CN111896745A - 一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒及其制备方法、应用 - Google Patents

一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒及其制备方法、应用。该试剂盒包括检测卡，所述检测卡含有CK‑MB、cTnI及MYO检测试纸条各一条；所述检测试纸条是由吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、胶金垫、PVC板和塑料卡组成；在硝酸纤维素膜C线包被羊抗鼠IgG抗体，T线分别包被鼠抗CK‑MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体；在胶金垫上喷有胶体金标记的相应的鼠抗CK‑MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体。本发明制备的试剂盒能够显著提高检测灵敏度，通过将抗体进行预处理，捕获能力增强，减少漏诊及误诊率；检测时间短，且对检测环境要求低，特异性及稳定性好。

Description

一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒及其制备方 法、应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒及其制备方法、应用。
背景技术
心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，而急性心肌梗死是最常见、最危险的影响人类健康的头号杀手。心肌肌钙蛋白是心肌肌肉收缩的调节蛋白，有三种不同基因的亚基组成，而常用于实验室诊断的是cTnT和cTnI，cTnI由于其高度的心肌特异性，对于心肌损伤的高度敏感性及较长的窗口期，已被临床及检验人员管饭接受，成为了诊断急性心梗的金标准，且成为判断冠脉综合征病人处于心肌损伤风险的最合适标志物；肌酸激酶同工酶，简称CK-MB，主要存在于心肌内，CK-MB是诊断心肌受损比较有价值生化指标。当心肌损伤后，CK-MB释放到血液中，3-8h后开始升高，可持续3-5天。肌红蛋白MYO是一种小分子色素蛋白，有珠蛋白与正铁血红素结合而成，可与氧成可逆性结合，在肌细胞内有转运和贮存氧的作用，在心肌受损时即从心肌细胞中弥散出来进入血液循环，肌红蛋白只存在于心肌及横纹肌内，其他组织包括平滑肌内都不含有此种蛋白。
早诊断、早治疗是挽救急性心肌梗死患者生命的关键。患者临床症状有时并不典型，心电图也有可能呈非特异性改变，因此心肌标志物的检测成为早期诊断的重要依据。目前，临床上常通过检测特异性标志物来进行对急性心肌梗死的早期诊断，包括。胶体金免疫层析法检测心肌标志物时具有良好的特异性、敏感性，但是，统计发现，仍具有较高程度的误诊率及漏诊率。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒。
本发明还提供了一种上述试剂盒的制备方法。
本发明还提供了一种上述试剂盒的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒，包括检测卡，所述检测卡含有CK-MB、cTnI及MYO检测试纸条各一条；所述检测试纸条是由吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、胶金垫、PVC板和塑料卡组成；在硝酸纤维素膜C线包被羊抗鼠IgG抗体，T线分别包被鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体；在胶金垫上喷有胶体金标记的相应的鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体。进一步的，所述鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体具体操作过程为：将钛酸正丁酯溶液中逐滴加入氨水，滴加结束后，离心后将沉淀二氧化钛采用乙醇、去离子水洗涤，然后将沉淀加入聚谷氨酸、壳聚糖，加入鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体溶液，搅拌均匀后即得。
上述钛酸正丁酯和氨水的体积比为1：1.5；所述氨水的体积分数为28%；所述聚谷氨酸、壳聚糖和二氧化钛的质量比为0.1：0.05：2。
进一步的，所述鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体溶液和钛酸正丁酯的体积比为1：0.2。
本发明还提供了一种上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将聚酯膜在室温下浸泡在胶体金溶液中1-2h，烘干后裁剪成30cm×0.7cm的长条，喷涂胶体金标记物工作液，喷量为2.0-2.5μL/cm，使胶体金标记物工作液均匀喷到已处理聚酯膜上，然后干燥；
（2）用MPB缓冲液将鼠抗CK-MB、cTnI、MYO单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体分别稀释至0.08μL/mm，然后用划膜仪将鼠抗CK-MB、cTnI、MYO单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体在硝酸纤维膜的T线和C线的位置划线，将其包被到硝酸纤维素膜上，然后干燥即可；
