CN110423732B - 一种在酿酒酵母中表达的酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在酿酒酵母中表达的关键酶及高产α‑和γ‑生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法。本发明通过基因克隆和密码子优化，获得五个可以在酿酒酵母中成功表达的酶，分别为HPPD、HPT、MPBQMT、TC和γ‑TMT；并将这五个酶逐步整合到酿酒酵母基因组上，进一步通过切除叶绿体转运肽和过表达限速酶，构建得到高产α‑和γ‑‑生育三烯酚的基因工程酵母菌株，命名为：YS‑356c，保藏编号为：CCTCC NO：M2019572。其总生育三烯酚产量达到2.09mg/g细胞干重。本发明的工程菌株可经发酵培养，直接从菌体中获得α‑和γ‑生育三烯酚，具有良好的市场前景和开应用价值。

Description

一种在酿酒酵母中表达的酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基 因工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物领域，特别是涉及一种在酿酒酵母中表达的酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法。
背景技术
维生素E是一种重要的脂溶性化合物，包括生育酚和生育三烯酚，它是维持机体正常代谢和机能的必需维生素。天然维生素E只存在于光合生物中，人和动物不能自我合成，只能从外界摄取。市面上的维生素E产品主要是α-生育酚，但最近研究表明，相比生育酚，生育三烯酚具有降低胆固醇的功效(生育三烯酚独有)，以及更好的抗氧化、抗癌、抗炎、心脏保护和神经保护功能。但生育三烯酚的来源稀少，商业化的天然生育三烯酚主要从油棕果中提取，由于其含量较低，分离难度大，产量受到限制，导致生产成本较高。而化学合成的生育三烯酚由于步骤复杂，副产物较多，无法实现商业化生产。因此，利用微生物异源合成生产生育三烯酚是一种高效且有前景的方法。
2008年，德国斯图加特大学的研究人员通过导入拟南芥和蓝藻来源的基因在大肠杆菌中实现的δ-生育三烯酚的合成，但产量很低，只有15μg/g细胞干重，且δ-生育三烯酚是未经甲基化的生育三烯酚形式，应用受到一定限制。到目前为止，仍未实现功能更强大，应用更广泛的α-或γ-生育三烯酚的异源生物合成。本发明提供一种以安全、高效的酿酒酵母为细胞工厂异源合成α-和γ-生育三烯酚的方法，为工业生产生育三烯酚提供新的思路和方法，解决目前产量低、生产成本高的难题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可以在酿酒酵母中表达的关键酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法，以植物或蓝藻维生素E合成途径中的关键酶为模板，通过基因克隆和密码子优化，获得五个可以在酿酒酵母中成功表达的酶，将其逐步整合到酿酒酵母染色体上，构建出一株产α-和γ-生育三烯酚的基因工程酵母菌株，并进一步通过切除叶绿体转运肽和过表达限速酶，构建出一株高产菌株，能够安全、高效、高产量、低成本的生产α-和γ-生育三烯酚。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种可以在酿酒酵母中表达的酶，包括：4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)；尿黑酸植基转移酶(HPT)；2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)；生育酚环化酶(TC)；γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)。
前述的一种在酿酒酵母中表达的酶，经密码子优化后，获得的序列：
4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
尿黑酸植基转移酶(HPT)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
生育酚环化酶(TC)的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌，新菌种的命名为：酿酒酵母YS-356c，Saccharomyces cerevisiae YS-356c，保藏编号为：CCTCC NO：M2019572。
一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将可以在酿酒酵母中表达的酶：4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)；尿黑酸植基转移酶(HPT)；2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)；生育酚环化酶(TC)；γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)，逐步导入到酿酒酵母菌株中，获得产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌株YS-16。
一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将可以在酿酒酵母中表达的酶：4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)；尿黑酸植基转移酶(HPT)；2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)；生育酚环化酶(TC)；γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)，逐步导入到酿酒酵母菌株中，获得产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌株YS-16；并切除MPBQMT，TC和γ-TMT三个酶的叶绿体转运肽，再过表达限速酶HPT，TC和γ-TMT，获得一株高产α- 和γ-生育三烯酚的基因工程菌YS-356c。
前述的一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌构建方法，以PGal1或PGal10为启动子，将外源基因逐步整合到宿主菌染色体上；宿主菌为酿酒酵母。
前述的一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌构建方法，通过切除MPBQMT，TC和γ-TMT三个酶的叶绿体转运肽，得到改造后的酶，其氨基酸序列：MPBQMT如SEQ ID NO： 6所示，TC如SEQ ID NO：8所示，γ-TMT如SEQ ID NO：10所示；其核苷酸序列：MPBQMT 如SEQID NO：7所示，TC如SEQ ID NO：9所示，γ-TMT如SEQ ID NO：11所示；再过表达限速酶HPT(SEQ ID NO：2)，TC(SEQ ID NO：9)和γ-TMT(SEQ ID NO：11)，获得一株高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌YS-356c。
本发明的有益之处在于：
本发明以植物或蓝藻维生素E合成途径中的关键酶基因序列为模板，通过基因克隆以及密码子优化，获得五个可以在酿酒酵母中成功表达的酶，再将这五个酶逐步整合到敲除GAL80 基因的酿酒酵母YS40染色体上，得到工程菌株YS-16，首次实现通过生物发酵法异源合成α- 和γ-生育三烯酚，其总生育三烯酚产量达到243.3μg/g细胞干重；
本发明进一步切除MPBQMT，TC和γ-TMT三个酶的叶绿体转运肽，再过表达限速酶HPT，TC和γ-TMT，获得一株高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌YS-356c，其总生育三烯酚产量达到2085.3μg/g细胞干重，相比菌株YS-16，产量提高了7.57倍，具有一定的市场前景和应用价值；
