CN111893049A - 一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明采用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)ATCC1381为原始菌株，通过基因工程手段在大肠杆菌中构建过表达载体，选择博莱霉素作为筛选抗性基因，真核生物的高保守序列18S rRNA作为同源臂，将线性化的过表达片段电转进入裂殖壶菌内，得到一株高产角鲨烯的基因工程菌株，为微生物生产角鲨烯以及产品工业化奠定了理论基础。

Description

一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其 构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
角鲨烯是由6个异戊二烯单位构成的脂质不皂化物，因其具有防御病毒、延缓衰老、抗击肿瘤等多种功效而被广泛用于食品、医疗、美容等领域。角鲨烯目前市场的主要来源是鲨鱼肝油，植物油中含量也较为丰富。随着角鲨烯的市场需求逐日上升，自然资源限制和化学合成方法复杂的反应以及极低的产率使角鲨烯满足不了需求，所以利用微生物资源生产角鲨烯的方式已经成为未来的发展趋势。这种方式凭借着周期短、操作简单、生产潜力大等优势引起了人们极大的关注。破囊壶菌、微藻、酵母以及类酵母是近年来研究的热点。有报道显示，从海水中筛选出来的破囊壶菌18W-13a角鲨烯产量可以达到1.29±0.13g/L；优化后的酿酒酵母角鲨烯产量达到11.00g/L，是目前已知基因工程菌株的最高产量。
基因工程是改造菌株的重要方式，通过基因工程手段提高角鲨烯的产量是目前研究的重心。有报道显示，通过基因改造将真菌甲羟戊酸途径相关的基因导入大肠杆菌中表达，角鲨烯产量达到52.1mg/L，实现了大肠杆菌基因工程菌株产角鲨烯的重大突破；另外，在酿酒酵母中过表达酰基转移酶的基因提高了油脂含量，为角鲨烯提供了更多的储存空间。
裂殖壶菌属于破囊壶菌属，是一类海洋真菌，因其可以高产不饱和脂肪酸而广为人知。裂殖壶菌生长速度快，发酵周期短，耐机械搅拌，是一种食品安全菌。角鲨烯是裂殖壶菌甲羟戊酸途径中合成甾醇类化合物的中间产物，在法尼转移酶或角鲨烯合酶催化下，两个法尼焦磷酸头头缩合并被NADPH还原为含有30个碳的碳氢化合物——角鲨烯。裂殖壶菌油脂含量占细胞干重的50％以上，为角鲨烯提供了良好的储存场所。截止目前还未有通过基因工程技术对裂殖壶菌进行改造以生产角鲨烯的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以Schizochytrium sp.ATCC1381为受体菌株，通过过表达鲨烯合成酶基因(SQS)以提高重组菌中角鲨烯的产量，这对未来裂殖壶菌的基础理论研究和产品开发具有重要的意义。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是选用产油Schizochytrium sp.ATCC1381为材料构建而成，所述菌株含有来源于Schizochytriumsp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS。
所述菌株中的角鲨烯合成酶基因(SQS)克隆于原始Schizochytriumsp.ATCC1381，该菌株对所述的角鲨烯合成酶基因(SQS)过表达，增加了基因拷贝数，提高了角鲨烯产量。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，包括：
1)克隆来源于Schizochytrium sp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS，并通过基因同源重组技术将该基因***pBluzeo-18S质粒中，构建过表达载体pBluzeo-SQS-18S；
2)用线性化后的所述过表达载体pBluzeo-SQS-18S电转导入Schizochytriumsp.ATCC1381，获得过表达角鲨烯合成酶基因SQS的裂殖壶菌基因工程菌株。
进一步地，所述步骤1)中，过表达载体pBluzeo-SQS-18S的构建方法包括：根据裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS的序列信息，设计如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的引物，通过PCR法得到角鲨烯合成酶基因SQS片段；连接所述角鲨烯合成酶基因SQS片段与质粒pBluzeo-18S并转化至大肠杆菌Trans110感受态细胞，获得所述过表达载体pBluzeo-SQS-18S。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种应用过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株生产角鲨烯的方法，将所述过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体提取角鲨烯。
