CN111868229B

CN111868229B - 一种乳酸菌及其应用

Info

Publication number: CN111868229B
Application number: CN201980007490.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡英杰; 黄惠宇; 吴健诚; 许志行
Original assignee: Bened Biomedical Co Ltd
Current assignee: Bened Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2024-06-18
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: TWI705136B; US20210085731A1; EP3735456B1; EP3735456A1; EP3735456A4; US11938156B2; CN111868229A; JP7309212B2; TW201930585A; WO2019134690A1; JP2021509811A; EP3735456C0

Abstract

本发明提供经分离且经纯化的乳酸菌，其为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)PS23(PS23)，及其在以下方面中的应用：延迟衰老过程；增进免疫调节活性；减少、预防或治疗过敏；减少、预防或治疗发炎；预防或治疗慢性病症；及/或预防及/或治疗情绪障碍或神经病状。

Description

一种乳酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及新颖益生菌及其应用。特定而言，本发明涉及新颖乳酸菌及相关组合物及使用方法。

背景技术

世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将益生菌定义为「活的微生物体，其在以足够的量投与时，赋予宿主健康益处」。已知诸如乳酸菌等益生菌具有肠功能调控活性、免疫刺激活性及抗癌活性。

各种乳酸菌菌株(LAB)用于制造发酵食品，包括牛乳、面包、蔬菜及其他可食用的植物材料。LAB是一组通常用于产生发酵食品的革兰氏阳性(Gram-positive)菌。已广泛研究LAB在饮食及临床应用中的益处。LAB已用作用于保存食物的发酵剂，其利用低pH及在其发酵活性期间产生的发酵产物的作用来抑制腐败细菌的生长。为此，LAB已用于制备多种不同食品，例如奶酪、酸乳及其他来自牛乳的发酵乳产品。由于已发现LAB在摄取后对人类及动物展现出有价值的性质，因此其已引起极大关注。特定而言，已发现乳杆菌属(Lactobacillus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)的特定菌株能够定殖肠黏膜且有助于维持人类及动物的健康。抗发炎活性及免疫调节活性为LAB的众所周知的特性。US 7875421涉及约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株的DNA序列的用途，特定而言用于阐明微生物与其定殖宿主的相互作用及此外用于阐明此菌株展现出的益生菌性质基础的其基因体序列。WO 2018/129722提供经分离的乳酸菌(LAB)(即发酵乳杆菌PS150(Lactobacillusfermentum PS150))，其用于改善情绪障碍或神经病状及治疗或预防神经退化性疾病。

然而，业内需要开发有益于健康的新颖益生菌。

发明内容

本揭示内容提供经分离且经纯化的乳酸菌，其为副干酪乳杆菌PS23(Lactobacillus paracasei PS23、PS23)，其已根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保存于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen)且登录号为DSM 32322。

本揭示内容亦提供组合物，其包含本发明的PS23细胞及视情况可食用的载剂或医药上可接受的载剂。在一个实施例中，PS23细胞可以全细菌的形式使用，这些细菌是活细胞或死细胞。在一个实施例中，组合物是呈适于经口投与的形式。在另一实施例中，组合物是呈固体、半固体、液体、粉末颗粒的形式。

本揭示内容亦提供技术方案1的乳酸菌的用途，其用于制造用于个体的以下目的的制剂：(i)延迟衰老过程(抗衰老)；(ii)增进免疫调节活性；(iii)减少、预防或治疗过敏；(iv)减少、预防或治疗发炎；(v)预防或治疗与肠道发炎有关的慢性病症；及/或(vi)预防及/或治疗情绪障碍或神经病状或治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病。在一个实施例中，抗衰老为预防或延迟免疫衰老、预防或延迟肌少症或增进肠道障壁或肠道免疫。在一个实施例中，PS23可预防或治疗与免疫***中的年龄相关性劣化(即，免疫衰老)及发炎衰老(immunosenescence)有关的慢性病症。在一个实施例中，PS23可预防或延迟肌少症。

在一个实施例中，与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病是选自由以下组成的群：中风、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、皮克氏病(Pick's disease)、库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob's disease)、帕金森-ALS-失智症候群、威尔森氏病(Wilson'sdisease)、多发性硬化、进行性核上性麻痹、神经病性疼痛有关的双极性障碍、皮质基底核退化症、精神***症、注意力缺失过动病症(ADHD)、失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、视网膜疾病、癫痫、中风、暂时性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、由与长时间暂停至脑部的血流有关的手术技术引起的缺血、头部损伤、脊髓损伤、缺氧及抑郁症。