用本发明构建的基因工程菌可以安全，高效地实现α-和γ-生育三烯酚的生产。
附图说明
图1是本发明基因工程菌株YS-356c一种实施例的构建方法；
图2是本发明实施例1的产物的生育三烯酚菌株的HPLC检测图谱；
图3是本发明实施例1产出的γ-生育三烯酚的质谱图(正离子模式)；
图4是本发明实施例1产出的γ-生育三烯酚的质谱图(负离子模式)；
图5是本发明实施例1产出的α-生育三烯酚的质谱图(正离子模式)；
图6是本发明实施例1产出的α-生育三烯酚的质谱图(负离子模式)；
图7是本发明两个实施例的工程菌株的HPLC峰图对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌的构建方法，包括如下内容：
一、克隆与表达生育三烯酚生物合成途径中关键酶，
以植物或蓝藻维生素E合成途径中的关键酶基因序列为模板，通过基因克隆以及密码子优化，获得五个可以在酿酒酵母中成功表达的酶；
分别是：
4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)，
尿黑酸植基转移酶(HPT)，
2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)，
生育酚环化酶(TC)，
γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)；
4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)，尿黑酸植基转移酶(HPT)，2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)，生育酚环化酶(TC)，γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)，其获得过程为：
1、提取植物的RNA并反转录成cDNA，或者提取蓝藻基因组DNA；
2、克隆目的基因，
以cDNA或者基因组DNA为模板，采用高保真酶进行PCR扩增；
将PCR产物目的片段和载体质粒通过限制性内切酶进行双酶切；
对酶切后的片段和质粒，使用T4DNA连接酶进行连接；
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞溶液后，涂布于抗性平板培养；
挑选出抗性平板上的阳性克隆；
将阳性克隆菌接种并培养后，进行质粒抽提，对重组质粒进行进一步DNA测序验证，序列比对；
3、优化目的基因序列的密码子，
通过密码子优化网站，以酿酒酵母为宿主进行密码子优化，将优化后的基因序列进行化学合成，并将相应的片段连接到pUMRI载体质粒上，得到连有目的基因的重组质粒；
4、将连有目的基因的重组质粒线性化后整合到酿酒酵母染色体上，
先用SfiI内切酶对重组质粒进行酶切得到线性化片段，再将其通过化学转化到酿酒酵母感受态细胞中，涂布于G418抗性平板上培养，PCR验证得到正确整合的菌株。
5、对整合菌株进行产物的检测，确定相应酶的表达。
二、将HPPD、HPT、MPBQMT、TC和γ-TMT这五个酶，以PGal1或PGal10为启动子，通过酶切酶连分别连接到pUMRI载体质粒上，将重组质粒用内切酶sfiI酶切线性化后，通过化学转化逐步整合到敲除GAL80基因的酿酒酵母YS40染色体上，构建得到一株产α-和γ- 生育三烯酚的基因工程酵母菌株YS-16。
三、在前期构建的基因工程酵母菌株YS-16的基础上，进一步切除MPBQMT，TC和γ-TMT三个酶的叶绿体转运肽，再过表达限速酶HPT，TC和γ-TMT，获得一株高产α-和γ- 生育三烯酚的基因工程菌YS-356c；
该菌种的命名为：酿酒酵母YS-356c，Saccharomyces cerevisiae YS-356c，保藏编号为： CCTCC NO：M2019572，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学；保藏日期为：2019年7月19日。
切除MPBQMT，TC和γ-TMT三个酶的叶绿体转运肽的方法为：
根据叶绿体转运肽预测网站，确定MPBQMT，TC和γ-TMT这三个酶的转运肽长度分别为51aa、47aa和40aa；
根据预测得到的叶绿体转运肽剪切位点，定位到相应的DNA序列，重新设计引物，通过PCR的方式将相应转运肽的DNA序列切除，然后通过酶切酶连的方式连接到质粒载体上，再转化到相应的酵母菌株中。
过表达限速酶HPT，TC和γ-TMT的方法为：在单拷贝菌株的基础上，在不同整合位点，以PGal1或PGal10为启动子，增加限速酶一个拷贝。
一种α-或γ-生育三烯酚的制备方法，是在基因工程菌株YS-16或高产菌株YS-356c的发酵培养物中制备得到。将菌株置于添加0.1％(w/v)酪氨酸的YPD液体培养基中，30℃，220 rpm下振荡培养96h，发酵液离心去上清，获得的菌体经研磨破碎，乙酸乙酯分离萃取，有机相干燥后得到α-和γ-生育三烯酚，具有良好的应用前景。
△以下通过实验验证基因工程菌能够实现α-和γ-生育三烯酚的高效合成
实验过程为：
步骤一，生育三烯酚生物合成途径中关键基因的克隆与表达。
以植物或蓝藻维生素E合成途径中的关键酶基因序列为模板，通过基因克隆以及进一步密码子优化，获得五个可以在酿酒酵母中成功表达的酶；
分别是：
4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)，SEQ ID NO：1；
尿黑酸植基转移酶(HPT)，SEQ ID NO：2；
2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)，SEQ ID NO：3；
生育酚环化酶(TC)，SEQ ID NO：4；
γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)，SEQ ID NO：5。
五个可以在酿酒酵母中成功表达的酶通过如下具体步骤得到：
1.1获取维生素E合成途径中的关键酶基因序列，
通过提取植物RNA并反转录成cDNA，获得维生素E合成途径中的关键酶基因序列；
具体步骤如下：
(1)称取植物组织约100mg，放入冷冻过的研钵中，加入适量液氮，充分研磨，反复3次磨成粉末。
(2)加入1ml RNAiso，匀浆，并转移到RNase-free的离心管中。
(3)室温放置5min，使其充***解。
(4)12000rpm离心5min，转移上清到新的1.5ml离心管中。
(5)加入200μl(1/5RNAiso Plus体积)氯仿，振荡混匀，室温静置5min。
(6)4℃，12000g离心15min，将上清转移到新的1.5ml离心管中。
(7)加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。
(8)4℃，12000g离心10min，弃上清，RNA为沉在管底的白色沉淀。
(9)加入RNAiso Plus等体积的75％乙醇清洗沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
(10)4℃，7500g离心5min，弃上清保留沉淀。
(11)室温晾干5-10min。注：RNA样品不能过于干燥，否则难以溶解。
(12)加入50μl DEPC处理水溶解，取3μl跑核酸胶验证。
将上述跑胶验证后的RNA样品使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA SynthesisKit试剂盒进行反转录，具体步骤详见产品说明书。取3μL反转录后的cDNA样品，跑核酸胶验证，并放置于﹣80℃冰箱，作为下一步PCR模板备用。
1.2蓝藻基因组DNA的提取，
将集胞藻PCC6803置于50ml BG-11液体培养基中，30℃，120rpm下振荡培养至对数生长期，取5ml藻液12000rpm离心，弃上清，使用BioFlux公司Biospin真菌基因组DNA 提取试剂盒提取集胞藻DNA，具体步骤详见产品说明书。
1.3目的基因的克隆，
以cDNA或者基因组DNA为模板，采用高保真酶(Prime STARTM HS DNA polymerase)进行PCR扩增。反应体系(50μl)如下：
Figure BDA0002166652990000041
PCR程序如下：
