CN103013890B - 一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法 - Google Patents

一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法 Download PDF

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本发明公开了一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法，是将植物乳杆菌与枯草芽孢杆按重量比1%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养18小时收获；或将干酪乳杆菌与枯草芽孢杆按重量比1.5%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养24小时收获。本发明特别适合于微生态制剂的液体发酵生产，其显著的优点是：将乳酸杆菌和芽孢杆菌进行混合发酵，充分发挥菌株间的协同作用，对乳酸菌的有氧代谢提供保护，提高了设备利用率。

Description

一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法
技术领域
本发明涉及一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养方法，尤其涉及一种植物乳杆菌或干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌条件优化的混合培养方法，属于生物技术领域。
背景技术
微生态制剂是指被添加到饲料中的一种重要肠道菌群调节剂，又称益生菌剂，具有调整肠道菌群平衡、促进机体免疫、改善饲料适口性、提高饲料利用率、增强动物抗病能力等作用，作为饲料添加抗生素的替代品已得到养殖业的认可。1989年美国食品药物管理局（FAD）和美国饲料公协会（AAFCO）公布了44种可直接饲喂且通常认为是安全的微生物作为微生态制剂生产菌株，其中包括28种乳酸菌、2种芽孢菌、2种酵母菌和2种曲霉。2008年12月我国农业部1126号公告规定的可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂共16种，如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、德氏乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母、产魭假丝酵母。
微生态制剂通常由多种微生物组成，是一种混合活菌制剂。目前应用于畜禽养殖业的微生态制剂主要是乳酸菌和芽孢杆菌。乳酸菌为兼性厌氧菌、芽孢杆菌为好氧菌，并且两者的生长特性及营养要求差异很大，传统的工业发酵中通常采用单独培养、然后再混合的生产工艺，由此导致设备利用率低，生产成本增加。研究表明，饲喂芽孢菌的动物，其肠道及粪便中乳酸菌数量增加，说明芽孢菌对乳酸菌的生长有促进作用；目前有报道，有些乳杆菌在有氧条件下生物量提高，在有血红素等物质存在下，可激活其过氧化氢酶，降低氧胁迫，菌体存活性延长。枯草芽孢杆菌为好氧菌，能产生多种过氧化物酶，对氧胁迫有完善的防御机制。基于此理论，研发植物乳杆菌或干酪乳杆菌与枯草芽孢杆菌混合培养的优化工艺条件，为微生态制剂的混合菌群发酵提供参考具有重要意义。
发明内容
针对现有生产工艺的不足，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌或干酪乳杆菌与枯草芽孢杆菌条件优化的混合培养方法。
本发明所述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法，步骤是：
（1）取指数生长后期至稳定期后期的植物乳杆菌或干酪乳杆菌菌株分别接种到MRS培养基中，37±1℃静止培养12±2小时；
（2）取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌菌株接种到LB培养基中，37±1℃、220rpm震荡培养12±2小时；
（3）将步骤（1）制得的植物乳杆菌与步骤（2）制得的枯草芽孢杆按重量比1%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37±1℃、220rpm震荡培养18±1小时收获；或将步骤（1）制得的干酪乳杆菌与步骤（2）制得的枯草芽孢杆按重量比1.5%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37±1℃、220rpm震荡培养24±1小时收获。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中：所述植物乳杆菌优选植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC No.6888；所述干酪乳杆菌优选干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393(pL251)；所述枯草芽孢杆菌优选B.subtilis ATCC23857。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中，所述MRS培养基的配方如下：
121℃条件下灭菌15分钟。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中，所述LB培养基的配方是：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，琼脂1.5-2g，水100ml。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中，所述MRS-Ca培养基的配方是：在MRS培养基上，加入终重量百分比浓度为0.02%的CaCl2。
一种应用于上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法的植物乳杆菌，所述菌株命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）K2，分离自新疆传统发酵酸奶，申请人已于2012年11月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.6888。
本发明公开了一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法，特别适合于微生态制剂的液体发酵生产。本发明显著的优点是：将乳酸杆菌和芽孢杆菌进行混合发酵，充分发挥菌株间的协同作用，对乳酸菌的有氧代谢提供保护，提高了设备利用率。
附图说明
图1所示，Lb.plantarum CGMCC6888和B.subtilis ATCC23857、Lb.casei ATCC393（pL215）和B.subtilis ATCC23857分别按照1%+10%和1.5%+10%接种比例接种于MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养的生长曲线，并与单独菌株培养时做比较。
其中：B.subtilis ATCC23857与Lb.plantarum CGMCC6888混合培养（■）、B.subtilisATCC23857与Lb.casei ATCC393（pL215）混合培养（▲）、B.subtilis ATCC23857单独培养（●）、Lb.plantarum CGMCC6888单独培养（□）、Lb.casei ATCC393（pL215）单独培养（△）的生长曲线。
图2Lb.plantarum CGMCC6888和B.subtilis ATCC23857、Lb.casei ATCC393（pL215）和B.subtilis ATCC23857按照附图1的比例接种于MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h、18h和24h时，植物乳杆菌、干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的活菌数。
其中：（a）Lb.plantarum CGMCC6888或Lb.caseiATCC393（pL215）活菌数；（b）B.subtilisATCC23857总菌数；（c）B.subtilis ATCC23857芽孢数。
具体实施方式
