CN116068207A - 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 - Google Patents
一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116068207A CN116068207A CN202310294454.3A CN202310294454A CN116068207A CN 116068207 A CN116068207 A CN 116068207A CN 202310294454 A CN202310294454 A CN 202310294454A CN 116068207 A CN116068207 A CN 116068207A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kit
- buffer solution
- microsphere
- tnf
- ifn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108010067755 dinitrophenyl-bovine serum albumin Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims abstract 10
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims abstract 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 56
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 46
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 34
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 28
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 25
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 24
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 24
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 19
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 19
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 18
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 18
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 17
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 12
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 12
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- 229920002593 Polyethylene Glycol 800 Polymers 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 5
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000040 effect on leukemia Effects 0.000 description 1
- 230000000044 effect on lymphoma Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测NK细胞活性的试剂盒：包括检测卡、样本稀释液和激活剂；检测卡内部设有试纸条，试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN‑γ抗体、生物素标记的TNF‑α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP‑BSA；试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线包被有IFN‑γ抗体，第二检测线包被有TNF‑α抗体，质控线包被有兔抗DNP抗体；激活剂包括人白介素IL‑2、IL‑12或两者的组合。本发明的试剂盒采用荧光微球联合生物素‑亲和素放大***，大大提高了试剂盒的特异性和检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测NK细胞活性的试剂盒。
背景技术
自然杀伤细胞（NK）是一种大颗粒淋巴细胞，能直接杀伤靶细胞的特殊淋巴细胞系，具有抗肿瘤、抗感染及免疫调节的功能。NK细胞是与T、B细胞并列的第3类群淋巴细胞，在外周血中约占淋巴细胞总数的5-25％。NK细胞疗法也是癌症治疗的新兴技术，其治疗关键在于产生数量足够能识别并杀伤肿瘤的免疫细胞，以及效应细胞能够到达肿瘤所在的部位，并在肿瘤周围被激活，而且能够发挥抗肿瘤的作用。除了能够杀伤肿瘤细胞外，还可以替代修补或者改善化疗所引起的免疫功能受损。
NK细胞活性的检测对于癌症的早期诊断以及癌症的干预治疗效果评价具有重要的指导意义。其杀伤效应是由其活化后释放出的毒性分子介导，如γ-干扰素 (IFN-γ)和α-肿瘤坏死因子(TNF-α）等。NK细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体（如真菌和寄生虫）、同种异体移植器官、组织等。它具有广谱抗瘤作用，特别是对淋巴瘤和白血病细胞作用更为明显。目前NK细胞活性检测的方法主要包括形态法、流式细胞仪技术和酶联免疫吸附（ELISA）。形态法的方法简便，易于掌握，但判断死细胞与活细胞不免带有检测者的主观因素，也无法计数轻微损伤的细胞。流式细胞设备价格昂贵，操作复杂，结果的准确性与样品的制备息息相关；酶联免疫法法自动化程度不高，检测时间长，且受人为因素影响较大。因此针对上述问题，有必要建立一种检测NK细胞活性的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，该试剂盒操作简单、检测时间短、灵敏度高、线性范围宽、无污染、可以定量检测。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括检测卡、样本稀释液和激活剂；所述检测卡内部设有试纸条，所述试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体、生物素标记的TNF-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP-BSA；所述试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线包被有IFN-γ抗体，所述第二检测线包被有TNF-α抗体，所述质控线包被有兔抗DNP抗体；所述激活剂包括人白介素IL-2、IL-12或两者的组合。
