CN111856026A - 基于胶乳增强免疫比浊法测定iii c的试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents

基于胶乳增强免疫比浊法测定iii c的试剂盒及其制备使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2；反应缓冲液R1包括缓冲液、无机盐、增浊剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂；胶乳试剂R2包括至少两种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种组成液之间的混合比例为1:1；此外，每种胶乳试剂组成液还分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中的胶乳微球，胶乳保存液包括缓冲液、无机盐、稳定剂、防腐剂、表面活性剂。本发明还提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒的制备使用方法。本发明的优点在于：不仅操作简单、检测速度快，而且选择性好、特异性佳、精密度高、重复性与一致性好。

Description

基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒及其制备使用 方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂制备领域，尤其涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
肝病发展的过程中会经历肝纤维化这一过程，随着肝纤维化的不断加重，肝细胞会出现大量的脱落和坏死，同时肝小叶结构会逐渐变得扭曲和增重，最终导致肝硬化的发生。因此，临床上针对肝病患者进行及时、有效的诊断和治疗可大大减轻患者的症状，避免病情进一步恶化。组织病理学检查是肝纤维化的临床诊断金标准，虽然病理检查具备极高的准确性，但难免会对患者造成一定的创伤，且不便多次诊断。为此，临床上广泛采用血清学指标来对肝纤维化的严重程度进行判断，其中，III型胶原蛋白(III C)是应用较广、准确度较高指标之一。
肝纤维化是由于不同程度和不同种类的慢性肝病所导致的纤维化，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、脂肪肝等肝纤维化发生的基本问题就是肝组织的内胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多样等基质增加。III型胶原蛋白(III C)属于细胞外基质成分，随着病情发展越来越重，细胞外基质成分在血清的含量会显著上升，因此对于判断肝病和肝纤维化的严重程度具有显著的价值。
关于III型胶原蛋白的检测方法，目前市场上主要是化学发光法。化学发光法是一种灵敏简便的方法，但其选择性差，会对一个系列的化合物做出反应，而不是针对单个的某一化合物。因此，目前急需一种选择性好、特异性佳、精密度高的III型胶原蛋白检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种选择性好、特异性佳、精密度高的基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2；
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：缓冲液5-12g/L，无机盐2-15 g/L，增浊剂10-30g/L，防腐剂1-2mL/L，稳定剂3-14g/L，表面活性剂0.5-2.5 mL/L，溶剂为纯化水；
所述胶乳试剂R2包括至少两种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为0.5-1.0mg/mL的相应III C单抗标记的胶乳微球；所述胶乳保存液包括的成分及相应含量为：缓冲液2-7g/L，无机盐5-12g/L，稳定剂 10-20g/L，防腐剂1-2mL/L，表面活性剂1-7mL/L，溶剂为纯化水；其中，在所述胶乳试剂R2中，每种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
作为本发明的优选方式之一，在所述反应缓冲液R1中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液(即，MES缓冲液)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(即，MOPSO 缓冲液)中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述增浊剂为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇 8000中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA和蔗糖中的一种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述反应缓冲液R1的pH为7.1-7.9。
作为本发明的优选方式之一，在所述胶乳保存液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖、甘露醇、甘氨酸中一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳保存液的pH为6.1-7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述III C单抗标记的胶乳微球中使用的胶乳微球直径为100-300nm。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳试剂R2的制备方法为：
①取固含量为10％的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取至少两种III C单抗，各自与制得的活化胶乳微球按照特定比例混匀，并进行一定时间的偶联，制取偶联后的胶乳微球；其中，所述活化胶乳微球与各III C单抗抗体的v/w比均分别为1:(3-5)，偶联时间为1h；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的胶乳试剂R2。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液R1：
按照反应缓冲液R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液R1；
(2)配制胶乳试剂R2：
①取固含量为10％的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取至少两种III C单抗，各自与制得的活化胶乳微球按照特定比例混匀，并进行一定时间的偶联，制取偶联后的胶乳微球；其中，所述活化胶乳微球与各III C单抗抗体的v/w比均分别为1:(3-5)，偶联时间为1h；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的胶乳试剂R2。
作为本发明的优选方式之一，在所述步骤①中，所述清洗缓冲液与活化缓冲液采用MES缓冲液；所述偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；所述活化剂采用 EDAC/NHS；在所述步骤③中，所述封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，封闭时间1h。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取5μL样本，加入200μL试剂R1，37℃孵育3-5min；
(2)加入50μL试剂R2，置37℃孵育；
(3)孵育60s后读取吸光值A1；再孵育5min，读取吸光值A2；最后，计算ΔA，△A＝A2-A1，根据ΔA测算样本中III C含量。
作为本发明的优选方式之一，本发明中采用的各种III C单抗抗体均来源于本领域可直接购买得到的常规III C单抗抗体。
本发明试剂盒的反应原理：