在一个实施例中，PS23可预防或治疗压力有关病症。在一个实施例中，PS23可改善睡眠质量及效率。

在一个实施例中，与肠道发炎有关的慢性病症是发炎性肠病或发炎性肠症候群。

图式简单说明

图1显示副干酪乳杆菌副干酪亚种PS23(Lactobacillus paracaseisubsp.Paracasei PS23)及其他干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)及副干酪乳杆菌模式菌株的基因体指纹分析图谱。M，标记物(250-10,000bp)；泳道1，副干酪乳杆菌坚韧亚种ATCC 25599(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans ATCC 25599)；泳道2，副干酪乳杆菌副干酪亚种ATCC 25302(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei ATCC 25302)；泳道3，干酪乳杆菌干酪亚种ATCC 393(Lactobacillus casei subsp.casei ATCC 393)；泳道4，副干酪乳杆菌副干酪亚种PS23。

图2显示热杀死或活体PS23降低粪便的潜血评分。

图3A及3B显示PS23降低DSS诱导的结肠缩短。A，DSS治疗组中的平均长度显著短于对照组。B，PS23挽救DSS诱导的结肠中的组织损害。

图4显示PS23降低结肠促发炎性细胞介素含量及MPO活性。

图5A至5E显示PS23能够逆转由生命早期压力诱导的异常表型。A及B，MS小鼠在开放空间中心区域中所花费的时间及进入中心区域的次数减少。C，MS小鼠在EPM开放臂中所花费的时间百分比减少。D，站立频率降低，此指示MS小鼠的探索性活动减少。E，MS不仅产生具有焦虑样行为的小鼠，且亦产生具有抑郁症样行为的小鼠。

图6显示PS23使MS诱导的发炎正常化。

图7显示PS23使MS诱导的HPA轴功能障碍正常化。

图8显示PS23增加海马体中的GR及BDNF蛋白质表达。

图9显示母婴分离小鼠的海马体中多巴胺的转换率。数据呈现为平均值±SD。相对于CON组，^***p<0.001；相对于MS组，^###p<0.001。

图10显示通过莫氏水迷宫(Morris water maze)测试对SAMP8小鼠的学***均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图11显示通过开放空间测试评价SAMP8小鼠的运动活动。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图12A及12B显示SAMP8小鼠脑组织中的血清素(A)及多巴胺(B)含量。数据呈现为平均值±SD。相对于未衰老组，^#p<0.05；相对于衰老组，^*p<0.05。

图13显示SAMP8小鼠中的血清BDNF含量。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图14(A)及14(B)显示SAMP8小鼠前额叶皮质及海马体中的SOD含量(A)及麸胱甘肽过氧化酶(GPx)含量(B)。数据呈现为平均值±SD。相对于未衰老组，^#p<0.05；相对于衰老组，^*p<0.05。

图15(A)至15(C)显示对SAMP8小鼠衰老程度的评估。评估类别包括行为(A)、皮肤及毛发(B)以及眼睛及脊柱(C)。数据呈现为平均值+/-SD。分级评分***遵循Takeda等人1981(Mech Ageing Dev.1981,17(2):183-94)。

图16显示SAMP8小鼠的吞噬作用活性。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图17(A)至17(C)显示SAMP8小鼠中的血清IL-10(A)、TNF-α(B)及MCP-1(C)的含量。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图18显示SAMP8小鼠脾细胞中总T细胞及CD4+细胞的百分比。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图19显示由经ConA刺激的SAMP8脾细胞所产生的IFN-γ及IL-5含量。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图20显示PS23对SAMP8小鼠中SOD及GPx的血清含量的效应。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图21(A)及21(B)显示SAMP8小鼠的身体组成(A)及前肢握力(B)。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图22显示SAMP8小鼠比目鱼肌的耗氧速率。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图23显示SAMP8小鼠胫骨前肌中的肌肉粒线体合成有关的基因表达。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图24显示SAMP8小鼠胫骨前肌中的发炎性细胞介素IL-6的基因表达。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图25(A)及25(B)显示SAMP8小鼠的肠道通透性(A)及肠道长度(B)。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图26(A)及26(B)显示SAMP8小鼠肠液中MCP-1(A)及IgA(B)的含量。数据呈现为平均值+/-SD。相对于未衰老组，#p<0.05；相对于衰老组，*p<0.05。

图27(A)至27(D)显示通过开放空间测试评价重复CORT注射小鼠的总路程(A)、中心时间(B)、中心进入次数(C)及中心路程(D)。数据呈现为平均值±SD。相对于CON组，^#p<0.05，^##p<0.01；相对于CORT组，^*p<0.05，^**p<0.01。

图28(A)及28(B)显示重复CORT注射小鼠的通过强迫游泳测试评价的不动时间(A)及蔗糖偏嗜度(B)。数据呈现为平均值±SD。相对于CON组，^#p<0.05；相对于CORT组，^*p<0.05，^**p<0.01。

图29(A)至29(C)显示重复CORT注射小鼠海马体中的盐皮质激素受体(A)、糖皮质激素受体(B)及BDNF(C)的相对表达程度。数据呈现为平均值±SD。相对于CON组，^##p<0.01，^###p<0.001；相对于CORT组，^*p<0.05，^***p<0.001。