作为一种改进的技术方案，所述激活剂的用量为5-10ng/mL。
作为一种改进的技术方案，所述样本稀释液为含有0.6wt%-1.8wt%PEG800、0.1wt%-1.5wt%Nacl、0.75wt%-2wt%PVA、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-1wt%S9的Tris缓冲液，且所述Tris缓冲液的pH为8.0-8.5，浓度为10-50mM。
作为一种改进的技术方案，采用生物素标记IFN-γ抗体和生物素标记TNF-α抗体的方法包括以下步骤：
（1）用pH8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或pH8.6、0.5mol/L硼酸缓冲液将IFN-γ或TNF-α稀释到1mg/mL，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的IFN-γ或TNF-α进行透析，透析后的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液备用；
（2）取步骤（1）中1ml备用的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的NHSB溶液，搅拌保温2-4h后加入9.6μL、1mol/LNH4Cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/L的叠氮钠、1.0g/LBSA以及甘油，-20℃保存即可。
作为一种改进的技术方案，采用荧光微球标记亲和素和荧光微球标记DNP-BSA的方法包括以下步骤：
（1）采用pH6.0、50mM MES缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用MES缓冲液进行复溶，备用；
（2）将微球、EDC、Sulfo-NHS按照质量比为1:0.1-1:0.1-3的比例活化20-60min，离心，采用步骤（1）中MES缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用pH6.5、50mM MES缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联0.1-1mg链酶亲和素或DNP-BSA的用量加入链酶亲和素或DNP-BSA，超声、孵育2-3h，再采用终浓度为100mM甘氨酸猝灭，继续孵育20-30min，采用微球封闭缓冲液洗涤、离心后复溶、封闭2-4h，离心，采用微球保存液进行复溶，4℃保存备用；
作为一种改进的技术方案，所述微球封闭缓冲液为含有1-5wt% BSA 和0.05wt%Tween-20的PBS缓冲液。
作为一种改进的技术方案，所述微球保存液为含有0.01wt%酪蛋白、 0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，所述碳酸钾缓冲液的浓度为3mM，pH为8.0-10.0。
作为一种改进的技术方案，所述结合垫的制备是将生物素标记的IFN-γ、TNF-α和荧光微球标记的亲和素按体积比1-4:1-4:1的比例分散于微球稀释液中，荧光微球标记的DNP-BSA以2.5%-10%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以1-4 μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在 37℃鼓风烘干2h后保存备用。
作为一种改进的技术方案，所述微球稀释液为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液的pH为8.0-8.2。
作为一种改进的技术方案，所述试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，所述封闭液为含有0.5wt%-3wt%牛血清白蛋白、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-5wt%PVP、0.02wt%-0.05wt%磷酸二氢钾和0.01wt%-0.1wt% 吐温20的Tris缓冲液，所述Tris缓冲液的浓度为10-50mM。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
本发明提供的检测NK细胞活性的试剂盒能在一条试纸条上实现对IFN-γ和TNF-α的同步、快速检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、各种细胞因子的检测之间无干扰，简单、快速。本发明的试剂盒采用荧光微球联合生物素-亲和素放大***，最大程度提高了信号灵敏度，大大提高了试剂盒的特异性和检测结果的准确性。
附图说明
图1为本发明一种用于检测NK细胞活性的试剂盒中检测卡的俯视图；
图2为图1中试纸条的俯视图；
图3为图2的侧视图；
其中，1-检测卡，11-样本加样孔，12-观测孔，13-安装标示孔，2-试纸条，21-加样垫，22-结合垫，23-硝酸纤维素膜，231-第一检测线，232-第二检测线，233-质控线，24-吸水垫，241-吸水纸，242-安装标志。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括检测卡、样本稀释液和激活剂；检测卡内部设有试纸条，试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体、生物素标记的TNF-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP-BSA；试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线包被有IFN-γ抗体，第二检测线包被有TNF-α抗体，质控线包被有兔抗DNP抗体；激活剂为人白介素IL-2，激活剂的用量为5ng/mL。
其中样本稀释液为含有0.6wt%PEG800、0.1wt%Nacl、0.75wt%PVA、0.1wt%酪蛋白、0.1wt%S9的Tris缓冲液，且Tris缓冲液的pH为8.0，浓度为20mM。
其中结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体和生物素标记的TNF-α抗体，采用生物素标记IFN-γ抗体或TNF-α抗体的方法包括以下步骤：
