CN111896736A - 活化血小板的检测方法和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种活化血小板的检测方法，包括将活化血小板标记试剂、血小板标记试剂和受试样品混合后通过免疫分析法考察所述受试样品中的血小板活化情况。偶联于活化血小板标志物的捕获抗体的第一标记物以及偶联于血小板标志物的捕获抗体的第二标记物的一种为标记微球，另一种为标记分子，使得在后续的检测过程中，所述标记微球能够作为免疫反应的载体并通过免疫分析法检测所述标记微球的特征信号来准确标定实际用作免疫反应载体的标记微球，从而无需同型对照就能够准确快速区分阴性微球和阳性微球，为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出与活化血小板相关的病例。本发明还提供了应用于所述检测方法的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及活化血小板的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
体内循环的血小板在许多病理情况下会由静息状态转为活化状态，例如脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、糖尿病、癌症和炎性反应性肠疾病等。由于活化血小板与许多疾病的发病率和死亡率关系密切，以及多种抗血小板药物在临床广泛应用，因此准确评估体内血小板活化的情况对鉴别风险人群及药物监测有着十分重要的意义。
活化血小板与静息的血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物，利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)可以对血小板和活化血小板膜上标志物进行定性分析，从而根据检测出的活化血小板的百分率来评估血小板的活化情况。例如公开号为CN110068682A的中国专利申请公开的用于诊断或预测白血病患者因细胞组织因子表达水平升高的血小板微颗粒的方法，就是采用流式细胞仪测定静息状态下的血小板以及活化状态下的血小板微颗粒。
然而，现有技术中应用流式细胞术对活化血小板进行检测，每个样本在检测时都需要作同型对照分析，使得操作步骤繁琐，不利于快速检测；更重要的是，血小板很容易受外界因素的影响，例如取血的过程就容易激活血小板，从而影响血小板的状态，因此，同型对照也不能保证得到的血小板是完全的活化或静息状态，会影响检测结果的准确性。
因此，有必要开发一种新型的检测方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活化血小板的检测方法以及应用所述检测方法的检测试剂盒，以简化检测步骤的同时能准确快速区分阴性样本和阳性样本，从而为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出与活化血小板相关的病例。
为实现上述目的，本发明的所述检测方法包括：
S1：提供活化血小板标记试剂、血小板标记试剂和受试样品；
所述活化血小板标记试剂包含活化血小板标志物的捕获抗体，以及偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体的第一标记物；
所述血小板标记试剂包含血小板标志物的捕获抗体，以及偶联于所述血小板标志物的捕获抗体的第二标记物；
所述第一标记物和所述第二标记物的一种为标记微球，另一种为标记分子；
S2：将所述活化血小板标记试剂、所述血小板标记试剂和所述受试样品混合，以形成待测样本；
S3：通过免疫分析法对所述待测样本进行测试，以考察所述受试样品中的血小板活化情况。
本发明的所述检测方法的有益效果在于：偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体的第一标记物以及偶联于所述血小板标志物的捕获抗体的第二标记物的一种为标记微球，另一种为标记分子，使得在后续的检测过程中，所述标记微球能够作为免疫反应的载体并通过免疫分析法检测所述标记微球的特征信号来准确标定实际用作免疫反应载体的标记微球，从而无需同型对照就能够准确快速区分阴性微球和阳性微球，为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出与活化血小板相关的病例。
优选的，所述标记微球与所述标记分子通过所述免疫分析法呈现的特征信号不同。其有益效果在于：有利于分析结果的准确性。