图30显示重复CORT注射小鼠粪便中的双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)及球形梭菌(Clostridium coccoides)群的相对丰度。数据呈现为平均值±SD。相对于CON组，^##p<0.01，^###p<0.001；相对于CORT组，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

图31显示重复CORT注射小鼠脑组织中的血清素含量。数据呈现为平均值±SD。相对于CON组，^#p<0.05，^##p<0.05；相对于CORT组，^*p<0.05，^**p<0.01。

图32(A)及32(B)显示经口投与PS23一周增进PSQI评分(A)及睡眠效率(B)。数据呈现为平均值±SD。*p<0.05。

图33显示实验设计。

具体实施方式

除非另有明确说明，否则与连词「及」连接的物项组不应解读为需要那些物项中的每一者及每个均存在于分组中，而是应解读为「及/或」。类似地，除非另有明确说明，否则与连词「或」连接的物项组不应解读为需要在所述组中相互排除，而是应解读为「及/或」。此外，尽管可以单数形式描述或主张本发明的物项、组件或组件，但预计多数在其范围内，除非限于明确说明单数。

除非另有明确说明，否则如本文所使用，术语「一(a、an)」及「所述」应理解为意指单数及多数二者。因此，「一(a、an)」及「所述」(及若适当，其文法变化形式)是指一或多个。

术语「益生菌」在现有技术中视为在以足够量投与时赋予宿主健康益处的微生物。益生菌微生物必须满足与毒性的缺乏、存活率、黏附及有益效应有关的若干要求。这些益生菌特征是菌株依赖性的，即使在同一物种的细菌内亦是如此。

如本文所使用，术语「医药上可接受」是指在合理医学判断范围内适于与个体(人类或非人类动物)的组织接触使用而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症且与合理益处/风险比相称的化合物、材料、组合物及/或剂型。在与调配物的其他成分兼容的意义上，每一载剂、赋形剂等亦必须是「可接受的」。适宜载剂、赋形剂等可参见标准医药文献。

术语「可食用的载剂」是指适于与个体的组织接触使用的化合物、材料、组合物及/或剂型。在与调配物的其他成分兼容的意义上，每一载剂亦必须是「可接受的」。

如本文所使用的术语「有效量」是在合理医学判断范围内高至足够以正向方式显著改变欲治疗病状且低到足够避免严重副作用(以合理的效益/风险比)的组合物中每一菌株的菌落形成单位(cfu)的量。

如本文所使用，术语「病症」可与「疾病」或「病状」交换使用。

如本文所使用，术语「情绪障碍」是一类描述情绪严重变化的疾患。情绪障碍下的疾患包括：重度抑郁症、双极性障碍(躁狂-欣快、活动过多、过度膨胀的自我、不切实际的乐观)、持续性抑郁症(长久性轻度抑郁症)、循环性情感疾患(双极性障碍的轻度形式)及SAD(季节性情感障碍)。

如本文所使用，术语「神经病状」是一类描述神经损害及疾病对脑功能就行为、记忆力或认知而言的影响的疾患。神经病状下的疾患包括(但不限于)压力(例如慢性轻度压力)、认知减退、认知损害(包括轻度认知损害(MCI))、记忆差错、一般回忆问题、认知障碍或诸如阿兹海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、中风及精神***症等神经退化性疾病。

术语「治疗」应理解为意指减轻或减少特定疾病或病状的至少一种征象、症状、适应症或效应。如本文所使用，「预防」应理解为限制、降低疾病或病状的发作速率或程度或抑制其至少一种征象或症状的发展。

如本文所使用，术语「个体」为可自投与如本文所揭示的化合物或组合物受益的任何动物。在一些实施例中，个体为哺乳动物，例如人类、灵长类动物、狗、猫、马、牛、猪、啮齿类动物(例如大鼠或小鼠)。通常，哺乳动物为人类。

在一个实施例中，本发明提供经分离且经纯化的乳酸菌，其为副干酪乳杆菌PS23(PS23)，其已根据布达佩斯条约保存于德国微生物菌种保藏中心且登录号为DSM 32322。

在一个实施例中，经分离且经纯化的副干酪乳杆菌群是自健康人类面部分离。

在一个实施例中，16S rRNA基因序列及pheS基因序列显示PS23与副干酪乳杆菌副干酪亚种具有高度相似性。

在另一态样中，本发明提供组合物，其包含本发明的PS23细胞及视情况可食用的载剂或医药上可接受的载剂。在本发明的组合物中，这些PS23细胞可以全细菌(其可为活的或死的)形式使用。优选地，细菌细胞是作为活的活细胞存在。