样本中的III型胶原蛋白与试剂中特异性的抗人Ⅲ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒结合，形成抗原抗体复合物而产生浊度，其浊度高低与标本中Ⅲ型胶原蛋白成正比。通过测定特定波长下的吸光度值，参照校准曲线即可计算出标本中III型胶原蛋白的含量。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒利用胶乳增强免疫比浊法测定III C，不仅操作简单、检测速度快，而且选择性好、特异性佳、精密度高、重复性与一致性好；
(2)本发明可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉，且自动化高，可节省检测时间，便于临床应用；
(3)通过本发明方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求；
(4)在胶乳增强免疫比浊法应用中，若采用多抗进行标记可以有效提高试剂灵敏度，但会造成特异性不强，使检测结果准确度下降；若采用一株单抗对胶乳进行标记，可以使特异性提高，但灵敏度又会受到影响；针对上述问题，本发明试剂盒中，选择采用至少两株特异性较强的III C单抗对胶乳进行分别标记，然后混合在一起，可以在保持灵敏度情况下，特异性也较强。
附图说明
图1是实施例6中基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒的线性范围线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2。
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液5 g/L，氯化镁或氯化钾2g/L，聚乙二醇1000或聚乙二醇200010g/L，Proclin300 1mL/L，BSA3 g/L，吐温-800.5mL/L，溶剂为纯化水，pH为7.1。
所述胶乳试剂R2包括至少两种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为0.5mg/mL的相应III C单抗标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液2g/L，氯化钠或氯化钾5g/L，BSA 10g/L，Proclin3001 mL/L，吐温-801mL/L，溶剂为纯化水， pH为6.1。
进一步地，在胶乳试剂R2中，每种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
进一步地，在胶乳试剂R2中，使用的胶乳微球直径为100nm。
实施例2
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2。
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液或2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液12g/L，氯化锌或氯化钙15g/L，聚乙二醇800030g/L，硫柳汞2mL/L，蔗糖14g/L，曲拉通X-1002.5mL/L，溶剂为纯化水，pH为7.9。
所述胶乳试剂R2包括至少两种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为1.0mg/mL的相应III C单抗标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液或2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液7 g/L，氯化锌或氯化钙12g/L，蔗糖或甘露醇20g/L，硫柳汞2mL/L，曲拉通X-100 7mL/L，溶剂为纯化水，pH为7.5。
进一步地，在胶乳试剂R2中，每种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
进一步地，在胶乳试剂R2中，使用的胶乳微球直径为300nm。
实施例3
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2。
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：MOPSO缓冲液8.06g/L，氯化钠5.4g/L，聚乙二醇600020g/L，Proclin3001.2 mL/L，BSA 6g/L，吐温-20 1.5mL/L，溶剂为纯化水，pH为7.6。
所述胶乳试剂R2包括至少两种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为0.75mg/mL的相应III C单抗标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：MOPSO缓冲液4.3g/L，氯化镁8.7g/L，甘氨酸16g/L，Proclin3001.2 mL/L，吐温-204.5mL/L，溶剂为纯化水，pH为 6.6。
进一步地，在胶乳试剂R2中，每种通过III C单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
进一步地，在胶乳试剂R2中，使用的胶乳微球直径为200nm。
实施例4
本实施例的一种上述实施例1-3中基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液R1：
按照反应缓冲液R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液R1。
(2)配制胶乳试剂R2：
清洗：取固含量为10％的胶乳微粒0.5mL，并加至3.0mL的清洗缓冲液中； 20000r/min下离心30min，去上清；用3.0mL活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声。该步骤中，清洗缓冲液和活化缓冲液采用MES缓冲液。
活化：量取一定量的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，混匀，对胶乳微粒进行活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球。该步骤中，偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；活化剂采用2％EDAC 0.1mL与4％NHS 0.2mL，活化时间0.5h；相应胶乳微粒与活化剂的比例为1：(15-25)(重量比)。
偶联：取至少两株经筛选好的特异性强的III C单抗各自与活化好的胶乳微粒进行偶联，制取偶联后的胶乳微球。该步骤中，活化好的胶乳微粒与各III C 单抗抗体的v/w比均分别为1:(3-5)，偶联时间为1h。
封闭：偶联时间结束后开始离心，20000r/min下离心30min，去上清；取5.0mL的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1h。该步骤中，封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，优选为1％Gly。
定溶：封闭结束后开始离心，20000r/min下离心30min，去上清；加入40mL 的胶乳保存液对胶乳微粒进行重悬超声，然后定溶，制取各自的胶乳试剂组成液；最后，将制取的各胶乳试剂组成液按照1：1比例混合，即得所需的胶乳试剂R2。
实施例5
本实施例的一种上述实施例1-3中基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒的使用方法。
检测仪器：日立7180；
温度：37℃；
比色杯：1cm；
分析方法：两点终点法；
测光点：19-34；
主副波长：546/0；
样本量/R1/R2:5uL/200uL/50uL；
反应方向：(+)。
使用步骤：参见表1。
表1本发明试剂盒的使用步骤
Figure BDA0002395098570000101
校准方式为样条函数Spline。采用多点校准模式，用纯化水为零点，建立工作曲线。
计算方法：以校准品浓度对相应△A拟合校准曲线，样本浓度值通过校准曲线得出。
实施例6
本实施例用以评价上述实施例1-3中基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒：