进一步地，所述发酵用菌种通过以下方法得到：将所述过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基中，培养获得一级种子；取所述一级种子接种于种子培养基中，培养获得二级种子，作为所述发酵用菌种。
其中，所述培养的条件为27～29℃，150～250r/min振摇培养。
进一步地，所述收集菌体提取角鲨烯的方法包括：
1)向发酵培养结束后的发酵液中加入11～13mol/L盐酸，64～66℃水浴0.5～1.5h；
2)冷却至室温，加入正己烷萃取，收集上层有机相；
3)重复步骤2)若干次，合并有机相，挥干溶剂，得到总油脂；
4)向所述总油脂中加入9～11％氢氧化钾乙醇溶液，64～66℃水浴皂化反应1～2h；
5)冷却至室温，加入正己烷萃取，收集上层有机相；
6)重复步骤5)若干次，直至有机相变为无色，合并有机相；
7)加入9～11％乙醇水溶液洗脱有机相若干次，直至洗脱液为中性；
8)合并有机相，挥干溶剂，得到总不皂化物，即为角鲨烯。
进一步地，所述发酵培养的整个周期可以达到168h，例如可以为48h、60h、72h、84h、96h、120h、144h、或168h。
其中，将所述过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于平板培养基，经抗性平板培养后，挑取单菌落接种于种子培养基活化；所述平板培养基的pH值为6.4～6.6，且包括配方比例为19～21g：9～11g：15～20g：49～51mL：1.5～2.5mL的葡萄糖、酵母粉、琼脂、20×组分A和500×CaCl2；其中，所述20×组分A包括：Na2SO4 238～242g/L，MgSO438～42g/L，KH2PO4 19～21g/L，(NH4)2SO4 19～21g/L，K2SO4 12～14g/L，KCl 9～11g/L，溶剂为水；所述500×CaCl2包括：CaCl2·2H2O 84～86g/L或无水CaCl2 64～65g/L，溶剂为水。
其中，所述种子培养基的pH值为6.4～6.6，且包括配方比例为19～21g：9～11g：49～51mL：1.5～2.5mL的葡萄糖、酵母粉、20×组分A和500×CaCl2；其中，所述20×组分A包括：Na2SO4 238～242g/L，MgSO4 38～42g/L，KH2PO4 19～21g/L，(NH4)2SO4 19～21g/L，K2SO412～14g/L，KCl 9～11g/L，溶剂为水；所述500×CaCl2包括：CaCl2·2H2O 84～86g/L或无水CaCl2 64～65g/L，溶剂为水。
其中，所述发酵培养基的pH值为6.4～6.6，且包括：葡萄糖90g/L、玉米浆粉5g/L、蛋白胨5g/L和20×组分A 50mL/L；其中，所述20×组分A包括：Na2SO4 238～242g/L，MgSO438～42g/L，KH2PO4 19～21g/L，(NH4)2SO4 19～21g/L，K2SO4 12～14g/L，KCl 9～11g/L，溶剂为水。
本发明采用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)ATCC1381为原始菌株，通过基因工程手段在大肠杆菌中构建过表达载体，选择博莱霉素(Zeocin)作为筛选抗性基因，真核生物的高保守序列18S rRNA作为同源臂。将线性化的过表达片段电转进入裂殖壶菌内，得到一株高产角鲨烯的基因工程菌株，为微生物生产角鲨烯以及产品工业化奠定了理论基础。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明中，除在领域内有通用意义或有特别说明外，％均为质量百分比，比例均为质量比。所述质量的单位例如为克、千克或吨。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
(1)本发明在裂殖壶菌转化***的基础上，采用电转的基因转化方式，构建了在裂殖壶菌中过表达的角鲨烯合成酶的基因工程菌株，获得的菌株具有多次传代的遗传稳定性。
(2)本发明在裂殖壶菌甲羟戊酸途径代谢通路上，选择了角鲨烯合成的关键酶进行过表达，增强了甲羟戊酸途径的代谢，削弱了油脂代谢途径，提高了裂殖壶菌生长期角鲨烯的积累量，这为该基因工程菌株工业化合成角鲨烯提供了基础。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为构建的大肠杆菌角鲨烯合成酶(SQS)过表达载体示意图。