本发明的组合物可呈适于投与、特定而言经口投与的任一形式。此包括(例如)固体、半固体、液体、颗粒及粉末。

本发明的组合物的实例为营养组合物。

所述组合物可为(例如)胶囊、锭剂或粉末。视情况，可存在益生菌(例如乳酸菌)的其他菌株。优选地，本发明组合物为类药剂营养品或医药产品或营养补充剂。

本文所阐述的组合物可为医药上可接受的组合物，其可包括一或多种医药上可接受的载剂、赋形剂、黏合剂、稀释剂或诸如此类。本发明组合物可经调配用于各种投与途径，例如通过经口投与。其亦可与递送媒剂组合提供，例如在一些囊封技术中。

对于经口投与而言，粉末、悬浮液、颗粒、锭剂、丸剂、胶囊、胶囊锭及囊片可接受作为固体剂型。这些剂型可通过(例如)将本文所揭示的一或多种化合物与至少一种添加剂(例如淀粉或其他添加剂)混合来制备。适宜添加剂为蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、聚葡萄糖、淀粉、琼脂、海藻酸盐、几丁质、几丁聚醣、果胶、黄蓍胶、***胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。视情况，经口剂型可含有有助于投与的其他成分，例如无活性稀释剂、或润滑剂(例如硬脂酸镁)、或防腐剂(例如对羟苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化剂(例如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸)、崩解剂、黏合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂或芳香剂。锭剂及丸剂可进一步经业内已知的适宜包衣材料来处理。

用于经口投与的液体剂型可呈医药上可接受的乳液、糖浆、酏剂、悬浮液及溶液的形式，其可含有无活性稀释剂(例如水)。可使用诸如(但不限于)油、水、醇及这些物质的组合等无菌液体将医药调配物及组合物制备为液体悬浮液或溶液。可添加医药上适宜的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂用于经口或非经肠投与。

在另一态样中，本发明提供用于个体的以下方法：(i)延迟衰老过程(抗衰老)；(ii)增进免疫调节活性；(iii)减少、预防或治疗过敏；(iv)减少、预防或治疗发炎；(v)预防或治疗与肠道发炎有关的慢性病症；及/或(vi)预防及/或治疗情绪障碍或神经病状或治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病，其包含向所述个体投与有效量的本发明的PS23细胞或含有其的组合物。在一个实施例中，有效量范围为约1×10⁷至约1×10¹³个细胞/天的热杀死PS23细胞或约1×10⁷至约1×10¹³CFU/天的活体PS23细胞。在一些实施例中，有效量范围为约1×10⁷至约1×10¹²个细胞/天、约1×10⁷至约1×10¹¹个细胞/天、约1×10⁷至约1×10¹⁰个细胞/天、约1×10⁸至约1×10¹³个细胞/天、约1×10⁸至约1×10¹²个细胞/天或约1×10⁸至约1×10¹¹个细胞/天的热杀死PS23细胞或1×10⁷至约1×10¹²CFU/天、约1×10⁷至约1×10¹¹CFU/天、约1×10⁷至约1×10¹⁰CFU/天、约1×10⁸至约1×10¹³CFU/天或约1×10⁸至约1×10¹²CFU/天或约1×10⁸至约1×10¹¹CFU/天的活体PS23细胞。在另一实施例中，有效量为约1×10¹⁰个细胞/天的热杀死PS23细胞或1×10¹⁰CFU/天的活体PS23细胞。

在一个实施例中，抗衰老包括(但不限于)预防或延迟免疫衰老、预防或延迟肌少症及增进肠道障壁或肠道免疫。

PS23可增进吞噬作用活性、改善全身发炎、增加总T细胞及CD4+细胞群体且平衡脾细胞的Th1/Th2反应。因此，PS23可预防或治疗与免疫***中的年龄相关性劣化(即，免疫衰老)及发炎衰老有关的慢性病症，例如心血管疾病、癌症及2型糖尿病。

PS23亦可预防或延迟肌少症。肌少症为年龄有关的肌肉质量损失及肌肉力量下降，其与身体残疾、生活质量差及脆弱性强烈相关。

在一个实施例中，与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病可选自由以下组成的群：中风、阿兹海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、皮克氏病、库贾氏病、帕金森-ALS-失智症候群、威尔森氏病、多发性硬化、进行性核上性麻痹、神经病性疼痛有关的双极性障碍、皮质基底核退化症、精神***症、注意力缺失过动病症(ADHD)、失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、视网膜疾病、癫痫、中风、暂时性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、由与长时间暂停至脑部的血流有关的手术技术引起的缺血、头部损伤、脊髓损伤、缺氧及抑郁症。

PS23可增加学习能力、记忆力及运动活动。因此，PS28可预防且延迟神经退化。这些效应可通过降低脑中的氧化压力且通过增强BDNF表达来达成。因此，PS23可预防或治疗中枢神经***(CNS)中的衰老及氧化压力有关的病症，例如慢性脑发炎、脑血管意外、衰老及神经退化性疾病。