Figure BDA0002166652990000042
Figure BDA0002166652990000051
将PCR产物目的片段和整合型pUMRI系列质粒通过Takara限制性内切酶进行双酶切，双酶切体系按照Takara限制性内切酶说明书，酶切后对体系进行DNA凝胶回收处理，具体步骤按照Axygen试剂盒说明书进行。
对酶切后的片段和质粒，使用T4DNA连接酶进行连接，连接体系(10μl)如下：
Figure BDA0002166652990000052
22℃，连接30min后，将10μl的连接产物加入到大肠杆菌感受态细胞溶液中，冰上放置 15min后，42℃热击90s，并迅速置于冰浴中3min，加入1ml LB液体培养基，37℃摇床下复苏45min，然后离心，弃部分上清，取适量涂到相应的抗性LB平板上，37℃培养箱放置15h。
为了挑选出抗性平板上的阳性克隆，首先从平板上随机挑取5-10个单克隆至400μl含相应抗性LB培养基的离心管中，37℃下培养3小时，在10μl PCR体系下，取0.5μl菌液作为模板，用Easy Taq DNA 聚合酶进行PCR验证，扩增体系(10μl)如下：
Figure BDA0002166652990000053
PCR程序如下：
Figure BDA0002166652990000054
菌液PCR后，进行核酸电泳验证，将阳性克隆菌接种到5ml相应抗性的LB试管内，30℃，220rpm下，过夜培养12-16h后，进行质粒抽提，质粒抽提按Axygen相应试剂盒说明书进行，抽提后，对重组质粒进行进一步DNA测序验证，序列比对。
1.4目的基因的密码子优化，
将目的基因的对应氨基酸序列上传到密码子优化网站www.jcat.de，以酿酒酵母为宿主进行密码子优化，优化后的基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司化学合成。并将相应的片段连接到pUMRI系列质粒上。
1.5将连有目的基因的重组质粒整合到酿酒酵母染色体上，
需要说明的是：载体质粒选择pUMRI系列质粒只是一种优选实施例，pUMRI系列质粒是本课题组之前构建的用于酿酒酵母染色体整合的一套基因组装工具(GenBank：KM216412；KM216413；KM216415)。该质粒带有URA3和KanMX双重选择标记，其结构为：染色体上游同源区段-正向重复序列-KanMX表达盒-URA3表达盒-正向重复序列-多克隆位点-染色体下游同源区段。其中KanMX基因可以编码卡那霉素抗性用于大肠杆菌中克隆的筛选，也可以编码遗传霉素抗性用于酿酒酵母在G418抗性平板上筛选。这些质粒在上下游同源臂交接处含有Sfi I酶切位点，通过Sfi I酶切将其线性化。
酶切体系(30ul)：26μl质粒，3μl 10×QuickCut Buffer，1μl Sfi I内切酶。
酶切条件：在50℃下水浴2小时。
将酶切之后的产物，使用PCR清洗试剂盒清洗，用于酿酒酵母化转实验。
酿酒酵母感受态制备：从YPD平板上挑取酵母单菌落接种到5ml YPD试管中，30℃，220rpm过夜培养，按2％的接种量转接到50ml YPD摇瓶中，30℃，220rpm培养4-5h， OD600长到约2.0左右。
酿酒酵母化转步骤：
(1)将ssDNA置于100℃金属浴中加热5min后，迅速放入冰中冷却备用。
(2)取45ml感受态酵母菌液于50ml灭菌离心管中，在4000rpm，20℃下离心5min，弃上清。
(3)用20ml无菌水清洗一次，离心弃上清，再用1ml无菌水重悬，按100μl每管分装于1.5ml灭菌离心管中，离心弃上清。
(4)在离心管中依次加入如下化转体系(360μl)：
Figure BDA0002166652990000061
(5)充分混匀，42℃金属浴中放置40min。
(6)12000rpm离心30s，弃上清，加入1ml YPD液体培养基复苏2h。
(7)12000rpm离心1min，弃上清，加1ml无菌水重悬浮，取100ul涂布于相应抗性平板。
步骤二，将HPPD、HPT、MPBQMT、TC和γ-TMT这五个酶，逐步整合到敲除GAL80 基因的酿酒酵母YS40染色体上，构建得到一株产α-和γ-生育三烯酚的基因工程酵母菌株 YS-16，作为实施例1；
具体步骤如下所示：
2.1合成途径的构建
将HPPD、HPT、MPBQMT、TC和γ-TMT这五个酶，以PGal1或PGal10为启动子，通过酶切酶连，分别连接到pUMRI系列质粒上，将重组质粒Sfi I酶切线性化后，通过化学转化逐步整合到酿酒酵母YS40染色体上，构建出产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌株YS-16。
2.2工程菌的培养
YPD平板上挑取酵母单菌落于5ml YPD液体试管中，在30℃，220rpm恒温摇床中过夜培养，然后转接到50ml添加0.1％(W/V)酪氨酸的YPD液体培养基的250ml三角摇瓶中，设定摇瓶中的初始OD600为0.05，置于30℃，220rpm恒温摇床中培养96h。
2.3产物提取
(1)取5ml酵母发酵液，4000rpm离心5min，弃上清，然后用5ml蒸馏水清洗一次，离心弃上清，加入200μL的蒸馏水，重悬菌体。
(2)在2ml离心管中加入500ml体积的研磨珠(0.1mm和0.5mm的氧化锆珠子各半)，然后将重悬后的菌液全部转移到2ml的离心管中。
(3)将装有珠子和菌体的离心管，置于全自动样品快速研磨仪中，65HZ，研磨5min。
(4)研磨完后，在该离心管中加入800μl的丙酮萃取，充分混匀，并置于超声10min。
(5)超声后，4000rpm离心30s，吸上清到新的2ml离心管中，然后在原来的2ml 离心管中再加入1ml丙酮，复萃一次，充分混匀，超声10min。
(6)不用离心，将浑浊的液体全部转移到步骤(5)的新离心管中，这样获得约2ml的浑浊萃取液。
(7)12000rpm离心5min，取1ml上清至新的1.5ml离心管，再用0.22μm有机系滤头过滤，待进HPLC检测。
2.4生育三烯酚HPLC分析条件
流动相：乙腈(A)和纯水(B)
比例：70％A/30％B
色谱柱：Agilent，ZORBAX，SB-C18(4.6×250mm)
流速：0.8ml/min
检测波长：292nm(紫外检测器)
梯度洗脱条件：0–10min：70％A/30％B—90％A/10％B
10–40min：90％A/10％B—100％A/0％B
40–70min：100％A/0％B
70–80min：100％A/0％B—70％A/30％B
2.5LC-MS分析条件
液相条件：
流动相：甲醇(A)和纯水(B)
比例：70％A/30％B
色谱柱：Agilent，ZORBAX，SB-C18(4.6×250mm)
流速：0.8ml/min
检测波长：292nm(紫外检测器)
梯度洗脱条件：0–10min：70％A/30％B—90％A/10％B
10–40min：90％A/10％B—100％A/0％B
40–70min：100％A/0％B
70–80min：100％A/0％B—70％A/30％B
质谱条件：
ESI电离；雾化器压力：25psi；干燥气流速：8L/min；干燥气温度：220℃；毛细管压力：4500V。
将实施例1的产物通过高效液相色谱(HPLC)分析检测，获得的产物峰与标准品γ-生育三烯酚和α-生育三烯酚相对应，并进一步结合质谱检测，结果如图2，确定其产物为γ-生育三烯酚和α-生育三烯酚，制作标准品曲线后，确定其产量，其中γ-生育三烯酚产量为172μg/g 细胞干重，α-生育三烯酚产量为71.3μg/g细胞干重，总生育三烯酚产量为243.3μg/g细胞干重，液相质谱结果如图3、4、5、6。
步骤三，通过切除MPBQMT，TC和γ-TMT三个酶的叶绿体转运肽，提高其催化活性，改造后的酶其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示；再过表达限速酶HPT(SEQ ID NO：2)，TC(SEQ ID NO：9)和γ-TMT(SEQ ID NO：11)，获得一株高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌YS-356C，作为实施例2；
具体步骤如下所示：
3.1叶绿体转运肽的预测和切除