优选的，所述第一标记物的种类至少为1，所述第二标记物的种类至少为1。其有益效果在于：有利于分析结果的准确性。
进一步优选的，所述活化血小板标志物的捕获抗体的种类至少为1，所述血小板标志物的捕获抗体的种类至少为1。
进一步优选的，所述第一标记物的种类至少为2，不同的所述第一标记物标记不同种类的活化血小板标志物的捕获抗体。
进一步优选的，所述第二标记物的种类至少为2，不同的所述第二标记物标记不同种类的血小板标志物的捕获抗体。
本发明还提供了所述检测方法所应用的检测试剂盒，包括所述活化血小板标记试剂和所述血小板标记试剂。其有益效果请参见前述所述检测方法的有益效果，在此不做赘述。
优选的，所述标记微球为负载有第一荧光素的微球，所述标记分子为第二荧光素，所述第一荧光素和所述第二荧光素的激发波长不同。其有益效果在于：避免不同荧光素的特征信号之间的相互干扰，有利于检测结果的准确性。
进一步优选的，所述标记微球的直径为2-20微米。其有益效果在于：加强所述标记微球的特征信号强度，避免其他杂质信号的干扰。
进一步优选的，所述标记微球通过至少一种活化官能团偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体或所述血小板标志物的捕获抗体，所述至少一种活化官能团为活化的氨基、羧基、醛基和磺酸基中的至少一种。
进一步优选的，所述第一荧光素的发光波长范围的下限值与所述第二荧光素的发光波长范围的上限值之差不低于-100。
进一步优选的，所述第一荧光素的最大发射波长不低于600，所述第二荧光素的最大发射波长不高于600，所述第一荧光素与第二荧光素能被405nm、488nm和633nm波长中的至少一种光所激发。
进一步优选的，所述第一荧光素为PE-Cy5、APC、PerCP-Cy5.5、AlexaFluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750和Alexa Fluor790中的至少一种，所述第二荧光素为PE和FITC中的至少一种。
进一步优选的，所述活化血小板标志物为CD62P、CD63、PAC-1、CD107a和CD107b中的至少一种，所述血小板标志物为CD42a、CD42b、CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b和CD61中的至少一种。
优选的，所述活化血小板标志物捕获抗体和所述血小板标志物捕获抗体均为单抗。其有益效果在于：针对特定抗原表位，有利于检测结果的准确性。
附图说明
图1为本发明一些实施例的荧光微球单抗的结构示意图；
图2为本发明一些实施例的荧光单抗的结构示意图；
图3为本发明一些实施例的受试血样的血小板结构示意图；
图4为图1所示的荧光微球单抗、图2所示的荧光单抗与图3所示的血小板相结合形成的免疫复合物的结构示意图；
图5为本发明另一些实施例的免疫复合物的结构示意图；
图6为本发明又一些实施例的免疫复合物的结构示意图；
图7为本发明一种实施例的以PerCP通道采集的荧光信号的强度为Y轴，APC通道采集的荧光信号的强度为X轴得到的散点图；
图8为以标记微球在APC通道的荧光信号强度为Y轴，PE的荧光信号强度为X轴并关联图7所示P1后设十字门所得到的散点图；
图9为本发明另一种实施例的以PerCP通道采集的荧光信号的强度为Y轴，APC通道采集的荧光信号的强度为X轴得到的散点图；
图10为以标记微球在APC通道的荧光信号强度为Y轴，FITC的荧光信号强度为X轴并关联图9所示P1后设十字门所得到的散点图；
图11为本发明又一种实施例的以PerCP通道采集的荧光信号的强度为Y轴，APC通道采集的荧光信号的强度为X轴得到的散点图；
图12为以两种标记微球在APC通道的荧光信号强度为Y轴，PE的荧光信号强度为X轴并关联图11所示的P1后设十字门所得到的散点图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例所述的捕获抗体的含义为：能够与受试样品中的相关标志物发生免疫应答的特异性抗体。
针对现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种活化血小板的检测方法以及应用于所述检测方法的检测试剂盒。
本发明实施例的所述检测试剂盒包括活化血小板标记试剂和所述血小板标记试剂。
具体的，所述活化血小板标记试剂包含活化血小板标志物的捕获抗体，以及偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体的第一标记物；所述血小板标记试剂包含血小板标志物的捕获抗体，以及偶联于所述血小板标志物的捕获抗体的第二标记物。
