CN111903839A - 一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及其制备方法与应用 - Google Patents
一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及其制备方法，属于饲料技术领域，先将稻壳粉、玉米粉、豆粕、麸皮、红糖、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母按比例先后混匀经过一次固态发酵制得酵素A，其次将稻壳粉、玉米粉、豆粕、麸皮、钙粉、酵素A、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌按比例先后混匀经二次固态发酵并加入抗菌肽制剂制得复合菌发酵饲料，该种饲料通过特定配比及特定工艺达到菌种间最优协同作用，保障了各类菌种的代谢特点，最大程度地积累了各种微生物抑制动物肠道致病细菌的活性产物，改善了饲料的理化性状，适口性及营养价值，解决了饲料污染问题，达到了预防细菌性肠道疾病及动物肠道健康保健的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及饲料技术领域，具体涉及一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及其制备方法与应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，肉食品消费增加，其质量越来越受到消费者的关注，致使位于养殖前端的饲料质量也愈来愈受重视。目前，国内市场上出现了一些发酵饲料产品，发酵饲料主要通过微生物的发酵作用改变饲料的理化性状，增加适口性及营养价值，促进动物消化吸收、减少饲养畜产品的成本和环境污染，进一步提高饲料使用价值。
但因饲料的原料类别广泛、可利用的微生物种类多且微生物的组合配比差异比较大，在发酵饲料生产工艺、产品质量上仍有很大的提升空间。霉菌毒素污染一直是饲料安全的重大隐患，尤其是发酵饲料在高湿度的生产和保存过程中容易受到霉菌污染，饲料受到霉菌毒素污染后，会导致动物腹泻呕吐、生产性能下降、免疫功能抑制和繁殖机能障碍，严重者甚至死亡。
发明内容
本发明的目的在于：为解决以上如何优化生产工艺、提升饲料产品质量以及霉菌和霉菌毒素对饲料污染的技术问题，本发明提供一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及制备方法与应用。该复合菌发酵饲料保障了各类菌种的代谢特点，最大程度地积累了各种微生物抑制动物肠道致病细菌的活性产物，能有效改善饲料的理化性状，适口性及营养价值，达到了预防细菌性肠道疾病及动物肠道健康保健的有益效果，有效解决了饲料污染安全问题。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，制备该复合菌发酵饲料的原料包括营养基质原料、用于固态堆积发酵的益生菌复合菌种及由枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽及其代谢物。
进一步地，该复合菌发酵饲料营养基质原料组成及抗菌肽的重量百分比含量分别为：稻壳粉44％，玉米粉20％，豆粕10％，麸皮5％，钙粉4.75％，酵素A15％，红糖0.25％，抗菌肽1％。
具体地，由于抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的多肽物质，其可以通过基因工程技术，利用益生菌高产量、强特异性表达获得，抗菌肽可以通过与黄曲霉、赭曲霉等饲料中常见霉菌表面甲壳素分子亲和，抑制霉菌生长和繁殖，在复合菌发酵饲料的生产制备过程中我们有效的利用了抗菌肽特点及功效。
具体地，所述的抗菌肽包括由枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽及其代谢物，抗菌肽是一种含氨基酸序列为“Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu”的蜜蜂抗菌肽，该蜜蜂抗菌肽是经基因工程编辑技术构建至枯草芽孢杆菌分泌表达所得，在本方案中，所述的抗菌肽及其代谢物通过基因工程编辑技术，将表达的基因成功构建至枯草芽孢杆菌，然后该枯草芽孢杆菌经高密度液态发酵，添加载体，并经喷雾干燥制成抗菌肽及枯草芽孢杆菌代谢物的菌剂。
进一步地，所述的营养基质原料组分酵素A由营养基质原料、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母经固态发酵制备而成，酵素A的营养基质原料组成及重量百分比含量为：稻壳粉45％，玉米粉20％，豆粕20％，麸皮14.75％，红糖0.25％。