图2为电转导入Schizochytrium sp.ATCC1381的线性重组片段示意图。
图3为重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。琼脂糖凝胶电泳分析，M为marker；泳道1为裂殖壶菌野生型对照菌株；泳道2为载体pBluzeo-SQS-18S转化的重组菌株。
图4为Schizochytrium sp.ATCC1381野生型菌株与过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)工程菌角鲨烯产量对比图。
图5为Schizochytrium sp.ATCC1381野生型菌株与基因工程菌角鲨烯合成酶基因(SQS)RT-qPCR的结果分析图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
下述各实施例中采用的培养基如下：
平板培养基的pH为6.5，且该培养基由葡萄糖20g、酵母粉10g、琼脂15～20g、20×组分A 50mL和500×CaCl2 2mL组成。
每250mL的20×组分A的组成为：Na2SO4 60g，MgSO4 10g，KH2PO4 5g，(NH4)2SO4 5g，K2SO4 3.25g，KCl 2.5g，水定容至250mL。
每100mL的500×CaCl2的组成为：CaCl2·2H2O 8.5g或无水CaCl2 6.418g，水定容至100mL。
一级和二级种子液的种子培养基的pH为6.5，且由葡萄糖20g、酵母粉10g、20×组分A 50mL和500×CaCl2 2mL组成。
基础培养基(即发酵培养基)的pH为6.5，每升发酵培养基中含有葡萄糖90g/L、玉米浆粉5g/L、蛋白胨5g/L和20×组分A 50mL。
实施例1.裂殖壶菌角鲨烯合成酶基因(SQS)的克隆
根据裂殖壶菌角鲨烯合成酶基因(SQS)的序列信息，设计分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物P1、P2，下划线部分分别为酶切位点NheI和XbaI，以Schizochytrium sp.ATCC1381基因组为模版，用引物P1/P2、PrimerStar高保真聚合酶，通过PCR对角鲨烯合成酶进行扩增，得到角鲨烯合成酶基因(SQS)片段。PCR程序为：94℃30s，60℃30s，72℃1.5min，34个循环，并对PCR产物进行纯化，纯化产物1％的琼脂糖凝胶电泳验证。
SEQ ID No.1 P1(sense)：GCGTCTAGAATGTTCTCCATGCTCACATT
SEQ ID No.2 P2(antisense)：GCGGCTAGCTTAGTCAGAGTGGGTTTGGCC
实施例2.过表达载体pBluzeo-SQS-18S的构建
1、酶切反应
用限制性内切酶NheI和XbaI分别双酶切过表达载体质粒pBluzeo-18S(质粒来源：购于上海生工生物工程(上海)股份有限公司)和PCR纯化产物角鲨烯合成酶基因(SQS)片段，胶回收。酶切体系(50μL)：2μL NheI，2μL XbaI，5μL Loading Buffer，20μL质粒或PCR纯化产物，21μL ddH2O，37℃水浴酶切2h。酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳回收。
2、连接反应
用T4连接酶将酶切后的角鲨烯合成酶基因(SQS)片段和载体pBluzeo-18S片段连接，16℃连接12h，得到重组过表达载体pBluzeo-SQS-18S。连接体系(25μL)：2μL目的基因片段，1μL载体酶切后片段，2.5μL连接酶buffer，19.5μL ddH2O，16℃连接12h。
3、连接产物转化大肠杆菌Trans110感受态细胞，转化方法如下：
(1)无菌状态下取100μL感受态细胞，加入连接产物混匀，冰上放置30min。
(2)42℃热激90s，迅速放置冰上3～5min。
(3)加入900μL LB培养基，37℃，150r/min孵育1h。
(4)取200μL涂布于含100μg/mL氨苄抗性LB平板上。倒置37℃培养过夜。
挑去阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组过表达载体pBluzeo-SQS-18S。
实施例3.过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)的裂殖壶菌基因工程菌株的构建
1、裂殖壶菌感受态细胞的制备
(1)挑取平板上已活化好的Schizochytrium sp.ATCC1381裂殖壶菌单菌落至50mL种子培养基，28℃，200r/min摇床培养24h。
(2)按4％的接种量转接至50mL种子培养基，28℃，200r/min摇床培养24h。
(3)取20mL菌液，4000rpm室温下离心2min，弃上清。