实施例1：混合培养接种条件的优化
为使两种菌生长在同一体系中时具有基本一致的生长速率，两种菌混合前种子的生长状态、混合时的接种量和接种比例非常重要。本发明首先将种子活化至对数期后期至稳定期前期，方法是（1）取指数生长后期至稳定期后期的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCCNo.6888或干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393（pL215）菌株分别接种到MRS培养基中，37℃静止培养12小时；（2）取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857菌株接种到LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养12小时；然后将植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）CGMCC No.6888或干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393（pL215）与（B.subtilis）ATCC23857先按重量比1%+20%、2%+20%、1%+10%、1%+5%接种量混合于20mL MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养18h～24h，测定培养接的吸光度（OD600nm），结果确定最佳的混合条件（以重量百分比计）为：1%植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCCNo.6888+10%枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857，或1.5%干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393（pL215）+10%枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857生物量最高。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中，所述MRS培养基的配方如下：
121℃条件下灭菌15分钟。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中，所述LB培养基的配方是：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，琼脂1.5-2g，水100ml。
上述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法中，所述MRS-Ca培养基的配方是：在MRS培养基基础上，加入终重量百分比浓度为0.02%的CaCl2。
上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC No.6888，分离自新疆传统发酵酸奶，申请人已于2012年11月27日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，上述干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393（pL215）与枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857均购自美国标准生物品保藏中心。
实施例2：混合培养物最佳收获时间的确定
乳杆菌的活菌数、芽孢杆菌的芽孢数是衡量微生态制剂质量的标准。按照实施例1最佳接种比例，即以重量比计，将1%植物乳杆菌（Lb.plantarum）CGMCC No.6888+10%枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857，或1.5%干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393（pL215）+10%枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857接种于20mL MRS-Ca培养基后，37℃、220rpm震荡培养，分别于12h、18h、24h取样测定乳杆菌活菌数、芽孢杆菌总菌数及芽孢数。
实验结果：对于有氧代谢时遭受氧胁迫较轻的Lb.casei ATCC393（pL215），培养时间延长至24h时对于其活菌数无明显影响，并可获得更高的芽孢数。对于有氧代谢时产生大量H2O2的植物乳杆菌（Lb.plantarum）CGMCC No.6888，虽然混合培养物中B.subtilisATCC23857可以清除环境中H2O2（未检测到H2O2的积累），其活菌数还是因为一定程度的氧胁迫，在18h后开始出现明显下降，因此培养时间不能再延长，收获时间是18h。
综合以上数据，对于Lb.caseiATCC393（pL215）和B.subtilis ACTT23857的混合培养，较优的接种量为1.5%+10%，收获时间为24h；对于Lb.plantarum CGMCC6888和B.subtilisATCC23857的混合培养，较优的接种量为1%+10%，收获时间为18h。
实施例3：优选乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养方法
（1）取指数生长后期至稳定期后期的植物乳杆菌（Lb.plantarum）CGMCC6888或干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393(pL215)菌株分别接种到MRS培养基中，37℃静止培养12小时；
（2）取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC23857菌株接种到LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养12小时；
（3）将步骤（1）制得的植物乳杆菌与步骤（2）制得的枯草芽孢杆按重量比1%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养18小时收获；或将步骤（1）制得的干酪乳杆菌与步骤（2）制得的枯草芽孢杆按重量比1.5%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37℃、220rpm震荡培养24小时收获。
上述实施例中所用MRS培养基、LB培养基、MRS-Ca培养基的配方同实施例1。

Claims (2)

1.一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法，步骤是：
（1）取指数生长后期至稳定期后期的植物乳杆菌或干酪乳杆菌菌株分别接种到MRS培养基中，37±1℃静止培养12±2小时；
（2）取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌菌株接种到LB培养基中，37±1℃、220rpm震荡培养12±2小时；
（3）将步骤（1）制得的植物乳杆菌与步骤（2）制得的枯草芽孢杆菌按重量比1%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37±1℃、220rpm震荡培养18±1小时收获；或将步骤（1）制得的干酪乳杆菌与步骤（2）制得的枯草芽孢杆菌按重量比1.5%﹕10%的混合接种比例接种在MRS-Ca培养基中，37±1℃、220rpm震荡培养24±1小时收获；
其中，上述MRS-Ca培养基的配方是：在MRS培养基的基础上，加入终重量百分比浓度为0.02%的CaCl2。
2.如权利要求1所述乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法，其特征在于：所述植物乳杆菌是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC No.6888；所述干酪乳杆菌是干酪乳杆菌（Lb.casei）ATCC393；所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis ATCC23857。
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