根据叶绿体转运肽设计网站(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)，分别导入 MPBQMT，TC和γ-TMT的氨基酸序列，提交后，如果cTP显示为Y，说明该片段存在叶绿体转运肽序列，cTP-length显示为叶绿体转运肽氨基酸序列长度，cTP-score指的是该剪切位点的分数，分数越高意味着可能性越大，但有时候cTP-length预测的长度不一定准确，可以再选择几个cTP-score相对较高的点，作为备选剪接位点，具体效果须进一步进行催化活性的比较，来最终确定最适叶绿体转运肽剪切位点，最终，确定这三个酶的转运肽长度分别为51aa、 47aa和40aa。
根据预测得到的叶绿体转运肽剪切位点，定位到相应的DNA序列，重新设计引物，通过PCR的方式将相应转运肽的DNA序列切除，然后通过酶切酶连的方式连接到质粒载体上，再转化到相应的酵母菌株中。
MPBQMT氨基酸序列SEQ ID NO：6；
MPBQMT核苷酸序列如SEQ ID NO：7；
生育酚环化酶(TC)的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
生育酚环化酶(TC)核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的氨基酸序列如SEQ ID NO：10；
γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
3.2过表达限速酶提高产物产量；
在单拷贝菌株的基础上，在不同的整合位点，以PGal1或PGal10为启动子，增加限速酶一个拷贝的方式来进行过表达，通过过表达不同组合的关键酶来确定关键限速步骤，并且获得一个最佳的过表达组合，分别为限速酶HPT(SEQ ID NO：2)，TC(SEQ ID NO：9)和γ-TMT(SEQ ID NO：11)，在单拷贝菌株上过表达这三个限速酶，获得一株高产酵母工程菌株 YS-356c，相比出发菌株YS-16，其总生育三烯酚产量提高了7.54倍，达到2.09mg/g细胞干重，其中γ-生育三烯酚的产量为1407.9μg/g细胞干重，α-生育三烯酚为677.4μg/g细胞干重。
将实施例1和实施例2的实验结果进行对比，HPLC峰图对比如图7所示：
Figure BDA0002166652990000081
结果分析：
基因工程菌株YS-16首次实现利用生物发酵法异源合成α-生育三烯酚和γ-生育三烯酚；而优化后的高产菌株YS-356c，其产量相比YS-16提高了7-8倍，具有一定的市场前景和应用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种在酿酒酵母中表达的酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法
<141> 2019-08-13
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgtgtttgt ctttggcttc tactgctcaa agaaacactc aattcagatc tagagttttg 60
gttttggctg aattggttaa gtctatgggt caccaaaacg ctgctgtttc tgaaaaccaa 120
aaccacgacg acggtgctgc ttcttctcca ggtttcaagt tggttggttt ctctaagttc 180
gttagaaaga acccaaagtc tgacaagttc aaggttaaga gattccacca catcgaattc 240
tggtgtggtg acgctactaa cgttgctaga agattctctt ggggtttggg tatgagattc 300
tctgctaagt ctgacttgtc tactggtaac atggttcacg cttcttactt gttgacttct 360
ggtgacttga gattcttgtt cactgctcca tactctccat ctttgtctgc tggtgaaatc 420
aagccaacta ctactgcttc tatcccatct ttcgaccacg gttcttgtag atctttcttc 480
tcttctcacg gtttgggtgt tagagctgtt gctatcgaag ttgaagacgc tgaatctgct 540
ttctctatct ctgttgctaa cggtgctatc ccatcttctc caccaatcgt tttgaacgaa 600
gctgttacta tcgctgaagt taagttgtac ggtgacgttg ttttgagata cgtttcttac 660
aaggctgaag acactgaaaa gtctgaattc ttgccaggtt tcgaaagagt tgaagacgct 720
tcttctttcc cattggacta cggtatcaga agattggacc acgctgttgg taacgttcca 780
gaattgggtc cagctttgac ttacgttgct ggtttcactg gtttccacca attcgctgaa 840
ttcactgctg acgacgttgg tactgctgaa tctggtttga actctgctgt tttggcttct 900
aacgacgaaa tggttttgtt gccaatcaac gaaccagttc acggtactaa gagaaagtct 960
caaatccaaa cttacttgga acacaacgaa ggtgctggtt tgcaacactt ggctttgatg 1020
tctgaagaca tcttcagaac tttgagagaa atgagaaaga gatcttctat cggtggtttc 1080
gacttcatgc catctccacc accaacttac taccaaaact tgaagaagag agttggtgac 1140
gttttgtctg acgaccaaat caaggaatgt gaagaattgg gtatcttggt tgacagagac 1200
gaccaaggta ctttgttgca aatcttcact aagccattgg gtgacagacc aactatcttc 1260
atcgaaatca tccaaagagt tggttgtatg atgaaggacg aagaaggtaa ggcttaccaa 1320
tctggtggtt gtggtggttt cggtaagggt aacttctctg aattgttcaa gtctatcgaa 1380
gaatacgaaa agactttgga agctaagcaa ttggttggtt aa 1422
<210> 2
<211> 927
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggctacta ttcaagcttt ttggagattt tctaggccac atactattat tggtactact 60
ttgtctgttt gggctgttta tttgttgact attttgggtg atggtaactc tgttaactca 120
ccagcttctt tggacttggt tttcggtgct tggttggctt gcttgttggg taacgtctac 180
attgttggat tgaatcaatt gtgggatgtt gatattgaca gaattaacaa acctaatttg 240
ccattagcta acggtgattt ttcaatagct caaggtaggt ggattgttgg tttgtgcggt 300
gtcgcttctt tggctattgc ttggggtttg ggtttgtggt tgggtttgac tgttggtatt 360
tctttaatta ttggtactgc ttattctgtt ccaccagtta gattgaaaag attctctttg 420