(4)用25mL的预处理剂(含25mL DTT的20mM pH 6.5磷酸缓冲液)重悬菌体，150rpm震荡30min以松散细胞壁。
(5)用20mL已预冷的无菌水洗涤菌体两次，离心条件均为：4000rpm，4℃离心2min。
(6)用1M的无菌预冷山梨醇溶液洗涤菌体两次，离心条件均为：4000rpm，4℃离心2min。
(7)用200μL的1M的无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，分装于1.5mL的无菌离心管，每管100μL，冰上备用。
2、裂殖壶菌电转化
(1)将10μL线性化后的重组过表达载体pBluzeo-SQS-18S(约5μg)加入100μL裂殖壶菌感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min。
(2)电击，2KV，一个脉冲。
(3)立即往电转杯加入1mL预冷的含1M山梨醇的种子培养基，混匀后转移至含1M山梨醇的种子培养基。
(4)28℃，200rpm培养2～3h。
(5)取适量菌液涂板，28℃培养2～4天。
3、过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)的裂殖壶菌基因工程菌株的筛选和鉴定
(1)挑取平板菌落接种至含50mg/L博莱霉素的种子培养基中，28℃，200rpm培养24h。
(2)传代7次保证过表达载体稳定遗传，每一代都重复步骤(1)中描述实验。
(3)稳定遗传的菌株为过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)的裂殖壶菌基因工程菌株表型，保藏于-80℃冰箱。
(4)提取具有过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)的裂殖壶菌基因组，设计一对与博莱霉素抗性基因特异性结合的引物(如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)进行PCR验证：
SEQ ID No.3P3(sense)：CTTCAAAACACCCAAGCACAGCA
SEQ ID No.4P4(antisense)：GTGGACACGACCTCCGACCACTC
重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳分析结果见图3，电泳结果表明重组过表达载体pBluzeo-SQS-18S成功***到裂殖壶菌基因组中。
实施例4.裂殖壶菌过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)工程菌株角鲨烯含量测定
1、发酵种子培养：将所述基因工程菌株与裂殖壶菌原始型菌株经抗性平板培养后，挑去单菌落接种于250mL锥形瓶(含种子培养基50mL)中，28℃，200r/min摇床培养24h后为一级种子。取2mL一级种子培养液接种于250mL锥形瓶(含种子培养基50mL)中，28℃，200r/min摇床培养24h为二级种子，作为发酵用菌种。
2、摇瓶发酵培养：取4mL二级种子培养液接种于500mL锥形瓶(含发酵培养基100mL)中，28℃，200r/min摇床培养168h，每隔24h取样。
3、收集菌体提取角鲨烯，包括以下步骤：
(1)发酵液中加入100mL 12mol/L盐酸，65℃水浴1h。
(2)冷却至室温，加入50mL正己烷，震荡10min，静置10min，收集上层有机相。
(3)重复步骤(2)两次，合并有机相65℃旋蒸10min至正己烷挥发完全得到总油脂。
(4)加入50mL 10％氢氧化钾乙醇溶液，65℃水浴皂化反应1.5h。
(5)冷却至室温，加入50mL正己烷，震荡10min，静置10min，收集上层有机相。
(6)重复步骤(5)3次，直至洗脱出来的有机相变为无色，合并有机相。
(7)加入10％乙醇水溶液洗脱有机相3次，pH试纸测定流出液为中性为止。
(8)将有机相65℃旋蒸10min至正己烷挥发完全得到总不皂化物。
(9)5mL色谱纯正己烷重新溶解不皂化物，气相检测分析角鲨烯含量。
实施例5.阳性转化子中角鲨烯合成酶基因(SQS)转录水平的RT-qPCR检测
根据角鲨烯合成酶基因(SQS)序列和内参Actin序列设计如SEQ ID No.5至SEQ IDNo.8所示的引物：
SEQ ID No.5 SQSF:TGTACTCGAGGAAGACAAGAAAGAC
SEQ ID No.6 SQSR:CACCAAAACCATGCAACGG
SEQ ID No.7 ActinF:TGTCCTCACGCTCAAGTACCCCAT
SEQ ID No.8 ActinR:GAAGGTCTCGAACATGATCTGGGTCAT
1、裂殖壶菌总RNA提取：
(1)将样品转移至预冷的研钵中，充分研磨，将粉末移至1.5mL灭菌管中，加入600μL裂解液(含DTT)。