（1）用pH8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或pH8.6、0.5mol/L硼酸缓冲液将IFN-γ或TNF-α稀释到1mg/mL，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的IFN-γ或TNF-α进行透析，透析后的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液备用；
（2）取步骤（1）中1ml备用的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的NHSB溶液，搅拌保温2h后加入9.6μL、1mol/LNH4Cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/L的叠氮钠、1.0g/LBSA以及甘油，-20℃保存即可。
其中结合垫上包被有荧光微球标记的亲和素和荧光微球标记的DNP-BSA，采用荧光微球标记亲和素或DNP-BSA的方法包括以下步骤：
（1）采用pH6.0、50mM MES缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用MES缓冲液进行复溶，备用；
（2）将微球、EDC、Sulfo-NHS按照质量比为1:0.1:0.1的比例活化20min，离心，采用步骤（1）中MES缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用pH6.5、50mM MES缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联0.1mg链酶亲和素或DNP-BSA的用量加入链酶亲和素或DNP-BSA，超声、孵育2h，再采用终浓度为100mM甘氨酸猝灭，继续孵育20min，采用微球封闭缓冲液（为含有1wt% BSA 和0.05wt% Tween-20的PBS缓冲液）洗涤、离心后复溶、封闭2h，离心，采用微球保存液（为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，碳酸钾缓冲液的浓度为3mM，pH8.0）进行复溶，4℃保存备用；
其中结合垫的制备是将生物素标记的IFN-γ、TNF-α和荧光微球标记的亲和素按体积比1:1:1的比例分散于微球稀释液（为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液的pH为8.0）中，荧光微球标记的DNP-BSA以2.5%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以1μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在37℃鼓风烘干2h后保存备用。
其中试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，封闭液为含有0.5wt%牛血清白蛋白、0.1wt%酪蛋白、0.1wt%PVP、0.02wt%磷酸二氢钾和0.01wt%吐温20的Tris缓冲液，Tris缓冲液的浓度为20mM。
如图1所示，本发明中的检测卡1包括卡固在一起上板块和下板块，上板块的一端设有样本加样孔11，上板块的另一端设有安装标示孔13，样本加样孔11和安装标示孔13之间设有观测孔12。
如图1至图3共同所示，检测卡1内的试纸条2按照从上到下的顺序包括加样垫21、结合垫22、硝酸纤维素膜23、吸水垫24，其中加样垫21与样本加样孔11相对应，硝酸纤维素膜23与观测孔12相对应，且硝酸纤维素膜23上依次设有第一检测线231、第二检测线232、质控线233；吸水垫24的上方设有吸水纸241和安装标志242。
实施例2
一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括检测卡、样本稀释液和激活剂；检测卡内部设有试纸条，试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体、生物素标记的TNF-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP-BSA；试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线包被有IFN-γ抗体，第二检测线包被有TNF-α抗体，质控线包被有兔抗DNP抗体；激活剂为人白介素IL-12，激活剂的用量为8ng/mL。
其中样本稀释液为含有1wt%PEG800、0.5wt%Nacl、1wt%PVA、0.2wt%酪蛋白、0.5wt%S9的Tris缓冲液，且Tris缓冲液的pH为8.2，浓度为40mM。
其中结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体和生物素标记的TNF-α抗体，采用生物素标记IFN-γ抗体或TNF-α抗体的方法包括以下步骤：
（1）用pH8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或pH8.6、0.5mol/L硼酸缓冲液将IFN-γ或TNF-α稀释到1mg/mL，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的IFN-γ或TNF-α进行透析，透析后的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液备用；
（2）取步骤（1）中1ml备用的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的NHSB溶液，搅拌保温3h后加入9.6μL、1mol/LNH4Cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/L的叠氮钠、1.0g/LBSA以及甘油，-20℃保存即可。
其中结合垫上包被有荧光微球标记的亲和素和荧光微球标记的DNP-BSA，采用荧光微球标记亲和素或DNP-BSA的方法包括以下步骤：
（1）采用pH6.0、50mM MES缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用MES缓冲液进行复溶，备用；
（2）将微球、EDC、Sulfo-NHS按照质量比为1:0.5:1的比例活化35min，离心，采用步骤（1）中MES缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用pH6.5、50mM MES缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联0.5mg链酶亲和素或DNP-BSA的用量加入链酶亲和素或DNP-BSA，超声、孵育2.5h，再采用终浓度为100mM甘氨酸猝灭，继续孵育25min，采用微球封闭缓冲液（为含有2.5wt% BSA和 0.05wt% Tween-20的PBS缓冲液）洗涤、离心后复溶、封闭3h，离心，采用微球保存液（为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，碳酸钾缓冲液的浓度为3mM，pH8.8）进行复溶，4℃保存备用；