ttagctgcat tgtgtatttt aactgttaga ggtattgttg ttaatttggg tttattcttg 480
ttctttagaa ttggtttggg ttatccacca actttgataa ctccaatttg ggttttaact 540
ttgtttattt tggttttcac tgttgcaatt gctattttca aggatgttcc agatatggaa 600
ggtgatagac aattcaaaat tcaaacattg acattgcaaa ttggtaaaca aaatgtcttc 660
agaggtactt taattttgtt gacaggttgt tatttggcta tggctatttg gggtttgtgg 720
gctgctatgc ctttgaacac tgctttcttg attgtttctc atttgtgttt gttggctttg 780
ttgtggtgga ggtctaggga tgttcacttg gaatctaaaa ctgaaattgc ttcattctat 840
caatttattt ggaaattgtt ctttttagaa tatttgttgt acccattggc tttgtggtta 900
ccaaattttt ctaatactat tttctaa 927
<210> 3
<211> 1017
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atggcttctt tgatgttgaa cggtgctatc actttcccaa agggtttggg ttctccaggt 60
tctaacttgc acgctagatc tatcccaaga ccaactttgt tgtctgttac tagaacttct 120
actccaagat tgtctgttgc tactagatgt tcttcttctt ctgtttcttc ttctagacca 180
tctgctcaac caagattcat ccaacacaag aaggaagctt actggttcta cagattcttg 240
tctatcgttt acgaccacgt tatcaaccca ggtcactgga ctgaagacat gagagacgac 300
gctttggaac cagctgactt gtctcaccca gacatgagag ttgttgacgt tggtggtggt 360
actggtttca ctactttggg tatcgttaag actgttaagg ctaagaacgt tactatcttg 420
gaccaatctc cacaccaatt ggctaaggct aagcaaaagg aaccattgaa ggaatgtaag 480
atcgttgaag gtgacgctga agacttgcca ttcccaactg actacgctga cagatacgtt 540
tctgctggtt ctatcgaata ctggccagac ccacaaagag gtatcagaga agcttacaga 600
gttttgaaga tcggtggtaa ggcttgtttg atcggtccag tttacccaac tttctggttg 660
tctagattct tctctgacgt ttggatgttg ttcccaaagg aagaagaata catcgaatgg 720
ttcaagaacg ctggtttcaa ggacgttcaa ttgaagagaa tcggtccaaa gtggtacaga 780
ggtgttagaa gacacggttt gatcatgggt tgttctgtta ctggtgttaa gccagcttct 840
ggtgactctc cattgcaatt gggtccaaag gaagaagacg ttgaaaagcc agttaacaac 900
ccattctctt tcttgggtag attcttgttg ggtactttgg ctgctgcttg gttcgttttg 960
atcccaatct acatgtggat caaggaccaa atcgttccaa aggaccaacc aatctaa 1017
<210> 4
<211> 1467
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atggaaatca gatctttgat cgtttctatg aacccaaact tgtcttcttt cgaattgtct 60
agaccagttt ctccattgac tagatctttg gttccattca gatctactaa gttggttcca 120
agatctatct ctagagtttc tgcttctatc tctactccaa actctgaaac tgacaagatc 180
tctgttaagc cagtttacgt tccaacttct ccaaacagag aattgagaac tccacactct 240
ggttaccact tcgacggtac tccaagaaag ttcttcgaag gttggtactt cagagtttct 300
atcccagaaa agagagaatc tttctgtttc atgtactctg ttgaaaaccc agctttcaga 360
caatctttgt ctccattgga agttgctttg tacggtccaa gattcactgg tgttggtgct 420
caaatcttgg gtgctaacga caagtacttg tgtcaatacg aacaagactc tcacaacttc 480
tggggtgaca gacacgaatt ggttttgggt aacactttct ctgctgttcc aggtgctaag 540
gctccaaaca aggaagttcc accagaagaa ttcaacagaa gagtttctga aggtttccaa 600
gctactccat tctggcacca aggtcacatc tgtgacgacg gtagaactga ctacgctgaa 660
actgttaagt ctgctagatg ggaatactct actagaccag tttacggttg gggtgacgtt 720
ggtgctaagc aaaagtctac tgctggttgg ccagctgctt tcccagtttt cgaaccacac 780
tggcaaatct gtatggctgg tggtttgtct actggttgga tcgaatgggg tggtgaaaga 840
ttcgaattca gagacgctcc atcttactct gaaaagaact ggggtggtgg tttcccaaga 900
aagtggttct gggttcaatg taacgttttc gaaggtgcta ctggtgaagt tgctttgact 960
gctggtggtg gtttgagaca attgccaggt ttgactgaaa cttacgaaaa cgctgctttg 1020
gtttgtgttc actacgacgg taagatgtac gaattcgttc catggaacgg tgttgttaga 1080
tgggaaatgt ctccatgggg ttactggtac atcactgctg aaaacgaaaa ccacgttgtt 1140
gaattggaag ctagaactaa cgaagctggt actccattga gagctccaac tactgaagtt 1200
ggtttggcta ctgcttgtag agactcttgt tacggtgaat tgaagttgca aatctgggaa 1260
agattgtacg acggttctaa gggtaaggtt atcttggaaa ctaagtcttc tatggctgct 1320
gttgaaatcg gtggtggtcc atggttcggt acttggaagg gtgacacttc taacactcca 1380
gaattgttga agcaagcttt gcaagttcca ttggacttgg aatctgcttt gggtttggtt 1440