进一步地，所述的用于发酵的复合菌种原料包括以下菌种及各菌种的活菌数为：嗜酸乳杆菌，其活菌数≥2×1011CFU/g，酿酒酵母，其活菌数≥1×1011CFU/g，枯草芽孢杆菌，其活菌数≥1×1011CFU/g和地衣芽孢杆菌，其活菌数≥1×1011CFU/g。
一种如上所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料的制备方法，包括以下步骤：
第一步，一次发酵制备酵素A：取45％的稻壳粉，20％的玉米粉，20％的豆粕，14.75％的麸皮，以上原料所取的量均为重量百分比含量，混合粉碎过筛，筛子的过滤孔径为40目，将红糖重量百分占比为0.25％用开水进行溶解，将溶解好的红糖水加入过筛后的混合基质原料中，并加入与总混合基质原料的重量占比为35～40％的水搅拌，向混匀后的营养基质原料中接入嗜酸乳杆菌、酿酒酵母，每一菌种的接入量与总干粉的重量占比为1％，接入菌种后，搅拌混匀成松散状基料，以每1000kg基料为一堆为标准，分别分堆堆积开始固态发酵，保持堆积环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋总基料0.5％的无菌水保湿，固态堆积发酵20～24h后即制得酵素A，以上原料所取的量均为与总营养基质原料的重量百分比含量；
第二步，第二次发酵制备复合菌发酵饲料：分别取44％的稻壳粉、20％的玉米粉、10％的豆粕、5％的麸皮、4.75％的钙粉、15％的酵素A，以上原料所取的量均为重量百分占比，混合粉碎过筛，筛子的过滤孔径为40目，将红糖重量百分占比为0.25％用开水进行溶解，将溶解好的红糖水加入过筛后的干料中，并加入与总混合基质原料的重量占比为35～40％水搅拌，向混匀后的营养基质原料中接入枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，每一菌种的接入量与总干粉的重量占比为0.8～2％，接入菌种后，搅拌混匀成松散状基料，以每1000kg基料为一堆为标准，分堆堆积开始固态发酵，保持堆积环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋总基料0.5％的无菌水保湿，固态堆积发酵56～60h后，向发酵饲料中加入发酵饲料重要占比为1％的抗菌肽及其代谢物，即制得复合菌发酵饲料，以上原料所取的百分含量均为与总营养基质原料的重量百分比含量。
可选地，向固态发酵营养基质中接种时活化条件为：10kg千亿级菌剂溶于37℃温水中进行活化2～4h。
可选地，该方案所采用的固态发酵方法为通风环境下物料的堆积发酵，每1000kg物料为一堆堆放在室内并保持环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋5kg无菌水保湿。
一种颗粒饲料，该颗粒饲料组分包括基础饲料和如前所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料。
可选地，所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料占基础饲料重量的2～8％。例如，反刍动物按所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料占比基础饲料重量的2～4％进行添加，与基础饲料混合配制成反刍动物颗粒饲料，猪按所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料占比基础饲料重量的4～5％进行添加，与基础饲料混合配制成猪饲料，禽按所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料占比基础饲料重量的3～5％进行添加，与基础饲料混合配制成禽类颗粒饲料。
该发酵饲料及系列产物对动物细菌性肠道疾病有优良的预防效果，尤其对如孕马、牦牛等在养殖过程中具有较高死亡率的特殊经济动物有良好的控制效果。
与现有技术相比，本发明具有以下创新性操作及有益效果：
本发明在第一次发酵制备酵素A步骤中先加入了嗜酸乳杆菌(≥2×1011CFU/g)和酿酒酵母(≥1×1011CFU/g)两种菌种，酿酒酵母通过代谢多种酶系对营养基质中的营养物进行初消化，代谢生成多种蛋白质、核酸、维生素、多糖等物质，为后续发酵和饲料应用提供丰富的蛋白质酶、淀粉酶等酶系；同时嗜酸乳杆菌容易培养，在堆积发酵过程中有发酵启动快、能分泌嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(1aetocidon)等因子,对肠道致病菌进行拮抗抑制，保证发酵过程和饲料应用中无致病细菌的污染和滋生，通过在在第二轮发酵过程中，接种枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，可以大幅提升芽孢杆菌类益生菌的有效活菌数并积累芽孢杆菌多肽等抑菌物质，为发酵饲料实现预防细菌性肠道疾病提供了抑菌活性成分的保障，且进一步补充芽孢杆菌多肽、脂肪酶等消化酶类，提高益生菌活菌数和协同配伍。整套活菌配伍应用于动物饲料，使其进入动物肠道中复苏增殖、发挥益生特性，包括改善动物肠道菌群、增强机体免疫力以及提供多种动物所需的酶类等，可以弥补动物体内源酶的不足，促进动物的生长发育，具有显著的益生作用。