（3）玻璃纤维在室温下浸泡在样品垫处理液中1-2h，干燥后得样品垫；
（4）将胶金垫、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸粘贴在PVC板上制备成大板，然后进行切条即得。
本发明所使用的胶体金标记物工作液的制备过程为：将0.1M的碳酸钾溶液加入胶体金溶液中，调整pH为7.5，然后分别将鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI和鼠抗MYO单克隆抗体加入，室温搅拌30min，用1%BSA溶液不断搅拌，封闭20min，分别高速离心进行分离纯化，2000r/min离心15min，取沉淀，然后上清10000r/min离心45min，弃上清，将沉淀采用胶体金稀释液稀释至6mL/100mL。
进一步的，所述胶体金溶液为采用柠檬酸三钠还原法，将0.01%氯金酸溶液加热至沸，再加入1%柠檬酸三钠溶液1mL/100mL,继续加热煮沸15min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积即可。
本发明还提供了一种上述试剂盒在同时检测CK-MB、cTnI及MYO中的应用。
本发明所使用的胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法，将0.01%氯金酸溶液加热至沸腾，然后加入1%柠檬酸三钠溶液1mL/100mL，继续煮沸15min，冷却至室温后加入蒸馏水恢复至原体积，4℃保存备用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明制备的试剂盒能够显著提高检测灵敏度，通过将抗体进行预处理，能够使得其捕获能力增强，减少漏诊及误诊率；
（2）本发明制备的试剂盒检测时间短，且对检测环境要求低，特异性及稳定性好。
附图说明
图1为本发明制备的检测试纸条的示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
（1）本发明所使用的原料要求具体如下：
鼠抗CK-MB单克隆抗体如表1所述。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
鼠抗cTnI单克隆抗体如表2所述。
表2
Figure 707806DEST_PATH_IMAGE002
鼠抗MYO单克隆抗体如表3所示。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（2）肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部阳性参考品：从医院收集急性心肌梗死病人（发病3h以上）或其他心肌受损病人且经两家实际检测CK-MB为阳性的血清标本若干份，经60℃，1h灭火处理，从中选出若干份强阳性、中阳性、弱阳性血清，每组混合后按显色强弱分成3份，组成企业内部阳性参考品，进行标号，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部阴性参考品：从医院收集非极性心肌梗死病人或正常人的血清标本若干份，经60℃，1h灭活处理，从中选出若干份分别混合为9份，组成企业内部阴性参考品，进行标号，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部检出限参考品：用PBS+5%牛血清将CK-MB标准品（市售）稀释至40ng/mL，20 ng/mL，10 ng/mL，5 ng/mL，2.5 ng/mL，标记后，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部精密性参考品：选出几份急性心肌梗死病人且经两家实际检测CK-MB为中值阳性的血清标本，经60℃，1h灭活处理，混合后得到CV值企业内部精密性参考品，按1mL/支分装，-20℃保存。
肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部特异性参考品：1000ng/mL肌酸激酶同工酶MM（CK-MM）、1000ng/mL肌酸激酶同工酶BB（CK-BB），按0.5mL/支分装，-20℃保存。
心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部阳性参考品：从医院收集急性心肌梗死病人（发病3h以上）或其他心肌受损病人且经两家实际检测cTnI为阳性的血清标本若干份，经60℃，1h灭火处理，从中选出若干份强阳性、中阳性、弱阳性血清，每组混合后按显色强弱分成3份，组成企业内部阳性参考品，进行标号，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部阴性参考品：从医院收集非极性心肌梗死病人或正常人的血清标本若干份，经60℃，1h灭活处理，从中选出若干份分别混合为9份，组成企业内部阴性参考品，进行标号，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部检出限参考品：用PBS+5%牛血清将cTnI标准品（市售）稀释至64ng/mL，16 ng/mL，4 ng/mL，1 ng/mL，2.5 ng/mL，标记后，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部精密性参考品：选出几份急性心肌梗死病人且经两家实际检测cTnI为中值阳性的血清标本，经60℃，1h灭活处理，混合后得到CV值企业内部精密性参考品，按1mL/支分装，-20℃保存。