ccattcttca agccaccagg tttgtaa 1467
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgaaggcta ctttggctgc tccatcttct ttgacttctt tgccatacag aactaactct 60
tctttcggtt ctaagtcttc tttgttgttc agatctccat cttcttcttc ttctgtttct 120
atgactacta ctagaggtaa cgttgctgtt gctgctgctg ctacttctac tgaagctttg 180
agaaagggta tcgctgaatt ctacaacgaa acttctggtt tgtgggaaga aatctggggt 240
gaccacatgc accacggttt ctacgaccca gactcttctg ttcaattgtc tgactctggt 300
cacaaggaag ctcaaatcag aatgatcgaa gaatctttga gattcgctgg tgttactgac 360
gaagaagaag aaaagaagat caagaaggtt gttgacgttg gttgtggtat cggtggttct 420
tctagatact tggcttctaa gttcggtgct gaatgtatcg gtatcacttt gtctccagtt 480
caagctaaga gagctaacga cttggctgct gctcaatctt tggctcacaa ggcttctttc 540
caagttgctg acgctttgga ccaaccattc gaagacggta agttcgactt ggtttggtct 600
atggaatctg gtgaacacat gccagacaag gctaagttcg ttaaggaatt ggttagagtt 660
gctgctccag gtggtagaat catcatcgtt acttggtgtc acagaaactt gtctgctggt 720
gaagaagctt tgcaaccatg ggaacaaaac atcttggaca agatctgtaa gactttctac 780
ttgccagctt ggtgttctac tgacgactac gttaacttgt tgcaatctca ctctttgcaa 840
gacatcaagt gtgctgactg gtctgaaaac gttgctccat tctggccagc tgttatcaga 900
actgctttga cttggaaggg tttggtttct ttgttgagat ctggtatgaa gtctatcaag 960
ggtgctttga ctatgccatt gatgatcgaa ggttacaaga agggtgttat caagttcggt 1020
atcatcactt gtcaaaagcc attgtaa 1047
<210> 6
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Met Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Arg Pro Ser Ala Gln Pro Arg Phe
1 5 10 15
Ile Gln His Lys Lys Glu Ala Tyr Trp Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Ile
20 25 30
Val Tyr Asp His Val Ile Asn Pro Gly His Trp Thr Glu Asp Met Arg
35 40 45
Asp Asp Ala Leu Glu Pro Ala Asp Leu Ser His Pro Asp Met Arg Val
50 55 60
Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Phe Thr Thr Leu Gly Ile Val Lys
65 70 75 80
Thr Val Lys Ala Lys Asn Val Thr Ile Leu Asp Gln Ser Pro His Gln
85 90 95
Leu Ala Lys Ala Lys Gln Lys Glu Pro Leu Lys Glu Cys Lys Ile Val
100 105 110
Glu Gly Asp Ala Glu Asp Leu Pro Phe Pro Thr Asp Tyr Ala Asp Arg
115 120 125
Tyr Val Ser Ala Gly Ser Ile Glu Tyr Trp Pro Asp Pro Gln Arg Gly
130 135 140
Ile Arg Glu Ala Tyr Arg Val Leu Lys Ile Gly Gly Lys Ala Cys Leu
145 150 155 160
Ile Gly Pro Val Tyr Pro Thr Phe Trp Leu Ser Arg Phe Phe Ser Asp
165 170 175
Val Trp Met Leu Phe Pro Lys Glu Glu Glu Tyr Ile Glu Trp Phe Lys
180 185 190
Asn Ala Gly Phe Lys Asp Val Gln Leu Lys Arg Ile Gly Pro Lys Trp
195 200 205
Tyr Arg Gly Val Arg Arg His Gly Leu Ile Met Gly Cys Ser Val Thr
210 215 220
Gly Val Lys Pro Ala Ser Gly Asp Ser Pro Leu Gln Leu Gly Pro Lys
225 230 235 240
Glu Glu Asp Val Glu Lys Pro Val Asn Asn Pro Phe Ser Phe Leu Gly
245 250 255
Arg Phe Leu Leu Gly Thr Leu Ala Ala Ala Trp Phe Val Leu Ile Pro
260 265 270
Ile Tyr Met Trp Ile Lys Asp Gln Ile Val Pro Lys Asp Gln Pro Ile
275 280 285
<210> 7
<211> 867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atgtcttctt ctgtttcttc ttctagacca tctgctcaac caagattcat ccaacacaag 60
aaggaagctt actggttcta cagattcttg tctatcgttt acgaccacgt tatcaaccca 120
ggtcactgga ctgaagacat gagagacgac gctttggaac cagctgactt gtctcaccca 180
gacatgagag ttgttgacgt tggtggtggt actggtttca ctactttggg tatcgttaag 240
actgttaagg ctaagaacgt tactatcttg gaccaatctc cacaccaatt ggctaaggct 300
aagcaaaagg aaccattgaa ggaatgtaag atcgttgaag gtgacgctga agacttgcca 360
ttcccaactg actacgctga cagatacgtt tctgctggtt ctatcgaata ctggccagac 420
ccacaaagag gtatcagaga agcttacaga gttttgaaga tcggtggtaa ggcttgtttg 480
atcggtccag tttacccaac tttctggttg tctagattct tctctgacgt ttggatgttg 540
ttcccaaagg aagaagaata catcgaatgg ttcaagaacg ctggtttcaa ggacgttcaa 600
