CN109030816A - 用于诊断肝素诱导血小板减少症的活化试验 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断肝素诱导血小板减少症的活化试验。具体而言，本发明涉及用于确定肝素诱导血小板减少症(HIT)的功能性、易自动化试验。其测量的是来自活化血小板的PF4(血小板因子4)的分泌。

Description

用于诊断肝素诱导血小板减少症的活化试验
技术领域
本发明属于体外诊断领域，并且涉及用于确定肝素诱导血小板减少症的功能性、易自动化的试验。
背景技术
肝素诱导血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia，HIT)是一种血栓性疾病，其可能发生在肝素治疗期间并且可能造成危及生命的血栓栓塞并发症。患者生成与肝素和血小板因子4(PF4)组成的复合物结合的抗体，该抗体被称为抗PF4/肝素复合物抗体。在体内，结合抗体的PF4/肝素复合物结合到血小板表面，并且造成血小板的活化。这导致血小板计数的减少以及血栓栓塞风险的增加。
HIT诊断中主要用到两条试验原理。第一试验原理是基于对患者体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的直接检测。为此，样本与PF4/肝素复合物或由PF4和另一合适聚阴离子(诸如聚乙烯磺酸根)组成的复合物接触，并且使用传统免疫测定法方法(例如，ELISA)检测存在于样本中的任意抗PF4/肝素复合物抗体的结合。然而，尽管抗PF4/肝素复合物抗体的检测是敏感的，但是缺点在于其不够特定，即抗体的检测不足以做出阳性的HIT诊断，而阴性结果会合适可靠地排除HIT。因此，建议采用基于第二试验原理的功能性试验进行确认。
第二功能性试验原理基于对抗PF4/肝素复合物抗体的血小板活化行为的检测。在所述试验原理中，从一个或多个正常供体上洗涤得到的血小板与来自患者的血浆或血精样本混合并且与肝素混合，并且基于已知活化标记，诸如基于所释放的血清素(血清素释放试验)的量或基于可目测识别的血小板聚集反应(HIPA试验)，测量血小板的活化。如果患者样本包含抗PF4/肝素复合物抗体，则可以确立相比正常样本(没有此类抗体)增加的血小板的活化。
迄今为止，不能在传统实验室中也不能以自动的方式执行两个所述功能性试验原理，因为其需要复杂的人工操作，因此只能由训练过的人员执行。此外，血清素释放试验需要通过离心步骤移除血小板并使用放射性物质。
发明内容
本发明的目的是：提供避免上述缺点的用于检测体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的功能性方法。
已经发现的是，通过对包含所查样本、血小板和肝素(或功能等同的PF4结合性多糖或聚阴离子)的反应混合物中PF4进行定量确定，可以确定样本是否包含抗PF4/肝素复合物抗体。所述反应混合物中，包含抗PF4/肝素复合物抗体的样本明显会造成血小板中PF4的分泌，这意味着反应混合物中PF4量的增加表明抗PF4/肝素复合物抗体的存在，并且因此表明肝素诱导血小板减少症的存在。
因此，本发明提供了一种检测体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的方法。该方法包括以下步骤：
i.通过将样本、包含血小板的试剂以及PF4结合性非支链多糖混合或与PF4结合性聚阴离子混合，提供反应混合物；
ii.温育反应混合物；并且之后
iii.确定反应混合物中PF4的量；
iv.将所确定的反应混合物中PF4的量与包含已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的供体体液样本的反应混合物中PF4的量的预定的参考值进行比较；并且
v.当确定在反应混合物中的PF4的量超过参考值时，确立抗PF4/肝素复合物抗体的存在于样本中。
体液样本优选地来自人。优选地，体液样本基本上不含血小板，并尤其是血浆或血清。
对于提供反应混合物所需要的包含血小板的试剂优选地为洗涤且重新悬浮的人类血小板的悬浮液。血小板优选地来自已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的一个或多个健康供体。例如，合适的包含血小板的试剂是通过对柠檬酸钠全血样本进行离心制备成的，还优选地添加有水蛭素，以获取富含血小板的血浆。再次向富含血小板的血浆中添加柠檬酸钠溶液和三磷酸腺苷双磷酸酶，再次执行离心，并且随后丢弃无细胞的上清液。最后，沉淀的血小板被聚集在缓冲悬浮溶液中。