(2)用移液枪反复吹打至无明显沉淀，12,000rpm，4℃离心5min。
(3)取上清至1.5mL RNase Free Tube中。
(4)将gDNA Eraserin Column安放至2mL的Collection Tube上。
(5)将上清转移至gDNA Eraserin Column中，12,000rpm，室温离心1min。
(6)弃gDNA Eraserin Column，保留2mL Collection Tube中的滤液。
(7)向滤液中加入液体二分之一体积的无水乙醇，用移液枪将溶液混匀，立即将混合液(含沉淀)转移至RNAin Column(含2mL Collection Tube)中，12,000rpm，室温离心1min，弃滤液。
(8)加入500μL Buffer RWA，12,000rpm，室温离心30s。
(9)加入600μL Buffer RWB(已加100％乙醇)，12,000rpm，室温离心30s。
(10)重复步骤(9)。
(11)将RNAin Column安置于2mL Collection Tube上，12,000rpm，室温离心2min。
(12)将RNAin Column安置于1.5mLRNase Free Collection Tub，加入50μL的RNase Free水，室温静置5min，12,000rpm，室温离心2min。
2、RNA反转录：
(1)在PCR管中加入反应试剂。
(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。
(3)在上述PCR管中按照表1配置反转录反应液，总量20μL。
(4)按照表2条件进行反转录反应。
表1反转录体系
Figure BDA0002563784610000101
表2反转录条件
Figure BDA0002563784610000102
3、实时荧光定量PCR：
qPCR使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(+dyeI)。在八连管中按表3所述添加反应体系。采用相对定量法，使用PCR仪进行此反应，反应程序如表4所示。
表3 qPCR反应体系
Figure BDA0002563784610000111
表4 qPCR程序
Figure BDA0002563784610000112
结果表明，通过本发明的方法获得的过表达角鲨烯合成酶基因(SQS)的裂殖壶菌基因工程菌株具有多次传代遗传稳定性，qPCR结果显示不同时间点的角鲨烯合成酶基因(SQS)转录水平均有明显提高。角鲨烯的产量也有大幅提升，相比于野生型菌株增加了193％。利用此方法构建的基因工程菌株及构建方法为后续理论研究和工业化生产奠定了有力的基础。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgtctagaa tgttctccat gctcacatt 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggctagct tagtcagagt gggtttggcc 30
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttcaaaaca cccaagcaca gca 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggacacga cctccgacca ctc 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtactcgag gaagacaaga aagac 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccaaaacc atgcaacgg 19
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtcctcacg ctcaagtacc ccat 24
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtctcg aacatgatct gggtcat 27

Claims (10)

1.一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于：所述菌株是选用Schizochytrium sp.ATCC1381为材料构建而成，所述菌株含有来源于Schizochytriumsp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS。
2.一种权利要求1所述的过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括：