本发明所采用的嗜酸乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组合具有优良的协同效应，通过二轮发酵最优地保障了各类菌种代谢特点，最大程度地积累了各种益生菌抑制动物肠道致病细菌的活性产物，有效的改善了饲料的理化性状，适口性及营养价值。在第二轮发酵的最后加入由枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽及其代谢物，通过抗菌肽保证了发酵饲料不发霉、不产霉菌毒素这一特性，有效的解决生产过程中霉菌和霉菌毒素对饲料的污染的问题，进一步的达到了预防细菌性肠道疾病的目的及最优的动物肠道保健效果。制备的复合菌发酵饲料通过长期饲喂动物，还可预防由细菌病原体引起的腹泻等肠道疾病，同时有助于提高动物的采食量和饲料利用率。
附图说明
图1为一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料的制备方法流程图；
图2为一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料6个月保质期内的生化指标；
图3为一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料6个月保质期内的菌种鉴定及活菌计数结果，其中，(a)为LB琼脂平板上枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌菌落照片；(b)为MRS琼脂平板上嗜酸乳杆菌及酿酒酵母菌落照片；(c)为6个月内每月活菌计数结果；
图4为一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料6个月保质期内霉菌毒素的检测结果。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1
一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，制备该复合菌发酵饲料的原料包括营养基质原料、用于固态堆积发酵的益生菌复合菌种及由枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽及其代谢物，1000kg基质营养原料组成成分及重量分别为：稻壳粉440kg、玉米粉200kg、豆粕100kg、麸皮50kg、钙粉47.5kg、酵素A150kg、红糖2.5kg，由枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽及其代谢物10kg，用于固态堆积发酵过程的益生菌复合菌种种类及重量分别为：嗜酸乳杆菌10kg、酿酒酵母10kg、枯草芽孢杆菌10kg、地衣芽孢杆菌10kg。酵素A由营养基质原料、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母经固态发酵而成，营养基质原料重量为1000kg时，各组分及重量分别为：稻壳粉450kg，玉米粉200kg，豆粕200kg，麸皮147.5kg，红糖2.5kg，嗜酸乳杆菌10kg、酿酒酵母10kg。该部分主要是对制备工艺用的优质酵素A及复合菌饲料的原料组成及重量百分比含量情况进行一个阐释。
实施例2
首先，1000kg营养基质原料一次发酵制备酵素A：分别称取稻壳粉450kg，玉米粉200kg，豆粕200kg，麸皮147.5kg，混合粉碎过筛，筛子的过滤孔径为40目，然后再称取红糖2.5kg用开水进行溶解，将溶解好的红糖水加入过筛后的营养基质原料混料中，并加入与营养基质原料混料的重量占比为35～40％水搅拌，向搅拌混匀后的营养基质原料中接入嗜酸乳杆菌、酿酒酵母，每一菌种的接入量的重量为10kg，接入菌种后，搅拌混匀成松散状基料，以每1000kg基料分一堆为标准，分别分堆堆积开始固态发酵，本实施例只有一堆，保持堆积环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋5kg无菌水保湿，固态堆积发酵20～24h后即制得酵素A。该步骤为制备工艺用优质酵素A的一个具体实施步骤，在该步骤中，在常规的营养基质原料进行混合后，加入了两种优选的益生菌嗜酸乳杆菌及酿酒酵母，充分利用其代谢特点，接种前需对菌种进行活化，活化条件将菌剂于37℃温水中进行活化2～4h，而后经过固态堆积发酵得到酵素A；