在一些实施例中，PS23可预防且治疗压力有关病症。PS23挽救焦虑样行为、探索性活动、抑郁症样行为、正规化HPA轴功能障碍、增加海马体中的GR及BDNF蛋白质表达且保护神经元免受压力且增加海马体中的多巴胺转换率。

在一些实施例中，PS23预防且治疗压力有关病症。PS23可减少CORT诱导的抑郁症样行为、增加海马体中的糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)及BDNF蛋白质表达、保护神经元免受压力且增加脑中的血清素含量。

在一些实施例中，PS23改善睡眠质量及效率。

在一个实施例中，PS23可增进肠道通透性、减少肠道发炎或增进黏膜免疫性。在一个实施例中，与肠道发炎有关的慢性病症包括(但不限于)发炎性肠病及发炎性肠症候群。

通过下文所呈现的实例更详细地阐述本发明，实例的前为附图的简要说明。然而，不言而喻，这些实例是以说明本发明目标物的方式给出，且不以任何方式构成对其的限制。

实例

材料及方法

1.1.PS23的制备

PS23(DSM 32322)是自健康人类粪便分离。通过对其16S rDNA序列进行系谱分类将其鉴别为新颖菌株。将经分离的PS23接种于Man Rogosa Sharpe培养液(MRS；BD Difco,Becton-Dickinson,Sparks,MD MD,USA)中，在37℃下培养18h，且然后通过在6000×g下离心10min收获。将团粒重新悬浮于MRS加上12.5％甘油中至每毫升5×10⁹个群落形成单位的最终浓度。然后将重新悬浮的溶液等分于冷冻管中且在-20℃下储存直至使用。当使用时，使等分试样预热至37℃持续1h且重新悬浮于盐水中，之后投与小鼠。

1.2.动物及圈养

本研究中所使用的所有小鼠均是购自实验室动物中心(Laboratory AnimalCenter，NLAC；Taipei)且安置在阳明大学(Yang-Ming University)的动物中心。使房间保持在22±2℃、50％-60％湿度下，且处于12h光/暗循环下。除非另有说明，否则随时自由地为小鼠提供水及饲料(实验室饮食可高压灭菌的啮齿类动物饮食5010；PMI NutritionInternational,Brentwood,MO,USA)。所有动物实验程序均由阳明大学实验动物照护及使用委员会审查并批准。使小鼠适应一周，之后开始实验。

1.3.实验设计及样品收集

对于DSS诱导的UC小鼠模型，将雌性BALB/c小鼠(6至8周龄)随机分配至健康(CON)、UC对照(DSS)、DSS+热杀死PS23(热杀死)及DSS+活体PS23(活体)组中。自第1天至第7天，向CON及DSS组二者经口投与盐水；而向热杀死组及活体组分别经口投与热杀死(1×10⁹个细胞/小鼠/天)或活体PS23(1×10⁹CFU/小鼠/天)。在第8天，将所有DSS组的饮用水换成5％的DSS水(g/mL)。在第14天，收集小鼠的粪便以用于量测粪便潜血含量。在收集粪便之后，使用CO₂窒息将小鼠处死。小心地切除结肠，以量测自盲肠至***的长度。然后在量测之后立即切下一小部分末端结肠且固定于10％磷酸盐缓冲的***(formalin)中用于组织学用途。将结肠的剩余部分储存在-80℃下直至进行结肠蛋白质提取。

对于MS小鼠模型，使用定时怀孕的雌性C57BL/6J小鼠。为评估PS23的影响精神效应，吾人向MS实验组投与PS23。自PD29通过胃管灌食给予MS组经盐水重新悬浮的热杀死(1×10⁹个细胞/小鼠/天)或活体PS23(1×10⁹CFU/小鼠/天)达4周，而在同一时期期间给予MS及未经处理的对照组盐水。在PS23治疗期结束时，使小鼠经历一连串行为测试。按照以下顺序自最小压力至最大压力依次给予测试：开放空间测试(OFT)；高架十字迷宫(EPM)；及强迫游泳测试(FST)。所有测试均是在光照阶段期间进行。

1.4结肠组织均质上清液的制备

使结肠组织于RIPA溶解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5、150mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠、1％ NP-40及0.1％ SDS)中在蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)存在下均质化。于冰上使结肠蛋白质匀浆培育15min，且然后在4℃下在12,000g下离心10min。收集上清液且储存在-80℃下直至进行分析。使用Bradford分析测定蛋白质含量。

1.5细胞介素产生的测定

通过市售套组(IFN-γ及IL-10使用Biolegand ELISA套组；IL-8、TNF-α、IL-1β及IL-6使用eBioscience ELISA套组)量测血清或结肠组织均质上清液中的细胞介素含量。