1)克隆来源于Schizochytrium sp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS，并将该基因***pBluzeo-18S质粒中，构建过表达载体pBluzeo-SQS-18S；
2)用所述过表达载体pBluzeo-SQS-18S转化Schizochytrium sp.ATCC1381，获得过表达角鲨烯合成酶基因SQS的裂殖壶菌基因工程菌株。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，过表达载体pBluzeo-SQS-18S的构建方法包括：根据裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS的序列信息，设计如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物，通过PCR法得到角鲨烯合成酶基因SQS片段；连接所述角鲨烯合成酶基因SQS片段与质粒pBluzeo-18S并转化至大肠杆菌Trans110感受态细胞，获得所述过表达载体pBluzeo-SQS-18S。
4.一种应用权利要求1所述的过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株生产角鲨烯的方法，其特征在于：将所述过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体提取角鲨烯。
5.根据权利要求4所述的生产角鲨烯的方法，其特征在于：所述发酵用菌种通过以下方法得到：将所述过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基中，培养获得一级种子；取所述一级种子接种于种子培养基中，培养获得二级种子，作为所述发酵用菌种。
6.根据权利要求4或5所述的生产角鲨烯的方法，其特征在于：所述培养的条件为27～29℃，150～250r/min振摇培养。
7.根据权利要求4所述的生产角鲨烯的方法，其特征在于：所述收集菌体提取角鲨烯的方法包括：
1)向发酵培养结束后的发酵液中加入11～13mol/L盐酸，64～66℃水浴0.5～1.5h；
2)冷却至室温，加入正己烷萃取，收集上层有机相；
3)重复步骤2)若干次，合并有机相，挥干溶剂，得到总油脂；
4)向所述总油脂中加入9～11％氢氧化钾乙醇溶液，64～66℃水浴皂化反应1～2h；
5)冷却至室温，加入正己烷萃取，收集上层有机相；
6)重复步骤5)若干次，直至有机相变为无色，合并有机相；
7)加入9～11％乙醇水溶液洗脱有机相若干次，直至洗脱液为中性；
8)合并有机相，挥干溶剂，得到总不皂化物，即为角鲨烯。
8.根据权利要求4所述的生产角鲨烯的方法，其特征在于：所述种子培养基的pH值为6.4～6.6，且包括配方比例为19～21g：9～11g：49～51mL：1.5～2.5mL的葡萄糖、酵母粉、20×组分A和500×CaCl2；其中，所述20×组分A包括：Na2SO4 238～242g/L，MgSO4 38～42g/L，KH2PO4 19～21g/L，(NH4)2SO4 19～21g/L，K2SO4 12～14g/L，KCl 9～11g/L，溶剂为水；所述500×CaCl2包括：CaCl2·2H2O 84～86g/L或无水CaCl2 64～65g/L，溶剂为水。
9.根据权利要求4所述的生产角鲨烯的方法，其特征在于：所述发酵培养基的pH值为6.4～6.6，且包括：葡萄糖90g/L、玉米浆粉5g/L、蛋白胨5g/L和20×组分A 50mL/L；其中，所述20×组分A包括：Na2SO4 238～242g/L，MgSO4 38～42g/L，KH2PO4 19～21g/L，(NH4)2SO4 19～21g/L，K2SO4 12～14g/L，KCl 9～11g/L，溶剂为水。
10.根据权利要求4所述的生产角鲨烯的方法，其特征在于：将所述过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于平板培养基，经抗性平板培养后，挑取单菌落接种于种子培养基活化；所述平板培养基的pH值为6.4～6.6，且包括配方比例为19～21g：9～11g：15～20g：49～51mL：1.5～2.5mL的葡萄糖、酵母粉、琼脂、20×组分A和500×CaCl2；其中，所述20×组分A包括：Na2SO4 238～242g/L，MgSO4 38～42g/L，KH2PO4 19～21g/L，(NH4)2SO4 19～21g/L，K2SO4 12～14g/L，KCl 9～11g/L，溶剂为水；所述500×CaCl2包括：CaCl2·2H2O 84～86g/L或无水CaCl2 64～65g/L，溶剂为水。
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