本发明实施例的所述检测方法包括：将所述活化血小板标记试剂、所述血小板标记试剂和受试样品混合后通过免疫分析法考察所述受试样品中的血小板活化情况。
本发明一些实施例中，所述受试样品为受试血样。
本发明实施例中，所述第一标记物和所述第二标记物的一种为标记微球，另一种为标记分子，使得在后续的检测过程中，所述标记微球能够作为免疫反应的载体并通过免疫分析法检测所述标记微球的特征信号来准确标定实际用作免疫反应载体的标记微球，从而实现准确快速区分阴性微球和阳性微球，为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出与活化血小板相关的病例。
本发明一些实施例中，所述标记微球与所述标记分子通过所述免疫分析法呈现的特征信号不同，避免后续检测过程中所述标记微球与所述标记分子之间的特征信号相互干扰影响检测结果的准确性。所述免疫分析法包括流式细胞术。
本发明一些实施例中，所述免疫分析法为流式细胞术，所述标记微球为负载有第一荧光素的微球，所述标记分子为第二荧光素，所述第一荧光素和所述第二荧光素的激发波长不同，使得所述标记微球能够作为免疫反应的载体以形成免疫复合物，进而通过后续的流式细胞仪的不同检测通道分析免疫复合物的荧光信号，能够准确标定实际用作免疫反应载体的标记微球，从而准确区分阴性微球和阳性微球的占比。
本发明一些实施例中，所述标记微球与所述标记分子通过所述免疫分析法呈现的特征信号不同。
本发明一些实施例中，所述第一标记物的种类至少为1，所述第二标记物的种类至少为1。
本发明实施例1和2中，所述第一标记物的种类为1，所述第二标记物的种类为1。
图1为本发明一些实施例的荧光微球单抗的结构示意图。图2为本发明一些实施例的荧光单抗的结构示意图。
参照图1和图2，荧光微球单抗1包括第一标记微球11和偶联于所述第一标记微球11表面的活化血小板标志物的第一捕获单抗13，所述第一标记微球11内部包埋有第一荧光素12。荧光单抗2包括血小板标志物的捕获单抗22以及交联于所述血小板标志物的捕获单抗22的第二荧光素21。
图3为本发明一些实施例的受试血样的血小板结构示意图。图4为图1所示的荧光微球单抗、图2所示的荧光单抗与图3所示的血小板相结合形成的免疫复合物的结构示意图。
参照图3，血小板3一经活化，表面具有第一活化血小板标志物31、血小板标志物32和第二活化血小板标志物33。进一步参照图1至图4，所述荧光微球单抗1具有的所述活化血小板标志物的第一捕获单抗13能够与所述第一活化血小板标志物31结合以产生免疫应答，所述荧光单抗2具有的所述血小板标志物的捕获单抗22能够与所述血小板标志物32结合以产生免疫应答，由此形成图4所示的第一免疫复合物4。
进一步的，由于所述第一免疫复合物4同时具有所述第一荧光素12和所述第二荧光素21，控制所述第一荧光素12的激发波长与所述第二荧光素21的激发波长不同。
在后续的流式细胞术分析的过程中，一方面所述第一荧光素12能够在第一通道被激发，在第二通道无激发或仅有少量的激发，由此产生的通道信号能够成为所述第一标记微球11的特征信号；另一方面，所述第二荧光素21能够在第二通道被激发，由此产生的通道信号能够成为活化血小板的特征信号。
进一步的，所述第一标记微球11过量添加，以使所述第一标记微球11偶联的所述活化血小板标志物的第一捕获单抗13相对所述第一活化血小板标志物31而言一定是过量的，由此对所述第一免疫复合物4同时携带有所述第一荧光素12和所述第二荧光素21，未参与免疫应答的所述第一标记微球11携带有所述第一荧光素12，因此，采用所述第一标记微球11作为免疫反应的载体，在后续的免疫分析过程中只需要对所述第一标记微球11的荧光信号进行分析就能够统计出阴性微球和阳性微球的占比，从而避免了其他杂信号的干扰，为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出和活化血小板相关的病例。
图5为本发明另一些实施例的免疫复合物的结构示意图。
参照图4和图5，第二免疫复合物5与所述第一免疫复合物4的区别在于：所述第二免疫复合物中，所述活化血小板标志物的第一捕获单抗13携带所述第二荧光素21，而所述第一标记微球11偶联于所述血小板标志物的捕获单抗22。