1.6髓过氧化酶活性分析

通过市售套组(Cayman MPO过氧化分析套组)量测结肠组织均质上清液髓过氧化酶(MPO)活性值。

1.7开放空间测试

通过OFT检查小鼠的运动活动。在此测试中，将小鼠置于开放空间活动室中10min(Tru Scan活动***；Coulbourn Instruments,Whitehall,PA,USA)。方形活动室(25.4×25.4×38cm)是由Plexiglas墙壁制成，每一侧上具有两个光束感测条。每次测试之后，利用70％乙醇清洁盒子。自动记录活动且利用Tru Scan 2.2软件(Coulbourn Instruments)进行量化。通过Tru Scan活动***量测行进的总路程、移动时间及中心路程及时间。中心区界定为量测12.5×12.5cm的中心中的区域。

1.8高架十字迷宫测试

高架十字迷宫是由两个闭合臂及两个开放臂(高度，45cm；全臂长度，66cm；臂宽度，10cm；闭合臂的墙壁高度，30cm)构成。使用此测试来评价小鼠的焦虑样行为。将小鼠置于中心臂交叉区(10×10cm)中且容许在迷宫中自由探索10min。在每次测试之后，利用70％乙醇清洁迷宫。通过安装在迷宫中心天花板上的摄像机记录小鼠活动。稍后通过EthoVision视讯跟踪软件(Noldus Information Technology,Wageningen,theNetherlands)分析所记录的活动。量化总行进路程及在开放臂及闭合臂中停留的持续时间。

1.9强迫游泳测试

使用FST来评价小鼠的抑郁症样行为。简言之，在第一天将小鼠置于含有15cm水(23℃-25℃)的透明丙烯酸圆筒(高度，30cm；内部直径，10cm)中使其游泳6min。游泳之后，利用薄型纸使小鼠干燥且使其返回至饲养笼。第二天，给予小鼠5min的第二游泳时段。通过摄像机记录游泳时段且通过EthoVision视讯跟踪软件分析行为。量化第二时段期间的不动时间。

1.10血清皮质酮

首先将血清稀释，且然后使用市售CORT EIA套组(Cayman Chemical,Michigan,MI,USA)分析皮质酮浓度。遵循制造商的说明书，使用套组中所提供的标准品对皮质酮浓度进行内插。

1.11统计分析

所有数据均表示为平均值±SEM或平均值±SD。在适当时利用庞费洛尼事后测试(Bonferroni’s post-test)或双尾t测试通过单向或双向方差分析(ANOVA)分析各组之间的差异。

实例1副干酪乳杆菌PS23的基因分型

下表列示与PS23的16S rRNA序列及pheS DNA序列相比，其16S rRNA及pheS DNA序列显示最高相似性值的那些生物体。

16S rRNA基因及pheS基因的比较指示PS23属副干酪乳杆菌副干酪亚种。

通过ERIC-PCR及(GTG)₅-PCR分析的基因体指纹分析显示PS23是副干酪乳杆菌的新颖菌株(参见图1)。

使用API 50CHL套组(bioMerieux,France)研究PS23的糖利用。发酵测试指示PS23具有与副干酪乳杆菌副干酪亚种相似的生物化学性质。

+，阳性；-，阴性；±，较弱。

实例2 PS23降低肠道出血

由于每天5％ DSS持续7天可引起严重组织损害且导致肠道出血，因此在DSS处理组中的粪便中可能存在血液。为量测肠道发炎的严重程度，吾人自每一小鼠收集粪便以在第13天进行潜血分析。颜色较深的样品评分较高。如图2中所示，DSS组中的粪便潜血评分显著高于对照组(p<0.0001)，此指示DSS挑战后肠道出血增加。此由粪便及其***具有血液的观察结果支持，指示所有经DSS处理的小鼠均患有轻度至重度的肠道发炎。长期投与热杀死或活体PS23能够降低出血，此乃因发现粪便潜血评分较低(图2)。特定而言，活体PS23较其热杀死形式更有效地降低出血，此乃因评分显著低于DSS组(图2；p<0.05)。

实例3 PS23降低DSS诱导的结肠缩短

DSS鼠类模型的特征在于结肠长度缩短。吾人发现，DSS治疗组中的平均长度显著短于对照组(图3A；p<0.0001)。然而，PS23组中的长度较长，尤其在活体组中，其显著长于DSS组(图3A；p<0.01)。另外，吾人发现，活体PS23组中的小鼠结肠中存在更多的固结粪便，此指示投与降低腹泻。此外，组织学显示PS23挽救结肠中DSS诱导的组织损害(图3B)，如根据对肠细胞损失、隐窝发炎、嗜中性球、固有层、上皮增生及单核细胞的观察结果所评估。