其中结合垫的制备是将生物素标记的IFN-γ、TNF-α和荧光微球标记的亲和素按体积比1:2:1的比例分散于微球稀释液（为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的Tris-Hcl缓冲液，Tris-Hcl缓冲液的pH为8.1）中，荧光微球标记的DNP-BSA以5%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以2μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在37℃鼓风烘干2h后保存备用。
其中试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，封闭液为含有1.5wt%牛血清白蛋白、0.2wt%酪蛋白、1.5wt%PVP、0.03wt%磷酸二氢钾和0.05wt% 吐温20的Tris缓冲液，Tris缓冲液的浓度为10mM。
实施例3
一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括检测卡、样本稀释液和激活剂；检测卡内部设有试纸条，试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体、生物素标记的TNF-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP-BSA；试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线包被有IFN-γ抗体，第二检测线包被有TNF-α抗体，质控线包被有兔抗DNP抗体；激活剂为人白介素IL-12，激活剂的用量为10ng/mL。
其中样本稀释液为含有1.5wt%PEG800、1wt%Nacl、1.5wt%PVA、0.3wt%酪蛋白、0.8wt%S9的Tris缓冲液，且Tris缓冲液的pH为8.3，浓度为30mM。
其中结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体和生物素标记的TNF-α抗体，采用生物素标记IFN-γ抗体或TNF-α抗体的方法包括以下步骤：
（1）用pH8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或pH8.6、0.5mol/L硼酸缓冲液将IFN-γ或TNF-α稀释到1mg/mL，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的IFN-γ或TNF-α进行透析，透析后的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液备用；
（2）取步骤（1）中1ml备用的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的NHSB溶液，搅拌保温3.5h后加入9.6μL、1mol/LNH4Cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/L的叠氮钠、1.0g/LBSA以及甘油，-20℃保存即可。
其中结合垫上包被有荧光微球标记的亲和素和荧光微球标记的DNP-BSA，采用荧光微球标记亲和素和DNP-BSA的方法包括以下步骤：
（1）采用pH6.0、50mM MES缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用MES缓冲液进行复溶，备用；
（2）将微球、EDC、Sulfo-NHS按照质量比为1:0.8:2的比例活化45min，离心，采用步骤（1）中MES缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用pH6.5、50mM MES缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联0.8mg链酶亲和素或DNP-BSA的用量加入链酶亲和素或DNP-BSA，超声、孵育2.8h，再采用终浓度为100mM甘氨酸猝灭，继续孵育28min，采用微球封闭缓冲液（为含有3.5wt% BSA和 0.05wt% Tween-20的PBS缓冲液）洗涤、离心后复溶、封闭3.5h，离心，采用微球保存液（为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，碳酸钾缓冲液的浓度为3mM，pH9.5）进行复溶，4℃保存备用；
其中结合垫的制备是将生物素标记的IFN-γ、TNF-α和荧光微球标记的亲和素按体积比3:2:1的比例分散于微球稀释液（为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的Tris-Hcl缓冲液，Tris-Hcl缓冲液的pH为8.2）中，荧光微球标记的DNP-BSA以7.5%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以3μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在37℃鼓风烘干2h后保存备用。
其中试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，封闭液为含有2wt%牛血清白蛋白、0.3wt%酪蛋白、3wt%PVP、0.04wt%磷酸二氢钾和0.8wt% 吐温20的Tris缓冲液，Tris缓冲液的浓度为30mM。
实施例4
一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括检测卡、样本稀释液和激活剂；检测卡内部设有试纸条，试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体、生物素标记的TNF-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP-BSA；试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线包被有IFN-γ抗体，第二检测线包被有TNF-α抗体，质控线包被有兔抗DNP抗体；激活剂包括人白介素IL-2和IL-12（按照体积比1:1的比例混合）。激活剂的用量为8ng/mL。
其中样本稀释液为含有1.8wt%PEG800、1.5wt%Nacl、2wt%PVA、0.5wt%酪蛋白、1wt%S9的Tris缓冲液，且Tris缓冲液的pH为8.5，浓度为50mM。
其中结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体和生物素标记的TNF-α抗体，采用生物素标记IFN-γ抗体或TNF-α抗体的方法包括以下步骤：