ttgaagagaa tcggtccaaa gtggtacaga ggtgttagaa gacacggttt gatcatgggt 660
tgttctgtta ctggtgttaa gccagcttct ggtgactctc cattgcaatt gggtccaaag 720
gaagaagacg ttgaaaagcc agttaacaac ccattctctt tcttgggtag attcttgttg 780
ggtactttgg ctgctgcttg gttcgttttg atcccaatct acatgtggat caaggaccaa 840
atcgttccaa aggaccaacc aatctaa 867
<210> 8
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Met Ala Ser Ile Ser Thr Pro Asn Ser Glu Thr Asp Lys Ile Ser Val
1 5 10 15
Lys Pro Val Tyr Val Pro Thr Ser Pro Asn Arg Glu Leu Arg Thr Pro
20 25 30
His Ser Gly Tyr His Phe Asp Gly Thr Pro Arg Lys Phe Phe Glu Gly
35 40 45
Trp Tyr Phe Arg Val Ser Ile Pro Glu Lys Arg Glu Ser Phe Cys Phe
50 55 60
Met Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Phe Arg Gln Ser Leu Ser Pro Leu
65 70 75 80
Glu Val Ala Leu Tyr Gly Pro Arg Phe Thr Gly Val Gly Ala Gln Ile
85 90 95
Leu Gly Ala Asn Asp Lys Tyr Leu Cys Gln Tyr Glu Gln Asp Ser His
100 105 110
Asn Phe Trp Gly Asp Arg His Glu Leu Val Leu Gly Asn Thr Phe Ser
115 120 125
Ala Val Pro Gly Ala Lys Ala Pro Asn Lys Glu Val Pro Pro Glu Glu
130 135 140
Phe Asn Arg Arg Val Ser Glu Gly Phe Gln Ala Thr Pro Phe Trp His
145 150 155 160
Gln Gly His Ile Cys Asp Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Glu Thr Val
165 170 175
Lys Ser Ala Arg Trp Glu Tyr Ser Thr Arg Pro Val Tyr Gly Trp Gly
180 185 190
Asp Val Gly Ala Lys Gln Lys Ser Thr Ala Gly Trp Pro Ala Ala Phe
195 200 205
Pro Val Phe Glu Pro His Trp Gln Ile Cys Met Ala Gly Gly Leu Ser
210 215 220
Thr Gly Trp Ile Glu Trp Gly Gly Glu Arg Phe Glu Phe Arg Asp Ala
225 230 235 240
Pro Ser Tyr Ser Glu Lys Asn Trp Gly Gly Gly Phe Pro Arg Lys Trp
245 250 255
Phe Trp Val Gln Cys Asn Val Phe Glu Gly Ala Thr Gly Glu Val Ala
260 265 270
Leu Thr Ala Gly Gly Gly Leu Arg Gln Leu Pro Gly Leu Thr Glu Thr
275 280 285
Tyr Glu Asn Ala Ala Leu Val Cys Val His Tyr Asp Gly Lys Met Tyr
290 295 300
Glu Phe Val Pro Trp Asn Gly Val Val Arg Trp Glu Met Ser Pro Trp
305 310 315 320
Gly Tyr Trp Tyr Ile Thr Ala Glu Asn Glu Asn His Val Val Glu Leu
325 330 335
Glu Ala Arg Thr Asn Glu Ala Gly Thr Pro Leu Arg Ala Pro Thr Thr
340 345 350
Glu Val Gly Leu Ala Thr Ala Cys Arg Asp Ser Cys Tyr Gly Glu Leu
355 360 365
Lys Leu Gln Ile Trp Glu Arg Leu Tyr Asp Gly Ser Lys Gly Lys Val
370 375 380
Ile Leu Glu Thr Lys Ser Ser Met Ala Ala Val Glu Ile Gly Gly Gly
385 390 395 400
Pro Trp Phe Gly Thr Trp Lys Gly Asp Thr Ser Asn Thr Pro Glu Leu
405 410 415
Leu Lys Gln Ala Leu Gln Val Pro Leu Asp Leu Glu Ser Ala Leu Gly
420 425 430
Leu Val Pro Phe Phe Lys Pro Pro Gly Leu
435 440
<210> 9
<211> 1329
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atggcttcta tctctactcc aaactctgaa actgacaaga tctctgttaa gccagtttac 60
gttccaactt ctccaaacag agaattgaga actccacact ctggttacca cttcgacggt 120
actccaagaa agttcttcga aggttggtac ttcagagttt ctatcccaga aaagagagaa 180
tctttctgtt tcatgtactc tgttgaaaac ccagctttca gacaatcttt gtctccattg 240
gaagttgctt tgtacggtcc aagattcact ggtgttggtg ctcaaatctt gggtgctaac 300
gacaagtact tgtgtcaata cgaacaagac tctcacaact tctggggtga cagacacgaa 360
ttggttttgg gtaacacttt ctctgctgtt ccaggtgcta aggctccaaa caaggaagtt 420
ccaccagaag aattcaacag aagagtttct gaaggtttcc aagctactcc attctggcac 480
caaggtcaca tctgtgacga cggtagaact gactacgctg aaactgttaa gtctgctaga 540
tgggaatact ctactagacc agtttacggt tggggtgacg ttggtgctaa gcaaaagtct 600
actgctggtt ggccagctgc tttcccagtt ttcgaaccac actggcaaat ctgtatggct 660
ggtggtttgt ctactggttg gatcgaatgg ggtggtgaaa gattcgaatt cagagacgct 720
ccatcttact ctgaaaagaa ctggggtggt ggtttcccaa gaaagtggtt ctgggttcaa 780
tgtaacgttt tcgaaggtgc tactggtgaa gttgctttga ctgctggtgg tggtttgaga 840