体液样本进一步与PF4结合性非支链多糖或与PF4结合性聚阴离子混合。已知需要检测的通过抗PF4/肝素复合物抗体结合的与PF4形成复合物的多种PF4结合性物质。例如，合适的非支链多糖为肝素、未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)、低分子量肝素(LMWH)、葡聚糖硫酸酯(dextran sulfate)和岩藻多糖。例如，合适的聚阴离子为聚乙烯硫酸根、聚乙烯磺酸根、聚乙烯磷酸根、聚乙烯膦酸根、聚苯乙烯硫酸根和聚苯乙烯磺酸根。
在确定反应混合物中PF4的量之前，将反应混合物温育一段时间以使得PF4结合性非支链多糖或聚阴离子与存在于样本中的PF4蛋白质能够形成复合物，使得推测存在于样本中的抗PF4/肝素复合物抗体能够结合到形成的复合物，以及最终使得通过将结合抗体的复合物结合到血小板表面而能够活化血小板。典型的温育时间在5到10分钟之间，优选地在+37℃。
在充分温育之后，执行步骤以确定反应混合物中PF4的量。可以以多种方式执行反应混合物中PF4的量的确定。优选的是通过使至少一种PF4结合伴侣，诸如抗PF4抗体或肝素或PF4结合性非支链多糖或PF4结合性聚阴离子，与反应混合物接触来确定反应混合物中PF4的量的结合试验。例如，可以通过使反应混合物(全部或部分地)与固相缔合的PF4结合伴侣接触而实现。通过洗涤移除未结合成分，并且在第二被标记PFA结合伴侣(ELISA技术)的辅助下确定结合到固相的PF4蛋白质的量。具体的合适的抗PF4抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，该单克隆抗体或多克隆抗体具有对自由PF4的特异性，即其具有对未结合到肝素或功能等同的多糖或聚阴离子的PF4的特异性，或者为结合到自由和复合PF4蛋白质的单克隆抗体或者多克隆抗体。
特别优选的是均质免疫测定法，使用该方法可以省去未结合成分的移除以及因此产生的洗涤步骤。为此，反应混合物(全部或部分地)与第一抗PF4抗体和第二抗PF4抗体混合，并且与信号形成***的第一组分和第二组分混合。信号形成***的组分相互作用，从而在信号形成***的第一和第二组分接近彼此时形成可检测的信号。就此而言，第一抗PF4抗体在反应混合物温育期间处于与信号形成***的第一组分缔合的状态或者与信号形成***的第一组分缔合，并且第二抗PF4抗体在反应混合物温育期间处于与信号形成***的第二组分缔合的状态或与信号形成***的第二组分缔合。
均质PF4免疫测定法的一个实施例中，信号形成***的组分为颗粒固相，例如，乳胶颗粒、通过比浊法或散射测浊法来确定其凝集。为此，信号形成***的第一组分由第一颗粒固相构成，其特征为所述颗粒固相处于与第一抗PF4抗体缔合的状态，或可与第一抗PF4抗体缔合。第一颗粒固相可以处在经由共价键或结合对X/Y与第一抗PF4抗体结合的状态，或可以经由结合对X/Y在反应混合中与之结合。此外，信号形成***的第二组分由第二颗粒固相构成，其特征为所述颗粒固相处于与第二抗PF4抗体缔合的状态，或可与第二抗PF4抗体缔合。第二颗粒固相可以处在经由共价键或结合对A/B与第二抗PF4抗体结合的状态，或可以经由结合对A/B在反应混合中与之结合。大约在1920年就已知了基于颗粒增强的光散射原理的免疫测定法(综述见Newman,D.J.等人，颗粒增强的光散射免疫测定法(Particleenhanced light scattering immunoassay).Ann Clin Biochem，1992；29:22–42)。优选地，使用直径在0.1μm到0.5μm，特别优选地直径在0.15μm到0.35μm的聚苯乙烯颗粒。优选地，使用具有胺基、羧基或乙醛官能基的聚苯乙烯颗粒。进一步优选地，使用壳/核颗粒。例如，在Peula,J.M.等人，抗体在聚合物载体上与醛基的共价耦合(Covalent coupling ofantibodies to aldehyde groups on polymer carriers).Journal of MaterialsScience：Materials in Medicine，1995；6:779–785.中描述了颗粒的合成和配合基的共价耦合。