与所述第一免疫复合物4相同的是，由于所述第一标记微球11过量添加，以使所述第一标记微球11偶联的所述血小板标志物的捕获单抗22相对所述血小板标志物32而言一定是过量的，所述第二免疫复合物5同时携带有所述第一荧光素12和所述第二荧光素21，未参与免疫应答的所述第一标记微球11携带有所述第一荧光素12，因此，采用所述第一标记微球11作为免疫反应的载体，在后续的免疫分析过程中只需要对所述第一标记微球11的荧光信号进行分析就能够统计出阴性微球和阳性微球的占比，从而避免了其他杂信号的干扰，为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出和活化血小板相关的病例。
本发明一些实施例中，所述第一标记物的种类至少为2，不同的所述第一标记物标记不同种类的活化血小板标志物的捕获抗体。
本发明一些实施例中，所述第二标记物的种类至少为2，不同的所述第二标记物标记不同种类的血小板标志物的捕获抗体。
图6为本发明又一些实施例的免疫复合物的结构示意图。
参照图3、图4和图6，第三免疫复合物6与所述第一免疫复合物4的区别在于：还具有结合于活化的所述血小板3的第二标记微球61，所述第二标记微球61偶联有活化血小板标志物的第二捕获单抗63，并包埋有第三荧光素62。所述第二捕获单抗63能够与所述第二活化血小板标志物33结合以产生免疫应答。
具体的，所述第三免疫复合物6同时携带有所述第一标记微球11和所述第二标记微球61，应用于流式细胞术分析的过程中，所述第一荧光素12和所述第三荧光素62均能够在第一通道被激发，在第二通道无激发或仅有少量的激发，由此产生的通道信号能够成为所述第一标记微球11和所述第二标记微球61的特征信号；另一方面，所述第二荧光素21能够在第二通道被激发，由此产生的通道信号能够成为活化血小板的特征信号。使用两种标记微球作为免疫反应的载体，在后续的免疫分析过程中通过对两种微球的荧光信号进行比对分析能够进一步准确统计阳性微球的占比。
本发明一些实施例中，所述活化血小板标志物的第二捕获单抗63与所述活化血小板标志物的第一捕获单抗13的种类不同，分别用于与所述血小板3的不同种类的活化血小板标志物发生免疫应答。
本发明一些实施例中，所述第三荧光素62与所述第一荧光素12为同一种类荧光素或不同种类的荧光素。
本发明一些实施例中，当所述第三荧光素62与所述第一荧光素12为同一种类的荧光素，所述第三荧光素62与所述第一荧光素12具有不同的浓度，以使所述第一标记微球11和所述第二标记微球61具有不同强度的荧光信号。
本发明一些实施例中，所述第一标记微球11与所述第二标记微球61为同一种类的微球或不同种类的微球。
本发明一些实施例中，所述活化血小板标志物的捕获抗体的种类至少为1，所述血小板标志物的捕获抗体的种类至少为1。所述活化血小板标志物为CD62P、CD63、PAC-1、CD107a和CD107b中的至少一种。所述血小板标志物为CD42a、CD42b、CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b和CD61中的至少一种。
本发明实施例1中，所述活化血小板标志物为CD62P，所述血小板标志物分别为CD61，所述活化血小板标志物的捕获单抗偶联于所述标记微球。
本发明实施例2中，所述活化血小板标志物为CD62P，所述血小板标志物为CD42b，所述血小板标志物的捕获单抗偶联于所述标记微球。
本发明实施例3中，所述活化血小板标志物为CD63和CD62P，所述血小板标志物为CD42a。CD63的捕获单抗和CD62P的捕获单抗分别偶联于同一种类但具有不同荧光强度的标记微球。
本发明一些实施例中，所述标记微球的直径为2-20微米。
本发明实施例1-3中的标记微球的直径分别为2微米、10微米和20微米。
本发明一些实施例中，所述标记微球由微球包埋所述第一荧光素形成。具体的包埋方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
本发明一些实施例中，所述微球为聚合物微球。
本发明实施例1-3中，所述微球均为聚苯乙烯(Polystyrene，PS)微球。
本发明一些实施例中，所述标记微球通过至少一种活化官能团偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体或所述血小板标志物的捕获抗体，所述至少一种活化官能团为活化的氨基或活化的羧基。
本发明一些实施例中，所述至少一种活化官能团为活化的氨基、羧基、醛基和磺酸基中的至少一种。
本发明实施例1和实施例2的活化官能团为活化的羧基，实施例3的活化官能团为活化的氨基。
本发明一些实施例中，所述第一荧光素的发光波长范围的下限值与所述第二荧光素的发光波长范围的上限值之差不低于-100，以最大限度减少不同荧光素的特征信号之间的相互干扰，有利于检测结果的准确性。