心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部特异性参考品：1000ng/mL心肌肌钙蛋白T（cTnT）、1000ng/mL心肌肌钙蛋白C（cTnC），按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌红蛋白企业内部阳性参考品：从医院收集急性心肌梗死病人（发病3h以上）或其他心肌受损病人且经两家实际检测Myo为阳性的血清标本若干份，经60℃，1h灭火处理，从中选出若干份强阳性、中阳性、弱阳性血清，每组混合后按显色强弱分成3份，组成企业内部阳性参考品，进行标号，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌红蛋白企业内部阴性参考品：从医院收集非极性心肌梗死病人或正常人的血清标本若干份，经60℃，1h灭活处理，从中选出若干份分别混合为9份，组成企业内部阴性参考品，进行标号，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌红蛋白企业内部检出限参考品：用0.02M Tris+5%牛血清将Myo标准品（市售）稀释至64ng/mL，400 ng/mL，200 ng/mL，100 ng/mL，50 ng/mL，25 ng/mL，标记后，按0.5mL/支分装，-20℃保存。
肌红蛋白企业内部精密性参考品：选出几份急性心肌梗死病人且经两家实际检测Myo为中值阳性的血清标本，经60℃，1h灭活处理，混合后得到CV值企业内部精密性参考品，按1mL/支分装，-20℃保存。
实施例1
一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒，包括检测卡，所述检测卡含有CK-MB、cTnI及MYO检测试纸条各一条；所述检测试纸条是由吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、胶金垫、PVC板和塑料卡组成；在硝酸纤维素膜C线包被羊抗鼠IgG抗体，T线分别包被鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体；在胶金垫上喷有胶体金标记的相应的鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体。鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体具体操作过程为：将1mL钛酸正丁酯中逐滴加入1.5mL的氨水，滴加结束后，离心后将沉淀二氧化钛采用乙醇、去离子水洗涤，然后按照聚谷氨酸、壳聚糖和二氧化钛质量比为0.1：0.05：2的比例进行混合，加入鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体溶液，搅拌均匀后即得。
具体制备方法如下：
（1）胶体金溶液为采用柠檬酸三钠还原法，将0.01%氯金酸溶液加热至沸，再加入1%柠檬酸三钠溶液1mL/100mL,继续加热煮沸15min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积即可）；
（2）胶体金标记物工作液的制备过程为：将0.1M的碳酸钾溶液加入胶体金溶液中，调整pH为7.5，然后分别将鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI和鼠抗MYO单克隆抗体加入，室温搅拌30min，用1%BSA溶液不断搅拌，封闭20min，分别高速离心进行分离纯化，2000r/min离心15min，取沉淀，然后上清10000r/min离心45min，弃上清，将沉淀采用胶体金稀释液稀释至6mL/100mL；
（3）将聚酯膜在室温下浸泡在胶体金溶液中1-2h，烘干后裁剪成30cm×0.7cm的长条，喷涂胶体金标记物工作液，喷量为2.0-2.5μL/cm，使胶体金标记物工作液均匀喷到已处理聚酯膜上，然后干燥；
（4）用MPB缓冲液将鼠抗CK-MB、cTnI、MYO单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体分别稀释至0.08μL/mm，然后用划膜仪将鼠抗CK-MB、cTnI、MYO单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体在硝酸纤维膜的T线和C线的位置划线，将其包被到硝酸纤维素膜上，然后干燥即可；
（5）玻璃纤维在室温下浸泡在样品垫处理液中1-2h，干燥后得样品垫；
（6）将胶金垫、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸粘贴在PVC板上制备成大板，然后进行切条即得。
实施例1制备的试剂盒中，膜宽为3.9±0.1mm，液体移动速度不低于10mm/min。
对比例1
制备过程及组成同实施例1基本相同，不同之处在于，抗体不采用二氧化钛模板进行负载，标记抗体及包被抗体直接进行相应的标记和包被。
效果验证
（1）阴性参考品符合率
9份心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部阴性参考品，9份肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部阴性参考品，9份肌红蛋白企业内部阴性参考品，取同批号试纸对相应的检测物进行检测，向加样孔内分别加入100μL的参考品，5-20min内读取结果，其检测结果全部为阴性，符合率为100%。