实例4 PS23降低结肠促发炎性细胞介素含量及MPO活性

在DSS-结肠炎模型中已报导DSS诱导的肠道发炎及结肠组织中TNF-α、IL-6及MPO活性的增加。吾人在DSS处理小鼠的结肠组织发现TNF-α、IL-6及MPO活性增加的类似结果(图4)。另一方面，投与热杀死及活体PS23二者均降低结肠组织中的所有细胞介素含量及MPO活性，而两组中TNF-α、IL-6及MPO活性的降低在统计学上达到与DSS组的显著差异(图4；p<0.05)。

实例5 PS23挽救MS诱导的焦虑样行为及探索性活动

吾人向C57BL/6J小鼠施加MS且使用旷场测试(OFT)、高架十字迷宫(EPM)及强迫游泳测试(FST)来评价MS小鼠的行为。如图5中所示，在开放空间中心区域中停留的时间及进入次数减少(图5A及5B)，且在EPM开放臂中停留的时间百分比降低(图5C)，此指示MS导致小鼠更加焦虑。另外，吾人亦发现站立频率降低(图5D)，此指示MS小鼠具有减少的探索性活动。此外，吾人发现MS不仅产生具有焦虑样行为的小鼠，且亦产生具有抑郁症样行为的小鼠，如在FST中，不动时间增加(图5E)。有趣的是，投与热杀死及活体PS23二者持续4周挽救这些降低(图5A-5E)，此指示PS23能够逆转由生命早期压力诱导的异常表型。

实例6 PS23正规化MS诱导的发炎

吾人发现，MS将小鼠的免疫性转向发炎增加，此乃因在MS组中血清TNF-α及IL-6较高，而抗发炎性细胞介素IL-10则低于对照(图6)。另一方面，吾人发现长期投与PS23降低发炎(由血清TNF-α及IL-6减少所示)且增加IL-10含量(图6)。由于过度活化的免疫反应增加发生身体及心理功能障碍的风险，因此吾人在MS小鼠中的发现可与先前DSS实验中所示的PS23抗发炎效应相呼应且可部分地为PS23如何改善MS小鼠的焦虑样及抑郁症样行为的基础。

实例7 PS23正规化MS诱导的HPA轴功能障碍

与显示MS破坏HPA轴的大多数先前研究一致，吾人发现在与非MS对照小鼠相比时，在基础状态及受压状态二者下CORT含量不同，且HPA轴活性在基础状态下过度活化(图7；p<0.01)。尽管如此，吾人发现，FST后30min出现减弱的CORT含量，且受压对基础CORT含量的比率显著低于对照(图7；p<0.0001)，此表明HPA轴受MS损害且在刺激时不能维持足够的CORT含量。相比之下，MS组的热杀死及活体PS23二者中的CORT含量挽救至接近对照含量(图7)，此指示PS23能够正规化失调的HPA轴。

实例8 PS23增加海马体中的GR及BDNF蛋白质表达

GR是负责HPA轴中的反馈抑制的主要受体。为更详细地研究MS及PS23对HPA轴的效应，吾人检查海马体GR蛋白含量。吾人发现MS小鼠中的GR表达降低(图8)，此指示MS损害HPA轴的反馈回路，此可为MS组中血清CORT含量升高的原因。另外，吾人发现，此区中BDNF蛋白含量降低(图8)。海马体中BDNF含量的改变与抑郁症相关。有可能在生命早期期间，MS程序损害小鼠中的海马体发育并导致BDNF含量不足，此二者均削弱压力反应。相反，由于与MS组相比，GR及BDNF蛋白含量显著增加(图8；p<0.05)，因此长期投与热杀死及活体PS23二者能够逆转这些含量的降低，且保护海马体神经元免受压力。

经口投与活体或热杀死PS23增加海马体中的多巴胺转换率(图9)。

实例9衰老加速倾向小鼠8(SAMP8)小鼠模型中的抗衰老研究

实验设计示于图33中。

PS23预防且延迟神经退化。经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠的学习及记忆能力(图10)。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠的运动活动(图11)。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠的神经传递质(例如血清素及多巴胺)含量(图12(A)及12(B))。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠的血清BDNF含量(图13)。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠前额叶皮质及海马体中的抗氧化酶(例如超氧化物歧化酶(SOD)及麸胱甘肽过氧化酶(GPx))的含量(图14(A)及14(B))。

经口投与PS23延迟且预防衰老SAMP8小鼠的衰老有关的生理变化(图15(A)至15(C))。

经口投与PS23增进衰老SAMP8小鼠的受衰老损害的吞噬作用活性(图16)。

经口投与PS23通过增加抗发炎性细胞介素IL-10、减少促发炎细胞介素TNF-α且减少发炎性趋化介素MCP-1来改善衰老SAMP8小鼠的全身发炎(图17(A)至17(C))。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠脾细胞中的总T细胞及CD4⁺细胞群体(图18)。