（1）用pH8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或pH8.6、0.5mol/L硼酸缓冲液将IFN-γ或TNF-α稀释到1mg/mL，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的IFN-γ或TNF-α进行透析，透析后的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液备用；
（2）取步骤（1）中1ml备用的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的NHSB溶液，搅拌保温4h后加入9.6μL、1mol/LNH4Cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/L的叠氮钠、1.0g/LBSA以及甘油，-20℃保存即可。
其中结合垫上包被有荧光微球标记的亲和素和荧光微球标记的DNP-BSA，采用荧光微球标记亲和素或DNP-BSA的方法包括以下步骤：
（1）采用pH6.0、50mM MES缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用MES缓冲液进行复溶，备用；
（2）将微球、EDC、Sulfo-NHS按照质量比为1:1:3的比例活化60min，离心，采用步骤（1）中MES缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用pH6.5、50mM MES缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联1mg链酶亲和素或DNP-BSA的用量加入链酶亲和素或DNP-BSA，超声、孵育3h，再采用终浓度为100mM甘氨酸猝灭，继续孵育30min，采用微球封闭缓冲液（为含有5wt% BSA 和0.05wt% Tween-20的PBS缓冲液）洗涤、离心后复溶、封闭4h，离心，采用微球保存液（为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，碳酸钾缓冲液的浓度为3mM，pH10）进行复溶，4℃保存备用；
其中结合垫的制备是将生物素标记的IFN-γ、TNF-α和荧光微球标记的亲和素按体积比4:4:1的比例分散于微球稀释液（为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的Tris-Hcl缓冲液，Tris-Hcl缓冲液的pH为8.2）中，荧光微球标记的DNP-BSA以10%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以4μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在37℃鼓风烘干2h后保存备用。
其中试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，封闭液为含有3wt%牛血清白蛋白、0.5wt%酪蛋白、5wt%PVP、0.05wt%磷酸二氢钾和0.1wt% 吐温20的Tris缓冲液，Tris缓冲液的浓度为50mM。
实施例5
本发明试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
（1）将试剂盒从2-8℃拿出恢复至室温；
（2）取100μL全血样本至配备装有300μL激活剂的离心管中，充分混匀后静置反应2h后，4000rpm离心5min，收集上清液；
（3）取100μl上清液，加入至配备200μL样本稀释液的离心管中,充分混匀,得到待测样本液；
（4）取100μL上述待测样本液加入检测卡加样垫上，静置15min。
（5）将检测卡***仪器，读取检测结果。
标准曲线的制作
（1）将IFN-γ质控品按照50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL和4000pg/mL的浓度配置，将TNF-α质控品按照10pg/mL、50pg/mL、150pg/mL、500pg/mL和1000pg/mL的浓度配置；每个点进行三个重复，取100uL滴入试剂盒的检测卡的加样孔中。15min后用荧光分析仪检测，得出相应的T和C的荧光信号强度和T/C比值。以样本中标准品浓度为x轴，T/C比值为y轴，用荧光定量分析仪配套软件进行四参数曲线拟合，得相应抗体的标准曲线，实验数据如下；
IFN-γ的相关系数为0.9999，最低检出限为36pg/mL。
TNF-α的相关系数为0.9999，最低检出限为4.2pg/mL。
实施例6
重复性试验
（1）取10份同一批次的试剂盒（实施例3），用配套仪器分别检测IFN-γ质控品浓度分别为200pg/mL、2000pg/mL两个浓度点的信号，分别计算测量值的总平均值和标准差(S)，计算变异系数(CV)；具体结果见表3。
通过表3可以发现，变异系数(CV)小于10％，满足要求；
（2）取10份同一批次的试剂盒（实施例3），用配套仪器分别检测TNF-α质控品浓度分别为50pg/mL、500pg/mL两个浓度点的信号，分别计算测量值的总平均值和标准差(S)，具体结果见表4。
通过表4数据可以发现，变异系数(CV)小于10％，满足要求。
实施例7
特异性试验
收集200例癌症患者及200例健康查体人群的全血样本，用本实施例3中的试剂盒对上述样本进行检测。检测结果如下表5所示：
通过表5中的数据可以得到，所收集样本的阳性符合率99%，阴性符合率99.5%。本发明的试剂盒具有较好的特异性。
实施例8
稳定性试验
将同一批次的试剂盒（实施例2）分为2组分别置于常温、37℃的环境中进行加速稳定性考察。根据稳定性实验原理，即阿伦尼乌斯公式：d(In k)/dT=Ea/RT2 Ea，常温保存24个月，相当于37度破坏180天。分别于0天、5天、10天、15天、30天、60天、100天、150天、180天进行稳定性考察，用相应的质控品进行了验证，每个样本做三个重复，以平均值进行计算。具体的实验结果见表6和表7；
由上表可知，破坏5天时，相对0天各样本测量结果变化略大，但整体CV值可控，结果可接受，后期5-180天结果基本稳定，因此，该产品的稳定性达标。
为了更好的证明本发明的试剂盒具有较高的灵敏度和准确性，以实施例3为参照，给出了4个对比例，采用以下4个对比例中的试剂盒产品分别对200名健康者和200名癌症患者进行检测，具体检测结果见表8。
对比例1
市售NK细胞活性检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）；
对比例2
市售NK细胞活性检测试剂盒（荧光免疫层析法）；
对比例3
与实施例3中试剂盒不同的是，加样垫不采用封闭液进行处理，其余操作相同；
对比例4
与实施例3中试剂盒不同的是，微球保存液为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的PBS缓冲液；其余操作相同；