（2）阳性参考品符合率
9份心肌肌钙蛋白Ⅰ企业内部阳性参考品，9份肌酸激酶同工酶CK-MB企业内部阳性参考品，9份肌红蛋白企业内部阳性参考品，取同批号试纸对相应的检测物进行检测，向加样孔内分别加入100μL的参考品，其检测结果全部为阳性，符合率为100%。
（3）最低检出限
将5种浓度的心肌肌钙蛋白Ⅰ、肌酸激酶同工酶CK-MB、肌红蛋白检出限参考品，分别进行检测，向加样孔分别加入100μL，5-20min读取结果，本发明制备的试剂盒阳性反应符合，且S5为阴性，而对比例1制备得到的试剂盒，部分阳性反应少于4份。
（4）精密性
实施例1制备的试剂盒随机抽取同一批号检测卡10块，向各自的试纸条对应的加样孔加入100μL的企业内部精密性参考品，5-20min读取结果，批内反应一致，显色度均一，均为阳性。
（5）特异性
随机抽取10个试剂盒进行检测，实施例1制备的试剂盒，检测浓度为1000ng/mL心肌钙蛋白T、600 ng/mL心肌钙蛋白C企业内部特异性参考品，结果均为阴性；1000ng/mL CK-MM、CK-BB检测结果均为阴性，而对比例1中，心肌钙蛋白T出现1次阳性结果，CK-BB出现一次阳性结果。
Myo试纸条无特异性参考品，不做相应的检测。
（6）稳定性
2-30℃条件下放置12个月后，一个月内，采用企业内部参考品进行检测，其阳性参考品、阴性参考品等均符合要求。
37℃条件下放置20d的待检品，采用试剂盒进行检测时，其各项检测均符合要求，而对比例1制备的试剂盒，重复10次进行检测，阳性参考品中出现2次阴性结果，特异性检测中出现误检。

Claims (9)

1.一种利用胶体金法联合检测心肌标志物的试剂盒，其特征在于，包括检测卡，所述检测卡含有CK-MB、cTnI及MYO检测试纸条各一条；所述检测试纸条是由吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、胶金垫、PVC板和塑料卡组成；在硝酸纤维素膜C线包被羊抗鼠IgG抗体，T线分别包被鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体；在胶金垫上喷有胶体金标记的相应的鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体具体操作过程为：将钛酸正丁酯溶液中逐滴加入氨水，滴加结束后，离心后将沉淀二氧化钛采用乙醇、去离子水洗涤，然后将沉淀加入聚谷氨酸、壳聚糖，加入鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体溶液，搅拌均匀后即得。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述钛酸正丁酯和氨水的体积比为1：1.5；所述氨水的体积分数为28%。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述聚谷氨酸、壳聚糖和二氧化钛的质量比为0.1：0.05：2。
5.根据权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI、鼠抗MYO单克隆抗体溶液和钛酸正丁酯的体积比为1：0.2。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将聚酯膜在室温下浸泡在胶体金溶液中1-2h，烘干后裁剪成30cm×0.7cm的长条，喷涂胶体金标记物工作液，喷量为2.0-2.5μL/cm，使胶体金标记物工作液均匀喷到已处理聚酯膜上，然后干燥；
（2）用MPB缓冲液将鼠抗CK-MB、cTnI、MYO单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体分别稀释至0.08μL/mm，然后用划膜仪将鼠抗CK-MB、cTnI、MYO单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体在硝酸纤维膜的T线和C线的位置划线，将其包被到硝酸纤维素膜上，然后干燥即可；
（3）玻璃纤维在室温下浸泡在样品垫处理液中1-2h，干燥后得样品垫；
（4）将胶金垫、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸粘贴在PVC板上制备成大板，然后进行切条即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金标记物工作液的制备过程为：将0.1M的碳酸钾溶液加入胶体金溶液中，调整pH为7.5，然后分别将鼠抗CK-MB、鼠抗cTnI和鼠抗MYO单克隆抗体加入，室温搅拌30min，用1%BSA溶液不断搅拌，封闭20min，分别高速离心进行分离纯化，2000r/min离心15min，取沉淀，然后上清10000r/min离心45min，弃上清，将沉淀采用胶体金稀释液稀释至6mL/100mL。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金溶液为采用柠檬酸三钠还原法，将0.01%氯金酸溶液加热至沸，再加入1%柠檬酸三钠溶液1mL/100mL,继续加热煮沸15min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积即可。
9.一种如权利要求1-5任一项所述的试剂盒在同时检测CK-MB、cTnI及MYO中的应用。
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