本发明一些实施例中，所述第一荧光素的最大发射波长不低于600，所述第二荧光素的最大发射波长不高于600，所述第一荧光素与第二荧光素能被405nm、488nm和633nm波长中的至少一种光所激发。
进一步的，所述第一荧光素为PE-Cy5、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)、PerCP-Cy5.5、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、AlexaFluor750和AlexaFluor790中的至少一种，所述第二荧光素为藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)和异硫氰酸(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)中的至少一种。
本发明一些实施例中，所述第二荧光素为PE和FITC中的至少一种。
本发明实施例1中，包埋于所述标记微球中的所述第一荧光素为PE-Cy5。
本发明实施例2中，包埋于所述标记微球中的所述第一荧光素为APC。
本发明实施例3中，分别包埋于两种标记微球中的第一荧光素均为PerCP-Cy5.5。
本发明实施例1和实施例3的所述第二荧光素均为PE，实施例2的所述第二荧光素为FITC。
本发明一些实施例中，所述活化血小板标记试剂还具有第一缓冲液，以分散所述活化血小板标志物的捕获抗体。
本发明实施例1中，所述第一缓冲液为浓度50毫摩尔/升，pH值为6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液，所述活化血小板标志物的捕获单抗的浓度为500微克/毫升，所述标记微球的浓度为10×107个/毫升。
本发明实施例2中，所述第一缓冲液为浓度100毫摩尔/升，pH值为9.0的碳酸盐缓冲液，所述活化血小板标志物的捕获单抗的浓度为10微克/毫升，所述第二荧光素的浓度为5毫克/毫升。
本发明实施例3中，用于分别分散两种活化血小板标志物的捕获抗体的第一缓冲液均为浓度10毫摩尔/升，pH值为7.4的PBS缓冲液；两种活化血小板标志物的捕获抗体的浓度均为200微克/毫升，两种标记微球的浓度均为5×107个/毫升。
本发明一些实施例中，所述血小板标记试剂还具有第二缓冲液，以分散所述血小板标志物的捕获抗体。
本发明实施例1中，所述第二缓冲液为浓度10毫摩尔/升，pH值为7.4的PBS缓冲液，所述血小板标志物的捕获单抗的浓度为0.1毫克/毫升，所述第二荧光素的浓度为0.1毫克/毫升。
本发明实施例2中，所述第二缓冲液为浓度50毫摩尔/升，pH值为6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液，所述血小板标志物的捕获单抗的浓度为2.0毫克/毫升，所述标记微球的浓度为1×107个/毫升。
本发明实施例3中，所述第二缓冲液为浓度100毫摩尔/升，pH值为7.0的磷酸盐缓冲液，所述血小板标志物的捕获单抗的浓度为5.0毫克/毫升，所述第二荧光素的浓度为5.0毫克/毫升。
本发明实施例提供了偶联有所述标记微球的捕获抗体的制备方法，包括：提供所述标记微球和所述捕获抗体，对所述标记微球进行活化处理后，对得到的活化标记微球和所述捕获抗体进行偶联反应，得到偶联有所述标记微球的所述捕获抗体。
具体的，所述捕获抗体为所述活化血小板标志物的捕获抗体和所述血小板标志物的捕获抗体中的任意一种。
所述活化处理具体为：将每种标记微球的悬液和偶联剂混合以形成第一混合液；然后将所述第一混合液在15-25摄氏度下旋转反应0.5小时以活化所述标记微球的官能团，得到第一反应液；最后使用缓冲液对所述第一反应液在2-8摄氏度、800g的离心力下进行反复离心处理以去除未反应的偶联剂，并得到沉降微球。其中，偶联剂的用量相对于所述标记微球的官能团含量而言是过量的，以确保所述标记微球的官能团能全部形成活化官能团。
本发明实施例1的活化处理中，所述标记微球的悬液浓度为10×107个/毫升，体积为1毫升，所述标记微球的官能团摩尔含量为0.01微摩尔/毫升；使用的偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，EDC和NHS在所述第一混合液中的浓度均为5毫克/毫升；使用的缓冲液是浓度为50毫摩尔/升，pH为6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液。
本发明实施例2的活化处理与实施例1的活化处理的区别在于：所述标记微球的悬液浓度为1×107个/毫升，所述标记微球的官能团摩尔含量为0.5微摩尔/毫升。