通过表8数据可以发现，本发明中试剂盒和对比例1-4相比较，具有较高的灵敏度和特异性。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测卡、样本稀释液和激活剂；所述检测卡内部设有试纸条，所述试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN-γ抗体、生物素标记的TNF-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP-BSA；所述试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线包被有IFN-γ抗体，所述第二检测线包被有TNF-α抗体，所述质控线包被有兔抗DNP抗体；所述激活剂包括人白介素IL-2、IL-12或两者的组合。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述激活剂的用量为5-10ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为含有0.6wt%-1.8wt%PEG800、0.1wt%-1.5wt%Nacl、0.75wt%-2wt%PVA、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-1wt%S9的Tris缓冲液，且所述Tris缓冲液的pH为8.0-8.5，浓度为10-50mM。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：采用生物素标记IFN-γ抗体或TNF-α抗体的方法包括以下步骤：
（1）用pH8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或pH8.6、0.5mol/L硼酸缓冲液将IFN-γ或TNF-α稀释到1mg/mL，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的IFN-γ或TNF-α进行透析，透析后的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液备用；
（2）取步骤（1）中1ml备用的IFN-γ抗体溶液或TNF-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的NHSB溶液，搅拌保温2-4h后加入9.6μL、1mol/LNH4Cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/L的叠氮钠、1.0g/LBSA以及甘油，-20℃保存即可。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：采用荧光微球标记亲和素或DNP-BSA的方法包括以下步骤：
（1）采用pH6.0、50mM MES缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用MES缓冲液进行复溶，备用；
（2）将微球、EDC、Sulfo-NHS按照质量比为1:0.1-1:0.1-3的比例活化20-60min，离心，采用步骤（1）中MES缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用pH6.5、50mM MES缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联0.1-1mg链酶亲和素或DNP-BSA的用量加入链酶亲和素或DNP-BSA，超声、孵育2-3h，再采用终浓度为100mM甘氨酸猝灭，继续孵育20-30min，采用微球封闭缓冲液洗涤、离心后复溶、封闭2-4h，离心，采用微球保存液进行复溶，4℃保存备用。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述微球封闭缓冲液为含有1-5wt% BSA 和 0.05wt% Tween-20的PBS缓冲液。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述微球保存液为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，所述碳酸钾缓冲液的浓度为3mM，pH为8.0-10.0。
8.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述结合垫的制备是将生物素标记的IFN-γ、TNF-α和荧光微球标记的亲和素按体积比1-4:1-4:1的比例分散于微球稀释液中，荧光微球标记的DNP-BSA按照2.5%-10%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以1-4 μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在 37℃鼓风烘干2h后保存备用。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述微球稀释液为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液的pH为8.0-8.2。
10.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，所述封闭液为含有0.5wt%-3wt%牛血清白蛋白、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-5wt%PVP、0.02wt%-0.05wt%磷酸二氢钾和0.01wt%-0.1wt% 吐温20的Tris缓冲液，所述Tris缓冲液的浓度为10-50mM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310294454.3A CN116068207A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310294454.3A CN116068207A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116068207A true CN116068207A (zh) | 2023-05-05 |
Family
ID=86178840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310294454.3A Pending CN116068207A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116068207A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116875548A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-10-13 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种nk细胞活性培养管及其生产工艺 |