(1)线性相关性验证
线性相关系数：在[5.0ng/mL-90.0ng/mL]范围内用接近线性区间下限的低值标本稀释接近线性区间上限的高值标本，混合成至少5个不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)，见表2。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应符合r≥0.9900。
Figure 1
表2本发明试剂盒的线性相关性比对值
Figure BDA0002395098570000112
图1是本发明试剂盒的线性范围线性回归图，如图1所示，本试剂盒的直线拟合曲线为：y＝1.0148x+0.0475，R2＝1.0；其中，R2>0.99，满足临床要求。
(2)精密度、重复性验证
重复性：在重复条件下，取(15.0±5.0)ng/mL和(40.0±10.0)ng/mL浓度的样本(质控品、校准品或其他定值样本)，用同一批号试剂重复测定10次，分别计算测定值的平均值和标准差，按公式(2)计算批内变异系数(CV)，所得结果CV应≤5.0％。
变异系数
Figure BDA0002395098570000113
式中：SD为标准差，计算公式为
Figure BDA0002395098570000114
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为
Figure BDA0002395098570000115
xn为同水平各次所测值；
Figure BDA0002395098570000121
为平均值，计算公式为
Figure BDA0002395098570000122
结果如表3所示。
表3本发明试剂盒的重复性检测结果总结表
Figure BDA0002395098570000123
由检测结果可以看出，低值样本的CV为3.49％，高值样本的CV为3.22％，均小于5％，满足临床要求。
(3)准确度验证
取高、低两个水平的质控品，按照说明书操作步骤进行测定，用同一批号试剂重复测定3次，测试结果记为(xi)，按公式(3)求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测试20次，并分别按照公式(3)计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次，结果符合要求，准确度被验证，即符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％的要求。
Figure BDA0002395098570000131
式中：xi为测定结果；
T为靶值。
结果如表4所示。
表4本发明试剂盒的准确度检测结果总结表
Figure BDA0002395098570000132
从检测结果可以看出，低值质控的相对偏差为5.7％，高值质控的相对偏差为2.8％，均小于15％，故满足临床要求。
综上所述，本发明提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定III C的试剂盒及其制备使用方法，能有效的提升III C检测试剂的灵敏度与特异性。本发明采用了创新的用至少两株特异性强的III C单抗通过标记胶乳微粒偶联然后混合在一起的技术来制备检测III C的试剂盒，实现了上全自动生化仪，自动检测，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2；
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：缓冲液5-12g/L，无机盐2-15g/L，增浊剂10-30g/L，防腐剂1-2mL/L，稳定剂3-14g/L，表面活性剂0.5-2.5mL/L，溶剂为纯化水；
所述胶乳试剂R2包括至少两种通过IIIC单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为0.5-1.0mg/mL的相应IIIC单抗标记的胶乳微球；所述胶乳保存液包括的成分及相应含量为：缓冲液2-7g/L，无机盐5-12g/L，稳定剂10-20g/L，防腐剂1-2mL/L，表面活性剂1-7mL/L，溶剂为纯化水；其中，在所述胶乳试剂R2中，每种通过IIIC单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，在所述反应缓冲液R1中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述增浊剂为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA和蔗糖中的一种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液R1的pH为7.1-7.9。
4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，在所述胶乳保存液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖、甘露醇、甘氨酸中一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，所述胶乳保存液的pH为6.1-7.5。
6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，所述IIIC单抗标记的胶乳微球中使用的胶乳微球直径为100-300nm。
7.根据权利要求1-6任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒，其特征在于，所述胶乳试剂R2的制备方法为：
①取固含量为10％的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取至少两种IIIC单抗，各自与制得的活化胶乳微球按照特定比例混匀，并进行一定时间的偶联，制取偶联后的胶乳微球；其中，所述活化胶乳微球与各IIIC单抗抗体的v/w比均分别为1:(3-5)，偶联时间为1h；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的胶乳试剂R2。
8.一种如权利要求1-7任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液R1：
按照反应缓冲液R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液R1；
(2)配制胶乳试剂R2：
①取固含量为10％的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取至少两种IIIC单抗，各自与制得的活化胶乳微球按照特定比例混匀，并进行一定时间的偶联，制取偶联后的胶乳微球；其中，所述活化胶乳微球与各IIIC单抗抗体的v/w比均分别为1:(3-5)，偶联时间为1h；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的胶乳试剂R2。
9.根据权利要求8所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤①中，所述清洗缓冲液与活化缓冲液采用MES缓冲液；所述偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；所述活化剂采用EDAC/NHS；在所述步骤③中，所述封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，封闭时间1h。
10.一种如权利要求1-7任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定IIIC的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取5μL样本，加入200μL试剂R1，37℃孵育3-5min；
(2)加入50μL试剂R2，置37℃孵育；
(3)孵育60s后读取吸光值A1；再孵育5min，读取吸光值A2；最后，计算ΔA，△A＝A2-A1，根据ΔA测算样本中IIIC含量。
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