其次，1000kg原料二次发酵制备复合菌发酵饲料：稻壳粉440kg，玉米粉200kg，豆粕100kg，麸皮50kg，钙粉47.5kg，酵素A150kg，混合粉碎过筛，筛子的过滤孔径为40目，将红糖2.5kg用开水进行溶解，将溶解好的红糖水加入过筛后的干料中，并加入与营养基质原料混料的35～40％水搅拌，向混匀后的营养基质原料中接入枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，每一菌种的接入量与总干粉的重量为10kg，接入菌种后，搅拌混匀成松散状基料，以每1000kg搅拌混匀后的基料为一堆为标准，分堆堆积开始固态发酵，保持堆积环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋5kg无菌水保湿，固态堆积发酵56～60h后，向发酵饲料中加入抗菌肽及其代谢物10kg，即制得所述的复合菌发酵饲料。
实施例3
一种颗粒饲料，由基础饲料和复合菌发酵饲料混合配制而成。该实施方式是将复合菌发酵饲料作为制作颗粒饲料的添加剂，1000kg的基础饲料加入复合菌发酵饲料20kg，最终制得1020kg的所述颗粒饲料，可选地，1000kg的基础饲料需加入复合菌发酵饲料80kg，最终可制得1080kg的所述颗粒饲料，依据饲养不同的动物，进行不同的混合配比。
实施例4
通过实施例2的制备方法所得到的复合菌发酵饲料和通过实施例3所配制得到的颗粒饲料，均可应用于马、牛、羊、猪、禽的饲养过程中，尤其对如孕马、牦牛等在养殖过程中具有较高死亡率的特殊经济动物有良好的控制效果，该复合菌发酵饲料通过长期饲喂动物，还可预防由细菌病原体引起的腹泻等肠道疾病，同时有助于提高动物的采食量和饲料利用率。
实施例5
为了进一步证明本发明提供如前所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及其制备方法的有益效果，进一步进行了如下测试：
参考GB/T14924.9-2001中提供的实验动物配合饲料常规营养成分测定方法，对6个月保质期内复合菌发酵饲料的水分、粗蛋白、粗灰分、粗纤维、钙、磷含量进行检测，检测间隔为1个月，每次检测做6个平行，取6个月检测结果的平均值为最终结果。检测结果表明：复合菌发酵饲料的水分含量为(23.78±1.84)％，粗蛋白含量为(13.10±0.31)％，粗灰分含量为(6.94±0.16)％，粗纤维含量为(1.56±0.21)％，钙含量为(1.56±0.05)％，磷含量为(0.54±0.04)％。
采用平板菌落计数法检测6个月保质期内复合菌发酵饲料的活菌数变化状况。从制成成品第一个月起，每隔1月取复合菌发酵饲料0.1g,梯度稀释至10-5，分别取100ul涂布于LB营养琼脂培养基和MRS琼脂培养基，37℃培养12h,选择菌落清晰、计数明确的平板进行分类计数，根据菌落形态及显微镜镜检(革兰氏染色)观察结果。每次检测做3组平行，取6个月检测结果的平均值为最终结果。测试结果表明：6个月保质期内LB营养琼脂培养基上含枯草芽孢杆菌活菌数为(4.45±1.04)×108CFU/g，含地衣芽孢杆菌活菌数为(4.04±0.73)×108CFU/g，MRS琼脂培养基上含酿酒酵母菌活菌数为(2.01±0.34)×108CFU/g，含嗜酸乳杆菌活菌数为(8.10±1.01)×108CFU/g，总活菌数为(1.86±0.04)×109CFU/g。
采购青岛普瑞邦生物工程有限公司的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1)和赭曲霉毒素(Ochratoxin)的酶联免疫分析(ELISA)试剂盒。按试剂盒说明对6个月保质期内复合菌发酵饲料的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素含量进行检测，检测间隔为1个月，每次检测做3组平行，取6个月检测结果的平均值为最终结果。测试结果表明结果显示：6个月内黄曲霉毒素B1的含量为(3.43±0.08)ppb,赭曲霉素的含量为(0.33±0.03)ppb，均低于国家饲料卫生标准中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素的最高限量(Aflatoxin B1≤10ppb,Ochratoxin≤100ppb),完全符合出厂规格。
以上检测结果均表明本发明提供的如前所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料及其制备方法解决了现有技术中的存在的问题，有效改善了饲料的理化性状，适口性及营养价值，解决了饲料生产过程中霉菌和霉菌毒素污染问题，具有良好的有益效果。
Claims (10)