| CN117471110A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-01-30 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种用于封闭抗原-微球指示***的封闭液及封闭方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040048274A1 (en) * | 2000-10-17 | 2004-03-11 | Morten Breindahl | Assay for directly detecting an inflammatory indicator in a body fluid sample |
| CN103472221A (zh) * | 2013-08-12 | 2013-12-25 | 南昌大学 | 荧光微球标记沙丁胺醇多克隆抗体的方法 |
| CN103675261A (zh) * | 2013-08-12 | 2014-03-26 | 南昌大学 | 荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法 |
| CN107015006A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-04 | 北京理工大学 | 一种细胞因子免疫层析试纸及其制备方法 |
| WO2020175960A1 (ko) * | 2019-02-28 | 2020-09-03 | 재단법인 아산사회복지재단 | 자연살해세포 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 검출 방법 |
| CN112269024A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-26 | 上海捷门生物技术有限公司 | 白细胞介素-6的检测试剂、试纸、试剂盒及其应用 |
| CN113125695A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-16 | 潍坊三维生物工程集团有限公司 | 一种用于检测游离脂肪酸的试剂盒 |
| CN113406339A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-09-17 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒 |
| CN114397458A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-04-26 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒 |
| CN115819580A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-03-21 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 针对人il-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用 |
-
2023
- 2023-03-24 CN CN202310294454.3A patent/CN116068207A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040048274A1 (en) * | 2000-10-17 | 2004-03-11 | Morten Breindahl | Assay for directly detecting an inflammatory indicator in a body fluid sample |
| CN103472221A (zh) * | 2013-08-12 | 2013-12-25 | 南昌大学 | 荧光微球标记沙丁胺醇多克隆抗体的方法 |
| CN103675261A (zh) * | 2013-08-12 | 2014-03-26 | 南昌大学 | 荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法 |
| CN107015006A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-04 | 北京理工大学 | 一种细胞因子免疫层析试纸及其制备方法 |
| WO2020175960A1 (ko) * | 2019-02-28 | 2020-09-03 | 재단법인 아산사회복지재단 | 자연살해세포 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 검출 방법 |
| CN112269024A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-26 | 上海捷门生物技术有限公司 | 白细胞介素-6的检测试剂、试纸、试剂盒及其应用 |
| CN113125695A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-16 | 潍坊三维生物工程集团有限公司 | 一种用于检测游离脂肪酸的试剂盒 |
| CN113406339A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-09-17 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒 |
| CN114397458A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-04-26 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒 |
| CN115819580A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-03-21 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 针对人il-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘颖: "提高白血病小鼠体内NK细胞活性的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, pages 12 - 13 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116875548A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-10-13 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种nk细胞活性培养管及其生产工艺 |