在均质PF4免疫测定法的另一实施例中，信号形成***包括至少一种第一组分和一种第二组分，其相互作用从而在彼此接近时形成可检测的信号，并且因此可以相互作用。尤其地，应当将组分之间的相互作用理解为表示能量转移，即组分之间的直接能量转移，例如通过光或电子辐射，以及经由活性化学分子，诸如短时间存在的单态氧。能量转移可以是从一个组分到另一个组分地发生，但是大量不同物质之间的能量转移也是可能的。例如，组分可以为由能量供体和能量受体，诸如光敏剂和化学发光剂(EP-A2-0515194，技术)或光敏剂和荧光团(WO95/06877)或放射性碘<125>和荧光团(Udenfriend等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:8672–8676)或荧光团和荧光猝灭剂(US3,996,345)，组成的一对。特别优选地，信号形成***的第一组分为化学发光剂，而信号形成***的第二组分为光敏剂，或相反，并且测量反应混合物中的化学发光。
可以彼此相互作用的信号形成***的第一组分和/或第二组分可以经由共价方式或经由特定相互作用处在与颗粒固相缔合的状态，或处在所述颗粒固相中的嵌入状态。术语颗粒固相应当理解为表示非细胞、可悬浮颗粒，诸如金属溶胶、二氧化硅颗粒、磁性颗粒或，特别优选为胶乳颗粒。优选的是直径为0.01–10μm的颗粒，特别优选的是直径为0.1–1μm的颗粒。
信号形成***的第一组分的特征为所述第一组分处于与第一抗PF4抗体缔合的状态或可与第一抗PF4抗体缔合，其中，该信号形成***的组分相互作用从而在其接近彼此时形成可检测的信号，并且因此彼此相互作用。信号形成***的第一组分可以直接地处于与第一抗PF4抗体缔合的状态或可与第一抗PF4抗体缔合。优选地，信号形成***的第一组分可以间接地处于与第一抗PF4抗体缔合的状态或可与第一抗PF4抗体缔合。为此，信号形成***的第一组分处于与颗粒固相缔合的状态，此外，该颗粒固相经由共价方式或经由结合对X/Y处于与第一抗PF4抗体缔合的状态或可经由结合对X/Y与第一抗PF4抗体缔合。
信号形成***的第二组分的特征为所述第二组分处于与第二抗PF4抗体缔合的状态或可与第二抗PF4抗体缔合，其中，该信号形成***的组分相互作用从而在其接近彼此时形成可检测的信号，并且因此彼此相互作用。信号形成***的第二组分可以直接地处于与第二抗PF4抗体缔合的状态或可与第二抗PF4抗体缔合。优选地，信号形成***的第二组分可以间接地处于与第二抗PF4抗体缔合的状态或可与第二抗PF4抗体缔合。为此，信号形成***的第二组分处于与颗粒固相缔合的状态，此外，该颗粒固相经由共价方式或经由结合对A/B处于与配合基缔合的状态或可经由结合对A/B与配合基缔合。
在两中情况中，“结合伴侣X和Y”以及“结合伴侣A和B”是彼此特异地识别和结合的两个不同的分子。特异的识别和结合的实例为抗体-抗原相互作用、多核苷酸相互作用等。
合适的结合对X/Y和A/B尤其地是抗原/抗体组合，其中结合伴侣X或A为抗PF4抗体的抗原表位。抗原表位可以为抗体的自然序列或结构表位。抗原表位也可以为修饰后的抗PF4抗体的异源序列或结构表位。异源序列或结构表位的实例为FLAG标记或HIS标记或荧光素标记，它们具体地用于标记肽或蛋白质。进一步合适结合对X/Y和A/B分别为互补多核苷酸X和Y以及A和B。特别优选的结合对X/Y和A/B为FLAG标记/抗FLAG标记抗体、HIS标记/抗HIS标记抗体、荧光素/抗荧光素抗体、生物素/亲和素和生物素/链霉亲和素。
已经发现，使用所述均质免疫测定法，可以省去用于移除反应混合物中血小板的离心步骤。这表示的是方法序列的简化，使得可以在普通分析器中对方法进行自动处理。在根据本发明的方法的优选实施例中，所提供的反应混合物没有经过用于沉淀或移除血小板的离心步骤。
在确定反应混合物中PF4的量之后，将因此确定的PF4的量与预定的参考值进行比较。合适参考值为以相同方法在包含来自已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的供体的体液样本的反应混合物中确定或之前已确定的PF4的量。通常，为了确定来自已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的健康供体的多个样本中的参考值，确定PF4的量并且之后将其与来自患有HIT并具有抗PF4/肝素复合物抗体的供体的多个样本的PF4的量进行比较。例如，参考值可以是允许区分含有抗PF4/肝素复合物抗体的样本和不含抗PF4/肝素复合物抗体的样本的阈值。如果所确定的反应混合物中的PF4的量超过了参考值，那么可以确定样本中存在抗PF4/肝素复合物抗体。相对地，如果所确定的反应混合物中的PF4的量达不到参考值，则可以确定样本中不存在抗PF4/肝素复合物抗体。
本发明进一步提供一种用于诊断肝素诱导血小板减少症的方法，其中，使用根据本发明的方法检测患者体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的存在。