1.一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，其特征在于，所述复合菌发酵饲料包括营养基质原料、益生菌复合菌种及抗菌肽，所述的益生菌复合菌种包括：嗜酸乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，其特征在于，所述复合菌发酵饲料的营养基质原料组成、抗菌肽的重量百分比含量分别为：稻壳粉44％，玉米粉20％，豆粕10％，麸皮5％，钙粉4.75％，酵素A15％，红糖0.25％，抗菌肽1％。
3.根据权利要求1所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌的活菌数≥2×1011CFU/g，酿酒酵母的活菌数≥1×1011CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥1×1011CFU/g)和地衣芽孢杆菌活菌数≥1×1011CFU/g，各菌种的重量百分比接种量为1％。
4.根据权利要求2所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，其特征在于，所述酵素A由营养基质原料、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母经固态发酵制备而成，酵素A的营养基质原料组成及重量百分比含量分别为：稻壳粉45％，玉米粉20％，豆粕20％，麸皮14.75％，红糖0.25％。
5.根据权利要求1所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，其特征在于，所述抗菌肽是由枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽及其代谢物，所述抗菌肽是一种含氨基酸序列“Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu”的蜜蜂抗菌肽。
6.基于权利要求1-5任意一项所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，一次发酵制备酵素A：取45％的稻壳粉、20％的玉米粉、20％的豆粕、14.75％的麸皮，混合粉碎过筛，筛子的过滤孔径为40目，将0.25％红糖用开水进行溶解，将溶解好的红糖水加入过筛后的干料中，并加入35～40％的水搅拌，向混匀后的营养基质原料中接入嗜酸乳杆菌、酿酒酵母，每一菌种的接入量为1％，接入菌种后，搅拌混匀成松散状基料，以每1000kg基料为一堆为标准，分别分堆堆积开始固态发酵，保持堆积环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋0.5％的无菌水保湿，固态堆积发酵20～24h后即制得酵素A，以上原料所取的百分量均为与总营养基质原料的重量百分比含量；
第二步，第二次发酵制备复合菌发酵饲料：取44％的稻壳粉、20％的玉米粉、10％的豆粕、5％的麸皮、4.75％的钙粉、15％的酵素A，混合粉碎过筛，筛子的过滤孔径为40目，称取0.25％的红糖用开水进行溶解，将溶解好的红糖水加入过筛后的干料中，并加入与与营养基质原料混料的重量占比为35～40％的水搅拌，向混匀后的营养基质原料中接入枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，每一菌种的接入量为1％，接入菌种后，搅拌混匀成松散状基料，以每1000kg基料为一堆为标准，分堆堆积开始固态发酵，保持堆积环境通风，发酵温度控制在35～42℃，当发酵温度达45℃时翻料一次并于每次翻料后表面喷淋0.5％的无菌水保湿，固态堆积发酵56～60h后，向发酵饲料中加入1％的抗菌肽及其代谢物，即制得复合菌发酵饲料，以上各原料所取的百分量均为与总营养基质原料的重量百分比含量。
7.根据权利要求6所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述制备方法经过二次固态发酵过程完成，先通过第一次发酵制备酵素A，再通过第二次发酵制备得复合菌发酵饲料。
8.根据权利要求6所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中，各益生菌复合菌种与总营养基质原料的重量百分比接种量为1％。
9.根据权利要求6所述的一种预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料的制备方法，其特征在于，经所述的二次固态堆积发酵过程，该复合菌发酵饲料在保质期6个月内不得检出霉菌，且黄曲霉毒素B1的检出浓度小于等于5.0ppb，赭曲霉毒素的检出浓度小于等于1.0ppb。
10.一种颗粒饲料，其特征在于，包括基础饲料和如权利要求1～5任一项所述的预防细菌性肠道疾病的复合菌发酵饲料，所述的复合菌发酵饲料及颗粒饲料应用于马、牛、羊、猪、禽的饲养过程中。
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