caattgccag gtttgactga aacttacgaa aacgctgctt tggtttgtgt tcactacgac 900
ggtaagatgt acgaattcgt tccatggaac ggtgttgtta gatgggaaat gtctccatgg 960
ggttactggt acatcactgc tgaaaacgaa aaccacgttg ttgaattgga agctagaact 1020
aacgaagctg gtactccatt gagagctcca actactgaag ttggtttggc tactgcttgt 1080
agagactctt gttacggtga attgaagttg caaatctggg aaagattgta cgacggttct 1140
aagggtaagg ttatcttgga aactaagtct tctatggctg ctgttgaaat cggtggtggt 1200
ccatggttcg gtacttggaa gggtgacact tctaacactc cagaattgtt gaagcaagct 1260
ttgcaagttc cattggactt ggaatctgct ttgggtttgg ttccattctt caagccacca 1320
ggtttgtaa 1329
<210> 10
<211> 308
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Met Thr Thr Thr Arg Gly Asn Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Ser
1 5 10 15
Thr Glu Ala Leu Arg Lys Gly Ile Ala Glu Phe Tyr Asn Glu Thr Ser
20 25 30
Gly Leu Trp Glu Glu Ile Trp Gly Asp His Met His His Gly Phe Tyr
35 40 45
Asp Pro Asp Ser Ser Val Gln Leu Ser Asp Ser Gly His Lys Glu Ala
50 55 60
Gln Ile Arg Met Ile Glu Glu Ser Leu Arg Phe Ala Gly Val Thr Asp
65 70 75 80
Glu Glu Glu Glu Lys Lys Ile Lys Lys Val Val Asp Val Gly Cys Gly
85 90 95
Ile Gly Gly Ser Ser Arg Tyr Leu Ala Ser Lys Phe Gly Ala Glu Cys
100 105 110
Ile Gly Ile Thr Leu Ser Pro Val Gln Ala Lys Arg Ala Asn Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Ala Gln Ser Leu Ala His Lys Ala Ser Phe Gln Val Ala Asp
130 135 140
Ala Leu Asp Gln Pro Phe Glu Asp Gly Lys Phe Asp Leu Val Trp Ser
145 150 155 160
Met Glu Ser Gly Glu His Met Pro Asp Lys Ala Lys Phe Val Lys Glu
165 170 175
Leu Val Arg Val Ala Ala Pro Gly Gly Arg Ile Ile Ile Val Thr Trp
180 185 190
Cys His Arg Asn Leu Ser Ala Gly Glu Glu Ala Leu Gln Pro Trp Glu
195 200 205
Gln Asn Ile Leu Asp Lys Ile Cys Lys Thr Phe Tyr Leu Pro Ala Trp
210 215 220
Cys Ser Thr Asp Asp Tyr Val Asn Leu Leu Gln Ser His Ser Leu Gln
225 230 235 240
Asp Ile Lys Cys Ala Asp Trp Ser Glu Asn Val Ala Pro Phe Trp Pro
245 250 255
Ala Val Ile Arg Thr Ala Leu Thr Trp Lys Gly Leu Val Ser Leu Leu
260 265 270
Arg Ser Gly Met Lys Ser Ile Lys Gly Ala Leu Thr Met Pro Leu Met
275 280 285
Ile Glu Gly Tyr Lys Lys Gly Val Ile Lys Phe Gly Ile Ile Thr Cys
290 295 300
Gln Lys Pro Leu
305
<210> 11
<211> 927
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atgactacta ctagaggtaa cgttgctgtt gctgctgctg ctacttctac tgaagctttg 60
agaaagggta tcgctgaatt ctacaacgaa acttctggtt tgtgggaaga aatctggggt 120
gaccacatgc accacggttt ctacgaccca gactcttctg ttcaattgtc tgactctggt 180
cacaaggaag ctcaaatcag aatgatcgaa gaatctttga gattcgctgg tgttactgac 240
gaagaagaag aaaagaagat caagaaggtt gttgacgttg gttgtggtat cggtggttct 300
tctagatact tggcttctaa gttcggtgct gaatgtatcg gtatcacttt gtctccagtt 360
caagctaaga gagctaacga cttggctgct gctcaatctt tggctcacaa ggcttctttc 420
caagttgctg acgctttgga ccaaccattc gaagacggta agttcgactt ggtttggtct 480
atggaatctg gtgaacacat gccagacaag gctaagttcg ttaaggaatt ggttagagtt 540
gctgctccag gtggtagaat catcatcgtt acttggtgtc acagaaactt gtctgctggt 600
gaagaagctt tgcaaccatg ggaacaaaac atcttggaca agatctgtaa gactttctac 660
ttgccagctt ggtgttctac tgacgactac gttaacttgt tgcaatctca ctctttgcaa 720
gacatcaagt gtgctgactg gtctgaaaac gttgctccat tctggccagc tgttatcaga 780
actgctttga cttggaaggg tttggtttct ttgttgagat ctggtatgaa gtctatcaag 840
ggtgctttga ctatgccatt gatgatcgaa ggttacaaga agggtgttat caagttcggt 900
atcatcactt gtcaaaagcc attgtaa 927

Claims (1)

1.一种高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌，其特征在于，基因工程菌的命名为：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS-356c，保藏编号为：CCTCC NO：M2019572。
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