此外，本发明进一步提供了用于实施根据本发明的方法的试剂盒。试剂盒至少包括以下组分：
a.包含血小板的第一试剂；
b.包含PF4结合性非支链多糖或PF4结合性聚阴离子的第二试剂；以及
c.用于检测PF4的一种或多种试剂，其中至少一种试剂包含抗PF4抗体。
包含血小板的试剂优选地为洗涤且重新悬浮的人类血小板的悬液。血小板优选地来自已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的一个或多个健康供体。例如，通过对柠檬酸钠全血样本进行离心来制备合适的包含血小板的试剂，另外优选地添加有水蛭素，以获取富含血小板的血浆。再次向富含血小板的血浆中添加柠檬酸盐溶液和三磷酸腺苷双磷酸酶，再次实施离心，并且随后丢弃无细胞的上清液。最后，沉淀的血小板被聚集在缓冲悬浮溶液中。合适的包含血小板的试剂每升至少包含300x109血小板。
第二试剂包含：
·PF4结合性非支链多糖，其优选地来自由肝素、未分级肝素和低分子量肝素、葡聚糖硫酸根和岩藻多糖组成的组；或
·PF4结合性聚阴离子，其优选地来自由聚乙烯硫酸根、聚乙烯磺酸根、聚乙烯磷酸根、聚乙烯膦酸根、聚苯乙烯硫酸根和聚苯乙烯磺酸根组成的组。
第一和第二试剂用于提供带有体液样本的反应混合物。
试剂盒还包含用于检测PF4的一种或多种试剂，其中至少一种试剂包含抗PF4抗体。包含抗PF4抗体的试剂可以为固相缔合抗体，例如，结合胶乳颗粒或在微滴定平板的孔内的抗体。根据试验形式，试剂盒包含用于定量检测结合抗PF4抗体的PF4的附加组分，诸如包含标记有可检测的标记的第二抗体的试剂。
优选地试剂盒包含：包含第一抗PF4抗体的试剂以及包含第二抗PF4抗体的另一试剂。第一抗PF4抗体和/或第二抗PF4抗体可以处于与固相和/或分别与信号形成***的第一组分和第二组分缔合的状态，其中，该信号形成***的组分相互作用从而在接近彼此时形成可检测的信号。
可以以液体形式或冻干形式提供根据本发明的试剂盒的试剂。如果试剂盒中某些或所有试剂都以冻干的形式存在，则试剂盒可以附加地包含为溶解冻干所需的溶剂，诸如蒸馏水或合适的缓冲溶液。
具体实施方式
以下实例用于示出本发明，而不应被理解为限制性的。
实例1：用于检测抗PF4/肝素复合物抗体的均质免疫测定法
本文所用的技术涉及通过同时将耦合胶乳颗粒的化学发光化合物(Chemibeads)和耦合乳胶颗粒的光敏剂结合到分析物来使它们接近彼此，使得由光敏剂生成的单态氧可以刺激化学发光化合物。
将2μL加热灭活(在56℃加热30min)的人类血浆样本与7.5μL悬液以及10μL缓冲溶液混合并在37℃温育，其中，该悬液包含来自6个健康供体的洗涤的人类血小板(大约300x109血小板/L)，而该缓冲溶液包含0.2IU/mL肝素。10分钟后，将以下组分加入反应混合物：
·50μL“Chemibead”溶液，其包含在缓冲溶液中的涂覆化学发光化合物(2-(4-(N,N,十四烷基)-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩)的乳胶颗粒以及结合自由和复合PF4蛋白质(50μg/mL)的第一单克隆抗PF4抗体(MAK-23/064)；
·50μL抗体溶液，其包含结合自由和复合PF4蛋白质(5μg/m)的第二生物素化的单克隆抗PF4抗体(MAK-23/074)；以及
·100μL“Sensibead”溶液，其包括在缓冲溶液中的涂覆光敏剂化合物(二-(三己)-硅-正丁基-酞菁)的乳胶颗粒以及链霉亲和素(50μg/mL)。
约10分钟后，测量化学发光信号[千次]。
使用根据本发明的方法(下文中也称为“PF4释放”)测量来自10个HIT患者的血浆样本，这些患者都是基于临床标准(4T评分，在一些情况中伴有血栓的发生)被诊断出HIT的，并且使用两种独立、市售的免疫测定法(AcuStar HIT-Ab(PF4-H)、Instrumentation Laboratories以及HPIA-IgG,Diagnostica Stago)确定抗PF4/肝素复合物抗体的存在。
此外，使用根据本发明的方法测量来自7个健康供体(其存在临床HIT标准并且不具有抗PF4/肝素复合物抗体)的血浆样本，并测量来自正常供体的正常血浆库(健康供体的约20份血浆，“FNP”)。
为了对PF4释放试验“100％控制”，使用包含活化血小板的抗PF4/肝素复合物抗体(50μg/mL)的抗体溶液，而不使用血浆样本，以便确定所用含血小板试剂的最大可能PF4分泌量。为了确定PF4分泌的百分比(PF4释放[％],)，将以千次计的原始值转换为100％控制的原始值的比率。