| CN116875548B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-01-02 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种nk细胞活性培养管及其生产工艺 |
| CN117471110A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-01-30 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种用于封闭抗原-微球指示***的封闭液及封闭方法 |
| CN117471110B (zh) * | 2023-12-27 | 2024-03-19 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种用于封闭抗原-微球指示***的封闭液及封闭方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116068207A (zh) | 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 | |
| US5122453A (en) | Method for discriminating surface stained lymphocytes | |
| AU678260B2 (en) | Method and device for detecting or measuring the amount of a cell-associated molecule | |
| Shimizu et al. | Proliferative activity of human thyroid tumors evaluated by proliferating cell nuclear antigen/cyclin immunohistochemical studies | |
| Sears et al. | Binding of intracellular protein to the erythrocyte membrane during incubation: the production of Heinz bodies | |
| CN110389221B (zh) | 一种用于分析CD1c+树突状细胞亚群表型和功能的组合配方试剂盒及其应用 | |
| CN112595765B (zh) | 一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法 | |
| CN110988364A (zh) | 一种应用流式细胞术检测移植后gvhd相关细胞因子的方法及检测试剂盒 | |
| Coulson et al. | Quantitation of cellular deoxyribonucleic acid by flow microfluorometry. | |
| Burger | [59] Assays for agglutination with lectins | |
| CN114609391A (zh) | 人胎盘生长因子测定试剂盒及其制备方法 | |
| Carpenter et al. | A biological assay for epidermal growth factor/urogastrone and related polypeptides | |
| Yam et al. | Immunocytochemical characterization of human blood cells | |
| KR900002840B1 (ko) | 안정화된 효소 결합체 조성물 | |
| FI96723C (fi) | Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä | |
| EP0170345A2 (en) | Flow cytometry | |
| CN115855779A (zh) | 一种定量检测nk细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法 | |
| US6534279B1 (en) | Reagent and method for the permeabilization and identification of erythrocytes | |
| Sen et al. | Kinetics and extent of repair of bleomycin-induced chromosome damage in quiescent normal human fibroblasts and human mononuclear blood cells | |
| Smith et al. | The characteristics of lymphocyte tritiated thymidine incorporation in response to mumps virus | |
| Cram et al. | Flow microfluorometric quantitation of the blastogenic response of lymphocytes. | |
| Anderson et al. | An immunoassay for heat shock protein 73/72: Use of the assay to correlate HSW3/72 levels in mammalian cells with heat response | |
| CN113295864A (zh) | 一种用于hiv抗原、抗体定量联合检测的试剂盒及检测方法 | |
| Hirata et al. | Enumeration of terminal deoxynucleotidyl transferase positive cells in leukemia/lymphoma by flow cytometry | |
| Libertin et al. | Analysis of Pneumocystis carinii cysts with a fluorescence-activated cell sorter |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230505 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |