如实施例2.2，结果见表3。
表3 BGG亲和柱纯化后各稀释倍数下竞争抑制ELISA结果
Figure GDA0002798545550000061
Figure GDA0002798545550000071
由表3分析得到，BSA亲和柱纯化后的抗体可测效价依然达到1：729000以上，综合抑制率在87％左右，抗体效价有少许下降，但是抑制率显著提升。
(3-8).将最后纯化完成的抗体于-20℃保存。
实施例3抗卡利普多多克隆抗体在快速诊断试纸条中的应用
1.本发明纯化得到的抗卡利普多多克隆抗体可应用于一种卡利普多胶体金检测试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗卡利普多的多克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有卡利普多-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。具体见图1。
2.检测时，室温下将试纸条样品垫的一端***待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线，等待10分钟后肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。
3.若只有C线显色，表示待测样品中含卡利普多且检测卡利普多的含量高于100ng/ml；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测卡利普多的含量低于100ng/ml；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
4.试纸条的制备方法为本领域的常规方法，本实施例仅做应用说明。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种抗卡利普多多克隆抗体，其特征在于通过采集免疫卡利普多人工抗原KAL-BSA的动物血清，再通过两步亲和层析法获得；其中所述的两步亲和层析法采用的亲和层是偶联BSA大分子的亲和柱以及偶联BGG大分子的亲和柱；
所述卡利普多人工抗原KAL-BSA，是对卡利普多进行化学修饰，偶联牛血清白蛋白BSA获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原。
2.一种抗卡利普多多克隆抗体的合成方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤（1）、将卡利普多人工抗原KAL-BSA稀释，与佐剂混合后对动物进行多次免疫；所述卡利普多人工抗原KAL-BSA，是对卡利普多进行化学修饰，偶联牛血清白蛋白BSA获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原；
步骤（2）、采集免疫动物的血清，用硫酸铵纯化后获得抗体半成品；
步骤（3）、将获得的抗体半成品依次过偶联BSA大分子的亲和柱以及偶联BGG大分子的亲和柱；收集流穿液，浓缩后透析多次。
3.如权利要求2所述的一种抗卡利普多多克隆抗体的合成方法，其特征在于偶联BSA大分子的亲和柱以及偶联BGG大分子的亲和柱的制备工艺具体是将100mlGE-Sepharose-4B填充胶用溴化氢活化，然后等量分成两份；分别将BSA和BGG蛋白溶于pH=9.6 0.01M碳酸盐缓冲液,立刻加入到活化好的填充胶中，搅拌均匀后过夜；然后用乙醇胺封闭，0.01M PBS冲洗平衡。
4.如权利要求1所述的一种抗卡利普多多克隆抗体在制备卡利普多检测试剂盒中的应用。
5.如权利要求1所述的一种抗卡利普多多克隆抗体在制备检测卡利普多的试纸条中的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于检测阈值达到100ng/ml。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的用于检测卡利普多的试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的抗卡利普多多克隆抗体，所述反应膜的检测线处包被有卡利普多-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线处包被有二抗。
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