出于比较的目的，根据被视为黄金标准的Sheridan,D.等人(1986)的肝素诱导血小板减少症的诊断检验.Blood67(1)：27–30，还使用[14C]-血清素释放试验(在下文中也称为“SRA”)测量所述样本。
试验结果列于表1。
表1：根据本发明比较PF4释放试验与用于诊断HIT的SRA试验
显然的是，根据本发明的方法的结果与SRA黄金标准试验的结果紧密相关。在所有包含HIT患者样本的反应混合物中，可以检测到相比于健康供体而言显著增加的PF4浓度。作为包含抗PF4/肝素复合物抗体的样本与不含抗PF4/肝素复合物抗体的样本的区别的阈值(截止值)，可以将PF4释放值限定为≥15％，甚至≥20％(SRA实验的截止值：≥20％)。然而，为了在统计上更为精确地对截止值进行限定，需要测量更多的样本。

Claims (10)

1.一种用于检测体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过将所述样本与包含血小板的试剂并且与PF4结合性非支链多糖或PF4结合性聚阴离子混合，提供反应混合物；
ii.温育所述反应混合物；并且之后
iii.确定所述反应混合物中PF4的量；
iv.将所确定的所述反应混合物中PF4的量与包含供体体液样本的反应混合物中PF4的量的预定参考值进行比较，所述供体体液样本已知不含抗PF4/肝素复合物抗体；并且
v.当确定的所述反应混合物中PF4的量超过所述参考值时，确立所述抗PF4/肝素复合物抗体存在于所述样本中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述包含血小板的试剂包含来自已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的一个或多个健康供体的人类血小板。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中，通过使至少一种抗PF4抗体与所述反应混合物接触来确定所述反应混合物中PF4的量。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，使以下各项与所述反应混合物混合：
·第一抗PF4抗体和第二抗PF4抗体，以及
·信号形成***的第一组分和第二组分，所述第一组分和所述第二组分相互作用从而在所述信号形成***的所述第一组分和所述第二组分极接近彼此时形成可检测的信号，
并且其中，所述第一抗PF4抗体在所述反应混合物的所述温育期间处于与所述信号形成***的所述第一组分缔合的状态或者与所述信号形成***的所述第一组分缔合，并且其中所述第二抗PF4抗体在所述反应混合物的所述温育期间处于与所述信号形成***的所述第二组分缔合的状态或者与所述信号形成***的所述第二组分缔合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在每种情况下所述信号形成***的所述第一组分和所述第二组分都包含颗粒固相，并且其中，对所述颗粒固相在所述反应混合物中的凝集进行测量。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述信号形成***的所述第一组分为化学发光剂，而所述信号形成***的所述第二组分为光敏剂，或相反，并且其中，测量所述反应混合物中的化学发光。
7.根据权利要求4到6中任一项所述的方法，其中，所提供的反应混合物不经历用于去除血小板的离心步骤。
8.一种用于诊断肝素诱导血小板减少症的方法，其中，使用根据权利要求1到7中任一项所述的方法检测来自患者的体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的存在。
9.一种测定试剂盒，用于进行根据权利要求1到8中任一项所述的方法，所述试剂盒包含以下组分：
a.包含血小板的第一试剂；
b.包含PF4结合性非支链多糖或PF4结合性聚阴离子的第二试剂；
以及
c.用于检测PF4的一种或多种试剂，其中至少一种试剂包含抗PF4抗体。
10.根据权利要求9所述的测定试剂盒，其中，所述第二试剂包含：
·PF4结合性非支链多糖，来自由肝素、未分级肝素、低分子量肝素、葡聚糖硫酸酯和岩藻多糖组成的组；或
·PF4结合性聚阴离子，来自由聚乙烯硫酸根、聚乙烯磺酸根、聚乙烯磷酸根、聚乙烯膦酸根、聚苯乙烯硫酸根和聚苯乙烯磺酸根组成的组。
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