经口投与PS23增加由CoA刺激的衰老SAMP8小鼠脾细胞的IFN-γ产生且减少IL-5(图19)。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠血清中的抗氧化酶(例如超氧化物歧化酶(SOD)及麸胱甘肽过氧化酶(GPx))的含量(图20)。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠的肌肉质量及握力(图21(A)及21(B))。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠比目鱼肌的耗氧速率(图22)。

经口投与PS23增加衰老SAMP8小鼠的肌肉粒线体合成有关的基因表达(图23)。

经口投与PS23减少衰老SAMP8小鼠胫骨前肌中的发炎性细胞介素IL-6基因表达(图24)。

经口投与PS23改善衰老SAMP8小鼠的肠道通透性且修复受衰老过程损害的肠道长度(图25(A)及25(B))。

经口投与PS23减少衰老SAMP8小鼠肠液中的发炎性趋化介素MCP-1且增加分泌性IgA(图26(A)及26(B))。

实例10 PS23预防且治疗压力有关病症

PS23预防且治疗压力有关病症。下文显示通过重复皮质酮注射诱导的抑郁症模型的实验设计。

雄性C57BL/6N小鼠，

6至8周龄，n＝10

经口投与活体或热杀死PS23挽救CORT诱导的焦虑样行为及探索性活动(图27(A)至27(D))。

经口投与活体或热杀死PS23挽救CORT诱导的抑郁症样行为(图28(A)及28(B))。

经口投与活体或热杀死PS23增加海马体中的糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)及BDNF蛋白质表达，且保护神经元免受压力(图29(A)至29(C))。

经口投与活体或热杀死PS23增加CORT诱导的抑郁症小鼠中「好」细菌(如乳杆菌属及双歧杆菌属)的相对丰度，且减少「坏」细菌(如梭菌属(Clostridium))的相对丰度。这些结果显示经口投与PS23可调节肠道微生物区(图30)。

经口投与PS23增加CORT诱导的抑郁症小鼠脑中的血清素含量(图31)。

PS23改善睡眠质量及效率。每天向六名健康人经口投与PS23(3×10¹⁰CFU/天)达一周。在第0天及第7天通过匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh Sleep Quality Index，PSQI)评价睡眠质量及效率。结果显示经口投与PS23改善睡眠质量及睡眠效率(图32(A)及32(B))。

Claims

1.一种经分离且经纯化的乳酸菌，其为副干酪乳杆菌PS23(PS23)，其已根据布达佩斯条约保存于德国微生物菌种保藏中心且登录号为DSM 32322。

2.一种组合物，其包含如权利要求1的乳酸菌及视情况可食用的载剂或医药上可接受的载剂。

3.如权利要求2的组合物，其中所述乳酸菌可以全细菌的形式使用，这些细菌是活细胞或死细胞。

4.如权利要求2的组合物，其是呈适于经口投与的形式。

5.如权利要求4的组合物，其是呈固体、半固体、液体、粉末颗粒的形式。

6.一种如权利要求1的乳酸菌的用途，其用于制造用于个体的以下目的的制剂：(i)延迟衰老过程；(ii)增进免疫调节活性；(iii)减少、预防或治疗过敏；(iv)减少、预防或治疗发炎；(v)预防或治疗与肠道发炎有关的慢性病症；及/或(vi)预防及/或治疗情绪障碍或神经病状或治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病。

7.如权利要求6的用途，其中所述延迟衰老过程是预防或延迟免疫衰老、预防或延迟肌少症或增进肠道障壁或肠道免疫。

8.如权利要求6的用途，其中所述乳酸菌可预防或治疗与免疫***中的年龄相关性劣化及发炎衰老有关的慢性病症。

9.如权利要求8的用途，其中所述与免疫***中的年龄相关性劣化为免疫衰老。

10.如权利要求6的用途，其中所述乳酸菌可预防或延迟肌少症。

11.如权利要求6的用途，其中与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的所述疾病是选自由以下组成的群：中风、阿兹海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、皮克氏病、库贾氏病、帕金森-ALS-失智症候群、威尔森氏病、多发性硬化、进行性核上性麻痹、神经病性疼痛有关的双极性障碍、皮质基底核退化症、精神***症、注意力缺失过动病症、失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、视网膜疾病、癫痫、中风、暂时性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、由与长时间暂停至脑部的血流有关的手术技术引起的缺血、头部损伤、脊髓损伤、缺氧及抑郁症。

12.如权利要求6的用途，其中所述乳酸菌可增加学习能力、记忆力及运动活动。

13.如权利要求6的用途，其中所述乳酸菌可预防或治疗压力有关病症。

14.如权利要求13的用途，其中所述压力有关病症是慢性脑发炎、脑血管意外、衰老或神经退化性疾病。

15.如权利要求6的用途，其中所述乳酸菌可改善睡眠质量及效率。

16.如权利要求6的用途，其中与肠道发炎有关的所述慢性病症是发炎性肠病或发炎性肠症候群。