本发明实施例3的活化处理与实施例1的活化处理的区别在于：每种标记微球的悬液浓度为5×107个/毫升，每种标记微球的官能团摩尔含量为1微摩尔/毫升；使用的偶联剂为戊二醛。
所述偶联反应具体为：将所述捕获抗体与所述沉降微球混合后，在15-25摄氏度下进行4小时的旋转反应，得到第二反应液；对所述第二反应液进行在2-8摄氏度、800g的离心力下进行5分钟的离心处理以去除未反应的捕获单抗，得到偶联有所述标记微球的捕获抗体。
本发明实施例1的偶联反应中，所述沉降微球的体积为1毫升，所述捕获单抗的添加量为500微克。
本发明实施例2的偶联反应与实施例1的偶联反应的区别在于：所述捕获单抗的添加量为10微克。
本发明实施例3的偶联反应与实施例1的偶联反应的区别在于：所述捕获单抗的添加量为200微克。
本发明实施例还提供了偶联有所述标记分子的捕获抗体的制备方法，包括：提供所述标记分子和所述捕获抗体，通过室温交联反应得到所述偶联有所述标记分子的捕获抗体。
具体的，所述捕获抗体为所述活化血小板标志物的捕获抗体和所述血小板标志物的捕获抗体中的任意一种。
所述室温交联反应具体为：使用还原剂在15-25摄氏度下对所述捕获抗体进行0.5-1小时的旋转反应以得到活化的捕获抗体；使用活化剂在15-25摄氏度下对所述标记分子旋转反应4小时以得到活化的标记分子；将所述活化的捕获抗体和所述活化的标记分子在15-25摄氏度下旋转反应4小时，然后通过分子筛筛选出偶联有所述标记分子的捕获抗体。
具体的，所述分子筛是货号为151-0140的Bio-Rad Bio-GelA-0.5m gel分子筛。
本发明实施例1的室温交联反应中，还原剂为DTT，还原剂与所述血小板标志物的捕获单抗的摩尔比为20：1；活化剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，SMCC与所述标记分子的摩尔比为1：20；所述活化的捕获抗体和所述活化的标记分子的摩尔比为1：2。
本发明实施例2的室温交联反应与实施例1的室温交联反应的区别在于：使用的所述标记分子为FITC，且不需要使用还原剂和活化剂，所述捕获抗体与所述标记分子的摩尔比为1:5。
本发明实施例3的室温交联反应与实施例1的室温交联反应的区别在于：使用的还原剂为三(2-羧乙基)膦，即Tris(2-carboxyethyl)phosphine，简记为TCEP。所述活化的捕获抗体和所述活化的标记分子的摩尔比为1:5。
本发明实施例还提供了所述检测试剂盒在考察所述受试样品中的血小板活化情况方面的应用，以不需要使用同型对照就能够准确快速区分阴性微球和阳性微球，从而为临床诊断提供可信度高的依据，以快速筛查出和活化血小板相关的病例。
具体的，所述应用包括分别对所述第一试剂和所述第二试剂进行稀释，然后混合受试血样以通过流式细胞术考察所述受试血样的血小板活化情况。
本发明实施例1-3中，所述受试血样为全血。
以实施例1为例，所述应用具体包括：将稀释后的活化血小板标记试剂和所述受试血样于流式管中混匀，然后加入稀释后的血小板标记试剂混匀并避光孵育30分钟；所述孵育完成后，向流式管加入浓度为2％的200微升的多聚甲醛溶液并混匀，然后在2-8摄氏度下避光固定30分钟，得到待测样本；通过流式细胞仪对所述待测样本进行检测和数据分析。
本发明实施例1-3中，使用来源于美国BD公司的型号为FACS Calibur的流式细胞仪对所述待测样本进行检测和数据分析。具体的检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
本发明实施例1-3的所述应用中，使用含0.1％BSA和0.1％Proclin300且pH值为7.4，浓度为10毫摩尔/升的PBS缓冲液稀释所述活化血小板标记试剂和所述血小板标记试剂，使偶联有所述活化血小板标志物的捕获单抗的标记微球的个数分别为2×104个、5×104个和10×104个。
本发明实施例1-3的所述应用中，所述受试血样的体积分别为2微升、5微升和10微升。
本发明实施例1-3中，稀释后的偶联有标记分子的捕获抗体的浓度均为0.1微克/毫升，所述捕获抗体为所述活化血小板标志物和所述血小板标志物中的任意一种的捕获抗体；所述血小板标记试剂的体积分别为5微升、10微升和20微升，所述活化血小板标记试剂的体积分别为5微升、10微升和20微升。
以实施例1为例，参照图1和图4，所述数据分析包括：
S1：以PerCP通道采集的荧光信号的强度为Y轴，APC通道采集的荧光信号的强度为X轴，得到图7所示的散点图，并于图7中设门P1以圈定所述第一标记微球11。
所述第一标记微球11的荧光信号由游离的所述第一标记微球11提供的信号以及参与免疫反应的所述第一标记微球11提供的信号共同组成，通过P1门能够准确圈定流式管中所有的所述第一标记微球11。
具体的，由于所述第一免疫复合物4和游离的所述第一标记微球11均携带有所述第一荧光素12，所述第一免疫复合物4还携带有所述第二荧光素21，因此在PerCP通道和APC通道都能够采集到所述第一标记微球11的特定荧光信号。进一步的，通过两个通道均采集是所述第一标记微球11的特定荧光信号，能够相互检验特定荧光信号确实来源于所述第一标记微球11，以避免杂质信号的干扰。
S2：以所述第一标记微球11在APC通道的荧光信号强度为Y轴，PE的荧光信号强度为X轴做散点图并关联P1，然后设十字门，得到图8所示的散点图。
实施例1中，参照图4和图8，实施例1的所述第二荧光素21为PE，由于用于检测的所述第一标记微球11是过量的，所述第一标记微球11中，低PE表达的荧光信号指示了没有结合血样中的活化血小板的所述第一标记微球11，即游离的所述第一标记微球11分布在Q1象限；高PE表达的荧光信号指示了结合血样中的活化血小板的所述第一标记微球11，并分布在了Q2象限。Q1与Q2象限的微球分布互不重叠且边界清晰，有助于统计结果的准确可靠。
因此，Q2象限统计的微球为阳性微球，Q1象限统计的微球为阴性微球，临床应用中，以Q2象限微球百分数占比，即阳性微球的数目占阳性微球和阴性微球总数目的百分比作为判断血小板活化情况的指标。
实施例1的全血包括5个健康人员的全血样本，样本编号为N1-1、N1-2、N1-3、N1-4和N1-5，以形成健康实验组；实施例1的全血还包括5个患者的全血样本，样本编号为P1-1、P1-2、P1-3、P1-4和P1-5，以形成患者实验组。这里的健康人员指无血栓相关疾病或症状，并未服用过血小板活化药物的人员；患者指患有心梗的人员。
对10个全血样本分别采用所述应用来考察血小板的活化情况，统计得到的Q2象限微球百分数占比的结果请参见表1。
表1
图9为本发明实施例2的以PerCP通道采集的荧光信号的强度为Y轴，APC通道采集的荧光信号的强度为X轴得到的散点图。图10为以所述第一标记微球11在APC通道的荧光信号强度为Y轴，FITC的荧光信号强度为X轴做散点图并关联图9所示的P1后设十字门所得到的散点图。从图10中可以看到，Q1和Q2象限的微球分布互不重叠且边界清晰，有助于统计结果的准确可靠。
对实施例2的10个全血样本分别采用所述应用来考察血小板的活化情况，统计得到的Q2象限微球百分数占比的结果请参见表2。其中，样本编号为N2-1、N2-2、N2-3、N2-4和N2-5的样本形成健康实验组，样品编号为P2-1、P2-2、P2-3、P2-4和P2-5的样本形成患者实验组。
表2
图11为本发明实施例3的以PerCP通道采集的荧光信号的强度为Y轴，APC通道采集的荧光信号的强度为X轴得到的散点图。图12为以所述第一标记微球11和所述第二标记微球61在APC通道的荧光信号强度为Y轴，PE的荧光信号强度为X轴做散点图并关联图11的P1后设十字门得到的散点图。
参照图8和图12，实施例3使用了两种不同的捕获单抗分别结合两种活化血小板标志物，且两种捕获单抗所分别偶联的标记微球均为PS微球，但包埋的荧光素的浓度不同，使得图12的Q2象限的阳性微球的信号强度更强，更有助于统计结果的准确性。
对实施例3的10个全血样本分别采用所述应用来考察血小板的活化情况，统计得到的Q2象限微球百分数占比的结果请参见表3。其中，样本编号为N3-1、N3-2、N3-3、N3-4和N3-5的样本形成健康实验组，样品编号为P3-1、P3-2、P3-3、P3-4和P3-5的样本形成患者实验组。
表3
参见表1、表2和表3，患者实验组的Q2象限微球百分数占比要明显高于健康实验组的Q2象限微球百分数占比。具体的，患者实验组的Q2象限微球百分数占比均高于10％，健康实验组的Q2象限微球百分数占比不超过5％。
上述结论的临床意义在于，通过本发明实施例的所述检测试剂盒能够得到足够多的与某种活化血小板相关疾病的检测样本的Q2象限微球百分数占比，并与健康实验组的Q2象限微球百分数占比相比较并进行统计分析，能够提供出能够作为临床参考的Q2象限微球百分数占比，例如10％。在临床检测中将患者全血样本的Q2象限微球百分数占比与10％做比较，若患者全血样本的Q2象限微球百分数占比不低于10％，能够快速认定该患者罹患相关疾病的概率很大，进而能够极大缩短诊疗判断时间，使该患者尽快进入相关疾病的细致筛查确认阶段。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。
Claims (15)
1.一种活化血小板的检测方法，其特征在于，包括：
S1：提供活化血小板标记试剂、血小板标记试剂和受试样品；
所述活化血小板标记试剂包含活化血小板标志物的捕获抗体，以及偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体的第一标记物；
所述血小板标记试剂包含血小板标志物的捕获抗体，以及偶联于所述血小板标志物的捕获抗体的第二标记物；
所述第一标记物和所述第二标记物的一种为标记微球，另一种为标记分子；
S2：将所述活化血小板标记试剂、所述血小板标记试剂和所述受试样品混合，以形成待测样本；
S3：通过免疫分析法对所述待测样本进行测试，以考察所述受试样品中的血小板活化情况。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标记微球与所述标记分子通过所述免疫分析法呈现的特征信号不同。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一标记物的种类至少为1，所述第二标记物的种类至少为1。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述活化血小板标志物的捕获抗体的种类至少为1，所述血小板标志物的捕获抗体的种类至少为1。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述第一标记物的种类至少为2，不同的所述第一标记物标记不同种类的活化血小板标志物的捕获抗体。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述第二标记物的种类至少为2，不同的所述第二标记物标记不同种类的血小板标志物的捕获抗体。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的检测方法所应用的检测试剂盒，其特征在于，包括所述活化血小板标记试剂和所述血小板标记试剂。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记微球为负载有第一荧光素的微球，所述标记分子为第二荧光素，所述第一荧光素和所述第二荧光素的激发波长不同。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记微球的直径为2-20微米。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记微球通过至少一种活化官能团偶联于所述活化血小板标志物的捕获抗体或所述血小板标志物的捕获抗体，所述至少一种活化官能团为活化的氨基、羧基、醛基和磺酸基中的至少一种。
11.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光素的发光波长范围的下限值与所述第二荧光素的发光波长范围的上限值之差不低于-100。
12.根据权利要求11所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光素的最大发射波长不低于600，所述第二荧光素的最大发射波长不高于600，所述第一荧光素与第二荧光素能被405nm、488nm和633nm波长中的至少一种光所激发。
13.根据权利要求12所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光素为PE-Cy5、APC、PerCP-Cy5.5、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、AlexaFluor700、Alexa Fluor750和AlexaFluor790中的至少一种，所述第二荧光素为PE和FITC中的至少一种。
14.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述活化血小板标志物为CD62P、CD63、PAC-1、CD107a和CD107b中的至少一种，所述血小板标志物为CD42a、CD42b、CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b和CD61中的至少一种。
15.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述活化血小板标志物捕获抗体和所述血小板标志物捕获抗体均为单抗。
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